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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE MEDICINA
DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA
CURSO DE ESPECIALIDAD EN ONCOLOGÍA MEDICA
MUTACIONES DEL GEN DYPD COMO PREDICTOR DE
TOXICIDAD SEVERA EN PACIENTES CON CANCER DE
ESOFAGO, TRATADOS CON 5 FLUORORACILO
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
ESPECIALISTA EN ONCOLOGIA MEDICA
PRESENTA:
DRA. CLAUDIA LORENA URZUA FLORES
DRA. ERIKA BETZABE RUIZ GARCIA
DIRECTORA DE TESIS
MÉXICO, D.F. A 15 DE AGOSTO DEL 2013
2
Indice
Resumen 3
Antecedentes
4-10
Planteamiento del problema
9
Pregunta de investigación
10
Justificación 10
Hipótesis
10
Objetivos
11
Metodología
11-17
Análisis estadístico 11
Resultados
18-19
Discusión
19
Bibliografía 19-23
3
Resumen
Mutaciones del gen dpd como predictor de toxicidad severa en pacientes con cancer de esófago, tratados con 5 fluorouracilo.
Objetivo:
Determinar la frecuencia de mutación del gen DYPD en pacientes con cáncer de esófago y asociar
la mutación con toxicidad asociada al 5-FU.
Material y Métodos:
El estudio se realizó en pacientes con cáncer de esófago localmente avanzado y metastásico, tratados en el Instituto Nacional de Cancerología, los cuales recibieron quimioterapia a base de fluoropirimidinas, de primera o segunda línea con o sin radioterapia.
Se realizó revisión de expedientes, registrando características clínicas, perfil de toxicidad,
clasificándose de acuerdo a CTACE v 3.
Las mutaciones se determinaron por PCR en tiempo real en muestras de tejido tumoral, y se realizó asociación entre la mutación y el perfil de toxicidad, el análisis se realizará por SPSS v 2.1
Resultados:
Se incluyeron pacientes con cáncer de esófago de Enero del 2011 a enero del 2013, 56 pacientes se incluyeron al estudio, un total de 45 hombres (80.4%) y 11 mujeres (19.6%), 6 pacientes tuvieron localización de esófago superior (10.7%), esófago medio 14 (25%), inferior 36 (64%), por histología epidermoide 28 (50%), y adenocarcinoma 28 pacientes (50%). En etapa clínica I 28 pacientes (50%), III 12 pacientes (21.4%), IV 16 pacientes (28.6%), los pacientes que recibieron radioterapia completa 31 pacientes (55.4%), radioterapia incompleta 10.
Conclusión:
No encontramos significancia estadística entre las características clínicas, por laboratorio, imagen y patología de los pacientes relacionados con la toxicidad, aunque si observamos una tendencia con hemoglobina menor de 10g/dl, albúmina, y con histología epidermoi de en relación a mayor toxicidad.
Palabras clave: cáncer de esófago, fluoropirimidinas, Gen DPYD.
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Antecedentes.
Epidemiología
El cáncer de esófago constituye la sexta causa de muerte por cáncer y la novena neoplasia más frecuente del mundo, se reportan 481,645 casos y 406,533 muertes a nivel mundial, con relación Hombre: mujer 2-4:1(1), el llamado Cinturón Asiático de cáncer de esófago comprende países como Turquía, Irán, Kazakstán y China, en los cuales existe alta incidencia de CCE, con más de 100 casos por 100 mil habitantes, también la incidencia es alta en el sur y este de África .En Estados Unidos se reportaron 16,980 casos y 14,70 muertes(2). En México, el Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas del 2003, reporto 734 casos y 1.5% de todas las muertes por cáncer (3), los tumores hacia tercio inferior de esófago han ido aumentando de manera progresiva, la edad promedio de presentación es a los 65 años.
