~ i ~

Universidad de Granada Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud

Centro de Investigación Biomédica Instituto de Biotecnología

Facultad de Medicina

Departamento de Fisiología

BENEFICIO DEL TRATAMIENTO CON

MELATONINA EN PACIENTES AFECTOS DE ENFERMEDAD DE DUCHENNE: ESTUDIO

FUNCIONAL Y BIOQUÍMICO PRELIMINAR

Mariam Chahbouni El mansouri

Granada, 2011

Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Mariam Chahbouni El mansouriD.L.: GR 611-2012ISBN: 978-84-694-6669-8

~ ii ~

Certificaciones

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D. DARÍO ACUÑA CASTROVIEJO, Catedrático de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, certifica que: Dña. Mariam Chahbouni Elmansouri, Licenciada en Farmacia, ha realizado bajo mi dirección en el Instituto de Biotecnología, Centro de Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, y Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, el presente trabajo de investigación, titulado: “BENEFICIO DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EN PACIENTES AFECTOS DE ENFERMEDAD DE DUCHENNE ESTUDIO FUNCIONAL Y BIOQUÍMICO PRELIMINAR”, que ha sido objeto de su Tesis Doctoral, reuniendo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Granada, 16 de mayo de 2011 El director, El interesado,

Fdo.: Darío Acuña Castroviejo Fdo.: Mariam Chahbouni Elmansouri

~ iv ~

Dña. GERMAINE ESCAMES ROSA, Profesora Titular de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, certifica que: Dña. Mariam Chahbouni Elmansouri, Licenciada en Farmacia, ha realizado bajo mi dirección en el Instituto de Biotecnología, Centro de Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, y Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, el presente trabajo de investigación, titulado: “BENEFICIO DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EN PACIENTES AFECTOS DE ENFERMEDAD DE DUCHENNE ESTUDIO FUNCIONAL Y BIOQUÍMICO PRELIMINAR”, que ha sido objeto de su Tesis Doctoral, reuniendo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Granada, 16 de mayo de 2011 El director, El interesado,

Fdo.: Germaine Escames Fdo.: Mariam Chahbouni Elmansouri

~ v ~

A mis padres, Darifa y Marzouk, por su constante apoyo, amor y comprensión

~ vi ~

“Aún cuando posiblemente

nunca encuentre, mientras pueda,

seguiré buscando”

José Saramago

“Es de gran alivio conocer

las propias limitaciones”

Albert Einstein

~ vii ~

Agradecimientos

~ viii ~

En primer lugar, quiero expresar mi más sincera gratitud al Prof. Darío Acuña Castroviejo, Catedrático de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, por haberme permitido realizar bajo su dirección el presente trabajo de investigación, así como depositar su confianza en mí, contribuyendo enormemente a terminar de despertar en mí el entusiasmo por la ciencia. Gracias por compartir conmigo ese cúmulo de conocimientos que posees y por el apoyo prestado en todo este tiempo.

Del mismo modo quiero hacer constar mi agradecimiento más cariñoso a la Prof. Germaine Escames por su predisposición permanente para brindarme ayuda en todo momento, así como por compartir conmigo generosamente su experiencia y valores vitales. De todo corazón, muchas gracias.

A mi esposo Abdelmajid por su constante ayuda y apoyo durante todo el largo proceso de elaboración de este trabajo y por estar ahí en los momentos difíciles. Gracias a ti esta Tesis Doctoral ha visto la luz. Por todo GRACIAS.

A mis padres, Darifa y Marzouk, a mis hermanos, abuela y amigos, que me han ofrecido todo lo necesario para poder llevar a cabo este trabajo, contando siempre con su apoyo y con su afecto.

Agradecimiento a los pediatras: a Belén Sevilla, en especial a Antonio Molina Carballo, y a todos los niños con DMD, así como a sus padres que con su colaboración ayudan de forma desinteresada a sacar este estudio hacia delante.

Gracias a las compañeras de Bioquímica de la Facultad de Medicina: Toñi, Laura, Pepi que me han recogido las muestras y me han facilitado los datos de los pacientes.

