universidad de guadalajararadio.cuci.udg.mx/bch/pdf/pr_bch1_v5.2s.pdf · internet como el...

!

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARACENTRO UNIVERSITARIO DE LA CIÉNEGA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA VIDA

Manual de Prácticas para

Bioquímica I

(I6140)

Fecha de Actualización 20.01.2020

!- 2 -

Índice

I. Reglamento General del Laboratorio.............................................................................................3II. Seguridad .......................................................................................................................................4III. Comportamiento en el Laboratorio en General .............................................................................5IV. Manejar Sustancias Peligrosas.......................................................................................................6V. Reglamento Interno........................................................................................................................7VI. Evaluación de las Prácticas............................................................................................................7VII. Reporte.......................................................................................................................................8Práctica No. 1 Espectrofotómetro........................................................................................................10Práctica No. 2 Desnaturalización de Enzimas .....................................................................................12Práctica No. 3 Cinética enzimática......................................................................................................15

Práctica alterna.................................................................................................................................18iPráctica No. 4 Cinética enzimática II .................................................................................................20Práctica No. 5 Azúcares reductores .....................................................................................................23Práctica No. 6 Fermentation ................................................................................................................25

!- 3 -

I. Reglamento General del LaboratorioEl profesor de la práctica deberá:

- Estar presente durante todo el desarrollo de la práctica- Mantener la disciplina de sus estudiantes durante la práctica

Todo el personal que ingrese al laboratorio deberá portar el material de protección personal como:- Bata (blanca, limpia, de algodón y manga larga)- Pantalones (largos)- Zapatos cerrados y de piso; preferiblemente de cuero- Guantes adecuados dependiendo de los reactivos y de las actividades. Con guantes nunca se toca

algo fuera del experimento. Véase a las "IdS Guantes"- Cubre-bocas, cofias, mascarillas y/o gafas de seguridad en casos necesarios

Además deberá:- Familiarizarse con la ubicación de los elementos de seguridad como extintor, puertas de

emergencia, duchas de emergencia, lava-ojos, botiquín de primeros auxilios etc., así como losnúmeros telefónicos de emergencia

- Sujetar el cabello y no usar gorra- Traer uñas cortas y sin esmalte- No maquillarse durante el desarrollo de la práctica ni manipular lentes de contacto- No comer, beber, masticar chicle- No fumar- No llevarse objetos a la boca como lápices o dedos- Lavarse las manos antes de entrar y de salir del laboratorio

Está prohibido portar la indumentaria de protección personal fuera del laboratorioNo almacenar alimentos o bebidas para el consumo humano en el laboratorioEstá prohibido el ingreso al laboratorio a personas no autorizadas, p.ej. niños o visitasCualquier incidente en el laboratorio reportarlo inmediatamente al responsableLos estudiantes no podrán salir del laboratorio durante la práctica a menos que sea muy necesarioEstá prohibido bloquear las rutas de evacuaciónToda sustancia química será etiquetada, clasificada y almacenada de acuerdo a la normatividad

existente (véase "Registro de Sustancias Peligrosas")Toda sustancia química no deberá ser eliminada directamente al desagüe sin antes consultar las

Fichas de Datos de Seguridad (véase "Registro Residuos Peligrosos")El responsable del laboratorio levantará un reporte cuando no se cumple con lo indicado en este

reglamento

!- 4 -

II. SeguridadPara entrar a las prácticas de bioquímica, cada estudiante tiene que conocer y cumplir las reglas deseguridad en el laboratorio. Información sobre el comportamiento en general se puede encontrar muydetallado en la página webhttp://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html y breve en los puntos"III: Comportamiento en el Laboratorio en General" y"IV: Manejar Sustancias Peligrosas" de este manual.También es obligatorio para el estudiante de informarse sobre los riesgos potenciales que provienende los reactivos y procedimientos que se aplicarán *antes* de que se lleven a cabo las prácticas.Información y documentos de pdf para bajar e imprimir se encuentra también en dicha página deinternet como el "Registro de Sustancias Peligrosas", "Instrucciones de Seguridad (IdS)" y "Fichas deDatos de Seguridad" (FDS) para las sustancias que se utilizarán.

En el caso de no cumplir las reglas de seguridad, el estudiante tiene que salir de la prácticainmediatamente y se evaluará este práctica con cero puntos. En caso de causar accidentesgraves o actuar con mala intención el estudiante puede ser excluido de las prácticas para todoel semestre.

