universidad de guayaquil facultad de ciencias...

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA:

Evaluación de los parámetros farmacognósticos y la capacidad

antioxidante de las semillas de toronja blanca

(Citrus paradisi Macfad)

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA

OPTAR POR EL GRADO DE QUíMICAS Y FARMACÉUTICAS

AUTORES:

Mayra Alejandra Moncerrate Barberán.

Madelyne Andrea Zuñiga Baque.

TUTOR:

PhD. Adonis Bello Alarcón

CO-TUTORA:

PhD. Meribary M. Monsalve P

GUAYAQUIL – ECUADOR

2018

i

DEDICATORIA

Al diseñador y creador de todas las cosas, el que nos ha dado fuerzas para

avanzar cuando hemos estado a punto de rendirnos, es por eso que con toda la

humildad que de nuestro corazón puede liberar; dedicamos en primer lugar

nuestro trabajo a Dios.

De igual manera, dedicamos esta tesis a nuestros padres que nos han

inculcado buenos valores y principios, ayudándonos a formarnos en la vida. A

nuestros hermanos que han estado junto a nosotras brindándonos su apoyo. A

nuestra familia en general porque siempre han estado apoyándonos en todo

momento, dándonos ánimos de no dar marcha atrás.

A nuestros amigos: Mayra Villavicencio, Karen Alcívar, Edison Noboa y Jean

Carlos Sancán, que gracias al equipo que hacemos nos hemos mantenido juntos

en toda esta travesía apoyándonos unos a otros.

Y, por último; pero no menos importante, a nuestro tutor el PhD. Adonis Bello

Alarcón y Co-Tutora PhD. Meribary Monsalve P, por sus valiosos conocimientos

y orientación en la realización del estudio.

Madelyne Zuñiga y Mayra Moncerrate

ii

INDICE GENERAL

INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................... 3

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................ 3

OBJETIVOS ........................................................................................... 4

Objetivo general ................................................................................. 4

Objetivos específicos .......................................................................... 4

HIPÓTESIS ............................................................................................ 4

Variables ................................................................................................ 5

Operacionalización de las variables .................................................... 5

CAPITULO I. MARCO TEÓRICO .......................................................... 7

I.1. Citrus ............................................................................................ 7

I.2. Citrus paradisi Macfad. ................................................................. 8

I.2.1. Descripción botánica. ............................................................. 8

I.2.3 Clasificación Taxonómica. ....................................................... 9

I.2.4. Clasificación de variedad de la toronja ................................... 9

1.3. Usos .......................................................................................... 11

I.4. Composición química ................................................................. 11

I.4.1 Flavonoides ........................................................................... 12

I.4.2. Ácidos orgánicos y azúcares ................................................ 13

I.4.3. Ácidos grasos....................................................................... 13

I.4.4. Vitaminas. ............................................................................ 14

I.4.5. Minerales ............................................................................. 15

I.5. Actividad biológica. ..................................................................... 16

I.5.1. Antioxidante ......................................................................... 16

iii

I.5.2. Antimicrobiano ..................................................................... 16

I.5.3. Anticancerígeno ................................................................... 17

I.6. Métodos de determinación de la capacidad antioxidante ........... 17

I.7 Análisis de aceites fijos ................................................................ 18

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS......................................... 20

II.1. Tipo de investigación ................................................................. 20

II.2. Lugar y pruebas de ensayo ....................................................... 20

II.3. Factores de estudio ................................................................... 20

II.4. Extracción de semillas .............................................................. 21

II.5. Identificación macromorfológica ................................................. 21

II.6. Análisis físico - químico de la semilla ......................................... 21

II.6.1. Determinación de Humedad ............................................... 21

II.6.2. Determinación de Cenizas .................................................. 22

II.6.3. Determinación de Fibras ..................................................... 24

II.6.4. Determinación de Nitrógeno total y Proteínas ..................... 25

II.7. Extracción Soxhlet ..................................................................... 25

II.8. Desgomado ............................................................................... 26

II.9. Análisis físico- químico del aceite. ............................................. 26

II.9.1 Densidad relativa ................................................................. 26

II.9.2. Índice de refracción ............................................................. 27

II.9.3. Índice de yodo (método de Hanus) ...................................... 27

II.9.4. Determinación de la acidez ................................................. 28

II.9.5. Índice de saponificación (índice de Koettstorfer) ................. 29

II.9.6. Determinación de materia insaponificable ........................... 29

II.10. Perfil lipídico ............................................................................ 30

iv

II.11. Determinación de la Capacidad antioxidante “in vitro” por el

método de DPPH .............................................................................. 31

III. 1. Interpretación de Resultados de semilla .................................. 32

III.1.1 Determinaciones macroscópicas ......................................... 32

III.1.2. Estudio Farmacognóstico en la semilla de Citrus paradisi. . 33

III.2 Extracción de aceite fijo de la especie Citrus paradisi Macfad. .. 37

III.3 Caracterización Fisicoquímica del Aceite Fijo. ........................... 38

III.3. Perfil lipídico ............................................................................. 40

ANEXOS .............................................................................................. 55

v

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Variables dependientes e independientes. ............................................. 5

Tabla II. Operacionalización de variables. ........................................................... 6

Tabla III. Descripción taxonómica ....................................................................... 9

Tabla IV. Variedad de la toronja ........................................................................ 10

Tabla VII. Parámetros físico- químicos usados en aceites nuevos. ................... 19

Tabla VIII. Dimensiones de semillas Citrus paradisi Macfad. ............................. 32

Tabla IX. Resultados del ensayo de humedad realizado a las semillas. ............ 33

Tabla X. Porcentaje de cenizas de las semillas. ................................................ 34

Tabla XI. Porcentaje de fibra en semillas de toronja blanca. ............................. 35

Tabla XII. Resultados de nitrógeno total y proteínas de semillas de toronja. ..... 36

Tabla XIII. Rendimiento de extracción por Soxhlet de los aceites fijos.. ............ 37

Tabla XVI. Composición de ácidos grasos en porcentaje del aceite de semilla de

toronja blanca. ................................................................................................... 41

Tabla XVII. Absorbancias de ácido gálico (solución estándar) a 515 nm ........... 43

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de flavonoides presentes en las semillas .......................... 12

Figura 2. Cromatograma de los compuestos grasos del aceite de las semillas de

toronja ............................................................................................................... 41

Figura 3. Curva de calibración de ácido gálico. ................................................. 43

Figura 4. Muestras interpolarizadas en la curva de calibración de ácido gálico . 44

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1. Parámetros realizados a las semillas .............................................. 55

ANEXO 2. Análisis físico- químico de las semillas ............................................. 56

ANEXO 3. Resultados de análisis de nitrógeno- proteína de nuez y cascarilla . 56

ANEXO 4. Caracterización fisicoquímica del aceite de nuez y cascarilla. .......... 56

ANEXO 5. Capacidad antioxidante .................................................................... 56

ANEXO 6. Esquema general del estudio de las semillas C. paradisi Macfad. .... 56

vii

RESUMEN

El presente trabajo tiene como objetivo evaluar los parámetros

farmacognósticos y la capacidad antioxidante in vitro de las semillas de la toronja

blanca (Citrus paradisi Macfad). Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de

Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas. Las semillas se

secaron en estufa y fueron separadas manualmente en episperma (cascarilla) y

endosperma (nuez). Los resultados de los análisis farmacognósticos obtenidos

fueron: cenizas totales (3.16% nuez, 2.03% cascarilla), cenizas insolubles en agua

(1.60% nuez, 1.36% cascarilla), cenizas insolubles en ácido (1.19% nuez, 0.22%

cascarilla), humedad residual (0.11% nuez, 7.53% cascarilla), nitrógeno total

(2.72% nuez, 1.20% cascarilla), fibra (22.99% nuez, 39.47% cascarilla), proteína

(16.99% nuez, 1.60% cascarilla). En la extracción del aceite se obtuvo un

rendimiento promedio de 72,5% (nuez) y 4,9% (cascarilla). La caracterización

físico-química del aceite mostró diferencias entre las partes estudiadas: densidad

relativa (0.9067 g/mL nuez, 0.7992 g/mL cascarilla), índice de refracción (1.4566

nuez, 1.4732 cascarilla), pérdida por calentamiento (4.43% nuez, 1.37%

cascarilla), índice de acidez (0.5% nuez, 3.6% cascarilla), índice de yodo (22.0

mg/100g aceite de nuez, 50.4 mg/100g aceite de cascarilla), índice de

saponificación (255.1 mg NaOH/g nuez, 280.3 mg NaOH/g cascarilla), materia

insaponificable (2.60% nuez, 4.42% cascarilla). El análisis por GC-MS del aceite

de la semilla mostró un 67.36% de ácidos grasos insaturados siendo el ácido

linoleico (39.11%) el más abundante. La actividad antioxidante in vitro, por DPPH,

de los extractos alcohólicos mostró un resultado equivalente a 0.95 (cascarilla) y

0.14 (nuez), mg de ácido gálico/g de semilla.

Palabras clave: Citrus paradisi, aceite de semilla, GC-MS, ácidos grasos,

DPPH.

viii

ABSTRACT

The present work has the objective to evaluate the pharmacognostic

parameters and the in vitro antioxidant capacity of white grapefruit seeds (Citrus

paradisi Macfad). The assays were performed at the Laboratory of Natural

Products of the Faculty of Chemical Sciences. The seeds were dried in an oven

and were separated manually in episperm (husk) and endosperm (nut). The results

of the pharmacognostic analyzes obtained were: total ashes (3.16% nut, 2.03%

husk), insoluble ashes in water (1.60% nut, 1.36% husk), ashes insoluble in acid

(1.19% nut, 0. 22% husk), residual moisture (0.11% nut, 7.53% husk), total

nitrogen (2.72% nut, 1.20% husk), fiber (22.99% nut, 39.47% husk), protein

(16.99% nut, 1.60% husk). In the extraction of the oil it was obtained an average

yield of 72.5% (nut) and 4.9% (husk). The physicochemical oil characterization

showed differences between the parts studied: relative density (0.9067 g/mL nut,

0.7992 g/mL husk), refractive index (1.4566 nut, 1.4732 husk), loss by heating

(4.43% nut, 1.37% husk), index of acidity (0.5% nut, 3.6% husk), iodine index (22.0

mg/100g oil of nut, 50.4 mg/100g oil of husk), index of saponification (255.1 mg

NaOH/g nut, 280.3 mg NaOH/g husk), unsaponifiable material (2.60% nut, 4.42%

husk). The GC-MS analysis of the seed oil showed a 67.36% of unsaturated fatty

acids being linoleic acid (39.11%) the most abundant. The antioxidant activity in

vitro, by DPPH, of the alcoholic extracts showed an equivalent result to 0.95 (husk)

and 0.14 (nut), mg of gallic acid/g of seed.

