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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
MODALIDAD: DESCRIPTIVA EXPERIMENTAL
TEMA:
ESTUDIO FARMACOGNOSTICO Y QUÍMICO DE LA CORTEZA
DE LOS FRUTOS DULCE Y AMARGOS DE Nepphelium lappaceum L.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO
REQUISITO PREVIO, PARA OPTAR POR EL GRADO DE
QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
AUTORES:
• BATIOJA GARCIA KAREN ANDREINA
• LARA MARIDUEÑA MARÍA FERNANDA
TUTOR:
Q.F LAURA VALDEZ LOPEZ MSC.
CONSULTORA EXTERNA:
MIGDALIA MIRANDA MARTINEZ
GUAYAQUIL – ECUADOR
2019
I
DEDICATORIA
El presente trabajo investigativo lo dedicamos principalmente a Dios,
por ser el inspirador y darnos fuerza para continuar en este proceso de obtener
uno de los anhelos más deseados.
A nuestros padres, por su amor, trabajo y sacrificio en todos estos años,
gracias a ustedes hemos logrado llegar hasta aquí́ y convertirnos en lo que
somos. Ha sido el orgullo y el privilegio de ser sus hijas, son los mejores
padres.
A nuestros hermanas (os) y a nuestros compañeros de corazón, por estar
siempre presentes, acompañándonos y por el apoyo moral, que nos brindaron
a lo largo de esta etapa de nuestras vidas.
A todas las personas que nos han apoyado y han hecho que el trabajo se
realice con éxito en especial a aquellos que nos abrieron las puertas y
compartieron sus conocimientos
II
AGRADECIMIENTO
Agradecemos a Dios por bendecirnos la vida, por guiarnos a lo largo de
nuestra existencia, ser el apoyo y fortaleza en aquellos momentos de dificultad y de
debilidad.
Gracias a nuestros padres: Miguel y Luz María; y, Franklin y Gina, por ser los
principales promotores de nuestros sueños, por confiar y creer en nuestras
expectativas, por los consejos, valores y principios que nos han inculcado.
Agradecemos a nuestros docentes de la Facultad de Ciencias Químicas, por haber
compartido sus conocimientos a lo largo de la preparación de nuestra profesión, de
manera especial, a la Q.F Laura Valdez tutora de nuestro proyecto de investigación
y la Dra. Migdalia Miranda quien ha guiado con su paciencia, y su rectitud, y al
master Oswaldo Pesantes por su valioso aporte para nuestra investigación.
III
ESTUDIO FARMACOGNOSTICO Y QUÍMICO DE LA CORTEZA
DE LOS FRUTOS DULCE Y AMARGOS DE Nepphelium lappaceum L.
AUTORES: Batioja Garcia Karen Andreina
Lara Maridueña María Fernanda
Tutor: Q.F Laura Valdez López
RESUMEN
El presente estudio farmacognóstico y químico realizado en las corteza
de dos variedades dulce y amarga de Nephelium lappaceum L. procedente del
país de Ecuador, permite demostrar la presencia de metabolitos secundarios
en el vegetal de estudio, se evidencio los resultados a través del tamizaje
fitoquímico obteniendo valores cualitativos de fenoles y flavonoides de gran
interés en las variedades; lo cual lleva a su estudios en la actividad
antioxidante. Mientras que en el estudio farmacognóstico realizamos distintos
análisis como es: Humedad, cenizas totales, cenizas insolubles en ácido
respectivamente dándonos como resultado que la corteza amarga presenta
mayor humedad que la corteza dulce y que la corteza dulce presenta mayor
cantidad de cenizas que la corteza amarga.
Palabras claves: Achotillo, estudio químico, flavonoides,
antioxidantes
IV
PHARMACOGNOSTIC AND CHEMICAL STUDY OF THE BARK OF
SWEET FRUITS AND BLACKBERRIES OF Nepphelium lappaceum L.
Authors: Batioja Garcia Karen Andreina
Lara Maridueña María Fernanda
Advisor: Q.F Laura Valdez López
ABSTRACT
The present pharmacognostic and chemical study conducted in the bark
of two sweet and bitter varieties of Nephelium lappaceum L. from the country of
Ecuador, allows to demonstrate the presence of secondary metabolites in the study
plant, the results were evidenced through phytochemical screening obtaining
qualitative values of phenols and flavonoids of great interest in the varieties; which
leads to his studies on antioxidant activity. While in the pharmacognostic study we
performed different analyzes such as: Moisture, total ash, ash insoluble in acid
respectively giving us as a result that the bitter crust has more moisture than the
sweet crust and that the sweet crust has more ash than the bitter crust
Keywords: Achotillo, chemical study, flavonoids, antioxidants
V
INDICE
RESUMEN........................................................................................................................ III
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
I.1 Planteamiento del problema ................................................................................... 2
I.2 Hipótesis ................................................................................................................... 3
I.3 Objetivo General ..................................................................................................... 3
Capítulo II MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 4
II.1 Nephelium lappaceum L. ............................................................................................ 4
II.1.1. Origen y Distribución ........................................................................................ 4
II.1.2 Taxonomía ........................................................................................................... 5
II.1.3. Descripción botánica .......................................................................................... 5
II.1.3.2.1. Valores Nutricionales del fruto ............................................................ 6
II.1.4. Propiedades Medicinales ................................................................................... 6
II.1.5. Variedades de Nephelium lappaceum L. .......................................................... 7
II.1.6. Composición química de N. lappaceum ......................................................... 8
II.2.1. Compuestos fenólicos ................................................................................. 9
II.2.2. Flavonoides ................................................................................................... 10
II.2.2.1. Clasificación. Distintos tipos de flavonoides. .......................................... 11
II.2.3. Antioxidantes ................................................................................................ 13
II.2.3.1. Generalidades ......................................................................................... 13
II.2.3.2. Comportamiento antioxidante de los fenoles ........................................ 13
II.2.3.3. Mediación de la actividad antioxidante ................................................. 14
II.2.4. Métodos de análisis .......................................................................................... 14
II.2.4.1. Cromatografía ................................................................................................ 14
II.2.4.2. Cromatografía en Capa Fina (CCF) ..................................................... 14
II.2.4.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.......................... 15
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................... 16
III.1. Metodología de la investigación ....................................................................... 16
III.2. Material vegetal en estudio ............................................................................... 16
III.3. Técnicas y Métodos ........................................................................................... 16
III.3.1. Análisis Macro-morfológico del fruto ........................................................ 16
III.4. Parámetros físico-químicos de las drogas crudas ........................................... 17
III.4.1. Humedad residual. ...................................................................................... 17
III.4.2. Sustancias solubles o extraíbles. ................................................................ 17
VI
III.4.3. Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido
clorhídrico al 10 %. ................................................................................................. 18
III.4.3.1. Cenizas totales. ..................................................................................... 18
III.4.3.2. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %. ................................ 18
III.5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico ........... 19
III.6. Extracción sucesiva del material vegetal ......................................................... 23
II.7. Cromatografía ..................................................................................................... 23
CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................ 26
V.1 CONCLUSIONES .................................................................................................... 39
V.2 RECOMENDACIONES .......................................................................................... 40
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fruto Nepphelium lappaceum L. .................................................................... 6
Figura 2. Principales clases de compuestos fenólicos presentes en frutos.................... 8
Figura 3. Estructuras químicas de diversos compuestos C6-C3-C6 encontrados en
alimentos .......................................................................................................................... 11
Figura 4. Esquema de extracción del material vegetal para la aplicación de técnicas de
tamizaje fitoquimico ......................................................................................................... 20
Figura 5. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los diferentes
extractos ............................................................................................................................ 20
Figura 6. Esquema de la extracción sucesiva del material vegetal. .............................. 1
Figura 7. Cromatogramas de Capa fina realizados a los extractos obtenidos. .......... 32