!- 5 -

III. Comportamiento en el Laboratorio en GeneralUsar una bata de algodón, manga larga, abotonada y limpia para protegernos

contra contaminaciones" para no contaminar el exterior, nunca se utiliza la bata fuera del laboratorio" batas sucias traen el peligro de contaminarse uno mismo

Usar zapatos cerrados (no sandalias) y seguros para caminar (sin tacón)" en verano se puede traer un par de zapatos adicionales adecuados para el

laboratorio

Usar material de seguridad personal (gafas, guantes, etc.), cuando es indicado

NO fumarNO comer, beber, maquillarseNO alcohol u otras drogasNO móvil/celular

No desarrollar experimentos peligrosos solos en el laboratorioNo correr ni jugar en el laboratorioNo recibir visitas personales en el laboratorioNo dejar bolsas o ropa en el laboratorioSiempre dejar el laboratorio limpio y ordenado- su material (quitar escrituras y adhesivos)- los equipos (p.ej. centrífuga)- su lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo)Avisar:- situaciones peligrosas- mal funcionamiento de equipos y/o- terminación de reactivosal Responsable del Laboratorio

Lavarse las manos después del trabajo y ponerse crema para la piel

!- 6 -

IV. Manejar Sustancias PeligrosasEs obligatorio informarse sobre los riesgos específicos de sustancias peligrosas" Ver las Fichas de Datos de Seguridad (FDS)http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/SDB.html" Ver al Registro de Sustancias Peligrosashttp://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/Anweisungen.html

Mujeres embarazadas y madres amamantandoNO pueden trabajar en el laboratorio con sustancias peligrosas

Almacenar:En recipientes adecuados y en una manera adecuadaMarcado conforme a su contenido- contenido (sustancia, mezcla, concentración)- fecha- propietario- símbolo de peligroNo en cantidades grandesSustancias que producen polvos, gases, vapores, aerosoles etc tóxicos, nocivos,

cancerígenos, corrosivos o inflamables almacenar en un lugar ventilado

Nunca almacenar alimentos en el laboratorioNunca almacenar reactivos en contenedores de alimentos

Manejar:No tocar químicosTrasvasar mediante un medio aplicable (e.je. embudo)Nunca poner las tapas boca abajo sobre la mesa- dejar químicos sobre la mesa- traer contaminación al recipienteNo dañar las etiquetas mientras se trasvasa (p.ej. por goteo)Nunca devolver reactivos en su envase original- traer contaminación al recipienteNo llenar recipientes más del 90% de su capacidad máximaCerrar bien los recipientes no usadosSustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles tóxicos, nocivos,

cancerígenos, corrosivos o inflamables se maneja en una campana deextracción

!- 7 -

V. Reglamento InternoEl estudiante tiene que entrar preparado a las prácticas, es decir con:- Ropa adecuada cumpliendo las reglas de seguridad (pantalones largos, zapatos cerados y seguros,

cabello corto o recogido, bata limpia; gafas de seguridad y guantes según necesidad)- Material necesario para llevar a cabo la práctica según el manual o el anuncio del profesor- Material estandar con que debe contar cada equipo: 70% EtOH en atomizador para limpiar

meseta, cerillos, perilla/bulbo, bisturí, guantes, portaobjetos, cubreobjetos, varilla de madera,algodón, gasa

- Método: Diagrama de flujo (escrito a mano) para llevar a cabo la prácticaordenado, fácil de leer = fácil para captar la información necesaria, sin distractores (sóloesquemas/dibujos necesarios), con espacio para anotar resultados crudos.Hay que enseñar este equema al profesor dentro de los primeros 15 min de la PR.

- Conocer la base teórica para entender el objetivo de la prácticaEn el caso de no cumplir algún punto de los anteriores, el estudiante puede ser excluido de estapráctica y se evaluará con cero puntos.

VI. Evaluación de las PrácticasEn cada práctica se evaluará al estudiante según el siguiente esquema:50 % Comportamiento en el laboratorio (actitud, preparación, desempeño, limpieza)50 % Reporte

La calificación final de las prácticas se calculará del promedio de todas las prácticas ofrecidas, dondecada práctica tiene el mismo peso. Prácticas ofrecidas no se repite; se evaluará una falta de asistenciano justificada con cero puntos.

La evaluación de la materia será:Exámenes 60 %Tarea 10 %Participación 5 %Prácticas 25 %Se tiene que aprobar la teoría (= exámenes + tareas + participación) y las prácticasindependientemente para aprobar la materia.

!- 8 -

VII. ReporteCada equipo tiene que entregar el reporte de la práctica (impreso) al profesor responsable a mástardar 6 días hábiles después de la práctica. Reportes de tipo "copy & paste" no son aceptables.

Generalmente, se evalua de reportes (detalles - ver abajo):* Expresión clara, precisa y concisa - es decir, no innecesariamente larga* Escritura sin faltas ortográficas o errores gramaticales* Contenido completo - por eso, el reporte debe cumplir con los siguientes puntos:

- Nombre, Apellido y código del estudiante, número del equipo, fecha, curso, tema de la práctica- Introducción (5): Pequeña introducción en la teoría en que se basa la práctica (la base para la

*discusión*; no tanto respuesta al cuestionario o una discusión anticipada)- Material (2): - Material (especial) usado (sin material estándar como tubo de ensayo, gradilla, ...)