Patología
Los tipos histológicos más comunes son epidermoide 51.6%, el 60% de estos se localiza en el tercio medio del esófago, 25% en el esófago distal, se originan del epitelio escamoso, tienden a diseminarse por vía linfática, el adenocarcinoma es el segundo subtipo histológico más frecuente se encuentra en un 42%, tienden a localizarse en el tercio distal del esófago y unión gastroesofágica, se asocian con metaplasia o displasia. No existe diferencia en el pronóstico de ambas histologías. (7, 8,9)
Factores de riesgo
Se han identificado factores de riesgo específicos para cada subtipo histológico l os factores de riesgo para cáncer de esófago epidermoide son tilosis en forma hereditaria (síndrome de Howell-Evans) (7), 7% antecedente de neoplasia de tracto Aero digestivo, tabaquismo, alcoholismo, hacen efecto sinérgico con un riesgo relativo hasta de 50 veces (8,9). Alta ingesta de nitrosaminas, flavotoxinas, nuez de Betel, alimentos y bebidas a altas temperaturas (10).
Por el contrario la infección por Helicobacter pylori, obesidad, enfermedad por reflujo gastroesofágico, esófago de Barret, divertículo de Zenker, además, se le relaciona con factores nutricionales, como dieta baja en selenio, vitamina E y caroteno beta, y consumo de encurtidos y conservas vegetales (que contienen nitrosaminas y micotoxinas) son factores de riesgo asociado con adenocarcinoma (8,9).
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Cuadro clínico
Las principales vías de diseminación son la extensión directa, los linfáticos y la vía hematógena. La extensión a estructuras contiguas se facilita por la falta de serosa y la estrecha relación anatómica con estructuras como el cayado aórtico, carina, tráquea y diafragma. La afección temprana de estos órganos dificulta el tratamiento quirúrgico.
La disfagia es la manifestación clínica más frecuente (75%). Sin embargo, se presenta hasta
que disminuye más de 60% el calibre de la luz esofágica, por lo que al momento del diagnóstico el tumor suele mostrar un crecimiento local avanzado. La pérdida ponderal significativa (mayor de 10%del peso corporal inicial en los últimos 6 meses) se presenta en 57% de los pacientes y es un indicador independiente de mal pronóstico. La odinofagia se presenta en 17% de los casos, la disnea en 12% y puede haber una fístula traqueoesofágica en 6%. El antecedente de reflujo gastroesofágico se presenta en 21% de los pacientes. (7, 8,9)
Tratamiento
En enfermedad localmente avanzada y metastásica el tratamiento estándar aparte del
quirúrgico es quimioterapia a base de 5- fluorouracilo ya tratamiento único, existen diversos estudios en los que se demuestra el beneficio de este medicamento.
El estudio del Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) 85-01 comparó la quimio radioterapia concomitante con la radioterapia sola. En el grupo de quimio radioterapia concomitante se observó ventaja notoria en cuanto a sobrevida a 5 años (27 contra 0%), mediana de supervivencia (14.1 contra 9.3 meses) y control local. Por su parte, el estudio del Intergroup (INT 0123), que investigó la importancia de las dosis elevadas de radioterapia (50.4 contra 64.8 Gy) en combinación con quimioterapia concomitante, no demostró diferencias estadísticamente relevantes entre ambos grupos (13).
El meta análisis de Cochrane, que comparó QT/RT o RT sola, reveló que la QT/RT definitiva
es la mejor opción en pacientes que no son candidatos a tratamiento quirúrgico, ya que a pesar de ser más tóxico mejora la supervivencia y disminuye la recurrencia local(11). Con cualquier modalidad terapéutica, la falla loco regional tiene lugar en cerca de 20 a 80% de los casos. Con la quimio radioterapia concomitante la falla es de 35 a 45%. Sin embargo, las metástasis a distancia persisten como la causa principal de fracaso (9,10).
Un meta-análisis de la participación de 1219 pacientes con cáncer color rectal tratados
con 5-FU, mostraron que la toxicidad de grado 3 ó 4 se encuentra en el 31-34% de los pacientes, con 0,5% de los pacientes que experimentan toxicidad letal. (15)
6
5-FU
El 5-Fluorouracilo (5-FU) descubierto por Heidelberg en 1957 por o su prodroga oral el capecitabine (utilizada por primera vez en 1999), son fármacos muy utilizado en una gran variedad neoplasias, tales como color rectal, gástrico, esófago, mama o páncreas. 5-FU es un compuesto orgánico aromático heterocíclico con una estructura similar a la de la pirimidina
Pertenecen a los análogos de las pirimidinas, y requieren de la conversión intracelular a metabolitos citotóxicos para dar lugar a sus efectos antitumorales. Los pacientes tratados con este fármaco pueden presentar diversos grados de toxicidad que va del 10-40%; en algunos casos siendo amenazantes para la vida.