Figura 8. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extracto hexanicos de la corteza
de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2). ................................................ 33
Figura 9. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extractos DCM de la corteza de
los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2). ..................................................... 37
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Taxonomia Nephelium lappaceum L. ............................................................... 5
Tabla II. Análisis Macroscópico de los Frutos ............................................................. 26
Tabla III. Medidas de los frutos de N.Lappaceum ...................................................... 27
Tabla IV. Determinación de parámetros físicos-químicos en las muestras de las dos
variedades ........................................................................................................................ 28
Tabla V. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto etéreo ........................ 29
Tabla VI. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto alcohólico ................ 30
Tabla VII. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto acuoso.................... 30
Tabla VIII. Resultado del factor de retención en la cromatografía de capa fina ...... 32
VII
Tabla IX. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM en el
extracto hexano ............................................................................................................... 34
Tabla X. Cuadro Comparativo de extracto con Diclorometano ................................. 35
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Recolección del Fruto ..................................................................................... 43
Anexo 2. Corteza de los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L. ..................... 43
Anexo 3. Corteza de los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L. .......................... 44
Anexo 4. Medir los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L.............................. 44
Anexo 5. Medir los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L. .................................. 45
Anexo 6. Secado de la corteza dulce y amargo de Neppelium lappaceum L. ............ 45
Anexo 7. Triturado de la corteza dulce y amrga de Nepphelium lappaceum L. ....... 46
Anexo 8. Molienda de la corteza dulce y amrga de Nepphelium lappaceum L. ........ 46
Anexo 9. Enasayo de Humedad Residual ...................................................................... 48
Anexo 10. Ensayo de cenizas totales e insolubles .......................................................... 49
Anexo 11. Ensayo de Sustancias Solubles ..................................................................... 50
Anexo 12. Extracto acuoso Cloruro Férrico ................................................................. 51
Anexo 13. Extracto acuoso Dragendorff ....................................................................... 51
Anexo 14. Extracto acuoso Fehling 1 ............................................................................ 52
Anexo 15. Extracto acuoso Fehling 2 ............................................................................ 52
Anexo 16. Extracto acuoso Na OH 1 ............................................................................. 53
Anexo 17. Extracto acuoso Na OH 2 ............................................................................. 53
Anexo 18. Extracto acuoso Shinoda 1 ........................................................................... 54
Anexo 19. Extracto acuoso Shinoda 2 ........................................................................... 54
Anexo 20. Extracto alcohólico Baljet ............................................................................. 55
Anexo 21. Extracto alcohólico Cloruro Férrico ........................................................... 55
Anexo 22. Extracto alcohólico Dragendorff ................................................................. 56
Anexo 23. Extracto alcohólico Fehling .......................................................................... 56
Anexo 24. Extracto alcohólico Liebermann Burchard ................................................ 57
Anexo 25. Extracto alcohólico Shinoda ......................................................................... 57
Anexo 26. Extracto etéreo Baljet ................................................................................... 58
Anexo 27. Extracto etéreo Liebermann Burchard ....................................................... 58
Anexo 28. Extracto etéreo Sudan................................................................................... 59
VIII
Anexo 29. Maceración para Extracción Sucesiva ........................................................ 59
Anexo 30. Muestra filtrada lista para Rota-evaporar ................................................. 60
Anexo 31. Rotaevaporando la muestra ......................................................................... 60
Anexo 32. Extractos obtenidos con el Rotaevaporador ............................................... 61
Anexo 33. Cromatografía Capa Fina de los extractos de N. lappaceum L. ............... 62
1
INTRODUCCIÓN
Desde épocas inmemorables, el hombre se ha valido de las partes de la planta para
satisfacer sus necesidades vitales, alimenticias, por sus propiedades nutricionales.
El fruto es una de las partes de la planta que más valores nutricionales aporta como
vitaminas que ayudan a la eliminación de los radicales libres del organismo.
Nephelium lappaceum L. es un frutal tropical originario de Malasia e Indonesia,
cultivado principalmente para su consumo como fruta fresca que ayuda a la
eliminación de estos radicales tiene formas redonda u ovoide de pericarpio rojo o
amarillo. Dentro las propiedades de achotillo también vale la pena mencionar un
compuesto muy importante llamado el ácido gálico, que también tiene efecto sobre
los radicales libres, protege al cuerpo del daño que producen y combate el cáncer
(Wall, 2006).
Se conoce que el achotillo tiene una gran variedad de compuestos que son
beneficiosos para la salud humana y los cuales se han aplicado para mejorar el estilo
de vida de las personas, pero al no tener conocimiento sobre los diversos
compuestos presenten en las partes de este fruto se puede estar perdiendo una gran
aplicabilidad de estos, en los diferentes campos como en las industrias
farmacéutica, cosmética y alimenticia.
La finalidad de este estudio en la corteza del fruto de la especie, es conocer los
diferentes metabolitos que se encuentran en mayor proporción, mediante diferentes
estudios como son estudios farmacognósticos y fitoquimicos, parámetros físicos
como humedad, cenizas y sustancias solubles; y determinación de la concentración
de los metabolitos presentes en la muestra.
2
CAPÍTULO I. EL PROBLEMA
I.1 Planteamiento del problema
La farmacognosia es el estudio de recursos naturales como fuente de nuevos
productos de importancia farmacéutica. Es la ciencia que estudia las propiedades
físicas, químicas, bioquímicas, biológicas y farmacéuticas de las drogas de origen
natural. Implica además la búsqueda de nuevas drogas a partir de recursos naturales,
combinada con la Química, es la ciencia que estudia tanto la composición, como la
estructura y las propiedades de la materia como los cambios que esta experimenta
durante las reacciones químicas y su relación con la energía. Sin embargo, existe
plantas que aún no han sido estudiadas a profundidad como es el caso del Nephelium
lappaceum L. ya que su corteza es rico en vitamina C; por ejemplo, ayudan a la
absorción del hierro y el cobre; a su vez este tipo de vitamina ayuda a eliminar los
radicales libres del organismo. Dentro las propiedades de achotillo también hay que
mencionar un compuesto llamado el ácido gálico, que también tiene efecto sobre
los radicales libres, protege al cuerpo del daño que producen y combate el cáncer
(Wall, 2006).
Las propiedades beneficiosas de las frutas y vegetales sobre la salud están
asociadas con los metabolitos secundarios llamados fitonutrientes, los cuales
pueden ser agrupados como fenoles, terpenos y derivados azufrados. El término
fenoles de las plantas debería ser el más adecuado, sin embargo, ha sido cambiado
por polifenoles, debido a su utilización en el campo nutricional, la industria
agrícola, cosmética y de alimentos.
1.1.1 Formulación del problema
¿Existirán diferencias farmacognosticas y químicas en la corteza del fruto
entre sus variedades dulce y amargo de Nephelium lappaceum L?
3
I.2 Hipótesis
El estudio farmacognostico y químico permitirá diferenciar las características y
componentes de las variedades dulce y amargo de N. lappaceum L.
I.3 Objetivo General
Realizar el estudio farmacognostico y químico de la corteza de los frutos
dulces y amargos de N. lappaceu
I.4 Objetivos Específicos
Establecer los parámetros físico-químicos de la corteza de los frutos de N.
lappaceum.
Determinar la composición cualitativa del material vegetal en estudio,
mediante tamizaje fitoquímico.
Desarrollar la extracción sucesiva, para la obtención de todos los
metabolitos secundarios.
Analizar los compuestos presentes en los extractos hexánicos y de
diclorometano de la corteza de los frutos de achotillo, mediante
Cromatografía gaseosa / Espectrometría de masas.
4
Capítulo II MARCO TEÓRICO
II.1 Nephelium lappaceum L.
II.1.1. Origen y Distribución
Nephelium lappaceum L. o comúnmente conocido como: achotillo, rambután o
mamón chino es una fruta nativa del continente asiático, particularmente de Malasia
e Indonesia; y que ha sido cultivada en otros países como Thailandia, Vietnam,
India, Sri Lanka desde 1912. Su vocablo proviene de malayo “rambut” que significa
pelo, el mismo que hace mención a las espinas largas y suaves que cubren la fruta.