- Soluciones, reactivos usados (pureza, conc., marca si es relevante - no la preparación)- Equipos (marca, modelo)

- Método (10): - Anexar "Diagrama de flujo para llevar a cabo la práctica" (véase V. Regl. interno)- Procedimiento (8): - Pasos que realizaron para llevar a cabo la práctica

tomar fotos puede ayudar a ilustrar el procedimientocopiar el método del protocolo y apuntar "aclaraciones" no será aceptable.

- Resultados (10): - Tabla (p.ej. de lecturas), fotos (con descripción) de los resultados primarios(p.ej. colores de soluciones)

- NO hay un rubro propio de "observaciones"(20) - Cálculos y resultados elaborados, gráficas (p.ej. Excel), explicación

- Discusión (20): - Qué se ha esperado (en base de la teoría como explicado en la introducción)?- Explicación de las reacciónes y relacionarlas con observaciones y resultados- Resultados cumplen con la expectativa?- En el caso de no: discusión de errores- Qué significan los resultados?- NO hay un rubro propio de "conclusiones". Es parte final de la discusión.

- Cuestionario (20): - Contestado- Bibliografia: Autor1, N1, N2 Autor2 & N3 Autor3 (año): Título. Revista, Volumen: páginas

http://www.domain-name.de/link/al/documento.pdf- Formato del reporte (5)

!- 9 -

En la escritura no hay de desapreciar el espacio para producir más páginas, p.ej. no se requiere una hojade portada, no hay que dejar partes grandes en blanco; se recomienda usar los dos lados de una hoja.Se evalua también:- Normalmente se escribe textos con fuentes con serifas/gracias (p.ej. Times) - mientras leyendas y

textos en gráficas son escritos con fuentes sin serifas/gracias (p.ej. Arial).

- Las páginas deben ser enumeradas (sin tomar en cuenta los anexos).- Hay que hacer saltos de página útiles/lógicas, p.ej. celdas de tablas no deben ser separados por un salto

de página. Igualmente, un título no debe ser separado de su texto por un salto de página.- Uso de mayúsculas (textos no se escribe en mayúsculas o cursiva) y de puntos (después de una oración)- Expresión científica y uso de termini technici: p.ej. desdoblar vs hidrolizar. Hay que evitar palabras

con conotaciones emociaónales (p.ej. apreciar).- Unidades: su uso correcto, las abreviaciones correctas, espacios, puntos- Formulas químicas: uso correcto de mayúsculas, minúsculas, superíndice, subíndiceEs recomendable escribir el método en infinitivo; media oraciones facilitan capar el contenido, p.ej.:

1) Añadir 3 ml H2O en tubo de ensayo 1) Se añadará 3 milílitros de agua en un tubo de ensayo.2) Medir Abs. a λ = 620 nm 2) Se medirá la absorbancia de la muestra a 620 nanó-

metros con el espectrofotómetro.El texto hay que escribir en forma impersonal (se ha observado, se medió) y no en forma personal

(obersvé, medimos).Fotos, tablas, graficas deben contar con una descripción entendible por si mismo (i.e. sin necesidad

de leer el texto) y tener referencia en el texto.Gráficas de coordenadas cartesianas deben iniciar con el valor cero y se debe indicar las unidades en

los ejes. La variable independiente se grafica en la eje X (abscisa), la dependiente en la eje Y(ordenada). Hay que especificar la muestra graficada (no "muestra 1" sino p.ej. conc. 1 mM). Ladistribución de los puntos debe ser proporcional (Excel: dispersión).

En la discusión o introducción hay que explicar, que se está esperando. Esto incluye reaccionesquímicas, que deben ser representados (es posible dibujarlas a mano).

Aunque gramaticalmente correcto, oraciones pueden ser falsos por su lógica, p.ej.: "La cinéticaenzimática estudia la velocidad..." - el sujeto de la oración es cinética, pero cinéticas NO puedenestudiar algo. Normalmente son seres humanos, que pueden estudiar...

Otras sugerencias en la escritura de textos científicos se puede encontrar en:http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/Paper.html

!- 10 -

Práctica No. 1Espectrofotómetro

Tipo de práctica: Por equipo Tiempo de duración: 2 h

ObjetivoConocer el fundamento del espectrofotómetro para determinar la absorción y concentración de unasustancia en solución.

IntroducciónEste instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de unamuestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto permite dar informaciónsobre la naturaleza de la sustancia en la muestra y también indicar indirectamente que cantidad de lasustancia que nos interesa está presente en dicha muestra. El color de las sustancias se debe a queestas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y sólo vemosaquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas.