Keywords: Citrus paradisi, seed oil, GC-MS, fatty acids, DPPH.

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LISTADO DE ABREVIATURA

g gramo

mg miligramos

μg microgramos

L Litro

μL microlitros

mL mililitros

μm micrómetros

mm milímetros

nm nanómetros

ºC grado Celsius

cm centímetro

N normalidad

KOH Hidróxido de Potasio

NaOH Hidróxido de Sodio

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización

CG-MS Cromatografía de gases acoplado con Espectrofotómetro de masas.

1

INTRODUCCIÓN

Los cítricos son las plantas más conocidas dentro de la familia botánica de las

Rutaceae, de la cual forma parte el fruto Citrus paradisi Macfad también conocida

como grapefruit por su vocablo inglés o como pomelo en español. Los árboles de

esta familia son perennifolio altos, su fruto es un hesperidio de 8 a 15 cm de

diámetro con pulpa sutilmente amarga por la presencia de glucósidos; cuyas

características las diferencian de la naranja (Citrus sinensis) al ser más redonda,

con cáscara de aspecto color amarillo claro (Morales et al., 2002; Celestino,1998).

En la industria alimentaria la pulpa de esta fruta es muy utilizada para la

preparación de jugos, que gozan de amplia demanda nacional e internacional. De

la cáscara se extrae esencias que son muy cotizadas por la industria cosmética y

la pectina que es muy usada como aditivo por sus propiedades espesantes,

emulsificantes, estabilizantes al momento de preparar gelatinas y mermeladas. De

este proceso únicamente las semillas quedan como desecho, pudiendo estas

también ser aprovechadas y brindar una ayuda socioeconómica (Escobedo,

2013).

Por otro lado, los aceites vegetales obtenidos de semillas tienen amplias

aplicaciones tanto industriales como para el consumo humano. En la actualidad

se están realizando extensas investigaciones en estos productos debido a sus

altos contenidos en ácidos grasos insaturados, omegas, y a la rica y diversa

composición química de la fracción de sustancias insaponificables con muchas

actividades biológicas (Etong, Mustapha & Taleat , 2014).

Los aceites fijos son compuestos insolubles en agua y solubles en disolventes

orgánicos debido a que están formados principalmente por mezcla de ácidos

2

grasos unidos mediante enlace covalente a moléculas de glicerol. Estos aceites

se encuentran principalmente en las semillas de los frutos. La evaluación de los

parámetros farmacognósticos junto con las propiedades físico químicas del aceite

extraído de las semillas serán útiles para identificar la calidad del aceite y las

fuentes de ácidos grasos saturados e insaturados que determinará su papel en el

funcionamiento fisiológico (Etong et al., 2014).

Los ácidos grasos forman parte de los principales componentes de los lípidos

y son la fuente de energía necesaria para la nutrición humana debido a que su

función principal es de origen metabólico. Dentro de los ácidos grasos insaturados,

el que más predomina en los aceites vegetales es el ácido linoleico, éste se

localiza por lo general en las grasas de la dieta, mientras que se encuentran

grandes concentraciones del ácido α-linolénico en algunas semillas y frutos secos

(FAO, 2012).

Los antioxidantes son compuestos que retardan o inhiben la oxidación de las

moléculas mediante la propagación de las reacciones de radicales libres; estos

pueden ser de dos categorías: sintéticos y naturales (Juárez y Gutiérrez, 2008).

Las industrias tienen en la actualidad gran interés en los antioxidantes

provenientes de productos naturales queriendo utilizarlos como nutraceúticos para

prevenir enfermedades. En los vegetales están presentes metabolitos secundarios

como los fenoles, estos constan en su estructura química de un anillo aromático

con grupos hidroxilos los cuales determinan la capacidad antioxidante (Lillo,

Carvajal, Nuñez, Balboa y Alvear, 2016). La mayoría de los cítricos se caracterizan

por su alto contenido en antioxidantes y su baja toxicidad, sobre todo en

flavonoides y presentan actividad antibacterial, antiviral, antitrombótica,

vasodilatador, entre otras (Ojito, Herrera, Vega y Portal, 2012).

Por lo anterior, la finalidad de este trabajo es determinar el potencial químico

que pudiera tener un desecho de la industria alimentaria nacional, en este caso,

las semillas de la toronja blanca (Citrus paradisi Macfad), y mediante evaluaciones

farmacognósticas y fitoquímicas establecer el potencial farmacognóstico y

antioxidante de los extractos etanólicos.

3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Ecuador, la producción nacional de Toronja va creciendo años tras años. A

su vez el aumento de la cosecha permite incrementar la preparación de jugos por

la industria alimentaria y la obtención de derivados a partir de la cáscara. Sin

embargo, no existen estudios que avalen el aprovechamiento de las semillas,

constituyéndose un material de desecho y en consecuencia un probable foco de

contaminación. Teniendo en cuenta lo anterior la presente investigación, se basa

en la evaluación de los parámetros farmacognósticos y la actividad antioxidante

“in vitro” de las semillas de Citrus paradisi Macfad.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

En el presente trabajo de investigación se plantea la siguiente interrogante:

¿Qué características farmacognósticas y actividad antioxidante tendrán las

semillas de toronja blanca (Citrus paradisi Macfad) cultivadas en el país?

4

OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar los parámetros farmacognósticos y la capacidad antioxidante “in

vitro” de las semillas de la toronja blanca (Citrus paradisi Macfad).

Objetivos específicos

Establecer los parámetros farmacognósticos de las semillas.

Analizar dos métodos de extracción y fraccionamiento para el estudio de

la composición química de las semillas.

Determinar las propiedades fisicoquímicas del aceite fijo obtenido de las

semillas.

Determinar la capacidad antioxidante “in vitro” de las semillas.

HIPÓTESIS

Las determinaciones de los parámetros farmacognósticos de las semillas de la

toronja blanca (Citrus paradisi Macfad) muestran una composición química rica en

moléculas que justifican la actividad antioxidante que presenta el extracto

hidroalcohólico.

5

VARIABLES

A partir de los objetivos específicos planificados para la investigación, se

analizaron las variables (Tabla I) que describen los principales resultados a

alcanzar.

Tabla I. Variables dependientes e independientes.

Dependiente Independiente

Calidad de la planta

Datos macromorfológico de la semilla.

Parámetros farmacognósticos de las semillas.

Calidad del aceite vegetal Parámetros físico-químicos del aceite.

Capacidad antioxidante Capcidad de inhibir el DPPH.

Fuente: Autores, 2018

Operacionalización de las variables

Mediante la operacionalización de las variables antes mencionadas (tabla I) se

pueden describir los indicadores y sus índices de medición. En la tabla II se

resume la información.

6

Tabla II. Operacionalización de variables.

Variables Conceptualización Indicadores Índice

Parámetros

farmacognósticos

de las semillas

Determinaciones que

permiten analizar la

calidad de una planta

al momento de su

estudio

Peso mg

Altura

cm

Anchura

Porcentajes de

humedad

%

Cenizas

Nitrógeno

Proteína

Fibra

Parámetros físico-

químicos del

aceite

Análisis químicos que

permiten evaluar la

calidad de un aceite

vegetal

Densidad g/mL

Índice de

refracción -

Yodo mg/100g

Insaponificación %

Acidez

mgKOH/g

Saponificación

Capacidad de

inhibir el DPPH

Propiedad de capturar

o reprimir radicales

libre

% de inhibición

de DPPH

Equivalente

mg de ácido

gálico/g

planta

Fuente: autores, 2018

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CAPITULO I. MARCO TEÓRICO

I.1. Citrus

El género Citrus de la familia Rutaceae, ha sido cultivado por más de cuatro mil

años, en los países europeos se hizo conocida a través de viajeros que fueron

cautivados por el aspecto de la fruta. Los cítricos son de gran importancia

económica en el mundo formando parte de la gran cantidad del producto frutal

mundial teniendo solo en el 2014 un aproximado de 7625,4 millones de toneladas

de cítricos comercializados, esto es equitativo a la cuarta parte de lo que se

produce en el ámbito frutal en el mundo (Zou, Xi, Hu, Nie, & Zhou, 2016; FAO,

2015)

Este género es bien conocido por sus valores nutricionales, debido a los

diversos estudios sobre las funciones biológicas de los compuestos fitoquímicos

presentes en los cítricos y sus productos derivados (Zou et al., 2016).

La naranja, siendo parte de este género tanto sus colores como el sabor son

características propias de las frutas en regiones subtropicales, al igual que las

mandarinas estas necesitan de un clima fresco para su producción. Por otro lado,

tenemos a las toronjas y las limas, las cuales se pueden desarrollar mejor en

climas cálidos al presentar resistencia a los climas fríos, estos factores no

favorecen su desarrollo llegando al punto de dañar la producción (Coello y Ramos,

2015).

8

I.2. Citrus paradisi Macfad.

Los pomelos o toronjas blancas se encuentran entre los cítricos más populares,

en la actualidad se ha encontrado que posee la capacidad de aumentar la

biodisponibilidad en cierto tipo de drogas. Este fruto contiene muchos nutrientes

que contribuyen a una dieta saludable, entre ellos azúcares, ácidos orgánicos y

compuestos fenólicos (Kelebek, 2010).