Este fruto tiene un sabor característico que es dulce, su pulpa es jugosa, y contenido
de ácido ascórbico y riboflavina (Moreno, 2013).
En América es una fruta muy conocida, y uno de los primeros países que la cultivo
fue México en el año 1950. Hoy en día se puede encontrar plantaciones del
Nephelium lappaceum L. en muchas áreas tropicales y subtropicales alrededor de
todo el mundo, así es el caso de Colombia, Ecuador, Honduras, México y Cuba.
(Arias, 2016).
El achotillo es un árbol tropical de medio tamaño, que alcanza 15-25 m de altura,
tiene un tronco recto de 60 cm de ancho, y sus hojas perennes son alternas,
compuestas pinnadas, de 7-30 cm de largo, las ramas son frágiles y rugosas sus
flores son pequeñas y no poseen pétalos (Valdez, 2014).
El fruto del achotillo es ovoide o elipsoidal, es de color rojo brillante o marrón
oscuro de 3-8 cm de largo. Su piel es delgada, coriácea y está cubierta de tubérculos,
de cada uno de los cuales se extiende una espina carnosa, roja o amarilla de 0.5-2
cm de largo, estas puntas son caducas en algunos tipos (Valdez, 2014).
La piel con puntas es responsable de la denominación común de la fruta, que se
basa en la palabra malaya "rambut", que significa "cabello". Adentro la pulpa es
blanca, translúcida, jugosa, ácida, o dulce, con 0.4-0.8 cm de espesor, adherida en
mayor o 6 menor grado a la semilla algo aplanada y ovoide, que es de 2,5-3,4 cm
5
de largo y 1- 1.5 de ancho. Puede haber 1 o 2 frutas subdesarrolladas pequeñas
ubicadas cerca del tallo de una fruta madura (Valdez, 2014).
II.1.2 Taxonomía
En la Tabla I se refiere la clasificación taxonómica de la especie Nephelium
lappaceum L. de acuerdo a Anderson, (2018).
Tabla I. Taxonomia Nephelium lappaceum L.
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Sapindales
Familia Sapindaceae
Genero Nephelium
Especie lappaceum
II.1.3. Descripción botánica
II.1.3.1. El árbol: su tamaño puede alcanzar de 15 a 20 metros de altura, su tronco
puede medir de 50 a 60 cm diámetro. Su corteza es de color gris y café-oscuro
(Navarrete, 2017).
II.1.3.2. Frutos: Los frutos pueden ser redondos elipsoide u ovalados. Los más
comunes son los ovoides miden de 3 a 6 cm de largo y de 3 a 4 cm de ancho de
color rojo claro a intenso. El pericarpio puede variar entre una coloración rosa a
carmesí. La parte comestible (arilo) de la fruta es color blanco translúcido con un
sabor ácido-dulce (Ochoa. 2013).
6
II.1.3.2.1. Valores Nutricionales del fruto
En la figura 1 se expone una foto de los frutos de la especie. A ésta se le atribuyen
propiedades medicinales astringentes y afrodisiacas, es un fruto nutritivo de alto
contenido en Vitamina C y Riboflavina, contiene vitaminas hidrosolubles del
complejo B como el ácido fólico (Perez, 2016).
Vargas (2003), demostró que de los tres componentes del fruto, la cáscara fue el
principal reservorio de macronutrientes con los contenidos más abundantes de N,
K, Ca, Mg y S. Tanto la semilla como la pulpa presentaron cantidades similares de
Ca, Mg y S. El nivel de P en los cultivares fue similar tanto en la cáscara como en
la semilla o en la pulpa.
Figura 1. Fruto Nepphelium lappaceum L.
II.1.4. Propiedades Medicinales
N. lappaceum por tener un gran valor nutricional se le atribuyen propiedades
medicinales tales como (Pérez, 2018):
Antioxidantes. Elimina los radicales libres.
Antiséptica. Desinfecta las heridas si se aplica de forma tópica.
Antivírica. Ayuda a combatir algunos virus.
7
Mejora el tránsito intestinal. Elimina la indigestión y las dolencias
estomacales.Calmante. Mejora el sistema nervioso, ayuda a eliminar y
prevenir la ansiedad y el estrés.
Reduce el colesterol. Reduce los riesgos de padecer enfermedades
cardiovasculares.
Mejora la absorción de hierro del organismo.
Fortalece el sistema inmunológico. Ayuda a la creación de nuevos glóbulos
rojo, glóbulos blancos y plaquetas.
Se utiliza como tratamiento contra la disentería.
Antipirética. La corteza y las raíces del rambután son utilizadas en
infusiones para eliminar y bajar la fiebre alta.
II.1.5. Variedades de Nephelium lappaceum L.
Para la especie se han informado diferentes variedades entre las cuales se pueden
citar (Pérez, 2016)
Nombre de
Variedad
Tamaño
del Fruto
Color de
Cascara
Pulpa de
Fruta
Cosecha p/
Arbol Edad Tipo
Ponderosa Extragrande Rojo 35.73% 138 Kgs. 6 años Freestone
Ferreras
Magsaysay Grande Rojo
Oscuro 42.68% 80 Kgs. 6 años Freestone
Gobernador
Infantada Extragrande Rojo 39.28% 150 Kgs. 6 años Agridulce
El Bebe
Eulie Extragrande Rojo 39.92% 160 Kgs. 8 años Freestone
8
II.1.6. Composición química de N. lappaceum
Nephelium lappaceum es una fruta tropical que posee propiedades antioxidantes.
Se han realizado experimentos sobre el aislamiento e identificación de los
constituyentes activos y sobre su actividad antioxidante utilizando ensayos de
inhibición de la peroxidación lipídica. El extracto metanólico de las cáscaras de N.
lappaceum a exhibido fuertes propiedades antioxidantes. La cromatografía
Sephadex LH-20 ha sido usada en el aislamiento de cada componente y se han
estudiado las propiedades antioxidantes de cada uno de ellos (Thitilertdecha, 2010).
Los compuestos aislados (figura 2), se identificaron como ácido elágico, corilagina
y geraniina .Estos compuestos representaron el 69.3% del extracto metanólico, con
geraniina (56.8%) como el componente principal y exhibieron actividades
antioxidantes mucho mayores que el BHT tanto en la peroxidación lipídica (77-186
veces) como en la DPPH • (42-87 veces) (Thitilertdecha, 2010).
Figura 2. Principales clases de compuestos fenólicos presentes en frutos
9
II.2. Metabolitos secundarios, Activad antioxidante y Métodos de análisis
II.2.1. Compuestos fenólicos
Sólo las plantas y los microorganismos son capaces de biosintetizar el núcleo
aromático. Hay dos vías principales por las cuales se biosintetizan los compuestos
fenólicos en la naturaleza:
• Acetato - malonato (acetogeninas o policétidos aromáticos, formados por
condensación de Claisen o aldólica, casi siempre policíclicos: cromonas,
isocoumarinas, orcinoles, dépsidos, depsidonas, xantonas, quinonas).
• Shiquimato (ácidos cinámicos y sus derivados: ácidos benzoicos, acetofenonas,
lignanos, ligninas y coumarinas).
Ambas vías pueden generar compuestos con el mismo esqueleto (quinonas) o
pueden conjugarse, formando compuestos de origen mixto (flavonoides). El patrón
de oxigenación puede tomarse como un indicio del origen de un polifenol, pues los
derivados del ácido acético pueden conservar la alternancia de los oxígenos (patrón
meta), mientras que los derivados del shiquimato guardan relación orto. No debe
olvidarse la posibilidad de oxigenaciones o deshidrataciones posteriores, que
alteran estos patrones, complicando cualquier análisis superficial.
Los compuestos fenólicos sencillos se pueden clasificar en:
• Derivados de fenoles simples (C6).
• Derivados de ácido benzoico (C6-C1).
• Derivados de acetofenona (C6-C2).
• Derivados del ácido cinámico (C6-C3).
La mayoría de los compuestos fenólicos de bajo peso molecular se presentan en
forma combinada, generalmente como O-glicósidos.