MaterialMaterial Cantidad Reactivos Cantidad

Celdas de plástico (semi-micro) 3 Solución madre de FeCl3 (50 mM) # 2 m$Tubos de ensayo, 10 m$ 6 Aqua destillata (A. dest.)Gradilla 1Micropipetas de 100, 1000 µ$, puntas 2 / grp 1 m$Equipo

1 muestra de FeCl3 de concentracióndesconocida

Espectrofotómetro 2 / grp

Método1. Preparar un banco de diluciones (1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50) de la solución madre2. Calibrar el espectrofotómetro a λ = 400 nm contra A. dest.3. Determinar la absorbancia de cada solución a λ = 400 nm4. Determinar la absorbancia de la muestra a λ = 400 nm

!- 11 -

ResultadosDiluciones A. dest. 1:1 1:2 1:5 1:10 1:20 1:50 muestra

DiluciónConc. [mM]Conc. [g/$]Abs (400 nm)- Calcular (y dibujar) una regresión lineal por los estándares (banco de dilución)- Calcular en base a esto la concentración de la muestra

Adicional

Cuestionario1. Especifique el peso molecular [g/mol], temperatura de fusión [°C], temperatura de ebullición [°C],

densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).Calcule la preparación de las soluciones [g/l].

2. Indique detalladamente el principio del espectrofotómetro.3. ¿Cuál es la Ley de Lambert-Beer?4. ¿Cuál es la diferencia entre extinción (atenuación), absorción y transmisión?

Bibliografía1. Spectro Educational Booklet 07, Biochrome: http://www.biochrom.co.uk/download/72/2. Edwards, K (2014): Visible Spectroscopy. University of California, Irvine:

https://faculty.sites.uci.edu/chem2l/files/2011/04/RDGVISSpec.pdf3. https://pharmaxchange.info/2012/04/ultraviolet-visible-uv-vis-spectroscopy-%E2%80%93-

derivation-of-beer-lambert-law/

Mecanismo de EvaluaciónVéase: VI Evaluación de las Prácticas, página 7.

Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalEl FeCl3 irrita la piel, se debe usar guantes de caucho butílico o PVC. En contacto con los ojos, lavarcon abundante agua manteniendo los párpados abiertos (mínimo 10 min), hay un riesgo de lesionesoculares graves; se debe usar gafas de seguridad. Llamar al oftalmólogo. En caso de ingestión, beberabundante agua y evitar vómito. Tras inhalación, tomar aire fresco. En contacto con la piel, lavar conagua. Quitar ropa contaminada. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos se depositan al contenedor de sales de metales pesados.

!- 12 -

Práctica No. 2Desnaturalización de Enzimas


ObjetivoDemostrar como el calor y/o pH pueden influir en la estructura terciara de una enzima, así como sufuncionalidad.

IntroducciónCada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que provoca continuos cambios en su estadobioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar yagilizar determinados procesos sintéticos y analíticos. La temperatura Influye en la actividad de lasenzimas. El punto óptimo es aquel que representa el máximo de actividad. A temperaturas bajas lasenzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50 ºC) laactividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.El pH puede afectar de varias maneras:- El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH- La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede provocar modificaciones en la

conformación de la enzima- El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH


Trozo de hígado fresco(trae el estudiante)

1 Agua oxigenada (H2O2, 3-5 %)(trae el estudiante) %

15 m$

Tubos de ensayo de 15 m$ 4 1 M HCl # 5 m$Pinza para tubo de ensayo 1 1 M NaOH # 5 m$Gradilla 1 Aqua destillata (A. dest.) 5 m$Pipetas de 5 m$ 4Mortero & pilón 1 Arena (trae el estudiante)Mechero de Bunsen 1EquipoBalanza 1 / grp

!- 13 -

Método

Hay que usar gafas de seguridad. Gafas ópticas no son adecuadas.

1) Normal1.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)1.2 Añadir 3 m$ de agua oxigenada1.3 Anotar y documentar las observaciones1.4 Después de la reacción retirar el agua oxigenada y añadir otra vez 3 m$ de agua oxigenada

2) Superficie2.1 Moler ~2 g de hígado con arena2.2 Transferir el hígado molido en un tubo de ensayo2.3 Añadir 3 m$ de agua oxigenada

3) Temperatura3.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)3.2 Añadir 5 m$ de A. dest. y hervir la muestra durante 5 min3.3 Dejar enfriar y retirar el agua sobrante3.4 Añadir 3 m$ agua oxigenada

4) pH4.1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado (~2 g en total)4.2 Añadir 5 m$ 1 M HCl e incubar a temperatura ambiente la muestra durante 5 min (mezclándola)4.3 Neutralizar con unos 5 m$ 1 M NaOH y retirar el sobrenadante4.4 Añadir 3 m$ agua oxigenada

Adicional


densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).Calcule la preparación de las soluciones [g/$ resp.ml/$].