Los recientes avances en la comprensión del metabolismo del 5-FU y las enzimas claves involucrado en la activación y degradación de los 5-FU ha llevado a una mayor conciencia de que el catabolismo ruta de 5-FU juega un papel importante en la determinación de la toxicidad, así como la eficacia hacia 5-FU(16,17).
El efecto más importante antitumoral de 5-FU puede ser atribuido a la inhibición de la
timidilato sintetasa (TS) por FdUMP [21-24].TS es una enzima crucial para la síntesis de novo de timidilato (dTMP) que es necesaria para la síntesis de ADN. Esta enzima es responsable de la metilación de los 2-5-monofosfato de desoxiuridina (dUMP) en timidina 5-monofosfato (dTMP) con la concomitante la oxidación de N5, N10-metilentetrahidrofolato a dihidrofolato y este a su vez es precursor de ADN, por lo cual al ser inhibida la TS impide la formación de ADN.
La contribución de mecanismos de citotoxicidad de 5-FU al RNA y ADN depende tanto de la concentración de 5-FU y la duración de la exposición, se ha sugerido que una exposición corta con altas concentraciones induce daño directo y mayor toxicidad, mientras que concentraciones más bajas con exposiciones más largas favorecen efectos directos sobre el ADN
Del 1-3% del 5FU administrado será convertido a metabolitos citotóxicos y más del 80%
será rápidamente degradado. En el catabolismo de 5-FU la enzima principal es la dihidropirimidina
deshidrogenasa (DPD), la cual cataliza la reducción de 5-FU en 5,6-dihidrofluoracil (FUH2) y
corresponde al 90% de la vía del catabolismo del 5-FU, las otras 2 vías del catabolismo del 5-FU
corresponden a la orotato foforibosil transferasa (OPRT) con fosforribosil pirofosfato (PRPP) como
cofactor, además de uridin quinasa (UP) (fig 1)
7
5¢DFUR
Rib-1-P Pathway 2
UP
FUR
Tegafur
TP
P450
5-FU
DPD
PRPP
Pathway 1
OPRT
UK FUMP
FUDP FUTP F-RNA
FdUDP FUH2 dRib-1-P
Pathway 3
FUdR
FdUMP
TS
FdUMP
Ch2THF
F- -Ala
Figur e 1 Metabolism of 5-FU, 50DFUR, and Tegafur.
TP TK
Fig 1 Metabolismo del 5-FU
DPD
La dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) es la enzima inicial y limitante de la velocidad
en la ruta que cataboliza las pirimidinas fluoradas, como 5-FU y sus derivados (capecitabina). La DPD, tiene, por tanto, un papel crítico tanto en la efectividad antineoplásica de 5-FU como en su toxicidad, DPD se encuentra presente en varios tejidos como tracto gastrointestinal, sangre periférica e hígado en el cual se lleva a cabo el catabolismo del 5 FU, DPD es una enzima saturable.
Un trastorno en la actividad de DPD tiene una relevancia extraordinaria en el catabolismo
de 5-FU y, por tanto, en su efectividad y toxicidad. Si la actividad de la DPD se ve incrementada
habrá menor cantidad de 5-FU y cierta resistencia a este compuesto. Por el lado contrario, si existe
una actividad disminuida de la DPD se producirá un descenso del catabolismo de 5-FU con la
consiguiente acumulación e incremento de su toxicidad (16, 17, 18,20).
Deficiencia DPD
El déficit total de DPD constituye una enfermedad congénita, autosómica recesiva, que se
manifiesta durante la infancia y se caracteriza por presencia de elevados niveles de timina y
uracilo en orina, sangre y líquido cefalorraquídeo, habitualmente acompañados de déficit
neurológico, retraso mental, convulsiones e hiperuraciluria (32).