En la naturaleza hay relativamente pocos fenoles simples, aunque son comunes en
las plantas superiores. Se forman a partir del ácido shiquímico o por degradación
de los fenilpropanos correspondientes (ácido cinámico y sus derivados), aunque
10
algunos derivan del ácido acético. Los derivados del ácido benzoico aparecen
generalmente esterificados o formando glicósidos (heterósidos). La mayoría forma
parte de estructuras más complejas (Miranda, 2012).
II.2.2. Flavonoides
Los flavonoides son compuestos que tienen bajo peso molecular que comparten un
esqueleto común difenilpirano (C6-C3-C6), se encuentran mayoritariamente
como glucósidos, y también pueden aparecen en forme libre. Se presentan como
sulfatos, dímeros ó polímeros (Quiñonez, 2012).
En los alimentos existen algunos compuestos bioactivos de tipo flavonoides,
denominados como fitonutrientes estos son una subclasificación de los polifenoles
que se caracterizan por tener estructuras C6-C3-C6 con dos o más anillos
aromáticos, y por tener cada uno, un hidroxilo aromático y unirse a un puente de
carbono. Este puente consta de tres carbonos para los flavonoides que se combina
con un oxígeno y dos carbonos (figura 3) (Hernández, 2015).
11
Figura 3. Estructuras químicas de diversos compuestos C6-C3-C6 encontrados
en alimentos
II.2.2.1. Clasificación. Distintos tipos de flavonoides.
En la mayoría de los flavonoides el anillo A puede ser meta dihidroxilado (5,7) o
victrihidroxilado (5, 6, 7), debido a su origen biosintético diferente del anillo B.
Las estructuras de los diferentes tipos de flavonoides dependen de la naturaleza del
oxígeno heterocíclico pues este deriva del pirano, del pirilo o de la pirona. La
ciclización se acomete entre el tercer carbono de la cadena y un grupo OH del anillo
12
A en posición orto a esta cadena (excepto para las auronas), lo cual conlleva a la
formación de la estructura del cromeno o cromona.
El puente C3 puede variar en su nivel de oxidación, siendo más alto en el caso de
las dehidrochalconas y menor en las catequinas.
De acuerdo con esto tendremos:
2-fenilbenzopirilio: antocianinas.
2-fenilcromonas (cromona = benzo-pirano): flavonas, flavonoles (80 % del
total); flavanonas, dihidroflavonoles; isoflavonas, isoflavanonas (3-
fenilcromanos).
2-fenilcromanos (cromano = benzopirano): flavanos, 3-flavanoles; 3,4-
flavandioles.
Chalconas y dihidrochalconas.
2-bencilideno coumaranonas (auronas).
En las plantas se encuentran fundamentalmente en forma de glicósidos, lo cual les
infieren una alta solubilidad en agua y disolventes polares, lo cual se incrementa
por la alta polaridad de sus estructuras. La variación estructural de los flavonoides
es inmensa, tanto por la naturaleza del azúcar, como por la posición del enlace
glicosídico. Los oligosacáridos que se combinan con los flavonoides están
generalmente restringidos a enlaces 1,2 ó 1,6 y, generalmente el azúcar es glucosa.
La posición de sustitución varía en las diversas estructuras flavonoides. Así, las
antocianinas casi todas tienen un azúcar en C3 y los biglucósidos 3,5 son muy
comunes, siendo raros los glicósidos en C7, como por ejemplo, la cianidina -7¬-
arabinósido. En contraste, los flavonoides frecuentemente tienen un azúcar en las
posiciones C3 y C7.
Mientras que la mayoría de los flavonoides simples son hidrolizados fácilmente por
las emulsinas, las antocianidinas requieren de enzimas específicas (antocianasas)
(Miranda, 2012).
13
II.2.3. Antioxidantes
II.2.3.1. Generalidades
Un antioxidante es un compuesto químico que hallándose presente a bajas
concentraciones con respecto a las de un sustrato oxidable, retarda o previene la
oxidación de dicho sustrato. Igualmente se definen como compuestos que protegen
el sistema celular de efectos potencialmente perjudiciales en los procesos que
puedan causar una oxidación excesiva (Hernández, 2015).
Un antioxidante es una sustancia que tiene las siguientes características:
Hallándose presente a bajas concentraciones respecto a las de un sustrato
oxidable, retarda o previene la oxidación de dicho sustrato.
Previene la formación de radicales libre en cantidades perjudiciales para el
organismo.
Estimula los mecanismos de reparación endógena al daño causado por el
ataque de radicales libres.
Suministra entidades químicas que aumentan la capacidad endógena de
secuestro de radicales libres.
II.2.3.2. Comportamiento antioxidante de los fenoles
Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos son caracterizados por
un núcleo benzénico que lleva uno o varios grupos hidroxilos y una cadena lateral
funcional. La concentración total de compuestos fenólicos suelen clasificar en dos
grandes grupos: no flavonoides y flavonoides (Dominguez, 2012).
Diversos trabajos relacionan la capacidad antioxidante con el contenido de fenoles
totales y antocianinas; ya que cada componente fenólico puede contribuir de forma
y proporción diferente. Distintos autores han determinado que existe una
correlación lineal positiva entre el contenido de fenoles totales y el poder reductor.
Este hecho ha sido observado en distintos productos vegetales, como extractos de
hierbas (Zheng y Wang, 2001) y en té (Benzie y Szeto, 1999) en (Dominguez,
2012).
14
II.2.3.3. Mediación de la actividad antioxidante
No puede ser medida directamente la actividad antioxidante, pero puede
determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación
controlada. Según Clarkson, la medición de una muestra oxidante, pueden usarse
intermediarios o productos finales para este modo valorar la actividad antioxidante
(Hernández, 2015).
La actividad antioxidante de una muestra no puede determinarse solo en un ensayo
de prueba. En la práctica se realizan varios modelos de test in vitro para así evaluar
esta actividad en la muestra de interés; pero es necesario considerar que los modelos
presentan diferentes variaciones ya que puede dificultar un poco la comparación de
los resultados entre un método y otro (Hernández, 2015).
II.2.4. Métodos de análisis
II.2.4.1. Cromatografía
Las técnicas cromatográficas se basan en la separación de las sustancias presentes
en una mezcla compleja al poner ésta en contacto con una fase móvil (líquido o gas)
y otra estacionaria (sólida o líquida) que permanece fija. Las sustancias van a migrar
a través de la fase estacionaria arrastradas por la fase móvil, a distinta velocidad
según su afinidad o solubilidad en una u otra fase. (Palomino, 2001)
Las sustancias más afines por la fase estacionaria migrarán más despacio, y las más
afines por la fase móvil, más deprisa. Ajustando los parámetros cromatográficos,
conseguiremos separar todos los componentes. Los tres tipos más comunes son la
cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de gases (CGL) y la de líquidos
(HPLC) (Palomino, 2001).
II.2.4.2. Cromatografía en Capa Fina (CCF)
Se emplea en controles de todo tipo de productos naturales, habiéndose establecido
como método analítico muy importante en las farmacopeas modernas. Permite
identificar de forma rápida y bajo coste los componentes presentes en un
15
determinado material vegetal. También se puede emplear como método
semicuantitativo. (Palomino, 2001)
II.2.4.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas
La cromatografía de gases-masas es una técnica que combina la capacidad de
separación que presenta la cromatografía de gases con la sensibilidad y capacidad
selectiva del detector de masas. Esta combinación permite analizar y cuantificar
compuestos trazas en mezclas complejas con un alto grado de efectividad. Esta
técnica está indicada para la separación de compuestos orgánicos volátiles y
semivolátiles. Hidrocarburos Poliaromáticos (PAHs), Pesticidas clorados y VOCs
son separados de forma adecuada mediante esta técnica. (Sarria, 2017)
16
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.1. Metodología de la investigación
El presente trabajo se basa en un método de investigación de tipo experimental,
según la finalidad de la investigación, se aplicó un método adecuado para la
extracción y la determinación de los compuestos presentes en el fruto, la misma que
se realizó en los Laboratorios de facultad de Ciencias Químicas de la Universidad
de Guayaquil.