I.2.1. Descripción botánica.

C. paradisi Macfad es un árbol de pequeña a mediana estatura, sus hojas

presentan coloración verde, con aroma característico, un tronco robusto, de altura

de 15 a 20 pies, con copa extendida redondeada y de forma regular, la corteza se

divide en dos secciones la parte externa es lisa, de color pardo y la interior de color

amarillo claro, contando con ramas principales engrosadas bien distribuidas (Little,

Wadsworth, & Marrero, 1977).

Estos árboles presentan flores grandes, blancas, y hojas elípticas redondeadas

en ambos extremos, El peciolo tiene de ¼ a 1 pulgada de largo, y el ala de ¼ a ½

pulgada de ancho. Las flores son solitarias o pueden presentarse de 2 a 6 en

racimos laterales. El cáliz tiene forma de copa con 5 dientes irregulares, el fruto

tiene una cáscara color amarillo claro, el pellejo de los gajos es amargo, las

semillas numerosas de coloración blancuzcas, elípticas y puntiagudas (Little et al.,

1977).

La toronja se distingue entre las frutas cítricas por un fruto grande que recibe

el nombre de hesperidio, es una baya policarpelar, de forma redondeada de color

amarillo pálido en la madurez; la pulpa generalmente presenta coloración rosada,

de sabor dulce y amargo. Esta fruta presenta una maduración temprana y contiene

aproximadamente de 40 a 60 semillas por fruta, su pulpa es jugosa y consistente

(SNAP, 2017).

9

I.2.3 Clasificación Taxonómica.

La toronja o pomelo pertenece a la famila Rutacea, tal y como se expresa en la

Tabla III.

Tabla III. Descripción taxonómica

Clase Angiospermae

Subclase Dicotyledonae

Familia Rutaceae

Género Citrus

Especie paradisi Macfad

Nombre Científico Citrus paradisi

Nombre vulgar Pomelo

Fuente: (Little et al., 1977)

I.2.4. Clasificación de variedad de la toronja

La toronja se caracteriza por dos variedades en general: toronja amarilla y

toronja rosada; aunque por su corteza, cantidad de semillas y otras características

se pueden encontrar una mayor variedad descritas en la tabla IV (Cruz, 2007).

10

Tabla IV. Variedad de la toronja

Tipo Descripción botánica

Duncan

Frutos ovalados con 12,5 cm de diámetro.

Piel de color amarillo.

De olor muy fuerte.

La pulpa contiene muchas semillas (50-70).

Marsh

Frutos más redondeados.

Piel lisa y aromática.

Pulpa amarilla y con pocas semillas (0-6).

Oro blanco

Híbrido de Citrus máxima y Citrus paradisi.

Piel amarillo pálido y gruesa.

La pulpa es de color amarilla pálida y poco ácida.

Pink Marsh

Mutación de la variedad "Marsh”.

Su fruto es mediano.

Piel color amarilla y no tiene mucho aroma.

No contiene muchas semillas.

Rio Star/ Rio Red

Se caracteriza por la coloración rojiza.

El color rojizo de sus frutos son tres veces más

intenso que el Star Ruby.

Sweety

Híbrido del pomelo y la toronja.

Pulpa poco ácida.

Triumph

Fruto ovalado.

Piel muy lisa y de color amarillo.

La pulpa es amarilla y contiene muchas semillas.

Fuente: (Celestino et al., 1998)

11

1.3. Usos

La toronja, se puede utilizar para formular diferentes productos cosméticos,

teniendo como propósito el tratamiento del acné y tonificación de la epidermis

enrojecida (Giamperi, Fraternale, Bucchini, & Ricci, 2004).

Las cáscaras de cítricos son industrializadas en la elaboración de subproductos

como alimento para el ganado, melazas, etanol, fibra y para la extracción de

bioactivos (flavonoides, aceites esenciales, d-limoneno) (Ajikumaran, Rajani,

Akhila, & Sabulal, 2017).

Tanto la fruta y la hoja de esta especie cítrica se usa tradicionalmente para

aplicaciones contra el cáncer en India y otros países. La cáscara de la fruta se

utiliza como un remedio para el tratamiento en la indigestión, bronquitis y el asma

en medicina tradicional China (Ajikumaran et al., 2017).

I.4. Composición química

Los frutos cítricos son una buena fuente de antioxidantes; más de 170 han sido

reportados en investigaciones, incluyendo en su composición vitaminas B1 y

vitamina C, proteínas, sales minerales, azúcares, ácido oxálico, ácido tartárico,

compuestos fenólicos, terpenoides y pectina, mientras que el jugo proveniente de

la misma contiene ácido málico, furanocumarinas y limonoides. También se

conoce que los cítricos al ser una fuente abundante de ácido ascórbico se usa

para contrarrestar el escorbuto (Azuma et al., 1998; Esmaeili et al., 2012; Giamperi

et al., 2004; Taddeo, Epifano, Fiorito, & Genovese, 2015; Zou et al., 2016).

12

I.4.1 Flavonoides

En los cítricos los flavonoides actúan para disminuir el riesgo de desarrollo de

enfermedades degenerativas como cáncer, diabetes, enfermedades

cardiovasculares y neurológicas. De acuerdo con sus estructuras moleculares,

son divididos en seis clases: flavonas, flavanonas, flavonoles, isoflavonas,

antocianidinas y flavonoides o catequinas. Las flavanonas cítricas están presentes

en el glucósido, las naringenina y hesperetina son las flavanonas más importantes,

las cáscaras poseen más flavonoides que las semillas. Giamperi y colaboradores

(2004) reportaron en su estudio de las semillas de Citrus paradisi en extracto

glicérico, la composición de algunos flavonoides como se muestra en la Figura 1

(Giamperi et al., 2004; Tripoli, Guardia, Giammanco, Majo, & Giammanco, 2007).

O

O

O

O

O HO H

HOH 3C

HOHO

O H

O

OO H

O

O

O

O

O HO H

HOH 3C

HOHO

O H

O

OO H

O

O

O

O HHO

HO O

OO H

O

HO

HO

O HHO

O

OO H

HO

O H

O H

O H

naringina hesperidina

poncirinaquercetina

Figura 1. Estructura de flavonoides presentes en las semillas

C. paradisi

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I.4.2. Ácidos orgánicos y azúcares

Los azúcares son los principales componentes de los sólidos solubles en jugo

de cítricos lo que aporta la dulzura en ellos. La sacarosa en el jugo de toronja está

presente en cantidades más grandes. Los ácidos ácidos orgánicos de la toronja

blanca son el cítrico y málico (Kelebek, 2010).

I.4.3. Ácidos grasos

Los ácidos grasos tienen un gran aporte en el carácter de los glicéridos. Se

encuentra mayoritariamente en la naturaleza, son compuestos alifáticos

monobásico que se compone de un solo grupo carboxilo ubicado en el extremo

de una cadena carbonada (Bailey, 2001).

I.4.3.1 Ácidos grasos saturados

Los ácidos grasos saturados a diferencia de los insaturados no tienen doble

enlace en su cadena carbonada, impidiendo que otras moléculas de hidrógeno se

unan. Ejemplo: ácido palmítico, ácido esteárico (Cantor, 2009).

I.4.3.2 Ácidos grasos insaturados

Los ácidos grasos insaturados tienen como mínimo un enlace doble en su

cadena. La de mayor uso es aquella cuyo primer doble enlace se ubica en el

primer carbono de la cadena denominándose omega. Existen tres tipos de

omegas: omega-9 (ácido oleico), presentes en grasas vegetales y animales; los

omega-6 (ácido linoleico) en los aceites vegetales y los omega-3 (ácido linolénico)

hallados en los aceites marinos y aceites vegetales como se puede observar en

la Tabla V (Nasiff-Hadad y Meriño-Ibarra, 2003).

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Tabla V. Ácidos grasos en vegetales

Ácido graso Fuente Contenido %

Láurico Coco 44-52

Palmíste 46-52

Palmítico Palma 32-47

Oléico

Oliva 65-86

Maní 42-72

Sésamo 34-45

Maíz 34-62

Linoleico

Soya 52-62

Algodón 40-55

Maíz 34-62

Girasol 58-67

Cártamo 78

Lino 30-60

Fuente: (Cantor, 2009)

I.4.4. Vitaminas.

Las vitaminas, son sustancias orgánicas indispensables para nuestra vida,

dado que el funcionamiento del organismo humano depende en gran parte de

ellas. Existen trece vitaminas de las cuales seis están presentes en los cítricos

(vitamina B1, B2, B3, A, C, y E). Estas tres últimas, aportan con actividades

antioxidantes (Zou et al., 2016).

15

I.4.4.1. Vitamina A

La vitamina A, también se la denomina β-caroteno, es una vitamina que se

encuentra, por lo general, en frutos rojos. Se considera uno de los responsables

de la pigmentación amarilla rojiza de gran parte de los aceites (Cantor, 2009).

I.4.4.2 Vitamina C

La vitamina C o ácido ascórbico, es un eliminador natural de radicales libres,

debido a que destruye una gran variedad de ROS (especie de oxigeno reactivo)

(Zou et al., 2016).

I.4.4.3. Vitamina E

La vitamina E, se caracteriza por ser liposoluble, incluyendo entre su grupo de

compuestos químicos los tocoferoles y tocotrienoles. Esta vitamina, se encuentra

principalmente en las cáscaras y semillas de los cítricos; su función es la de

proteger las membranas celulares contra el daño provocado por peroxidación de

lípidos (Zou et al., 2016).

I.4.5. Minerales

Los minerales, son compuestos tomados del suelo por la planta para su

desarrollo; con la excepción de carbono, hidrógeno y oxígeno (CHO). Entre los 81

elementos químicos encontrados, 19 están presentes en plantas del género

Citrus; incluyendo: calcio (Ca). fósforo (P), magnesio (Mg), potasio (K), azufre (S),

sodio (Na), hierro (Fe), manganeso (Mn), níquel (Ni), boro (B), silicio (Si), cobre

(Cu), zinc (Zn), molibdeno (Mo), selenio (Se), cobalto (Co), cromo (Cr), germanio

(Ge) y arsénico (As) (Zou et al., 2016).