A todos mis compañeros de laboratorio, tanto a los que conocí al inicio, durante y al final de mi ciclo en el laboratorio, por su ayuda y colaboración, pero sobre todo, por su generosidad y su amistad. Con ellos he compartido momentos inolvidables durante estos cuatro años.

Gracias a María del Carmen Sierra (Servicio de Análisis Clínicos), que me ha aconsejado continuamente y me ha animado a seguir trabajando.

A toda las personas que de alguna forma han colaborado para que esta tesis viese algún día la luz.

Finalmente, agradezco a la Fundación Hospital Clínico por el soporte institucional que han prestado a la realización de este estudio.

A todos, muchas gracias.

~ ix ~

Financiación

y Publicaciones

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I. FINANCIACIÓN

Este trabajo de investigación se ha llevado a cabo gracias a la financiación de las siguientes instituciones y proyectos de investigación: A. Beca predoctoral Beca de investigación Entidad financiadora: AECI: Agencia española de Cooperación internacional Duración: 2005-2008

B. Proyectos de Investigación B.1 Consejería de Sanidad, Junta de Andalucía Impacto del tratamiento con corticoides y/o melatonina en pacientes afectos de enfermedad de Duchenne u otros tipos de distrofia muscular. Estudio funcional y bioquímico preliminar. Grupo de Investigación CTS-101: Comunicación Intercelular.

B.2. Consejería de Economía, Innovación y Ciencia

Mecanismos de acción de la melatonina. Grupo de Investigación CTS-101: Comunicación Intercelular.

II. PUBLICACIONES RELACIONADAS CON ESTA TESIS DOCTORAL

A. Artículos en revistas

Autores: Chahbouni M, Escames G, Venegas C, Sevilla B, García JA, López LC, Muñoz-Hoyos A, Molina-Carballo A, Acuña-Castroviejo D. Título: Melatonin treatment normalizes plasma pro-inflammatory cytokines and

nitrosative/oxidative stress in patients suffering from Duchenne muscular dystrophy

Ref. Revista: J Pineal Res 2010; 48:282-289.

Autores: Chahbouni M, Escames G, López LC, Sevilla B, Doerrier C, Muñoz-Hoyos A, Molina-Carballo A, Acuña-Castroviejo D.

Título: Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes of patients suffering from Duchenne muscular dystrophy

Ref. Revista: Clin Biochem 2011; doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001.

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B. COMUNICACIONES A CONGRESOS

Autores: Chahbouni, M., Fernández, A., Puertas, A., del Pino, A., García, L., Escames, G., and Acuña-Castroviejo, D.

Título: Melatonin treatment reduces oxidative/nitrosative stress in Duchenne patients Tipo de Participación: comunicación Congreso: XXXV Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas (SECF) Publicación: Acta Physiologica Año: 2009 Lugar de Celebración: Valencia (España)

Autores: Venegas, C., López, A., Ortiz, F., Dayoub, J. C., Chahbouni, M., Escames, G., and Acuña-Castroviejo, D.

Título: Liver and brain subcellular distribution and synthesis regulation of melatonin Tipo de Participación: comunicación Congreso: XXXV Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas (SECF) Publicación: Acta Physiologica Año: 2009 Lugar de Celebración: Valencia (España)

Autores: Chahbouni M Título: Efecto de melatonina sobre el estrés oxidativo en pacientes con enfermedad de

Duchenne Tipo de Participación: comunicación Congreso: Endocrine and Neural Systems in Aging Año: 2008 Lugar de Celebración: Carmona (Sevilla)

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Abreviaturas

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HNE: 4-hidroxinonenal

ADN: ácido desoxirribonucleico

ARN: ácido ribonucleico

aFMK: N1-acetil-N2-formil-5-

Metoxiquinurenamina

ALT: alanina amino transferasa

AST: aspartato amino transferasa

aMT: melatonina

RH•3 : adrenalina

RH•3 : adenocromo

CAT: catalasa

CPK: creatina phosphokinasa

DAG: gluproteinas asociadas a

distrofina

DMD: Distrofia muscular de Duchenne.