III.2. Material vegetal en estudio
El material vegetal objeto de estudio fueron los frutos y se recolectaron entre los
meses de junio y agosto del 2017 en una Finca ubicada en la Provincia de Los Ríos
Cantón Quevedo, ubicada a 1°1´49”S y 79°24´48”E; se escogieron plantas adultas
de aproximadamente 15 a 25 m de altura en estado de floración-fructificación. Para
los análisis experimentales de la investigación se utilizaron dos variedades de
frutos, dulce y amarga.
III.3. Técnicas y Métodos
III.3.1. Análisis Macro-morfológico del fruto
Es una evaluación por medio de los órganos sensoriales en los cuales se tomará en
consideración: Morfología, tamaño, olor, color externo e interno y textura del
órgano vegetal (Miranda 2000).
Procedimiento:
Las características más relevantes a considerar son:
Estado de desarrollo
Condiciones: fresca, seca, completa o parte de ella.
Color.
Olor.
Peculiaridades.
17
III.4. Parámetros físico-químicos de las drogas crudas
III.4.1. Humedad residual.
Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó crisoles
tarados y para las pesadas una balanza analítica marca Sartorius. Los resultados se
obtuvieron a partir de la expresión:
Vf - Vi
Mx 100Hr =
Dónde:
Hr: humedad residual (%)
Vf: volumen final de agua (mL)
Vi: volumen inicial de agua (mL)
M: masa de la muestra (g)
100: factor matemático para el cálculo.
III.4.2. Sustancias solubles o extraíbles.
Se coloca 4,0 gramos de la muestra vegetal secado al aire, exactamente pesados, en
un matraz Erlenmeyer. Se añade 100ml del disolvente y pesar para obtener el peso
total incluyendo el matraz. Agitar bien y dejar reposar durante 1 hora. Se acopla un
condensador de reflujo al matraz y se hierve suavemente durante 1 hora, enfriar y
pesar. Ajustar al peso total original con el disolvente especificado en el
procedimiento de prueba para el material vegetal. Agitar bien y filtrar por succión
a través de un papel filtro seco.
Se transfiere 25 ml del filtrado a un plato de fondo plano y se evapora el contenido
hasta sequedad en un baño de agua. Secar a 105oC durante 2 horas, luego se enfría
en un desecador ´por 30 minutos y se procede a pesar.
FORMULA:
R.500.100
M (100-H)Ss =
18
Donde:
Ss: sustancias solubles (%)
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
H: humedad residual (%)
500 y 100: factores matemáticos para el cálculo.
III.4.3. Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido
clorhídrico al 10 %.
Para las determinaciones se empleó una mufla modelo SX2-12TP,
procedencia China. Las pesadas se realizaron en balanza analítica marca Sartorius.
Cada determinación se efectuó por triplicado a partir de 2 g de material.
III.4.3.1. Cenizas totales.
Los cálculos se efectuaron por la expresión siguiente:
CT =M2 - M
M1 - Mx 100
Donde:
Ct: cenizas totales (%)
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa del crisol con la muestra (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemático para el cálculo.
III.4.3.2. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %.
Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas
con ácido clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron según:
19
M2 - M
M1 - MB = x 100
Donde:
B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa del crisol con la porción de ensayo (g)
100: factor matemático para el cálculo.
III.5. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico
El tamizaje fitoquímico se realizó a la corteza del fruto, según
procedimiento descrito por Miranda y Cuéllar (2000). Se utilizó un sistema
de extracción con una batería de disolventes, de menor a mayor polaridad,
sobre el mismo material vegetal, para lograr que cada metabolito fuera
extraído adecuadamente según su selectividad por el disolvente empleado.
Las muestras se extrajeron sucesivamente con éter di etílico, etanol al
80 % y agua, para obtener los extractos correspondientes, los que fueron
sometidos a los diferentes ensayos. En las figuras 4 y 5 se muestran el
esquema general de extracción y los diferentes ensayos a realizar en cada
extracto obtenido, respectivamente.
20
Figura 4. Esquema de extracción del material vegetal para la
aplicación de técnicas de tamizaje fitoquimico
Figura 5. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a
realizar a los diferentes extractos
21
En cada caso para realizar los ensayos se procede de la siguiente manera:
Ensayo de Sudan.- En un tubo de ensayo colocar una alícuota del extracto del
material vegetal, agregar 1 mL de la solución de Sudán IV y llevar a baño de agua
hirviendo hasta evaporación del solvente, la presencia de una película o gotas de
color rojo en la superficie del tubo es indicativo de un ensayo positivo para
compuestos grasos.
Ensayos de Dragendorff, Mayer, Wagner.- Son pruebas cualitativas que permiten
identificar la presencia de alcaloides, para ello, si el extracto es acuoso se deberá
agregar para cada ensayo una alícuota del extracto previamente acidificada con 1
a 2 gotas de HCl concentrado y llevar a calentar, mientras, que si el extracto se
realizó con solventes orgánicos se procederá a evaporar y el residuo redisolverse
con 1 mL de HCl al 1% en agua, por último añadir 3 gotas del reactivo específico;
la presencia de opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado
(+++).
Ensayo de Baljet.- Es ideal para la identificación de coumarinas. Cuando el extracto
no es alcohólico, debe evaporarse el solvente en baño María y redisolverse con 1
mL alcohol; y al final se agrega 20 gotas del reactivo Baljet, la aparición de
coloración o precipitado rojo se considera positiva.
Ensayo de Borntrager.- Tomar una alícuota del extracto redisuelta en cloroformo
adicionar 1 mL de solución de hidróxido de sodio al 5 %, agitar mezclando las fases
y reposar. Si la fase acuosa alcalina se torna rosada o roja el ensayo se considera
positivo para quinonas.
Ensayo de Liebermann- Burchard.- Permite reconocer en un extracto la presencia
de triterpenos y/o esteroides por ambos tipos de productos poseer un núcleo del
androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. A una alícuota
del extracto redisuelta en cloroformo adicionar 1 mL de reactivo, y a continuación
observar el cambio rápido de coloración: Rosado azul (muy rápido); Verde intenso
(visible aunque rápido); Verde oscuro (final de la reacción).
22
Ensayo de resinas.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de la solución alcohólica
y 10 mL de agua destilada, la aparición de un precipitado sugiere la presencia de
resinas.
Ensayo de fehling.- Confirma la presencia de azucares reductores con la aparición
de un precipitado rojo, por ello, al residuo de una alícuota del extracto alcohólico
previamente disuelto con 2 mL de agua destilada, adicionar 2 mL del reactivo de
fehling y calentar en baño de agua caliente aproximadamente por 10 minutos, sin
embargo, si es un extracto acuoso agregar directamente el reactivo.
Ensayo de espuma.- En un tubo de ensayo transferir 2 mL de extracto y diluir con
5 veces su volumen en agua, mezclar fuertemente durante 10 minutos. Al presentar
espuma en la superficie del líquido de más de 2mm de altura y persistencia por más
de 2 minutos inmediatamente el ensayo se considera positivo para saponinas.
Ensayo de cloruro férrico.-Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos
y/ o taninos en un extracto vegetal, por ello, si el extracto es alcohólico a una
alícuota de este se le adicionan 3 gotas de cloruro férrico al 5% en solución salina
fisiológica. Si el extracto es acuoso a una alícuota del extracto se añade acetato de
sodio para neutralizar y 3 gotas de una tricloruro férrico al 5% en solución salina
fisiológica, un ensayo positivo puede sugerir la presencia de: Compuestos fenólicos
(Rojo-vino); taninos de tipo pirocatecólicos (verde intenso), taninos del tipo piro
pirogalotánicos (azul).
Ensayo Shinoda.- Exclusivo para la identificación de flavonoides en un extracto de
un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra el alcohol, se diluye con 1 mL
de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.
Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se
mezclan las bases y se deja reposar hasta que se separen.