Sin embargo, la deficiencia parcial de DPD no se manifiesta fenotípicamente, pero sí afecta
al metabolismo de 5-FU. Un 5% de la población presenta deficiencia parcial de DPD –aunque hay datos que sugieren un porcentaje bastante mayor - y, por tanto, es susceptible de presentar reacciones de toxicidad severa tras recibir dosis de 5-fluorouracilo. En general, la toxicidad
8
resultante de la administración de 5-FU en individuos con deficiencia parcial de DPD incluye síntomas gastrointestinales, mielosupresión, fiebre, mucositis, diarrea y en un porcentaje reducido de casos, neurotoxicidad. También se asocia con una cardiotoxicidad que incrementa el riesgo de infarto agudo de miocardio, inducción de arritmias ventriculares y supraventriculares. En los casos más severos pueden aparecer complicaciones como ataxia cerebelar, alteraciones de la función cognitiva e incluso la muerte (18, 19, 26, 29, 30,32).
Gen DYPD
El gen que codifica (DPYD) DPD se encuentra en el cromosoma 1p22 y esta constituido por
23 exones que abarca aproximadamente 950kb, 81% de las mutaciones se encuentran del exón 2
al 14.(16,20,23,24)
La DPD puede perder su actividad o reducirla si el gen que la codifica sufre al gunas
mutaciones específicas. Las que más se han relacionado con los efectos adversos más severos son
las siguientes: IVS142846A>T (que representa el 52% de los casos ya que al ocurrir, provoca la
pérdida de un exón completo codificado en el gen), 1236G>A, c.2921A>T, c.2846A>T, c.2657G>A,
c.1905+1G>A , c.1679T>A, c.1679T>G y c.496A>G. Estas mutaciones han sido detectadas en
poblaciones caucásicas y orientales, donde se ha determinado que la deficiencia se presenta entre
el 10 al 30% de los pacientes tratados con fluoropirimidinas, estas variantes se han relacionado
con toxicidad severa al 5FU incluso en los pacientes que presentan toxicidad grado 3 y 4 se ha
detectado deficiencia parcial en el 50% de los casos. (20,28, 29, 33,30). Diversos estudios han
sugerido que los factores epigenéticos también pueden influir en la actividad DPD como la
metilación aberrante del promotor DPYD (28,34)
Diferentes análisis genotípicos y fenotípicos se han realizado en Japón, Taiwán,
Corea(25,35), India, Pakistán(3637), África(38), Inglaterra, Holanda, Francia, Alemania, Portugal
(39,40,41), EU encontrando diferentes tasas poblacionales de deficiencia parcial de DPD, La
prevalencia de mutación IVS142846A se encuentra mutado en la alemanes 0.46%, turcos 0.75%,
finlandeses1.1%, taiwaneses 2.7%, afro-americanos 0%, Holanda 0.91%(18). En una cohorte de
114 pacientes coreanos tiene un valor mayor para la medición de actividad de DPD, por lo Tanto
interpretación de estos estudios se ha visto complicada debido a que no existe un conceso actual
de la deficiencia los estudios iniciales utilizaron el percentil 95 inferior como arbitrario punto de
corte, otros grupos han sugerido el uso el percentil 70 más bajo de actividad DPD de una población
normal como un nivel de umbral, que pondría a casi el 14% de la población en general en situación
de riesgo para el desarrollo de la toxicidad relacionada con 5FU.
9
Toxicidades
Los pacientes con deficiencia en la actividad de la DPD presentaran toxicidad, incluso
algunos casos de consecuencia fatal. Las complicaciones principales son hematológicas
(leucopenia, neutropenia febril y anemia o trombocitopenia), gastrointestinal (mucositis oral o
intestinal, estomatitis, diarrea, náusea y vómito) o dermatológicas (síndrome mano-pie, perdida
de pelo o piel seca), menos frecuentes pero también importantes son las anormalidades
neurológicas (ataxia cerebelar, deterioro cognitivo o niveles alterados de consciencia).
Las toxicidades relacionadas a Quimioterapia se clasifican de acuerdo a Common
Terminology Criteria for Adverse Events v 3 (CTCAE) National Cancer Institute, ver anexo
Técnicas de medición de DPD
Se han desarrollado diferentes técnicas para determinar la deficiencia de DPD, con 5 -FU
radiomarcado y medición de DPD en sangre periférica por medio de cromatografía(43,44), aunque
lo niveles son más altos en el hígado se correlacionó con la actividad, en sangre periférica . Por
PCR en tiempo real es un método alternativo de medir la actividad enzimática, sin embargo aún no
queda claro si la cuantificación de la expresión de ARNm, represente con precisión la actividad
enzimática(45).