CDNB: 1-cloro-2,4-dinitrobeceno

ECM: matriz extracelular

G6PDH: glucosa 6- fosfato

deshidrogenasa

GPx: glutatión peroxidasa

GRd: glutation reductasa

GSH: glutatión reducido

GSSG: glutatión oxidado

GT: glutatión total

H2O2: peróxido de hidrógeno

Hb: hemoglobina

HO•: radical hidroxilo

IFN-γ: interferon gamma

IGF: factor de crecimiento semejante a

Insulina

IL-2: interleuquina 2

IL-6: interleuquina 6

IL-β: interleuquina beta

iNOS: óxido nítrico sintasa inducible

nNoS: óxido nítrico sintasa neuronal

LDH: lactato dehedrogenasa

LPO: peroxidación lipídica

MDA: malonildialdehído

NADPH: dinucleótido de nicotinamida

y de adenina fosfato reducido

NEDA: naftil-etilen-diamina

NEM: N-etilmaleinimida

NF-kB: factor nuclear kappa B

NMFI: N-metil-2-fenilindol

NO•: óxido nítrico

O2¯•: anión superóxido

ONOO¯: radical peroxinitrito

RNS: especies reactivas de nitrógeno

ROS: especies reactivas de oxígeno

SOD: superóxido dismutasa

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Índice

~ xv ~

INTRODUCCIÓN 1 I.DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE 2

1. CONCEPTO DE DISTROFIA MUSCULAR 2 2. DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE 2

2.1. Definición. 2 2.2. Fisiopatología. 2

3. FUNCIONES DE LA DISTROFINA. 2 3.1. Distrofina y citoesqueleto. 3 3.2. Distrofina y cerebro. 3

4. PATOGENIA. 5 4.1. Papel del estrés oxidativo, nitrosativo, en la distrofia muscular. 5

4.1.1. Generalidades. 5 4.1.2. Estrés oxidativo mitocondrial y Enfermedad de Duchenne. 7 4.1.3. Factores inflamatorios y Enfermedad de Duchenne. 9

4.1.3.1. La paradoja del NO• en la patología de Duchenne. 11 5. DIAGNOSTICO DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE 11 6. CLÍNICA DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE 12 7.TRATAMIENTO DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE 13

7.1. Medicamentos. 14 7.2. Tratamientos concomitantes. 15

II. MELATONINA 15 1. Propiedades de la melatonina. 17

1.1. Melatonina y estrés oxidativo. 17 1.2. Melatonina y sistema inmunológico. 18 1.3. Utilidad de la melatonina en la enfermedad de Duchenne. 19

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 21

I-Hipótesis. 22 II-Objetivos. 22

PACIENTES Y MÉTODOS 23 I. PACIENTES Y TRATAMIENTO. 24 II.OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. 24

2.1. Obtención del plasma y glóbulos rojos. 24 2.2. Métodos analíticos. 24

2.2.1. Método de determinación de hemoglobina. 24 2.2.2. Determinación de la actividad glutation peroxidas (GPx) y la

glutation reductas (GRd).

25 2.2.3. Determinación de los niveles de glutation reducido (GSH) y

. glutation oxidado (GSSG).

25 2.2.4. Determinación de la peroxidación lipídica (LPO). 26 2.2.5. Determinación de los niveles plasmáticos de nitritos. 26 2.2.6. Determinación de los niveles de la glutation transferasa

(GST).

27 2.2.7. Determinación de la actividad superóxido dismutasa (SOD). 27 2.2.8. Determinación de los niveles de citoquinas. 27 2.2.9. Determinación de de la concentración de melatonina en plasma. 27 2.2.10. Determinación de marcadores plasmático de daño muscular. 28

III-ANÁLISIS ESTADÍSTICO 28

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RESULTADOS 29

I. RESULTADOS DEL ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO 30 1.1. Niveles de GSH y GSSG en hematíes de los pacientes con DMD. 30 1.2. Actividad eritocitaria de GPx y GRd. 31 1.3. Actividad eritrocitaria de la GST. 31 1.4. Actividad eritrocitaria de la superoxido dismutasa (SOD). 32

II. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE DAÑO INFLAMATORIO 33 2.1. Niveles plasmáticos de peroxidación lipídica (LPO). 33 2.2. Niveles plasmáticos de IL-1β, IL-2 e IL-6. 34 2.3. Niveles plasmáticos de TNF-α, INF-γ. 34 2.4. Niveles plasmáticos de de nitritos (NOx). 35 2.5. Niveles plasmáticos de melatonina. 36

III. RESULTADOS DE LOS MARCADORES DE DAÑO MUSCULAR 36 DISCUSIÓN 38

I. ASPECTOS GENERALES 39 II. MELATONINA, ESTRÉS OXIDATIVO Y DMD 40 III. MELATONINA, INFLAMACIÓN Y DMD 42 IV. ASPECTOS GLOBALES DEL TRATAMIENTO CON

MELATONINA EN LA DMD 45

CONCLUSIONES 46 BIBLIOGRAFÍA 48 ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS. Tabla 1. Datos Bioquímicos obtenidos de pacientes con la DMD y de controles. 37 Figura 1. Unión de la distrofina a los diferentes complejos. 4 Figura 2. Cadena de transporte de electrones. 8 Figura 3. Estructura química de la molécula de melatonina. 15 Figura 4. Mecanismo de neutralización de un radical hidroxilo y un radical anión superóxido por la melatonina.

17

Figura 5. Variación en el metabolismo intracelular de glutatión 30 Figura 6. Actividad de las enzimas GPx y GRd en el grupo control y en pacientes tratados con melatonina.

31

Figura 7. Niveles de GST en el grupo control y en pacientes tratados con melatonina.

32

Figura 8. Actividaes de la SOD en el grupo control y en el grupo tratado con melatonina.

32

Figura 9. Niveles plasmáticos de LPO en el grupo control y en pacientes antes y . tras el tratamiento con melatonina.

33

Figura 10: Niveles plasmáticos de IL-1β, IL-2 e IL-6 en el grupo control y en . pacientes antes y durante el tratamiento con melatonina.

34

Figura 11: Niveles plasmáticos de TNF-α e INF-γ en el grupo control y en . pacientes antes y después del tratamiento con melatonina.

35

Figura 12: Niveles en plasma de NOx en el grupo control y en patientes antes y después del tratamietno con melatonina.

35

Figura 13: Niveles plasmáticos de melatonina en el grupo control y en patientes . antes y durante el tratamiento con melatonina.

36

1

Introducción

2

I. DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

1. CONCEPTO DE DISTROFIA MUSCULAR

El termino distrofia muscular hace referencia a un grupo de enfermedades hereditarias progresivas. Las distrofias musculares son miopatías de origen genético, hereditarias y afectan a todas las razas. Cada tipo de distrofia muscular presenta características fenotípicas y genéticas exclusivas (1).

2. DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

2.1. Definición

Descrita por primera vez en 1861, el nombre se le puso en honor al neurólogo francés Guillaume Benjamin Amand Duchenne (1806-1875), que fue uno de los primeros médicos que estudió las distrofias musculares a mediados del siglo XIX. Es una enfermedad degenerativa de los músculos que se debilitan progresivamente, evolucionando hacia una parálisis total, y que aparece de forma temprana en la vida. También se denomina distrofia muscular pseudohipertrófica y se produce con una incidencia aproximada de 1 por 3.500 varones nacidos vivos (2).

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la más común dentro de las distrofias musculares, siendo una miopatía de origen genético. Es hereditaria recesiva ligada al cromosoma X (3) y afecta a todas las razas, siendo el pronóstico bien conocido (4). El defecto genético se localiza en el brazo corto del cromosoma X, en la región cromosómica Xp21 (5). Ello da lugar a la ausencia de la proteína denominada distrofina, responsable de las propiedades físicas de la membrana de la célula muscular. La falta de dicha proteína facilita los fenómenos de destrucción muscular que caracterizan a este tipo de distrofias (6).