16

I.5. Actividad biológica.

Los extractos de plantas van aumentando el interés en la industria alimentaria

como aditivos naturales, debido a sus propiedades antioxidantes y

antimicrobianas para protegerlos de la oxidación y proliferación de

microorganismos. Los productos naturales, muchas veces son más caros que los

sintéticos, por lo que en la actualidad se está prestando especial atención a la

extracción de antioxidantes de fuentes económicas o residuales, como: cáscara y

semillas (Sayari et al., 2015).

I.5.1. Antioxidante

La capacidad antioxidante de los cítricos, en los últimos años, han aumentado

la atención de investigadores debido a sus funciones tanto en la prevención como

el tratamiento de diversos enfermedades crónicas y degenerativas. (Zou et al.,

2016).

Se han utilizado extractos de Citrus paradisi como fuente de antioxidante para

la estabilización de carnes y derivados. En la investigación de Sayari (2015) donde

comparó diversos extractos; el acuoso, fue el eliminador de radicales más fuerte

con un IC50 de 36 ± 1.5 μg mL-1. El IC50, es la concentración de inhibidor

requerida en el 50% de la capacidad antioxidante (Sayari et al., 2015).

I.5.2. Antimicrobiano

Los extractos de Citrus paradisi (acuoso, metanólico y acetato de etilo)

utilizados por Sayari (2015) presentaron actividad antibacteriana contra cepas de

E. coli, K. pneumonia, S. aureus y B. cereus. Sin inhibición fue detectado contra

P. aeruginosa y E. faecalis. Estos resultados del extracto C. paradisi son de gran

importancia, particularmente, en caso de B. cereus debido a su resistencia a una

17

serie de compuestos fitoquímicos y a su vez para la producción de varios tipos de

enterotoxinas que causan gastroenteritis (Sayari et al., 2015).

I.5.3. Anticancerígeno

Los perfiles químicos de aceites y extractos de cáscara de cítricos fueron

analizados por cromatografía de gas (GC-FID, GC-MS) y HPTLC,

respectivamente. Ajikumaran y colaboradores (2017) demostraton citotoxicidad en

el extracto de cáscara y aceite; para DLA células “in vitro” y, las células “in vitro”

preservaron a ratones sin ningún síntoma visible de toxicidad; se pueden consumir

como aditivos alimentarios para protegerlos del cáncer, especialmente del linfoma

(Ajikumaran et al., 2017).

I.6. Métodos de determinación de la capacidad antioxidante

Los antioxidantes de fuentes naturales, son fácilmente aceptados por los

consumidores considerándolos como seguros; estos antioxidantes neutralizan los

radicales libres que perjudican a nuestro cuerpo causando desde envejecimiento

hasta enfermedades asociadas con el estrés oxidativo (Sayari et al., 2015).

La capacidad antioxidante, indica la cabida de un compuesto bioactivo para

mantener la estructura y función de la célula, eliminando los radicales libres para

inhibir las reacciones de peroxidación lipídica y prevenir el daño oxidativo; siendo

la base de otras funciones biológicas como: antienvejecimiento, anticancerígeno,

antiinflamatorio (Zou et al., 2016).

Unos contribuyentes directos de la capacidad antioxidante de materiales

vegetales, son los compuestos fenólicos y los flavonoides dado que, actúan como

agentes donantes de electrones o hidrógeno gracias a su reactividad

manifiestando considerables actividades de eliminación de radicales libres y

18

propiedades de quelación de iones metálicos. La capacidad antioxidante, se mide

en términos de donación de hidrógeno o capacidad de eliminación de radicales,

utilizando el DPPH estable como reactivo (Sayari et al., 2015).

El método DPPH, es ampliamente utilizado para investigar las actividades de

captación de radicales libres de compuestos. El DPPH, es un radical libre estable

que muestra una absorbancia máxima a 517 nm. Cuando los radicales DPPH

encuentran un sustrato donador de protones como un antioxidante, son eliminado

y la absorbancia a 517 nm se reduciría, tomándose como una medida para la

actividad de eliminación de radicales (Barreca et al., 2013).

I.7 Análisis de aceites fijos

Es necesario que se realice un análisis sobre las propiedades físico- químicas

y organolépticas de aceites para saber la calidad de ellos, determinando de esta

forma si sus características cualitativas y sápido- aromáticas se mantienen

intactas, comenzando desde el cultivo hasta su elaboración y conservación,

pudiendo asi clasificar los aceites (Piñeiro, 2008).

La calidad de los aceites vegetales que se usan regularmente es evaluada

mediantes los parámetros descritos en la tabla VI, sin embargo cuando se

requiere introducir al comercio un aceite nuevo se implementan además de los

parámetros tradicionales, antes mencionados, otros como los que se presentan

en la tabla VII.

19

Tabla VI. Parámetros físico-químicos del aceite.

Parámetro Finalidad

Índice de acidez Indica la pureza y frescura del aceite

Control de rancidez Se realiza mediante pruebas organolépticas para ver la frescura del aceite.

Índice de peróxido Determina el estado de conservación del aceite

Determinación de esteroles Permite caracterizar la clase de aceite por la cantidad de esteroles encontrados en él.

Determinación de la composición de ácidos grasos.

Al igual que los esteroles, permite diferenciar un aceite de otro debido que hay ácidos grasos diferentes en la composición de cada uno.

Fuente: (Piñeiro, 2008).

Tabla V. Parámetros físico- químicos usados en aceites nuevos.

Contenido de estigmastirenos. Índice de refracción

Materia insaponificable Índice de yodo

Contenido de agua Índice de saponificación

Materias volátiles Trazas de disolventes halogenados

Fuente: (Piñeiro, 2008).

20

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. Tipo de investigación

Este estudio se basa en una investigación experimental, descriptiva y

explicativa sobre la posible actividad antioxidante in vitro de las semillas de Citrus

paradisi Macfad., además de ser una investigación cuantitativa y cualitativa para

sus metabolitos secundarios.

II.2. Lugar y pruebas de ensayo

La especie fue recolectada en la provincia de Manabí, cantón El Carmen. Los

estudios farmacognósticos y la capacidad antioxidante se realizó en el laboratorio

de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de

Guayaquil.

II.3. Factores de estudio

Los factores de estudio a realizar en esta investigación son:

Semillas de la fruta Citrus paradisi Macfad

Aceite de la cascarilla y la nuez de Citrus paradisi Macfad

Extracto etanólico de las semillas

21

II.4. Extracción de semillas

Se realizó un corte transversal de la fruta teniendo cuidado de no llegar al centro

con la finalidad de no estropiar las semillas, con la ayuda de un tamiz se recolecto

solamente las semillas sin la pulpa y fueron secadas en estufa VWR Scientific

1350 GM a 40ºC durante aproximadamente 2 días. Manualmente se separó la

episperma (cascarilla) del endosperma (nuez). Posteriormente en un mortero se

pulverizó la nuez hasta obtener partículas de menor tamaño y en un molino se

consiguió un polvo fino de la cascarilla, se envasó y conservó en un lugar fresco

libre de contaminación para su posterior estudio (Escobedo, 2013).

II.5. Identificación macromorfológica

La descripción macromorfológica de las semillas de la especie se realiza a

simple vista con una lupa, observando su forma, consistencia y color. Por otro lado

con 100 semillas y un vernier se realizó mediciones (largo y ancho); con los

valores obtenidos se calculó un promedio y desviación estándar.

II.6. Análisis físico - químico de las semillas

II.6.1. Determinación de Humedad

Se pesó una cápsula de porcelana limpia y seca, luego se agregaron 2 g de

muestra bien esparcida. Se colocó la cápsula con la muestra en la estufa VWR

Scientific 1350 GM a una temperatura de 130ºC durante 3 horas, al cabo de este

tiempo se retiró de la estufa y se enfrió en un desecador durante 30 minutos,

repitiendo el proceso por una hora hasta llegar a peso constante (ISO 771, 1977).

22

El resultado se expresa en porcentaje, utilizando la ecuación siguiente:

% 𝐻 = 𝑎 −𝑏

𝑝𝑥 100

Dónde:

a: peso del recipiente con la muestra húmeda. (g)

b: peso del recipiente con la muestra seca. (g)

p: peso de la muestra tomada fresca.

II.6.2. Determinación de Cenizas

II.6.2.1 Cenizas totales

Se pesó un crisol de porcelana en la balanza analítica 210/0.0001 Boeco,

agregando 2 g de muestra, sometiendolo a incineración en la mufla Veb Elektro

Bad Frankenhasen a una temperatura de 600ºC durante 5 horas o hasta que la

ceniza presentó una coloración blanco/crema. Luego se retiró el crisol de la mufla,

dejándolo enfriar en el desecador para posteriormente pesar el contenido de

cenizas (Honorato y Hernández, 1998).

Fórmula:

% 𝐶 = 𝑊 −𝑊𝑂

𝑃⁄ 𝑋 100

Dónde:

W: peso del crisol con ceniza.

WO: peso del crisol vacío.

P: peso de la muestra.

23

II.6.2.2. Cenizas insolubles en agua

En el crisol donde se realizó el ensayo de cenizas totales, se agregó de 10 a

20 mL de agua destilada llevándolo a ebullición durante 10 minutos. Luego con

papel libre de cenizas se filtró realizando lavados del crisol hasta que no queden

cenizas en él. Terminado de filtrar se colocó el papel en un crisol nuevamente y

se incineró en la mufla a 600ºC durante aproximadamente 4 horas, pasado este

tiempo se colocó en un desecador y una vez frio se pesó para realizar los cálculos

respectivos utilizando la fórmula detallada acontinuación (NMX-F-260, 1978).