Mediciones del metabolito final del 5-FU fluoro-b-alanina (FBAL), disminución de niveles
de FBAL se correlacionan con DPD disminuida, otra técnica es medición del catabolismo del uracilo
(42). Otras técnicas para predecir la deficiencia parcial de DPD utilizan enfoques basados en
genómica por PCR en tiempo real.(20,28,29,30), así también diversos estudios han empleado la
técnica de PCR en tiempo real para mutaciones en el gen DYPD con asociación a toxicidad severa
Planteamiento del problema
El cáncer de esófago representa la sexta causa de muerte y la novena en frecuencia a nivel
mundial, mas de dos terceras partes se diagnostican en etapas avanzadas, el tratamiento
contempla la quimioterapia a base de fluoropirimidinas, en donde se han reportado toxicidad
grado 3 y 4 hasta en un 30% de los pacientes de los cuales la mitad tienen mutación de DPD.
10
En la práctica cotidiana, no se toma en cuenta la mutación de DPD antes de iniciar
tratamiento con fluoropirimidinas ni tampoco se conoce la incidencia de mutación de DPD en
población mexicana, así como determinar la frecuencia de las diferentes mutaciones ya conocidas.
Pregunta de investigación
La mutación del gen DYDPD se asocia a toxicidad severa en pacientes mexicanos tratados con 5-
Fluorouracilo?
Justificación.
En los estudios realizados para determinar la frecuencia de mutación de DPD en Europa,
África, Asia, se han reportado incidencias de mutaciones diferentes de acuerdo al grupo étnico, en
México no existe un reporte de mutación de DPD, así mismo se han asociado los diferentes tipos
de mutaciones a toxicidad severa tras la administración de 5 –FU, debido a que aproximadamente
el 50% de los pacientes que experimentan toxicidad grado 3 o 4 presentan mutación de este gen,
por lo cual en un futuro podría ser una prueba de tamizaje antes de iniciar tratamiento con
fluoropirimidinas.
HIPÓTESIS
Hipótesis nula:
La mutación del gen DYPD no se asocia con toxicidad severa en pacientes tratados con 5-FU.
Hipótesis alterna:
La mutación del gen DYPD se asocia a toxicidad severa en pacientes tratados con 5-FU.
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Objetivos
General:
Determinar de acuerdo a las características de los pacientes, que factores se asocian a mayor
toxicidad.
Secundarios:
Asociar respuesta con toxicidad
Determinar los diferentes tipos y la frecuencia de mutación de DPYD en pacientes con cáncer de
esófago
Metodología
Tipo de estudio: retrospectivo, exploratorio (no se realizó tamaño de muestra debido a que es
exploratorio).
Análisis estadístico
Se realizo análisis descriptivo de las variables clínicas, por imagen , patología y de laboratorio y
pposteriormente se realizó un análisis de modelo de regresión logística univariado para identificar
factores que existen en relación a toxicidad por quimioterapia mediante el programa SPSS versión
2.1, tomándose como p significatica 0.005
Definición de las variables y la forma de medición:
Nombre Fuente Definición Escala de
medición
Calificación
Edad Expedien
te
Pacientes entre 18 y 75 años Cuantitativa
discontinua
Numérica
Sexo Expedien
te
Género cualitativa 1. hombre 2. mujer
Histología Expedien
te
Patólogo
Tipo histológico reportado en el
laboratorio de patología
cualitativa 1. adenocarci noma
2. epidermoi de
Grado expedien
te
Patólogo
Grado de diferenciación histológica
reportado en el laboratorio de patología
cualitativa 1. Bien diferencia do
2. Moderada mente dif.
3. Poco dif.
Localizació
n
Expedien
te
Sitio anatómico en esófago y unión esofagogástrica donde se localiza el epicentro del tumor
cualitativa 1. Superior 2. Medio 3. Inferior 4. Unión
esófago- gástrica
Número
de Ciclos
de QT
Expedien
te
Número de ciclos de quimioterapia de primera línea recibidos
Cuantitativa
discontínua
Numérica
12
Quimioter
apia de
segunda
línea
expedien
te
Pacientes que hayan recibido otro esquema de quimioterapia posterior a la progresión
Cualitativa 1.- Si 2.- No
Respuesta
por TAC
(dependie
nte)
Expedien
te RECIST
V1.1
Modificación del diámetro mayor del tumor
Cualitativa 1.- Respuesta
completa 2.- Respuesta
parcial
3.- Enfermedad
estable
4.- progresión
Etapa
clínica
Expedien
te
AJCC,
2010
Clasificación de la enfermedad de acuerdo a la profundidad de invasión tumoral, número de ganglios y presencia de metástasis a distancia.