2. Explique el funcionamiento del Mechero de Bunsen.3. Diferencie entre las estructuras 1a, 2a, 3a y 4a de proteínas y *las fuerzas que las estabilizan*.4. Explique como 3 *otros* factores favorecen a la desnaturalización de las enzimas.

!- 14 -

Bibliografía1. Dechemax-Schülerwettbewerb (2015): Enzyme - Katalysatoren des Lebens. Dechema.

https://dechemax.de/dechemax_media/Bilder/Wettbewerbe_Archiv/Wettbewerb+2014/enzyme_musterlösung-p-1560.pdf

2. Science Buddies (2012): The Liver: Helping Enzymes help You. Scientific American.https://www.scientificamerican.com/article/bring-science-home-liver-helping-enzymes/


Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalEn el manejo del hígado, no se requiere medidas de seguridad especiales. Durante el corte del hígadocon las tijeras no se debe cortar sus dedos. Al hervir las muestras, la boca de los tubos debe estardirigida al contrario de cualquier persona por si el burbujeo al hervir es fuerte. Para evitar que sederrame el líquido en el tubo al hervir, se recomienda que el tubo tenga 3/4 partes de espacio libre.El HCl provoca quemaduras e irrita las vías respiratorias puesto que es una sustancia muy corrosivay se tiene que usar guantes de caucho nitrilo. En caso de perdida del conocimiento nunca dar a beberni provocar el vomito. Si se inhala, trasladar a la persona al aire libre. Si se tiene contacto con la piellavar abundantemente con agua. Quitar ropa contaminada. En caso de contacto con los ojos, lavarabundantemente con agua manteniendo los parpados abiertos. Si se llega a ingerir, beber abundanteagua. Evitar el vómito. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.NaOH es corrosivo y se debe usar guantes de caucho butílico. En caso de derrame neutralice concarbonato hidrogenado, para situaciones en las que entre en contacto con piel y ojos enjuagar conabundante agua y llamar al servicio médico de emergencias.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosEn este caso la neutralización del HCl se realiza con 1 M NaOH. Una vez neutralizado los desechosse pueden tirar al desagüe. Si existen residuos de hígado, se depositan en una bolsa de plástico, secierra bien y se tira en la basura.

!- 15 -

Práctica No. 3Cinética enzimática

Tipo de práctica: Grupal Tiempo de duración: 2 h

ObjetivoAprender el funcionamiento y la influencia en la velocidad de reacción de las enzimas, que tienenuna posición central en el metabolismo de los seres vivos.

IntroducciónLas enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizanlos procesos fisiológicos, producidos por los organismos vivos. En los sistemas biológicosconstituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales.La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por losvegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están dotados delas enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las delmetabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, ladivisión celular, la reproducción, etc., están regidas por la actividad de innumerables enzimasresponsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sinliberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, entreotras, prácticamente constante.Las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción osolo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcada que en general actúanexclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa.


por assayCelda de cuarzo 1Micropipeta de 100 µl y puntas 2 / grp

PBS, 100 mM, pH 7,4: Na2HPO4 * 2 H2O: 13,78 g/l NaH2PO4 * 2 H2O: 3,52 g/l

2,0 m$

Micropipeta de 1000 µl y puntas 2 / grp 0,13 mM Na-NAD+ in PBS 1,7 m$Contenedor para basura 2 / grp 25 mM Na-Lactate in PBS 0,2 m$

Equipo1% BSA (Bovine Serum Albumin) in PBS

Espectrofotómetro 2 / grp 0,50 unit/ml LDH in BSA 0,1 m$

!- 16 -

Método1. Pipetar según el siguiente esquema en la celda:

- 850 µ$ NAD+ soln- 50 µ$ LDH- Mezclar (tapar celda con plástico para mezclarla)

2. Determinar E0 (340 nm): blanco (auto cero)- 100 µ$ Sustrato (diferentes concentraciones según la Tabla 1)

3. Mezclar rápido (tapar celda con plástico para mezclarla)4. Determinar ∆E340 por 1-2 min cada 10 s5. Después por 3-4 min cada 15 s (o hasta que no haya más ∆E340 significativo)6. Cada concentración se determina por duplicado (entre todo el grupo)

Tabla 1. Preparación de la soln. sustrato y mediciones de las diferentes concentraciones de lactatoNo. Equipo Vol Lactato

[µ$$$$]Vol H2O

[µ$$$$]conc. Lactato

[mM]v0 [∆E/min]

0 0 100 1 10 902 20 803 30 704 40 605 50 506 60 407 70 308 80 209 90 10

10 100 0- Calcule v0 para cada concentración (PR grupal!)- Dibuje la cinética enzimática según Michaelis Menten y estime el KM para Lactato y vmax.