Fórmula:

% 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑎𝑔𝑢𝑎 =𝑚2

𝑚1∗ 100

Siendo:

m1: Peso de la muestra.

m2: Peso de cenizas tratadas en agua.

II.6.2.3. Cenizas insolubles en ácido

En el crisol que contiene las cenizas totales, se añadió 10 mL de ácido

clorhídrico 1% v/v llevándolas a ebullición durante 10 minutos. Luego se filtró con

papel libre de cenizas, realizando lavados a la muestra con agua caliente hasta

que no queden cenizas en el. Una vez terminada la filtración se colocó el papel

filtro en un crisol y se volvió a colocar en la mufla a 600ºC durante 4 horas hasta

su completa incineración, posteriormente se enfrió en un desecador y se pesó

24

para obtener los datos necesarios para aplicar la fórmula siguiente (Olvera,

Martínez, y Real de León, 1993).

Fórmula:

% 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 á𝑐𝑖𝑑𝑜 =𝑚2

𝑚1∗ 100

Siendo:

m1: Peso de la muestra.

m2: Peso de cenizas tratadas con ácido.

II.6.3. Determinación de Fibras

Se pesó 2 g de muestra en un matraz Erlenmeyer de 500mL, adicionalmente

se colocó 200 mL de ácido sulfúrico 0,255N, se calentó hasta ebullición,

manteniéndolo a volumen constante durante 30 minutos en la plancha de

calentamiento WiseStir MS-D. Una vez transcurrido el tiempo se enfrió y filtró,

realizando varios lavados con 300 mL agua destilada. Terminado los lavados se

transfirió el residuo del papel filtro a otro matraz Erlenmeyer, donde se adicionó

200 mL de hidróxido de sodio 0,313N, se repite el proceso de calentamiento por

el mismo tiempo; una vez enfriado, filtrado y lavado con agua destilada, la muestra

se transpasó a un crisol donde se adicionó 25mL de etanol, llevándolo a la estufa

por 2 horas, pasado este tiempo se colocó en un desecador por 30 minutos y se

pesó la muestra seca para tranferirla a la mufla Veb Elektro Bad Frankenhasen a

600ºC durante 4 horas. Una vez finalizado el tiempo se enfrió en el desecador y

se pesó el contendio de fibra obtenido (Olvera et al., 1993).

Fórmula:

𝐹𝑐 =(𝑚1 − 𝑚2) − (𝑚3 − 𝑚4)

𝑚𝑥 100

25

Siendo:

Fc: Contenido de fibra cruda, en porcentaje de masa.

m: Masa de la muestra desengrasada y seca, en g.

m1: Masa de crisol conteniendo asbestos y la fibra seca, en g.

m2: Masa de crisol contiendo asbesto después de ser incinerado,

en g.

m3: Masa de crisol del ensayo en blanco conteniendo asbestos,

en g.

m4: Masa de crisol del ensayo en blanco conteniendo asbesto,

después de ser incinerado, en gramos.

II.6.4. Determinación de Nitrógeno total y Proteínas

La determinación de nitrógeno total se realizó bajo la norma MLA_10 INEN 465

1980-09 y proteínas por MLA_22 AOAC 2011.11 Ed.20, 2016.

II.7. Extracción Soxhlet

Se pesaron 40 g de cascarilla y nuez pulverizadas, previamente secadas en

estufa dentro de un dedal, el cual se colocó dentro del equipo Soxhlet

adicionándole 150 mL aproximadamente del disolvente n-hexano, una vez armado

el equipo se dejó sifonear en la plancha de calentamiento durante 3 horas con la

finalidad de extraer el aceite fijo. Luego se filtró para posteriormente rotavaporar

en el equipo IKA RV 8 V-C hasta recuperar el disolvente utilizado y separar el

aceite que fue almacenado en frascos ambar para su posterior estudio.

Fórmula:

% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑥 100

26

II.8. Desgomado

En un matraz corazón de 25 mL se agregó el aceite crudo y mediante reflujo se

calentó hasta conseguir 60ºC, luego se le adicionó el 2% de agua destilada a 80ºC.

Se dejó en reflujo por 30 minutos a temperatura constante de 60ºC. Después se

realizó una vigorosa agitanción por 15 minutos. Pasado este tiempo se uso una

centrifuga Quantum a 3000 rpm durante 30 minutos, para facilitar la separación

del aceite y la goma, donde el aceite se retiró con la ayuda de una pipeta pasteur

y se almacenó en frasco ambar (Blanco, 2007).

II.9. Análisis físico- químico del aceite.

II.9.1 Densidad relativa

Se pesó el picnómetro limpio en la balanza analítica 210/0.0001 gramos Boeco,

luego se lleno con agua destilada el picnómetro evitando la formación de burbujas

al momento de colocar la tapa, se registró el pesó; por último en el picnómetro

seco y limpio se lleno con la muestra y se pesó, posteriormente se realizaron los

cálculos correspondientes (NTE INEN 0035, 1973).

Fórmula:

𝑑 =𝑚2 − 𝑚

𝑚1 − 𝑚

Siendo:

m: Peso de picnómetro vacío.

m1: Peso de picnómetro con agua.

m2: Peso de picnómetro con muestra.

27

II.9.2. Índice de refracción

Se limpió el prisma del refractómetro Thermo 334610 con n-hexano, para

proceder a la lectura del aceite a 20ºC – 25ºC se colocó unas 3 gotas en el prisma,

se cerró, se encendió la lámpara y se observó para equilibrar la luz, una vez que

se consiguió se apagó la lampara registrándose las cantidades observadas en el

equipo; teniendo en cuenta la temperatura a la cual se leyó la muestra se realiza

la corrección del resultado con la siguiente fórmula (NTE INEN-ISO 0042, 1973).

Fórmula:

𝑛𝐷 = 𝑛′𝐷 − (𝑇º𝑅𝑒𝑓 − 𝑇º)𝐹

Siendo:

nD: Índice de refracción a 250C.

n´D : Lectura del índice de refracción de la muestra.

T0ref : 250C.

T0 : Temperatura a la cual se leyó la muestra.

F: Factor.

II.9.3. Índice de yodo (método de Hanus)

Se pesó 4 gotas o 0,25 g en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, luego se

adicionó 10 mL de cloroformo agitando para disolver el aceite, una vez

homogenizado se agregó 10 mL de solución Wijs; durante 30 minutos se dejó sin

luz agitándolo ocasionalmente. Transcurrido el tiempo se colocó 5 mL de solución

de yoduro de potasio al 15% más 100 mL de agua destilada y 1 mL de almidón al

1%, se agitó vigorosamente durante la adición de los reactivos donde aparecerá

una coloración entre azul o negro, se procedió a titular con tiosulfato de sodio 0,1N

hasta que el color se desaparezca. Se corrió blanco con la muestra (NMX-F-152,

1981).

28

Fórmula:

𝐼𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑦𝑜𝑑𝑜 =(𝐵 − 𝑀)𝑥𝑁𝑥12.69

𝑊

Donde:

B: mL gastados en el blanco.

M: mL gastados en la muestra.

N: Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.

W: Peso de la muestra.

II.9.4. Determinación de la acidez

Se pesó en un matraz de Erlenmeyer un aproximado de 1,5 a 2 g de muestra.

Adicionándole 50 ml de alcohol 98% y 50 ml de éter de petróleo. Se agitó y añadió

1 mL de solución de fenolftaleína 1% para proceder a titular con solución de

Hidróxido de Sodio 0,1 N hasta aparición de coloración rosada persistente por 30

segundo se anotó el volumen gastado; se corrió un blanco junto con la muestra

(NTE INEN-ISO & 660, 2013).

Fórmulas:

% á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒𝑠 (𝑜𝑙é𝑖𝑐𝑜) =𝑉𝑥𝑁𝑥28.2

𝑃

Siendo:

V: Volumen en mL de solución de álcali utilizado.

N: Normalidad de la solución de KOH.

P: Peso en gramos del aceite problema.

M: Masa molecular del ácido graso.

29

II.9.5. Índice de saponificación (índice de Koettstorfer)

Se pesó en una balanza analítica OHAUS alrededor de 2,5 g de muestra dentro

de un balón de 250 mL de capacidad, adicionándole 25 mL de solución alcohólica

de KOH 0,5 N. Se conectó a un condensador y calentó por 30 minutos, se lo dejó

enfriar y adicionó 1mL de fenolftaleína 1% (indicador) para proceder a titular con

ácido clorhídrico 0,5 N. Se corrió blanco y se registro los volúmenes gastados

(Rodríguez, Maldonaado, Muro, y Miranda, 2016).

Fórmulas:

𝐼𝑠 =(𝑉𝐻𝐶𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝑉𝐻𝐶𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)𝑥 𝑁𝐻𝐶𝑙 𝑥 56.1

𝑊𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Siendo:

VHCl blanco: Volumen del consumo del blanco.

VHCl muestra: Volumen del consumo de la muestra.

NHCl : Normalidad de ácido clorhídrico.

Wmuestra: Peso de la muestra.

II.9.6. Determinación de materia insaponificable

Se pesó 5 g de muestra en un matraz Erlenmeyer, adicionándole 30 mL de

etanol y 5 mL de hidróxido de potasio al 50%, luego se conectó el refrigerante

durante 1 hora en una fuente de calor, pasado este tiempo se retira y se agrega

por la parte superior del refrigerante 50 mL de agua destilada, se agitó

vigorosamente, enfrió y se transfirió el contenido a un embudo de separación,

realizando 3 lavados con 50 mL de éter de petróleo, agitándolo y dejándolo en

reposo por 1 minuto, permitiendo la separación de la capa etérea; la cual fue

30

transferida a otro embudo de decantación para lavarla con 50 mL de etanol al 10%.

Se trasvasó la parte etérea en un critalizador para por medio de baño de vapor

eliminar la mayor cantidad de disolvente, posteriormente se secó en la estufa por

15 minutos y se pesó el residuo para calcular el porcentaje insaponificable de la

muestra (NMX-K-306-SCFI, 2006).