Categórica,
ordinal
T:1-4 N:1-3
M:0-1
Toxicidad Expedien
te
Se define como cualquier toxicidad en el tiempo en el que recibieron quimioterapia
Se evaluó neutropenia como neutrófilos
menos a 1500
Anemia < 10gr/dl
trombocitopenia < 75,000
mucositis eritema de la mucosa
diarrea aumento de número y
consistencia de evacuaciones síndrome mano-pie eritema en plantas y
palmas
vómito > 1 episodio en el dia
náusea que ocasione disminución del
apetito
Cuantitativa
continua
CTCAE v 3
13
14
Mutación
DPD
Laborato
rio de
medicina
traslacio
nal
Prueba realizada por PCR cualitativa Numérica
Población
La población incluye pacientes con cáncer de esófago y UEG con enfermedad localmente avanzada y metastásica, valorados por la Unidad Funcional de Gastro-oncología del Instituto Nacional de Cancerología, en el periodo comprendido entre enero del 2011 y diciembre del 2012.
Procedimiento
Criterios de Inclusión
Pacientes con cáncer de esófago y UEG, que hayan recibido quimioterapia a base de fluoropirimidinas, esquema de primera o segunda línea. Pacientes de 18 a 75 años Pacientes que cuenten con estudio de tomografía, para evaluación de respuesta al tratamiento con quimioterapia paliativa. Pacientes que cuenten con biopsia para determinación de mutación de DPD
Criterios de Exclusión
Pacientes que no hayan recibido fluoropirimidinas.
Las pruebas se realizarán en biopsias realizadas por endoscopia previa al tratamiento con quimioterapia. Desparafinación de muestras
1. Realizar de 5-10 cortes de muestras de tejido embebido en parafina de aproximadamente
25μm. 2. Depositar en microtubos para centrífuga de 1.5mL previamente etiquetados 3. Incubar con 1mL de xileno en horno de calor seco a una temperatura de 56oC durante una
hora. 4. Sacar los tubos del horno y eliminar la mayor cantidad del volumen para volver a colocar
1mL de xileno a cada uno de los tubos. Incubarán durante una hora a 56oC. 5. Eliminar la mayor cantidad de xileno posible y realizar 3 lavados por pipeteo con etanol
absoluto 6. Elimina la mayor cantidad de etanol remanente y de dejar secar a 56oC.
15
Extracción y purificación de ADN genómico (ADNg)
La extracción del ADNg se realizará mediante el empleo del kit DNeasy® blood and tissue de QIAGEN siguiendo las siguientes instrucciones del proveedor:
1. Colocar en un tubo eppendorf de 1.5 mL previamente etiquetado, 180 μl de Buffer ATL, y
agregar posteriormente 20 μl de proteinasa K, vortexear e incubar a 56°C hasta que el tejido este completamente lisado.
2. Vortexear 15 segundos y posteriormente adicionar 200 μl de Buffer AL y vortexear. Luego adicionar 200 μl etanol (96–100%) y vortexear nuevamente.
3. columna de DNeasy mini spin previamente etiquetada. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Desechar el filtrado y el tubo de colección.
4. Pasar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 ml, adicionar 500 μl de Buffer AW1, y centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 minuto. Desechar el filtrado con el tubo de colección.
5. Pasar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 ml, adicionar 500 μl de Buffer AW2 y centrifugar por 3 minutos a 20,000 x g (14,000 rpm) para secar. Descartar el filtrado con el tubo de colección.
6. Pasar la columna a un tubo de Eppendorf nuevo de 1.5 ml previamente etiquetado y pipetear 200 μl de Buffer AE directamente sobre la membrana. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto, y luego centrifugar por 1 minuto a 6000 x g (8000 rpm) para eluír.
Cuantificación de ADNg
La cuantificación del ADNg se realizará mediante el empleo del espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).
1. Dar doble Click al icono del software NanoDrop™ 2000 y seleccionar cuantificación de
ácidos nucleicos. Seleccionar Add to report antes de la medición para guardar los datos de las muestras automáticamente a un documento de trabajo.