Si la alícuota del extracto se encuentra en agua se procede de igual forma, a partir
de la adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo,
con el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos
todos los casos.
23
Ensayo de mucílagos.- Permite identificar estructuras de tipo polisacárido,
mediante la formación de coloide hidrófilo al enfriar entre 0-5 °C una alícuota del
extracto acuoso
Ensayo de principios amargos y astringentes.- Saborear 1 gota del extracto acuoso
y diferenciar el sabor de cada uno de estos principios al paladar.
III.6. Extracción sucesiva del material vegetal
El procedimiento seguido para la extracción del material vegetal, se expone en la
figura 6.
II.7. Cromatografía
Procedimiento
En la cámara se adiciona los solventes orgánicos (fase móvil) que son:
Hexano 10ml
Acetato etilo 5ml
Cloroformo 5ml
Metanol 2,5 ml
En la silicagel se mide 1 ml en la parte inferior la misma que será la línea de
referencia o de partida y 1,5 ml en la parte superior.
En la parte inferior se realizarán las punzadas con ayuda de un capilar, se realiza
una punzada se espere que se seque y luego se realiza la segunda punzada.
Luego la silicagel se la coloca en la cámara que esta con la fase móvil y se espera
hasta que los solventes corran o se desplacen sobre la fase fija.
Si en la silicagel al ser expuesta a la luz UV muestra manchas de colores significa
que existe la presencia de grupos cromóforos altamente saturados.
Luego se adiciona ácido sulfúrico al 50% en etanol el mismo que se lo emplea como
revelador no selectivo (revela todos los compuestos).
Rf=distancia recorrida por el soluto
distancia recorrida por la fase movil
24
Figura 6. Esquema de la extracción sucesiva del material vegetal.
500 g de material vegetal, seco y molido
Extracción por maceración7 días con Hexano
Filtrar
EXTRACTOHEXANO
Residuo
Extracción por maceración7 días con Diclorometano
Filtrar
EXTRACTODCM
Residuo
Extracción por maceración7 días con Acetato de etilo
Filtrar
EXTRACTOACETATO DE ETILO
ResiduoExtracción por maceración7 días con Butanol
Filtrar
EXTRACTOBUTANOL
ResiduoExtracción por maceración7 días con Metanol
Filtrar
EXTRACTOMETANOL
ResiduoDESECHAR
25
III.6.1. Análisis por cromatografía gaseosa.
Los extractos no polares se analizaron mediante el uso de un cromatógrafo de gases
Agilent Technologies acoplado a un espectrómetro de masas (sistema 7890A GC y
5975C inerte XL MSD con detector de triple eje). Las condiciones de trabajo fueron
las siguientes: Columna capilar HP-55% Phenyl Methyl Siloxan 325° C: 30 m x
320 µm x 0.25 µm. La temperatura inicial del horno se mantuvo a 70° C durante
2,0 minutos, luego se aumentó a 300° C a 5° C/min, donde se mantuvo por 6
minutos. El espectrómetro de masas fue operado a 70eV en modo full scan desde
40-1000 UMA. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuadrupolo 150°
C. Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas portador
helio a 1 mL/min. Los compuestos se identificaron mediante la comparación de sus
espectros de masas y la referencia de masa de Wiley 9th con NIST 2011 MS Library
tomando en cuenta aquellos con un porcentaje de similitud del 95% o superior.
26
CAPITULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION
La recolección de las dos variedades de frutos de achotillo, se realizó en el mes de
octubre del 2018. Cabe resaltar que el tratamiento de secado tuvo que ser inmediato
puesto que por el alto contenido de agua la corteza del fruto pierde sus propiedades
con prontitud.
Luego se realizó la limpieza y el análisis macroscópico de los frutos de las dos
variedades, las características se detallan en la tabla II.
Tabla II. Análisis Macroscópico de los Frutos
MACROSCOPIA
IMAGEN DE CADA
VARIEDAD ASPECTO
DULCE
Fruto esquizocarpo, profundamente partido en 2-3
mericarpios es grande redondeado, rojo, su corteza
delgada, semilla con arilo carnoso, blanco-
translúcido y muy jugoso.
AMARGA
Fruto esquizocarpo, profundamente partido en 2-3
mericarpios es pequeño ovalado, rojo amarillento-
verdoso, su corteza es gruesa, semilla con arilo
carnoso, blanco-translúcido jugoso.
Elaborado por: (Batioja & Lara)
27
Con la ayuda de un vernier se procedió a medir el largo y ancho de los frutos que
representaban nuestra muestra obtenida a partir de un total de 1000 frutos por
variedad, nuestros ejemplares medidos fueron 278, en la tabla 3 se presentan las
medidas promedio de cada variedad, y la desviación estándar correspondiente.
Tabla III. Medidas de los frutos de N. Lappaceum
Variedad Largo Ancho
Dulce 38.61 ± 0.08 32.90 ± 0.06
Amarga 33.21 ± 0.05 25.63 ± 0.04
Elaborado por: (Batioja & Lara)
Con las medidas descritas se pudo corroborar que los frutos de la variedad dulce
son más grande y de forma redondeada mientras que los frutos de la variedad
amarga son pequeños y ovalados.
Para continuar con el estudio se realizó el tratamiento de la muestra. Separamos la
corteza de la pulpa, siendo la corteza la parte de interés.
Se procedió a secar la muestra en la estufa para evitar que microorganismos
provocaran la descomposición de la misma, esta muestra seca fue triturada donde
se obtuvo 1352, 9g de la variedad dulce y 1987,2 de la variedad amarga.
Para las dos variedades de corteza objeto en estudio se determinaron los parámetros
físicos- químicos, los resultados se detallan en la tabla 4.
28
Tabla IV. Determinación de parámetros físicos-químicos en las muestras de las
dos variedades
PARÁMETROS
MUESTRA (CORTEZA DEL FRUTO)
Variedad dulce Variedad amarga
Humedad residual 2,931 ± 0,06 4,440 ± 0,26
Cenizas totales 3,046 ± 0,032 3,275 ± 0,08
Cenizas insolubles en HCl 99,950 ± 0,037 99,927 ± 0,047
Sustancias
solubles
Hexano 2,64 ± 0,065 10,95 ± 0,03
Acetato de
etilo 22,61 ± 0,025 31,40 ± 0,01
Etanol 80% 35,18 ± 0,041 43,36 ± 0,032
Etanol 50% 25,16 ± 0,038 26,78 ± 0,016
Agua 12,57 ± 0,016 16,58 ± 0,01
Elaborado por: Batioja & Lara
El contenido de agua en la muestra se determinó con el análisis de humedad
residual, este se ve dado por la pérdida de peso de la muestra seca, esta prueba
indicó que la variedad dulce presentaba menor porcentaje de humedad residual, y
la corteza amarga mostraba mayor porcentaje de humedad.
Se pudo deducir que la variedad dulce presentaba menor porcentaje de humedad
debido a que su corteza es más delgada y su mayor contenido de agua se encuentra
en la pulpa, mientras que la corteza de la variedad amarga tenía mayor espesor y su
pulpa era menos jugosa.
29
En la determinación de cenizas se demostró que la variedad amarga tenía mayor
contenido de material inorgánico.
La determinación de sustancias solubles se basa en la solubilidad de sustancias
activas en un solvente determinado, esta prueba se realiza cuando no se conoce la
acción de las sustancias activas y composición de la muestra en estudio.
Se realizó la prueba con hexano, acetato de etilo, etanol 80% etanol 50% y agua,
con estos disolventes se demostró que la corteza de la variedad amarga presentaba
mayor contenido de sustancias solubles. La mayor solubilidad de sustancias se dio
en etanol 80% y acetato de etilo.
El tamizaje fitoquímico permite determinar cualitativamente los principales grupos
químicos presentes en una droga y a partir de allí, orientar la extracción y/o
fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés.
Para el tamizaje fitoquímico se realizaron tres maceraciones: éter, metanol y agua,
también se utilizaron los extractos obtenidos en el análisis de sustancias solubles.