Fórmulas:

% insaponificable =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (𝑔)

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 (𝑔)x100

II.10. Perfil lipídico

El aceite (2 mg), en una balanza analítica METTLER TOLEDO, fue tratado con

1,5 mL de cloruro de acetilo al 10 % en metanol (disolución metilante). El recipiente

se cerró herméticamente y se calentó a 85 °C por 2 h con agitación vigorosa

ocasional. Al cabo de ese tiempo a temperatura ambiente, se adicionaron 2 mL de

n˗hexano y 2 mL de agua destilada. Se agitó en una zaranda por 15 min y se dejó

reposar. De la fase orgánica se extrajeron 1 mL hacia otro tubo de ensayo, se le

adicionaron 2 mL de n˗hexano y 2 mL de NaOH a 1 mol/L en metanol, se cerró y

se agitó en zaranda durante 15 min. Se dejó reposar y extrajo 1 mL de la fase

orgánica, de la cual se tomó 1 µL para el análisis por cromatógrafo de gases

(Shimadzu, Japón) GCMS-QP2010 Plus, equipado con un detector selectivo de

masas, serie QP2010. La inyección de la muestra se realizó manualmente por el

modo “split” con una relación de 1:20, siendo la temperatura del inyector 250 °C.

La separación se realizó en una columna capilar Crossbond de 30 m × 0,25 mm

DI y 0,25 µm de espesor de película. La temperatura del horno se programó a

100°C (3 min), 250°C (10 min) y 280°C hasta completar los 30 min, subiendo

dichas temperaturas a una velocidad de 5°C por minuto. Como gas portador se

utilizó helio a un flujo de 1 mL/min. El espectrómetro de masas fue operado en el

modo de ionización electrónica (IE) a 70 eV y con una temperatura de la fuente

iónica e interfase de 280 °C. La detección se realizó en el modo de barrido total

31

desde 30-500uma. Las estructuras de los ácidos grasos fueron propuestas sobre

la base del proceso de fragmentación general, así como por la base de datos NIST

21, con más un 93 % de confiabilidad en todos los casos. La cuantificación de los

compuestos fue realizada por normalización interna del área bajo la curva de cada

pico cromatográfico (Indarti et al., 2005).

II.11. Determinación de la Capacidad antioxidante “in vitro” por el

método de DPPH

Extración de muestra: Al material sólido sin grasa se adicionó etanol para

extraer compuestos de alta polaridad durante 48 horas, se filtra con la finalidad de

obtener extracto etanólico (Aristizabal, 2011).

Preparación de DPPH: Se pesaron 3 mg de DPPH y se lo llevó a un volumen

de 50 mL con etanol en un matraz volumétrico.

Preparación de solución patrón: Se realizó una solución patrón de ácido

gálico de 0,05g/L, pesando 2,5 mg de ácido gálico y llevándolo a un volumen de

50 mL con etanol en un matraz volumétrico, luego se realizaron 5 diluciones del

patrón a diferentes concentraciones (5,10,15,20,25 mg/L), se las llevó a un

volumen de 10 mL con etanol.

A cada vial protegido de la luz se agregó 200uL de las respectivas diluciones y

2 mL de DPPH, se agitó y dejó reposar durante 30 minutos, posteriormente se

hicieron las respectivas lecturas a 517 nm en el espectrofotómetro UV, siendo el

etanol el blanco; se realizó la curva de calibración del ácido gálico.

Preparación de la muestra:. Se realizó una solución con la muestra problema,

pesando 10 mg de muestra y diluyendola con etanol a un volumen de 10 mL en

matraz volumétrico obteniéndose una concentración de 1g/L, se realizó la lectura

a 517 nm en espectrofotómetro UV (Cruzado, Pastor, Castro, y Cedrón, 2013).

32

CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIONES

III. 1. Interpretación de Resultados de semillas

III.1.1 Determinaciones macroscópicas

En la tabla VIII podemos observar los valores promedio de las mediciones de

100 semillas de toronja blanca, su peso expresado en mg es de 324,83±2,53, su

largo de 1,49±0,21 cm y un ancho de 0,78±0,10 cm.

El largo característico promedio de las semillas de Citrus aurantifolia swingle

es de 0,99±0,28 cm datos reportados por Arriola Guevara y colaboradores (2006);

siendo la semilla de toronja de un mayor tamaño (Arriola-Guevara, García-

Herrera, Guatemala-Morales, y García-Fajardo, 2006).

Tabla VI. Dimensiones de semillas Citrus paradisi Macfad.

Peso

(mg)

Largo

(cm)

Ancho

(cm)

Promedio 324,83 1,49 0,78

Desviación Estándar

2,53 0,21 0,10


33

III.1.2. Estudio Farmacognóstico en la semilla de Citrus paradisi.

III.1.2.1 Humedad

Los resultados de las muestras por triplicado de nuez y cascarilla de las

semillas de toronja se encuentran descritos en la tabla IX, obteniéndose un mayor

porcentaje en la cascarilla 7,53±0,06% que en la nuez 2,67±0,11%.

Tabla VII. Resultados del ensayo de humedad realizado a las semillas.

NUEZ CASCARILLA

NO Muestras Porcentaje

(%)

Porcentaje

(%)

1 2,80 7,50

2 2,60 7,50

3 2,60 7,60

Promedio 2,67 7,53

Desviación estándar

0,11 0,06


En el estudio de Londoño et al. (2010) se expresa que las semillas oleaginosas

tienen hasta alrededor de 8% de humedad, lo cual favorece la extracción del aceite

(Londoño, Mieres-Pitre, y Hernández, 2012).

Se realizó el ensayo en muestras pulverizadas y secas en estufa; al comparar

resultados con el análisis de semillas de Arriola-Guevara et al. (2006) limón (Citrus

aurantifolia swingle) el porcentaje de humedad es mayor 68±0,51% debido a que

utilizaron muestras frescas, además reporta una actividad de agua de 0,22±0,28

en semilla secas al sol en 3 sesiones de 8 horas. (Arriola-Guevara et al., 2006)

34

III.1.2.2. Cenizas.

El porcentaje de cenizas totales obtenidos de la nuez de las semillas de Citrus

paradisi Macfad fue de 3,16±0,02 mayor al de la cascarilla que fue de 2,03±0,07.

Según la Real Farmacopea Española las cenizas totales deben ser ≤ 5%

cumpliendo ambas muestras el criterio establecido.

Arriola-Guevara (2016) informó el porcentaje de cenizas de la semilla de limón

en base seca de 2,41±0,58 aproximándose al porcentaje de cascarilla. Estos

valores indican que el porcentaje de mineral presente en las semillas de toronja

es alto (Arriola-Guevara et al., 2006).

Los porcentajes de cenizas insolubles en agua y acido se encuentran en la

tabla X donde podemos observar que la cascarilla presenta menores porcentajes

en comparación con los de la nuez.

Tabla VIII. Porcentaje de cenizas de las semillas.

NO

Muestras

Porcentaje de Cenizas

Totales (%)


Insolubles en Agua (%)


Insolubles en Acido (%)

N C N C N C

1 3,17 1,96 1,64 1,33 1,17 0,21

2 3,13 2,05 1,60 1,38 1,23 0,22

3 3,17 2,09 1,56 1,37 1,18 0,22

Promedio 3,16 2,03 1,60 1,36 1,19 0,22


0,02 0,07 0,04 0,03 0,03 0,01


35

III.1.2.3. Fibra cruda

En la tabla XI se comparan los resultados conseguidos del análisis de fibra

cruda, donde la cascarilla presentó el mayor porcentaje 39,47±1,28% que la nuez

22,99±0,43%.

Tabla IX. Porcentaje de fibra en semillas de toronja blanca.

NUEZ CASCARILLA

NO Muestras Porcentaje

(%)

Porcentaje

(%)

1 23,23 40,49

2 23,25 39,88

3 22,49 38,04

Promedio 22,99 39,47


0,43 1,28


En la literatura científica consultada Arriola-Guevara et al. (2006) informan

valores de 29,00±8,95% de fibra en base seca en las semillas del limón, superiores

a los resultados obtenido en las semillas de toronja. Las diferencias pudieran estar

asociada a las características botánicas de estas especies que tienen en común

el género Citrus (Arriola-Guevara et al., 2006).

Las diferencias entre la cascarilla y la nuez son significativas, pero en la literatra

no se encontró reportes de comparación entre ambas parte de las semillas. El alto

valor de fibra encontrado en la cascarilla sugiere su empleo como fuente de

obtención de estos materiales y por tanto pudiera constituirse en una alternativa

para el aprovechamiento de este recurso natural que hoy se desecha.

36

III.1.2.4. Nitrógeno Total y Proteínas.

El porcentaje de nitrógeno total y proteínas (tabla XII) es mayor en la nuez

obteniéndose resultados de 2,72±0,00 y 16,99±0,00 respectivamente, mientras

que la cascarilla presento valores de 1,20±0,00 para nitrógeno total y 1,60±0,00

para proteínas siendo mucho más bajo que la nuez.

Tabla X. Resultados de nitrógeno total y proteínas de semillas de toronja.

Nitrogeno Total

(%)

Proteinas

(%)

NUEZ CASCARILLA NUEZ CASCARILLA

Promedio 2,72 1,20 16,99 7,53

Desviación Estándar 0,00 0,00 0,00 0,00


El alto contenido de proteína se corresponde con otros reportes encontrado en

la literatura científicas para semillas de este género. Arriola-Guevara (2016)

informa un 21,21 ± 2,16 % para el Citrus aurantifolia (limón) y Anwar (2008) 24,38

± 0,15 % en Citrus paradisi. En los reportes anteriores no se separan la muez de

la cascarilla por lo que considerando la suma de los experimento el rendimiento

promedio sería de 24,52 ± 0,00%, muy similar al informado para esta especie

(Arriola-Guevara et al., 2006; Anwar et al., 2008).

