UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO.

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD.

CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATÒLOGICO.

ASIGNATURA:

BIOLOGÍA CELULAR

INFORME DE INVESTIGACIÓN BASADO EN LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

TEMA:

SEPARACIÓN DE ADN EN FUNCIÓN DE SU TAMAÑO

ELABORADO POR:

CHRISTIAN DAVID CHICAIZA OCHOA

SEGUNDO SEMESTRE

DOCENTE: DRA. ESTEFANÍA CARRILLO

FECHA DE LA PRÁCTICA: 27 DE JUNIO DEL 2014.

FECHA DE ENTREGA: 04 DE JULIO DEL 2014.

PERIODO:

MARZO - AGOSTO 2014

RIOBAMBA- ECUADOR

Separación de ADN en función de su tamaño Por: Viviana Allauca

ÍNDICE

1. RESUMEN......................................................................................................................3

2. INTRODUCCION.........................................................................................................4

3. OBJETIVOS...................................................................................................................5

3.1 Objetivo general:...............................................................................................................5

3.2 Objetivos especificos………………………………………………………………………..……5

4. MATERIALES Y METODOS.....................................................................................5

4.1 Movilización electroforética de la muestra de ADN.........................................................5

5. RESULTADOS Y DISCUSIONES...............................................................................6

5.1 Identificacion de las muestras obtenidas...........................................................................6

5.2 ADN extraído de una muestra.........................................................................................................6

6. CONCLUSIONES..........................................................................................................7

7. ANEXOS………………………………………………………………………………….7

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Separación de ADN en función de su tamaño Por: Viviana Allauca

1. RESUMEN

La práctica que se realizó dentro del laboratorio para la extracción del material genético se

utilizó una colonia de bacterias en una caja Petri, con una pipeta con 500 ml de agua y sal se

produce la ruptura de la pared celular y la membrana aplastantica para que se pueda extraer el

ADN. Para la preparación se debe colocar en un microtúbulo agua y sal (NaCl) y con la ayude

un palillo obtener una pequeña cantidad de bacterias se la agita hasta que esta se mezcle.

Después se los coloca en una malla y se la pone a baño María a 50º C aproximadamente por 5

minutos. Al retirarlo del baño maría se lo lleva a un recipiente y se lo coloca en ebullición por 5

minutos, al retirarlo de ebullición inmediatamente se lo coloca en hielo por un minuto. Una vez

retirados los microtúbulos del hielo se los lleva a la centrifuga sellados con un poco de cinta

adhesiva para que este no se abra al momento que se está centrifugando por 3 minutos. Una vez

destapado el tubo poner 50 ml de agua taparlo y colocarlo en el congelador por último se sacar el

tubo y colocar 300 ul de sobrenadante y 300 ul de etanol y ponerlo 3 min en la centrifuga, retirar

el tubo y arrojar el excedente de líquido.

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2. INTRODUCCION

La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas. La electroforesis también es una técnica habitual en el laboratorio clínico.

Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa.

Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel de agarosa) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz.

La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración.

En nuestro caso se utilizará un método de tinción NO TOXICO. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General:

Obtener material genético a partir de colonias bacterianas por el método de ebullición.

3.2. Objetivos Específicos:

Realizar una buena muestra para su estudio.

Adquirir destrezas en la extracción de la muestra de ADN.

Determinar el tiempo de separación de la muestra.

4. MATERIALES Y METODOS

Se realizó la preparación se debe colocar en un microtúbulo agua y NaCl y con la ayude un

palillo obtener una pequeña cantidad de bacterias se la agita hasta que esta se mezcle. Después se

los coloca en una malla y se la pone a baño María a 50º C aproximadamente por 5 min. Al

retirarlo del baño maría se lo lleva a un recipiente y se lo coloca en ebullición por 5 min, al

retirarlo de ebullición inmediatamente se lo coloca en hielo por un minuto. Una vez retirados los

microtúbulos del hielo se los lleva a la centrifuga sellados con un poco de cinta adhesiva para

que este no se abra al momento que se está centrifugando 3 min. Una vez destapado el tubo

poner 50 ml de agua taparlo y colocarlo en el congelador por último se sacar el tubo y colocar

300 ul de sobrenadante y 300 ul de etanol y ponerlo 3 min en la centrifuga, retirar el tubo y

arrojar el excedente de líquido.

4.1 Movilización electroforética de la muestra de ADN.

Para la movilización electroforética de la muestra de ADN se preparó un gel de electroforesis al

1%, pesando en la balanza 0,5gr de agarosa, 4ul de bromuro de etidio y disolviendo en 50ml de

tapón de electroforesis en una probeta, se llevó a ebullición, se mescló poco a poco con cuidado

para evitar que se queme, al observar que se diluyó todo correctamente se procedió a colocar en

la cubeta de la cámara de electroforesis y se dejó gelificar. Se preparó la muestra de ADN

colocando 18ul de muestra y 2ul de tapón de depósito se mescló bien y con cuidado se colocó la

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muestra preparada en los hoyos que se formó en el gel de electroforesis gracias a las peinetas

previamente colocadas en la cámara de electroforesis, se conectó los cables de la cámara de

electroforesis en los polos respectivos, quiere decir que el cable negro se conectó en el polo

negativo y el rojo en el polo positivo, se encendió la fuente de poder dejando migrar la distancia

necesaria, se retiró con mucho cuidado la cubeta de la cámara de electroforesis y observó en un

sitio obscuro con luz ultravioleta.

5. RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1 Identificación de las muestras obtenidas

Luego de haber realizado la práctica se puedo identificar la muestra y analizar la serie de pasos

por los que se pasó para poder extraer el ADN de la colonia de bacterias proporcionada por el

docente, ya una vez realizado el último paso se procedió a poner la muestra en el congelador

para en la próxima practica se pueda observar cuando se realiza la electroforesis.

5.2 ADN extraído de una muestra.

Se extrajo ADN en cada una de los 3 microtúbulos de polipropileno de 1,5 ml. Como se observa en la imagen a continuación.

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6. CONCLUSIONES

- Se obtuvo el material genético de las colonias bacterianas gracias a la ebullición de la

muestra.

- Se adquirió destreza gracias a que cada uno puedo realizar su propia muestra.

- Se realizó una excelente muestra para poder determinar el tiempo de separación de la

muestra de ADN.

7. ANEXOS

Imagen 3: Centrífuga Imagen 4: Balanza

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Imagen 1: Sistema electroforesis Imagen 2: Microtubulos con muestras de bacteria