Adicional


densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla). Calculela preparación de las soluciones [mg/ml o µg/ml]. Anote el coeficiente de extinción de NADH.

2. Explique el significado del KM en la equación de Michaelis-Menten.3. Compare los valores estimadas con valores de la literatura.4. ¿Cómo puede la enzima bajar la entalpía (energía) de activación?

!- 17 -

BibliografíaBergmeyer, H.U., and Bernt, E., (1974) In Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer, H.U., 2nd

ed.; Academic Press: New York, NY, Volume II, 574-579


Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLos reactivos utilizados en esta práctica no son tóxicos.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos líquidos se pueden tirar al desagüe.

!- 18 -

Práctica 3 - alternaSi por el Departamento no se ha comprado los reactivos necesarios para llevar a cabo la práctica

como debe ser, hay esta alternativa...


Celda de plástico 2 1 m$Micropipeta de 100 µl y puntas 2 / grp

Saliva (ayuno: estudiante no debecomer por lo menos 4 h antes)

Micropipeta de 1000 µl y puntas 2 / grp Lugol 1 m$Contenedor para basura 2 / grp Agua (potable) o PBS

Solución de almidón (1 %) 1 m$Equipo por GrupoEspectrofotómetro 2

Método1. Recolectar suficiente saliva (1 estudiante en ayuno por equipo).

La saliva debe ser líquida y sin espuma.2. Pipetar según el siguiente esquema en un tubo de ensayo:

- 700 µ$ Agua o PBS- 100 µ$ Lugol- 100 µ$ sustrato (véase Tabla 1) directamente en la celda

3. Determinar E0 (660 nm) blanco contra A. dest.- 100 µ$ Saliva

4. Mezclar rápido5. Determinar ∆E660 por 5 min cada 30 s6. Después por 10 min cada 60 s (o hasta que no haya más ∆E660 significativo)7. Cada concentración se determina por duplicado

ResultadosGrafique ∆E/t vs t para cada concentración de sustrato determinada.Calcule la velocidad inicial de la reacción para cada concentración de sustrato.

!- 19 -

Tabla 1. Preparación solución sustrato a diferentes concentracionesNo. Equipo Vol alm.

[µ$$$$]Vol H2O

[µ$$$$]conc. almidón

[mg/m$$$$]v0 [∆E/min]

1 0 1002 10 903 20 804 35 655 50 506 75 257 100 0

Adicional


densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).Calcule la preparación de las soluciones.

2. Explique el significado del KM en la equación de Michaelis-Menten.3. ¿Cómo puede la enzima bajar la entalpía (energía) de activación?

Bibliografía1. Hohmann, K. (2008): Hydrolyse von Stärke mit Speichel. Organisches Grundpraktikum.

Universität Marburg. https://www.chids.de/dachs/praktikumsprotokolle/PP0089Hydrolyse_Staerke.pdf


Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLa concentración de yodo utilizada en esta práctica es similar a utilizada para desinfectantes. Por lotanto las soluciones en esta práctica no son tóxicas. Sin embargo, se recomienda utilizar guantes paraevitar colorear la piel por el yodo.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosLos desechos líquidos se pueden tirar al desagüe.

!- 20 -

iPráctica No. 4Cinética enzimática II

Tipo de práctica: Individual Tiempo de duración: 2 h

ObjetivoAprender de calcular KM según Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y CornishBowden-Eisenthal.

IntroducciónLa ventaja del Michaelis-Menten plot - es muy ilustrativo - es al mismo tiempo su mayor desventaja:no se puede determinar exactamente la velocidad maximal (vmax) y por ende no se puede calcular laKM, la afinidad de la enzima a su sustrato.Por eso otros investigadores transformaron la ecuación de Michaelis-Menten para lograr sulinealización con el fin de calcular así las constantes características de la enzima, su velocidadmaximal (vmax) y su afinidad al sustrato (KM). Igualmente, cada transformación tiene sus ventajas ydesventajas. A parte de la ecuación original, las transformaciones más comunes son los siguientes:

Michaelis Menten:

v = vmax * [S] / (KM - [S])

Lineweaver-Burk:

1 / v = KM / vmax * 1/[S] + 1 / vmax

!- 21 -

Eadie-Hofstee:

v = -KM * v / [S] + vmax

Hanes-Wilkinson = Hanes-Woolf:

[S] / v = 1 / vmax * [S] + KM / vmax

Cornish Bowden-Eisenthal:

Dibujar: vn vs. -[S]n

vmax = (v / [S]) * KM + v

MaterialOrdenador y el programa Excel. Es importante tener los datos crudos ya en una tabla al inicio de lapráctica.

MétodoCalcular en/con el programa Excel los datos necesarios para las gráficas y regresiones lineales deMichaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y Cornish Bowden-Eisenthal.