37

III.2 Extracción de aceite fijo de la especie Citrus paradisi Macfad.

El rendimiento de aceite fijo obtenido (tabla XIII) luego de 3 horas de extracción

por Soxhlet a partir de 40 g de muestra fue de: 72,5 ± 4,3 para la nuez y 4,9 ±1,2

para la cascarilla, considerando que es un material de desecho el resultado de la

cascarilla no es despreciable.

Tabla XI. Rendimiento de extracción por Soxhlet de los aceites fijos..

NUEZ CASCARILLA

Extracciones mL de aceite

Rendimiento (%)

mL de aceite

Rendimiento (%)

1 31,0 70,3 2,1 4,2

2 30,0 68,0 2,3 4,6

3 30,2 68,5 2,8 5,6

4 30,5 69,1 1,5 3,0

5 26,6 60,3 2,4 4,8

6 29,6 67,1 1,7 3,4

7 28,9 65,5 1,5 3,0

8 27,7 58,7 1,7 3,4

9 25,9 66,9 2,1 4,2

10 29,5 65,7 1,4 2,8

Promedio 29,0 72,5 2,0 3,9


1,7 3,9 0,5 0,9


El aceite de nuez tiene un rendimiento mayor que el de otros cítricos como la

semilla de naranja (Citrus sinensis) 42,0±1,0 según informe de Escalante et al.

(2012) y del limón (Citrus aurantifolia swingle) 29,0±3,5 datos tomados de Arriola-

Guevara et al. (2006), mientras que Mingo et al. (1942) reportó en Citrus

Aurantium un 46,4% en nuez y 2,7% en la cascarilla, aún presentando mayores

rendimeinto de aceite los de la toronja blanca (Arriola-Guevara et al., 2006;

Escalante, Santos, Rojas, y Lárez, 2012; Mingo, Fernández, y Toledano, 1942).

38

III.3 Caracterización Fisicoquímica del Aceite Fijo.

El aceite extraído por Soxhlet de la nuez y cascarilla de las semillas de Citrus

paradisi Macfad es líquido a temperatura ambiente de color, amarillo claro nuez y

la cascarilla presenta una tonalidad más oscura. En las tablas XIV se puede

observar los resultados por triplicados de los parámetros fisicoquímicos realizados

al aceite fijo tanto de la nuez y cascarilla.

Tabla XIV. Parámetros físico químicos realizados al aceite fijo.

Parámetros Parte

estudiada

NO Muestras

Promedio Desviación Estándar 1 2 3

Densidad relativa

Nuez 0,9143 0,8981 0,9076 0,9067 0,0081

Cascarilla 0,8036 0,8032 0,7908 0,7992 0,0073

Índice de refracciòn

Nuez 1,4567 1,4567 1,4564 1,4566 0,0002

Cascarilla 1,4738 1,4725 1,4732 1,4732 0,0007

Perdida por calentamiento

(%)

Nuez 4,44 4,39 4,45 4,43 0,03

Cascarilla 1,37 1,38 1,37 1,37 0,01

Índice de acidez (mg

KOH/g)

Nuez 0,40 0,40 0,60 0,50 0,10

Cascarilla 3,60 3,70 3,40 3,60 0,20

Índice de yodo (mg/100g)

Nuez 21,20 22,90 21,80 22,00 0,90

Cascarilla 49,80 51,50 49,90 50,40 0,90

Índice de saponificaciòn

(mg KOH/g)

Nuez 254,80 255,60 255,00 255,10 0,40

Cascarilla 280,50 280,60 280,00 280,30 0,30

Materia insaponificable

(%)

Nuez 2,61 2,58 2,60 2,60 0,02

Cascarilla 4,44 4,40 4,41 4,42 0,02

Fuente: autores (2018)

El valor obtenido de la densidad relativa fue de 0,9067±0,0081 para el aceite

de nuez y de 0,7992±0,0073 para la cascarilla. Comparándolo con otros aceites

los resultados obtenidos de la nuez se asemeja al de Oleína de almendra de palma

39

con una densidad de 0,9060±0,0030 según datos del CODEX (1999). La densidad

del aceite de semillas de Citrus Aurantium investigada por Mingo et al. (1942) es

de 0,9203 siendo superior al de las semillas de la toronja blanca; tanto nuez como

cascarilla respectivamente mientras que las semillas de limón de Arriola-Guevara

et al. (2006) tiene una densidad 0,8100±0,0400 mayor al aceite de cascarilla. Los

aceites tienen una densidad entre 0,8800 y 0,9900 (Arriola-Guevara et al., 2006;

CODEX STAN 210, 1999; Mingo et al., 1942).

El índice de refracción dio un valor de 1,4566±0,0002 para el aceite de nuez y

1,4732±0,0007 a 250C para el de cascarilla. En general los Índices de refracción

de las sustancias grasas están entre 1,4600 y 1,5000 datos tomados de Medina

(2013). En relación con otros aceites tenemos una similitud entre el aceite de

palma 1,4540- 1,4560 con la nuez y aceite de pepitas de uva 1,4670- 1,4770 con

el de cascarilla, datos tomados del (CODEX STAN 210, 1999; Medina, 2013).

Los resultados de la pérdida de agua y materias volátiles presentes en las

muestras fueron mayores para el aceite de nuez 4,43% y menor para el de

cascarilla 1,37%

En el ensayo de ácido graso libre realizado a los aceites fue de 0,5±0,1 mg

KOH/g para el aceite de nuez siendo mayor el del aceite de cascarilla con 3,6±0,2

mg KOH/g. Según el Codex Alimentarius el índice de acidez máximo para aceites

de vegetales refinados es de 0,6 mg de KOH/g, encontrándose el aceite de nuez

dentro mientras que el de cascarilla era superior a lo indicado (CODEX STAN 210,

1999).

El valor promedio obtenido en el ensayo de índice de yodo por el método de

Wijs fue mayor para el aceite de cascarilla con 50,4±0,9 mg/100g que el presente

en el aceite de nuez 22,0±0,9 mg/100g lo que indica la existencia de menos

insaturaciones presentes en este aceite. Por lo general los aceites vegetales

según informe de Medina (2013) tienen un Índice de yodo entre 30-60

encontrándose ambos aceites dentro de este rango. Comparando con otros

aceites en el Codex Alimentarius el aceite de cascarilla presenta un índice similar

40

al del aceite de palma 50,0-55,0 mg/100g mientras que el de la nuez presenta

similitudes con el de Oleína de almendra de palma 20-28 y al aceite de almendra

de palma 14,1-21,0 mg/100g (CODEX STAN 210, 1999; Medina, 2013).

Índice de saponificación y materia insaponificable ambos parámetros fueron

más altos para el aceite de cascarilla con un resultado promedio de 280,3±0,3 mg

KOH/g siendo mayor para el rango del aceite de coco 248-265 mg KOH/g y

4,4±0.1% de insaponificación; mientras que el aceite de nuez presentó un índice

de saponificación de 255,1±0,4mg KOH/g encontrándose dentro del

requerimiento del Codex para Estearina de almendra de palma 244-255 mgKOH/g

al igual que el del aceite de coco y una materia insaponificable de 2,6±0,01%

(CODEX STAN 210, 1999).

III.3. Perfil lipídico

En la tabla XVI se presentan los valores del análisis realizado por CG-EM del

aceite de semillas de toronja blanca (Citrus paradisi Macfad). El cormatograma

obtenido (figura 2) muestra el perfil de ácidos grasos obtenidos. Como se observa

en las condiciones de medición los tiempos de retención de los ácidos grasos

principales aparecen entre los 15 a 30 minutos, muy similares a otros reportes

encontrados en la literatura científica (Anwar et al., 2008).

41

Tabla XII. Composición de ácidos grasos en porcentaje del aceite de semilla de

toronja blanca.

No, Pico Tiempo de retención

(min,) Fórmula Compuestos %

1 16,492 C12:0 Ácido láurico 1,71

2 18,382 C14:0 Ácido mirístico 1,34

3 20,688 C16:0 Ácido palmítico 21,19

4 24,274 C18:0 Ácido esteárico 8,27

5 25,731 C18:1 Ácido oleico 23,76

6 26,776 C18:2 Ácido linoleico 39,11

7 29,982 C18:3 Ácido a-linoleico 3,41

8 30,688 C20:1 Ácido eicosenoico 1,08


Figura 2. Cromatograma de los compuestos grasos del aceite de las semillas de toronja

42

El contenido de ácidos grasos insaturados fue de 67,36%, un valor alto y

similar a otros reportes de aceites vegetales, siendo el ácido linoleico el más

abundante con 39,11%, seguido del ácido oleico con 23,76%. Al comparar los

resultados obtenidos con los reportes de la literatura se observa mucha similitud.

Anwar (2008) informa un contenido de 64,10 %, siendo los ácidos linoleico y oleico

los más abundantes con 36,10 % y 21,91 %, respectivamente. Sin embargo,

Waheed y colaboradores (2009) informaron un 52,10 % de ácidos grasos

insaturados, siendo el ácido oleico el más abundante con un 24,06% y el ácido

linoleico 22,41%. Estas diferencias en los valores analizados sugieren que la

variedad vegetal pudiera modificar los contenidos de lípidos, sin embargo en los

artículos los autores no identifican cual es la variedad de la especie estudiada, lo

cual dificultad comprender con más detalles los resultados obtenidos (Anwar et

al., 2008; Waheed, Mahmud, Saleem, & Ahmad, 2009).

En el caso de los ácidos grasos saturados sucede algo similar a lo analizado

anteriormente. En esta investigación se reportó un 32,51%, siendo el ácido

palmítico el más abundante (21,19%). Anwar y colaboradores (2008) informan

36.10% con un contenido de ácido palmítico de 32,17% y Waheed y colaboradores

(2009) un 47,61% con 35,92 % de este mismo ácido graso saturado (Anwar et al.,

2008; Waheed et al., 2009).