Los resultados se exponen en las tablas 5, 6 y 7.
Tabla V. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto etéreo
Ensayo Extracto etéreo
Extractos de sustancias solubles.
Acetato de etilo Hexano
Dulce Amarga Dulce Amarga Dulce Amarga
Sudan
(compuestos grasos) - - + + + +
Dragendorff
(alcaloides) + + + + - -
Baljet
(lactonas y coumarinas) - - - - - -
Liebermann Buchard
(triterpenosesteroides) + + - - - -
Elaborado por: Batioja & Lara
30
Tabla VI. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto alcohólico
Ensayo Extracto alcohólico
Extractos de
sustancias solubles.
Etanol 80%
Dulce Amarga Dulce Amarga
Liebermann Buchard
(triterpenosesteroides) - - - -
Dragendorff
(alcaloides) + + - -
Cloruro Férrico
(fenoles y taninos) ++ ++ ++ ++
Fehling
(azucares reductores) - - - -
Shinoda
(flavonoides ) ++ ++ ++ ++
Baljet
(lactonas y coumarinas) + + - -
Elaborado por: Batioja & Lara
Tabla VII. Resultado del Tamizaje Fitoquímico con el extracto acuoso
Ensayo Extracto acuoso
Extractos de sustancias solubles.
Agua Etanol 50%
Dulce Amarga Dulce Amarga Dulce Amarga
Cloruro Férrico
(fenoles y taninos) +++ +++ +++ +++ +++ +++
Shinoda
(flavonoides ) +++ +++ ++ ++ - -
Dragendorff
(alcaloides) + + + + - -
Fehling
(azucares reductores) ++ ++ + + - -
Espuma
(saponinas) + + + + - -
Elaborado por: Batioja & Lara
31
Los resultados de la tabla V pusieron de manifiesto que en los extractos obtenidos
para las sustancias solubles con acetato de etilo y hexano existían trazas de
compuestos grasos, el ensayo para alcaloides dio positivo en extracto etéreo y en
acetato de etilo, por último el extracto etéreo presentó triterpenos/esteroides.
Cabe destacar que cuando en un extracto suele haber presencia de compuestos con
agrupaciones lactónicas o azúcares, el ensayo de alcaloides da positivo, ya que el
reactivo de Dragendorff precipita con estos compuestos. Se supone por tanto que el
ensayo para alcaloides debe ser producto de un falso positivo, pues en la familia
Sapindaceas no se informa la presencia de estos compuestos.
En la tabla VI se demostró que la corteza en estudio contenía compuestos fenólicos
en todos los extractos, puesto que los ensayo para fenoles, tanino y flavonoides
dieron altamente positivo, los extractos acuosos indicaron presencia de azucares
reductores.
En la tabla VII quedó evidenciado que la corteza del fruto N. lappaceum tenía un
porcentaje representativo de compuestos fenólicos, además de presentar una ligera
presencia de lactonas y coumarinas.
El estudio se continuó con la extracción sucesiva de las sustancias activas del
material vegetal en estudio, la misma se realizó a partir de solventes apolares y
terminó con solventes polares: Hexano, Diclorometano, Acetato de etilo, Butanol y
Metanol.
Con los extractos obtenidos se realizó una cromatografía en capa fina, y esta
permitió separar los componentes de cada uno de los extractos. Los resultados se
muestran en la figura 7.
32
Figura 7. Cromatogramas de Capa fina realizados a los extractos obtenidos.
No se apreciaron diferencias notables en los extractos, con excepción del extracto
de acetato de etilo donde observó una mancha intensa para la variedad dulce, no
distinguible para la variedad amarga. Con el sistema de disolvente empleado, los
extractos butanólicos y metanólicos no desarrollaron buena separación. Los valores
Rf de las manchas de mayor intensidad para los extractos de hexano, dicloro metano
y acetato de etilo se presentan en la tabla VIII.
Tabla VIII. Resultado del factor de retención en la cromatografía de capa fina
Extracto Factor de retención
Dulce Amarga
Hexano 0.71 0.75
Diclorometano 0.74 0.79
Acetato de etilo 0.64 0.64
Elaborado por: Batioja & Lara
El análisis por cromatografía en capa fina, permitió demostrar que la muestra en
estudio de ambas variedades tiene componentes similares, ya que así lo manifiesta
el factor de retención con los valores cercanos.
33
Análisis de los extractos por cromatografía de gases acoplado a espectrometría
de Masas (CG/EM)
Constituyó un objetivo de este trabajo, realizar un análisis de los extractos de baja
polaridad por el sistema acoplado CG-EM, para de esta forma identificar los
componentes de estas fracciones y la similitud o no de las variedades objeto de
estudio.
Los cromatogramas gaseosos analíticos de los extractos hexánicos de los frutos de
las variedades amarga y dulce, se presentan en la figura 8.
Figura 8. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extracto hexanicos de la
corteza de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2).
34
Se observó que existen diferencias en los perfiles cromatográficos de los extractos
hexánicos de la corteza del fruto de las variedades amargas y dulces. El equipo
registró un total de 48 picos cromatográficos para el extracto de la corteza amarga
y 75 para el de la corteza dulces, que a pesar de registrar menor intensidad resultó
de mayor complejidad.
De los 48 compuestos registrados para la variedad amarga, pudieron asignársele
estructura a 19 compuestos, mientras que de los 75 compuestos registrados por el
equipo para la variedad dulce se identificaron 22, en todos los casos por
comparación de los espectros con los de la biblioteca del equipo.
Los extractos obtenidos con hexano estuvieron fundamentalmente constituidos por
ésteres de ácidos grasos e hidrocarburos (Tabla IX).
De los 19 compuestos identificados en el extracto de la variedad amarga, 16 se
encontraban presentes en la variedad dulce, al igual que de los 22 componentes
identificados en la variedad dulce, 16 estaban presentes en la variedad amarga.
Los compuestos presentes en la variedad amarga, no encontrado en la variedad
dulce fueron el ácido linoleico (Acido 9,12- octadecadienoico), que es uno de los
componentes mayoritarios de este extracto; el β 14-H-Pregnano y el escualeno.
En el extracto de la variedad dulce, los ácidos grasos 9-hexadecenoico,
heptadecanoico, octadecanoico y cis-11 eicosenoico, no se encontraron en la
variedad amarga; así como el hidrocarburo tricosano y el α-tocoferol.
Además de las diferencias cualitativas entre ambos extractos, desde el punto de
vista cuantitativo, se observaron también diferencias.
El componente mayoritario del extracto hexánico de la variedad amarga fue el
Ácido cis-11-octadecenoico (ácido vaccénico, 22, 25 %), el cual lo fue también para
la variedad dulce, pero en este caso el porcentaje de abundancia fue de 47,67 %.
Tabla IX. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM
en el extracto hexano
35
VARIEDAD AMARGA VARIEDAD DULCE
TIEMPO DE RETENCION
COMPUESTO PORCENTAJE ABUNDANCIA
TIEMPO DE RETENCION
COMPUESTO PORCENTAJE ABUNDANCIA
24,609 Ácido tetradecanoico 0,32 24,665 Ácido tetradecanoico 0,41
27,993 Ácido hexadecanoico, metil éster
0,85 27,998 Ácido hexadecanoico, metil éster
0,57
28,328 Acido 9-hexadecenoico 0,66
28,952 Ácido hexadecanoico 16,58 29,164 Ácido hexadecanoico 19,83
29,336 Ácido hexadecanoico, etil éster
1,44 29,359 Ácido hexadecanoico, etil éster
1,25
30,676 Ácido heptadecanoico 0,30
31,162 Acido 9,12- octadecadienoico, metil éster
0,69 31,174 Acido 9,12- octadecadienoico, metil éster
0,48
32,169 Acido 9,12- octadecadienoico 19,98
32,320 Ácido cis-11-octadecenoico 22,25 32,576 Ácido cis-11-octadecenoico 47,67
32,827 Ácido octadecanoico 2,39
32,892 Ácido hexadecanoico, butil éster
0,85 32,924 Ácido hexadecanoico, butil éster
0,55
34,901 Tricosano 0,23
35,535 Ácido cis-11 Eicosenoico 0,48
36,542 Tetracosano 0,57 36,563 Tetracosano 0,59
37,606 β 14-H-Pregnano 0,55
38,135 Pentacosano 1,19 38,164 Pentacosano 1,34
39,668 Hexacosano 1,88 39,698 Hexacosano 2,05
41,161 Heptacosano 4,33 41,197 Heptacosano 4,83
42,575 Octacosano 2,23 42,611 Octacosano 2,00
42,693 Escaleno 2,25
43,968 Nonacosano 8,30 43,998 Nonacosano 5,12
45,796 γ Tocoferol 8,34 45,818 γ Tocoferol 4,87
46,795 α Tocoferol 0,99
48,292 Estigmasterol 3,56 48,314 Estigmasterol 2,57
49,645 β- Amirina 0,97 49,662 β- Amirina 0,80
El ácido linoleico fue el segundo componente de mayor abundancia en la variedad
amarga con un 19,98 % de abundancia
36
El otro componente mayoritario para ambas especies fue el ácido hexadecanoico
(palmítico), con un porcentaje de abundancia de 16,58 % para la variedad amarga
y un 19,83 % para la dulce.