!- 22 -

ResultadosDibuje las gráficas de Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y

Cornish Bowden-Eisenthal y representa los datos graficados en una tabla para la reacción de lapráctica 3. Indique también la ecuación para cada gráfica.

Calcule según Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Hanes-Wilkinson y CornishBowden-Eisenthal los valores vmax y KM para la reacción de la práctica 3; indique, cómo secalcula estos valores.

AdicionalTraducciones de Excel

ES EN DECelda Cell ZelleFila Row ZeileColumna Column Spalte

Pronostico Forecast SchätzerPendiente Slope SteigungEstimacion.lineal Linest RGP

Suma Sum SummePromedio Average MittelwertDesvest Stdev StabwRaiz Sqrt WurzelContar Count Anzahl

eje x (abscisa) x-axis (abscissa) x-Achse (Abszisse)eje y (ordenada) y-axis (ordinate) y-Achse (Ordinate)intersección intersection Schnittpunkt

Cuestionario1. Compare tus resultados con valores de la literatura. ¿Cuál transformación dió el mejor resultado?2. Discute "los pros" y "las contras" de cada transformación.3. ¿Qué es la diferencia entre Standard-Deviation (SD) y Standard Error of Mean (SEM)?


!- 23 -

Práctica No. 5Azúcares reductores


ObjetivoFamiliarizarse con las propiedades químicas de los azúcares determinando los azúcares reductorespor la reacción de Fehling.

IntroducciónLos azúcares reductores pueden, en determinadas condiciones, reducir a las sales cúpricas.Típicamente se dice, que el ensayo de Fehling se funda en el poder reductor del grupo aldehído. Éstese oxida al ácido carboxílico y al mismo tiempo se reduce la sal de cobre (II) al óxido de cobre (I),que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es, que se puededetectar la forma aldehído fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Al azúcar, que reducela solución de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice azúcar reductor.

MaterialFehling I: 0,27 M CuSO4 * 5 H2O en Aqua destillata (A. dest.)Fehling II: 1,205 M Na-K-tartrato * 4 H2O (sal de Seignette) + 2,5 M NaOH en A. dest. #

Material Cantidad Reactivos CantidadPipetas (2 ml), perilla 3 Reactivo de Fehling I 9 m$Tubos de ensayo de 15 m$ 6 Reactivo de Fehling II # 9 m$Gradilla 1 Soln. glucosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$

Soln. fructosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$Equipo Soln. sacarosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$Baño María (60 ºC) 2 / grp Soln. lactosa (1,0 %) - gotero 0,5 m$Vortex 2 / grp Soln. almidón (1,0 %) - gotero 0,5 m$Termómetro 1 / grp A. dest. - gotero 0,5 m$

Método1. Poner 1,5 m$ de reactivo Fehling I en un tubo de ensayo2. Añadir 1,5 m$ de reactivo Fehling II y mezclarlo (vortex)3. Añadir 5 gotas de muestra y mezclarlo (vortex)4. Calentar el tubo en el Baño María (60 °C) y documentar un cambio de color a los tiempos

0 s; 15 s; 30 s; 60 s; 120 s; 300 sRepetirlo con cada muestra - i.e. secuencial, NO hay que trabajar las muestras en paralelo!

!- 24 -

Adicional


densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).Calcule la preparación de las soluciones [g/$].

2. Define "carbohidrato" y diferencie entre aldosa y cetosa.3. Explique anillo intramolecular, las proyecciones Fischer & Haworth y la mutarrotación.4. Describa reacciones de reducción y oxidación: alditol, ácido aldónico, ácido urónico, lactona,

ácido aldárico.

Bibliografía1. https://chemdemos.uoregon.edu/demos/Fehling-Test2. Kuhn I. (2006): Nachweis für reduzierende Zucker - Fehling Reaktion. Organisch Chemisches

Grundpraktikum. https://www.chids.de/dachs/praktikumsprotokolle/PP0060Fehling-Reaktion.pdf3. Fleischer H. (2017): Fehlinterpretation der Fehling-Probe auf reduzierende Zucker. Chemkon, vol.

24, p. 27-30


Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalEl CuSO4 puede producir irritaciones en ojos y piel en personas predispuestas. Láveseinmediatamente con agua abundante. Usar guantes y gafas de seguridad. Contamina al medioambiente por ser bioacumulativo y no es intrínsecamente biodegradable por lo que no se debe tirar alalcantarillado.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosTodos los desechos que contengan CuSO4 (como aquellos tubos que contengan el reactivo de FehlingI), se depositan al contenedor de sales de metales pesados.

!- 25 -

Práctica No. 6Fermentation


ObjetivoEntender la differencia en el rendimiento energético entre la respiración (aeróbica) y la fermentación(anaeróbica).