III.1.3 Evaluación de la Capacidad Antioxidante

Las absorbancias de ácido gálico a diferentes concentraciones se encuentran

en la tabla XVII, con las cuales se logró realizar una curva de calibración como se

puede observar en la figura 3, con la finalidad de utilizar la ecuación de la recta

para relacionar la concentración de ácido gálico presente en las muestras descrito

en la tabla XVIII donde la cascarilla tiene una concentración mayor a la de la nuez;

debido a que una de las funciones principales de la cascarilla es la de ser

protectora se esperaba que fuera mayor su poder antioxidante observado por su

acción de inhibir los radicales de DPPH+ que en la nuez.

43

Tabla XIII. Absorbancias de ácido gálico (solución estándar) a 515 nm

Concentración mg/L

Absorbancia patrón

Absorbancia estandarizada

DPPH

Relación entre absorbancia

0 0,0321 1,3993 0,0000

5 0,0328 1,2560 0,1433

10 0,0333 1,1337 0,2656

15 0,0338 0,9971 0,4022

20 0,0344 0,8402 0,5591

25 0,0349 0,7134 0,6859


Figura 3. Curva de calibración de ácido gálico.

Tabla XVIII. Lecturas de las muestras y Q% de la capacidad antioxidante

Absorbancias Concentración Q

(%)

Equivalenye

mg ácido

gálico/g

muestra

NUEZ 0,0397 1,44 2,84 0,14

CASCARILLA 0,2785 10,17 19,90 0,95


y = 0,0275x - 0,0011R² = 0,9991

-0,1000

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0 5 10 15 20 25 30

AB

SOR

BA

NC

IAS

CONCENTRACIÓN

44

En la tabla XIX se muestran los porcentajes de inhibición de la capacidad

antioxidante en las distintas concentraciones preparadas de ácido gálico. En la

figura 4 se muestran los datos de la cascarilla y nuez interpolados en la curva de

calibración.

Tabla XIX. Valor Q del ácido gálico

Concentración de ácido gálico

(mg/L) Q (%)

0 0

5 10,24

10 18,98

15 28,74

20 39,96

25 49,02


Figura 4. Muestras interpolarizadas en la curva de calibración de ácido gálico

-0,1000

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

AB

SOR

BA

NC

IA

CONCENTRACIÓN

Curva patrón

cascarilla

nuez

45

Las muestras utilizadas fueron previamente desengrasadas y colocadas a

maceración con etanol al 98% por una semana; en las publicaciones consultadas

no se encontró información de capacidad antioxidante en extracto alcohólico de

semillas de toronja, pero si en extracto glicérico donde Giamperi et al. (2004)

reporto una capacidad antioxidante de 257,99±8,22% disuelto en entanol y en

medio acuoso 221,57±12,35% utilizando α-tocoferol como sustancia patrón,

usando una metodología descrita en el año de 1966 (Giamperi et al., 2004).

Mientras que Faleye et al. (2012) analizó extractos metanolicos de semillas de

toronja publicando un 13,09% como valor captado del radical libre en el ensayo

de DPPH en una concentración de 200µM usando L- ácido ascórbico como

sustancia patrón (Faleye, Oundaini, & Olugbade, 2012).

Las muestras de cascarilla y nuez de la semilla de Citrus paradisi Macfad

analizadas a una concentración de 561,36 µM/L (1mg-ml) dieron un Q% de 19,9%

y 2,84% respectivamente, usando ácido gálico como solución patrón lo que

diferencia los reportes publicados por los distintos autores pudiendo ser

significativo al momento de obtener los resultados; sin embargo se reafirma el

efecto antioxidante que pueden contener las semillas de toronja.

46

CONCLUSIONES

En el presente trabajo se evaluaron los parámetros farmacognósticos y la

capacidad antioxidante “in vitro” de las semillas de la toronja blanca (Citrus

paradisi Macfad) y con los resultados obtenidos se puede concluir que:

Las semillas tienen un peso promedio de 324,83 mg, largo de 1,49 cm y

ancho de 0,78 cm. Los parámetros farmacognósticos indican que para la

nuez de las semillas de toronja blanca el porcentaje de cenizas, nitrógeno

total y proteína fueron mayores que en la cascarilla de dicho organo.

Mientras que los valores de humedad y fibra fueron mas altos en esta

ultima.

En la extracción por Soxhlet se obtuvo un rendimiento promedio de 72,5%

para el aceite de nuez y 4,9% para el aceite de cascarilla de las semillas

de la especie estudiada.

Las propiedades fisicoquímicas de los aceites fijos obtenidos para la nuez

y cascarilla de las semillas de toronja cumplen con los criterios de calidad

de aceites vegetales (INEN). Densidad relativa: 0,9067 g/mL nuez, 0,7992

g/mL cascarilla; índice de refracción:1,4566 nuez, 1,4732 cascarilla;

pérdida por calentamiento: 4,43% nuez, 1,37% cascarilla; índice de acidez:

0,5% nuez, 3,6% cascarilla; índice de yodo: 22,0 mg/100g aceite de nuez,

50,4 mg/100g aceite de cascarilla; índice de saponificación: 255,1 mg

NaOH/g nuez, 280,3 mg NaOH/g cascarilla; materia insaponificable:

2,60% nuez, 4,42% cascarilla.

47

Mediante GC-MS se determinó que el aceite de la semilla tuvo un

porcentaje de ácidos grasos insaturados del 67.36% siendo el ácido

linoleico el mas abundante con un 39.11%.

Los extractos alcohólicos de la cascarilla y nuez mostraron capacidad

antioxidante en el ensayo de DPPH, siendo mayor en la cascarilla (0,95

mg ácido gálico/ g) que en la nuez (0,14 mg ácido gálico/ g).

48

RECOMENDACIONES

Determinar los compuestos fenólicos que se encuentran en la fracción

insaponificable de aceite de la semilla.

Realizar estudios comparativos con semillas de la misma especie.

Asegurar la eficacia como posible uso alimenticio o cosmético del aceite de

semilla de toronja blanca realizando investigaciones toxicológicas.

Comprobar la ausencia de microorganismos patógenos mediante ensayos

microbiológicos.

49

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55

ANEXOS

Determinaciones macroscópicas

Ilustración 1. Peso de semillas individuales

Ilustración 2. Mediciones de largo y ancho a semillas individuales.

Secado y Molienda de semillas.

ANEXO 1. Parámetros realizados a las semillas

Ilustración 3. Semillas frescas Ilustración 4. Secado de semillas en la estufa

56

Humedad relativa

Ilustración 5. Separación de cascarilla y nuez de las semillas

Ilustración 6. Nueces de semillas de toronja blanca

Ilustración 7. Trituración de nuez de las semillas

Ilustración 8. Molienda de Cascarilla de las semillas

Ilustración 9. Humedad realizada a nuez y cascarillas de semillas de toronja.

ANEXO 2 Análisis físico- químico de las semillas

57

Determinación de Cenizas

Ilustración 13. Ceniza total de cascarilla de semillas de toronja blanca.

Ilustración 15. Ceniza insoluble en acido

Ilustración 11. Peso de Crisol y muestra

Ilustración 14. Ceniza insoluble en agua

Ilustración 10. Muestras de cascarilla y nuez en la mufla.

Ilustración 12. Ceniza total de nuez de semillas de toronja.

58

Fibra

Ilustración 16. Pesado de muestra Ilustración 17. Ebullición por 30 minutos con ácido sulfúrico 0.255 N

Ilustración 18. Filtrar Ilustración 19. Residuo después de filtración

Ilustración 21. Filtrar Ilustración 20. Ebullición por 30 minutos con NaOH

59

Ilustración 22. Residuo después de filtración

Ilustración 24. Obtener las cenizas

Ilustración 23. Secar

Ilustración 25. Pesar

Ilustración 26. Fibra de nuez Ilustración 27. Fibra de cascarilla

60

ANEXO 3. Resultados de análisis de nitrógeno- proteína de nuez y cascarilla

Ilustración 28. Informe de los análisis de nitrógeno y proteína del episperma.

61

Ilustración 29. Informe de los análisis de nitrógeno y proteína del endosperma.

62

Ilustración 30. Extración de aceite Ilustración 31. Aceite de nuez

Ilustración 32. Filtración Ilustración 33. Rotaevaporacion

ANEXO 4 Caracterización fisicoquímica del aceite de nuez y cascarilla.

63

Ilustración 34. Aceite de Nuez Ilustración 35. Aceite de Cascarilla

Ilustración 36. Desgomado de aceite de nuez

Ilustración 37. Desgomado de aceite de cascarilla

Ilustración 38. Separación después de centrifugar

Ilustración 39. Goma

64

Ilustración 40. Densidad Ilustración 41. Indice de refracción

Ilustración 42. Perdida por calentamiento Ilustración 43. Indice de acidez

Ilustración 44. Indice de saponificación Ilustración 45. Indice de yodo

65

Ilustración 47. Baño de vapor a materia insaponificable

Ilustración 46. Materia insaponificable

Ilustración 48. Reactivos Ilustración 49. Preparación de diluciones de solución estándar

ANEXO 5 Capacidad antioxidante

66

Ilustración 50. Espectro de la curva de ácido gálico

Ilustración 51. Preparación de maceración alcohólica.

Ilustración 52. Extractos seco de las semilla de toronja

67

Ilustración 53. Preparación de muestras

Ilustración 55. Coloración de muestra con DPPH

Ilustración 54. Lectura en espectofotometro

68

TORONJA BLANCA

SEMILLAS IDENTIFICACIÓN MACROMORFOLÓGICA

EPISPERMA ENDOSPERMA

EXTRACCIÓN

SOXHLET

EXTRACTO

ETANÓLICO

PARÁMETROS

FARMACOGNÓSTICOS

S

CAPACIDAD

ANTIOXIDANTE

(DPPH)

PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS

PERFIL LIPÍDICO

DESGOMADO

HUMEDAD

FIBRA

CENIZA

PROTEÍNA

ANEXO 6 Esquema general del estudio de las semillas de C. paradisi Macfad.

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