De los componentes presentes es importante señalar al ácido vaccénico, (Omega 7),
el cual está presente en grasas vegetales y animales y para el cual se informan
propiedades como hipocolesterolémicos, disminuyendo el colesterol total, LDL y
triglicéridos (Wang y Proctor, 2008). Este compuesto se informa por primera vez
en la corteza del fruto de especie.
Los cromatogramas gaseosos analíticos de las fracciones de diclorometano se
presentan en la figura 9.
Para este extracto se encontró mayor similitud cromatográfica. Del 19 picos
cromatográficos registrados para el extracto de la variedad amarga, se identificaron
14; mientras que de los 24 registrados para la variedad dulce se identificaron 9.
Es importante señalar que de los 14 componentes de la variedad amarga, sólo tres
compuestos no se habían identificado en el extracto hexánico que fueron los
hidrocarburos heneicosano, docosano y nonadecano.
De los compuestos identificados en el extracto de la variedad dulce, todos se
encontraban presentes en el extracto hexánico.
Se destaca también que el componente mayoritario de la fracción resultó también
el ácido cia 11-vaccénico para ambas variedades, con porcentajes de 23,35 % y
26,93 % para las variedades amarga y dulce, respectivamente.
El otro componente mayoritario de la fracción el àcido hexadecanoico (palmítico),
con porcentajes superiores a los encontrados en la fracción hexánica (26,67 % var.
amarga; 25,37 % var. dulce).
37
El ácido linoleico, el cual no fue detectado en el extracto hexánico de la variedad
dulce, aparece en este extracto dentro de los componentes mayoritarios de ambas
variedades. En la tabla X. se exponen los componentes identificados en esta
fracción.
Figura 9. Cromatogramas gaseosas analíticos de los extractos DCM de la
corteza de los frutos de las variedades amarga (1) y dulce (2).
38
Tabla X. Cuadro comparativo de los compuestos identificados por CG-EM en el
extracto DCM
VARIEDAD AMARGA VARIEDAD DULCE
TIEMPO DE RETENCION
COMPUESTO PORCENTAJE ABUNDANCIA
TIEMPO DE RETENCION
COMPUESTO PORCENTAJE ABUNDANCIA
28,78 Ácido Hexadecanoico 26,67 28,73 Ácido Hexadecanoico 25,37
31,93 Ácido hexadecanoico, etil ester
2,13
31,93 Acido 9,12-Octadecadienoico
15,96 31,88 Acido 9,12-Octadecadienoico
19,01
32,07 Ácido cis-11-octadecenoico
23,35 32,02 Ácido cis-11-octadecenoico
26,93
32,45 Ácido Octadecanoico 4,12 32,42 Ácido Octadecanoico 6,19
32,85 Ácido Hexadecanoico, butil éster
2,76 32,84 Ácido Hexadecanoico, butil éster
4,76
36,51 Tetracosano 1,83
38,10 Heneicosano 2,79
39,63 Hexacosano 2,99 39,61 Hexacosano 4,97
41,097 Heptacosano 4,80
41,109 Docosano 3,69
42,528 Nonadecano 2,79
43,902 Heptacosano 3,26
43,89 Nonacosano 4,68
45,73 γ Tocoferol 2,36 45,72 γ Tocoferol 3,29
48,27 Estigmasterol 5,29
El análisis de los resultados, permitió corroborar, que por el método de extracción
por maceración, no permite agotar la droga ya que la mayoría de los componentes
identificados en este extracto, incluyendo los mayoritarios, ya se habían
identificado en el extracto hexánico.
39
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
V.1 CONCLUSIONES
Las características macroscópicas y los parámetros físicos-químicos,
permitieron establecer previas diferenciaciones entre las variedades
amarga y dulce de Nephelium lappaceum.
Con el estudio cualitativo de la droga, se determinó que los metabolitos
secundarios más abundantes en los extractos fueron: compuestos grasos,
triterpenos/esteroles y compuestos fenólicos.
Se estableció una metodología para la extracción de los metabolitos
secundarios de la corteza de los frutos, empleando una extracción
sucesiva con disolventes de polaridad creciente.
En el análisis por el sistema acoplado cromatografía gaseosa-
espectrometría de masas, se observaron diferencias cuali y cuantitativas
entre los extractos de las dos variedades.
El componente mayoritario para ambas variedades fue el ácido cis-11-
vaccénico, informado por primera vez para la especie.
40
V.2 RECOMENDACIONES
Completar los estudios con las fracciones polares.
Realizar el estudio genético de las variedades de Nephelium lappaceum
41
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43
ANEXOS
Anexo 1. Recolección del Fruto
Anexo 2. Corteza de los frutos amargos de Nepphelium
lappaceum L.
44
Anexo 3. Corteza de los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L.
Anexo 4. Medir los frutos amargos de Nepphelium lappaceum L.
45
Anexo 5. Medir los frutos dulce de Nepphelium lappaceum L.
Anexo 6. Secado de la corteza dulce y amargo de Neppelium
lappaceum L.
46
Anexo 7. Triturado de la corteza dulce y amrga de Nepphelium
lappaceum L.
Anexo 8. Molienda de la corteza dulce y amrga de Nepphelium
lappaceum L.
47
48
Anexo 9. Enasayo de Humedad Residual
49
Anexo 10. Ensayo de cenizas totales e insolubles
50
Anexo 11. Ensayo de Sustancias Solubles
51
Tamizaje Fitoquímico
Anexo 12. Extracto acuoso Cloruro Férrico
Anexo 13. Extracto acuoso Dragendorff
52
Anexo 14. Extracto acuoso Fehling 1
Anexo 15. Extracto acuoso Fehling 2
53
Anexo 16. Extracto acuoso Na OH 1
Anexo 17. Extracto acuoso Na OH 2
54
Anexo 18. Extracto acuoso Shinoda 1
Anexo 19. Extracto acuoso Shinoda 2
55
Anexo 20. Extracto alcohólico Baljet
Anexo 21. Extracto alcohólico Cloruro Férrico
56
Anexo 22. Extracto alcohólico Dragendorff
Anexo 23. Extracto alcohólico Fehling
57
Anexo 24. Extracto alcohólico Liebermann Burchard
Anexo 25. Extracto alcohólico Shinoda
58
Anexo 26. Extracto etéreo Baljet
Anexo 27. Extracto etéreo Liebermann Burchard
59
Anexo 28. Extracto etéreo Sudan
Anexo 29. Maceración para Extracción Sucesiva
60
Anexo 30. Muestra filtrada lista para Rota-evaporar
Anexo 31. Rotaevaporando la muestra
61
Anexo 32. Extractos obtenidos con el Rotaevaporador
62
Anexo 33. Cromatografía Capa Fina de los extractos de N.
lappaceum L.