IntroducciónLa glucólisis es una ruta metabólica altamente conservada que se encuentra en todos los seres vivos.La función principal es proveer ATP a la célula; para lograrlo se requiere una reacción de oxidación(Gra-3-Pi-DH). Al mismo tiempo se reduce NAD+ a NADH, que se tiene que reoxidar para que lacélula pueda seguir con la glucólisis. La reoxidación del NADH puede occurir transferiendo loselectrones vía la cadena respiratoria finalmente a O2 (= aeróbico). Si no hay oxígeno (= anaeróbico)se puede reducir piruvato, el producto final de la glucólisis, para reoxidar el NADH; estas rutasmetabólicas son conocidas como fermentación. Levaduras descarboxilan piruvato a acetaldehído(Piruvato-Descarboxilasa), que se reduce a etanol (Alcohol-Deshidrogenasa).

MaterialMaterial Cantidad Equipo

Pipetas (1 m$; 5 m$) 2 + 2 1 / grpTubos de ensayo de 15 m$, estéril 2

Baño María (25 °C)o temperatura ambiente

Gradilla 1 Mechero Bunsen 1Micropipeta de 100 µl 2 / grpPuntas amarillas, estérilestapón de goma con 2 agujeros 1Tubo de vidrio doblado (Fig. 1) 1Tubo de vidrio con tubo de goma 1Clip para cerrar el tubo de goma 1

Reactivos CantidadYNB (6,7 g/$) medio con Glc (20 g/$) 6 m$Cultivo de levadura 1 m$Methylene blue (0,2 g/$) 0,2 m$Aceite comestible (trae estudiante) 1 m$Jarbón 2 gotasAgua

Fig. 1: Tubo de vidrio doblado, tubo corto y tapón degoma para tubos de ensayo de 15 m$ con 2agujeros

!- 26 -

Método 1. Transferir estéril 3 m$ medio YNB con Glc en 1 tubo

de ensayo 2. Transferir 0,5 m$ cultivo de levadura estéril en este

tubo de ensayo 3. Añadir 100 µ$ Methylen blue y mezclarlo 4. Colocar el tubo doblado y el tubo corto con su goma

en los agujeros del tapón de goma 5. Poner agua en el tubo doblado 6. Colocar este conjunto sobre el tubo de ensayo. Los

niveles de agua deben ser equilibrados 7. Cerrar el tubo de goma con un clip (Fig. 2) e incubar

el tubo a 25 °C 8. Tomar el tiempo y observar/documentar el nivel de

agua en el tubo doblado

9. Repetir pasos 1-3 con otro tubo de ensayo10. Añadir 1 ml de aceite sobre el cultivo11. Seguir con el paso 6 tomando el conjunto del otro

tubo Fig. 2: Tubo de ensayo con medio, levaduras,methylene blue y una capa de aceite. Por laformación de gas cambió el nivel del agua en eltubo doblado (manómetro)

Discute el cambio de color en el cultivo y el tiempo en que los niveles de agua cambian,dependiendo de las condiciones de incubación.

Adicional


densidad [g/cm3], estado físico a 25 ºC y solubilidad [g/l] de los reactivos utilizados (tabla).Describe la composición de Yeast Nitrogen Broth (YNB).

2. Diferencia entre respiración aeróbica, respiración anaeróbica y fermentación.3. Compare el redimiento energético entre respiración (aeróbica) y fermentación (alcohólica).4. ¿Qué resultado esperarías si se hubiese usado miocitos humanos en vez de levaduras? ¿Cómo

variaría el experimento si la fuente de carbono en vez de glucosa hubiese sido a) piruvato, b)acetato o c) succinato?

!- 27 -

Bibliografía1. Measurement of anaerobic respiration in yeast. Supporting practical science & technology.

Cleapss, GL 98 MP 12/09, 2009


Medidas de Seguridad y Salud OcupacionalLos medios de crecimiento son son nocivos.Methylene blue: Nocivo en caso de ingestión. En caso de ingestión lavar la boca con agua e ingeriragua y pedir asistencia médica. Para su manipulasión usar guantes de nitrilo; en caso de contacto conla piel, ojos o boca lavar con abundante agua, en caso de inhalación respirar aire fresco. En caso deque persista el malestar, pedir atención médica. Methylene blue en agua (0,05%) no es consideradonocivo.

Disposición de Desechos Físicos, Químicos y BiológicosTodos los desechos que contengan levaduras hay que esterilizar acorde el método aplicable deslaboratorio (p.ej. autoclavar).

!- 28 -

Práctica 6 - alternaSi por el Departamento no se ha comprado los reactivos necesarios para llevar a cabo la práctica

como debe ser, se cancelará esta práctica.

universidad de guadalajararadio.cuci.udg.mx/bch/pdf/pr_bch1_v5.2s.pdf · internet como el...

Documents