2. Establecer el Blanco usando el Buffer apropiado. Pipetear 1-2 μL del Buffer, bajar el brazo y hacer clic en el botón Blank. La solución Blanco generalmente es la misma solución Buffer en que la molécula de interés fue disuelta.
3. Limpiar el blanco de los pedestales de medición utilizando un paño de laboratori o seco y sin pelusa. Introducir el ID de la muestra en el campo correspondiente. Vortexear durante 15 segundos el tubo que contiene la muestra y pipetear 1 μL y hacer clic en Measure.
4. Limpiar las muestras de los pedestales de medición y volver a repetir el punto 3 entre cada muestra.
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Pre-PCR
Se recomienda utilizar 20ng de ADNg, donde la misma cantidad de ADN debe ser utilizado entre cada muestra. Para preparar la reacción de PCR y la placa, se utilizarán sondas para g.846927A>T, g.843669A>T, g.827462G>A, g.476002G>A, g.410273T>G, g.226525A>G, g.42731T>C
Para cada muestra, calcular el número total de reacciones requeridas Calcular el volumen total requerido para cada componente de reacción:
Volumen por reacción x el número total de reacciones + 10%
Componente
Volumen para una reacción
20Lμ de reacción (Placas de 96 pozos)
TaqMan Genotyping master mix, 2X 12.5 μl Muestra de ADNg 13.75 μl
Taqman drug metabolism assay 1.25μl Total de volumen de super mix 27.5μL
1. Etiquetar tubos de 1.5 mL, añadir todos los componentes y vortexear 2. Centrifugar brevemente para eliminar todas las burbujas 3. Para cada conjunto de replicados, transferir alícuotas de super mix a un tubo, después añadir
el gen de referencia y alelo mutante (TaqMan mutation detection assay) a cada tubo.
Placa de PCR Volumen de super mix por reacción
96 pozos 27.5μL
4. Añadir el volumen apropiado mezcla de PCR en cada pozo de reacción de la placa de PCR. 5. Verificar que no haya presencia de burbujas en el fondo del pocillo, si fuera así, eliminarlas con
una punta de micropipeta. 6. Cubrir la placa con una película adhesiva óptica y llevar al equipo de PCR.
Reacción de cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR)
Encender el equipo de PCR y el ordenador. En el programa 7500 del sistema QPCR Applied Biosystems 7500 Fast:
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1. Dar click en “7500 Fast Software” para abrir el programa 2. En la ventana principal, dar click a “Advanced setup” para desplegar en menú de opciones 3. Etiquetar el nombre del experimento y seleccionar el tipo de placa a utilizar (No. de pozos) 4. Seleccionar en el tipo de experimento “Genotyping” 5. Seleccionar el tipo de reactivo (TaqMan) 6. Seleccionar la velocidad de rampa, la cual, depende de la master mix que se empleará. 7. Cambiar a la ventana “Plate setup” y seleccionar el número de blancos (8) 8. Etiquetar cada pocillo iniciando por el gen de referencia y seguido de los blancos para cada
muestra 9. Definir muestras seleccionando los pocillos de los blancos para cada muestra presionando la
tecla “Control”. El etiquetado de muestras se debe realizar después. 10. Cambiar a la ventana “Run Method” en el cual, el método de corrida ya está preseleccionado.
Definir el volumen de muestra a utilizar 11. Cambiar a la ventana “Reaction setup” y definir las concentraciones de la master mix (2.0X) y
del ensayo (10.0X), automáticamente, aparecerán los volúmenes que se debieron utilizar en la preparación de la master.
12. Dar click en “Start run” y “Ok”
Análisis de Datos
Los pasos de análisis son:
1. Analizar los datos en el sistema de PCR en tiempo real, utilizando los siguientes ajustes de
análisis: 1.1. CT manual (ciclo umbral): 0.2 1.2. Basal automático: On
El programa del PCR en tiempo real determina los valores CT para el ensayo de detección de mutación y las reacciones del Control positivo interno (IPC)
2. Revisar los gráficos de amplificación y/o valores CT para todos los pozos de reacción:
Tipo de reacción Parámetros Las muestras analizadas con el gen de referencia (FAM)
Verificar que las curvas de amplificación tengan una distintiva, la fase de amplificación linear y valores CT estén dentro de un rango de 18-28 para 20μL y de 17-27 para 10μL
Muestras analizadas con un mutante alelo (FAM)
Revisar las curvas de amplificación y valores CT. Presencia o ausencia de una distintiva, fase de amplificación linear y valores CT dependan de la cantidad de alelo mutante presente en la muestra.
Muestras control negativo Verificar que las muestras de control negativo no estén amplificadas o tengan valores muy altos de CT
18
Muestras de control sin molde Verificar que no estén aplificadas Replicados Verificar que los valores entre los replicados
tengan valores CT de similares
Resultados
Resultados
Se incluyeron pacientes con cáncer de esófago de Enero del 2011 a enero del 2013, 56 pacientes
se incluyeron al estudio, un total de 45 hombres (80.4%) y 11 mujeres (19.6%), con una eda d
media de 64.2 años, 6 pacientes tuvieron localización de esófago superior (10.7%), esófago medio
14 (25%), inferior 36 (64%), por histología epidermoide 28 (50%), y adenocarcinoma 28 pacientes
(50%). En etapa clínica I 28 pacientes (50%), III 12 pacientes (21.4%), IV 16 pacientes (28.6%), los
pacientes que recibieron radioterapia completa 31 pacientes (55.4%), radioterapia incompleta 10
(17.9%), antecedentes de tabaquismo 32 pacientes con 57.1%, alcoholismo 32 pacientes (57.1%).
Los pacientes que no presentaron neutropenia 46 pacientes (82.1%)algún grado de neutropenia
fueron 10 pacientes (17.8%).Diarrea 42 pacientes no presentaron (75%), algún grado de diarrea en
14 pacientes (25%). Sin ningún grado de mucositis 52 pacientes (92%) con algún grado de
mucositis 4 pacientes (7.2%), ningún paciente presentó síndrome mano-pie, no presentaron
anemia 54 pacientes (96%), 2 pacientes presentaron algún grado de anemia (3.5%).
El IMC promedio fue de 24kg/m2, con mínimo de 15.9kg/m2 y un máximo de 34.4 kg/m2, con
respecto a la albúmina con media de 3.7 g/dl, mínimo de 2.1g7dl y máximo de 3.7g/dl.
Hemoglobina media de 14.3g/dl con minino de 4.7g/dl.
Los pacientes que tuvieron respuesta por biopsia fueron 29 (51.8%), sin respuesta 27 (48.2%),
respuesta por imagen 35 pacientes (59%), y sin respuesta 21 pacientes (41%).
Se realizó análisis de regresión logística univariado para identificar factores que estén relacionados
con la toxicidad a quimioterapia , los resultados se resumen como ORy su respectivo intervalo de
confianza se tomó como p significativa 0.005, los resultados se enlistan en la tabla 1 .
Variable OR IC P
Edad 1.01 0.96-1.06 0.64
Hemoglobina 0.92 0.67-1.55 0.112
Albúmina 2.7 0.67-7.08 0.195
Antígeno 1.00 0.97-1.03 0.766
19
Carcinoembrionario
Radioterapia 2.4 0.56-10.1 0.235
ECOG > 2 1.64 0.97-7.17 0.510
Etapa clínica 1.00 0.23-3.92 0.999
Respuesta por imagen 0.58 0.14-2.32 0.447
Histología 2.77 0.63-12.1 0.174
Localización 2.57 0.49-13.5 0.264
Tabaquismo 1.15 0.28-4.76 0.841
Alcoholismo 2.15 0.46-9.98 0.327
Respuesta por biopsia 2.54 0.58-11.08 0.213
Análisis univariado (tabla 1 ).
Pendiente determinar mutación de DYPD por PCR en tiempo real
Discusión
En este estudio el 81% de los pacientes presentaron algún grado de toxicidad durante el
tratamiento con quimioterapia, no encontramos significancia estadística entre las características
clínicas, por laboratorio, imagen y patología de los pacientes relacionados con la toxicidad, aunque
si observamos una tendencia con hemoglobina menor de 10g/dl, albúmina, y con histología
epidermoide en relación a mayor toxicidad, posiblemente se deba al tamaño de la muestra, aún
están pendientes los resultados para determinar mutación de DYPD las cu ales se anexaran
posteriormente.
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