2.2. Fisiopatología

La DMD es causada por una mutación del gen que codifica la distrofina, (7, 8,9), una proteína de 427 kDa (10) localizada en la superficie interna del sarcolema de la fibra muscular. El gen de la distrofina está formado aproximadamente por unos 2000 pares de bases, constituyendo el mayor gen humano. Aunque el tamaño del gen puede variar, no se correlaciona con la intensidad de la enfermedad. La mutación génica más común es la deleción, que no están distribuida uniformemente en el gen, si no que son frecuentes cerca del comienzo de la terminación 5’ y en su zona media. Con menor frecuencia, la DMD puede estar causada también por una duplicación génica o por una mutación puntual. La identificación de una mutación especifica permite un diagnostico inequívoco y posibilita un análisis preciso de los portadores potenciales, así como el diagnóstico prenatal.

3. FUNCIONES DE LA DISTROFINA

En el músculo normal la distrofina va asociada a un complejo multimolecular de glicoproteínas (10) y tiene dos funciones: una función estructural, manteniendo la integridad

3

del sarcolema (mantiene las propiedades física de la membrana de las células musculares) y una función de “andamiaje” que integra en la membrana a proteínas mensajeras como la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS). Puesto que es una proteína de gran tamaño, sirve de unión entre la actina intracelular (citoesqueleto) y la matriz extracelular a través de un complejo de glicoproteínas transmembrana asociadas a la distrofina [DAG] (11,12) fig1.

3.1. Distrofina y citoesqueleto

En el músculo esquelético, la distrofina se encuentra en la cara citoplasmática del sarcolema asociada a la nNOS, formando parte de un gran complejo de proteínas y glicoproteínas sarcolémicas (Figura 1). La distrofina se une a la F-actina en su extremo amino terminal, y al distroglucano beta en su extremo carboxilo terminal. El distroglucano beta forma parte de un complejo constituido por el distroglucano alfa y la laminina de la matriz extracelular (ECM). La laminina tiene una estructura molecular heterotrimérica con forma de cruz constituida por una cadena pesada y dos cadenas ligeras, α1 y β1. En la matriz extracelular también se identifican los colágenos IV y VI (13). A semejanza del distroglucano beta, las proteínas sarcoglucano transmembrana también se unen a la distrofina. Estas cinco proteínas (sarcoglucano alfa a épsilon) forman complejos estables entre sí. Actualmente se han detectado otras proteínas de membrana que interviene en la distrofia muscular, y que incluyen la caveolina 3, que se une a la nNOS, la integrina α7 y el colágeno IV (14).

El complejo distrofina-glucoproteína parece aportar estabilidad al sarcolema, pero sólo se conoce de manera parcial la función de cada componente del complejo. El déficit de algunos de sus constituyentes puede dar lugar a alteraciones en los demás componentes. Por ejemplo, un déficit primario de distrofina (distrofia de Duchenne) puede ocasionar pérdida secundaria de sarcoglucano y de distroglucano. La pérdida primaria de un único sarcoglucano induce a la pérdida de otro sarcoglucano en la membrana, sin alterar de manera uniforme la distrofina. En cualquier caso, la disrupción de los complejos distrofina-glucoproteína debilita el sarcolema provocando daño (desgarros) en la membrana y el inicio de una secuencia de acontecimientos tales como el aumento de la concentración de calcio y de proteasa que causan lisis y finalizan con la necrosis de las fibras musculares y la muerte celular. Todo ello se refleja en un aumento de la creatin fosfoquinasa plasmática. Esta secuencia de acontecimientos tiene lugar de manera repetida durante toda la vida del paciente con distrofia muscular.

3.2 Distrofina y cerebro

Un tercio de los pacientes con DMD tienen también retraso mental, probablemente debido a mutaciones en la expresión de la distrofina en el sistema nervioso central y a otros productos del cerebro (15). Distintos estudios han demostrado que los varones con DMD tienen un trastorno cognitivo y un menor coeficiente de inteligencia (media 85). El modelo animal de la DMD, el ratón con déficit de distrofina (mdx), presenta un trastorno del reflejo pasivo de evitación y de la memoria a corto plazo. El cerebro de pacientes con DMD muestra anormalidades estructurales, anomalías de las dendritas y un menor número de neuronas, todo

4

ello en zonas que expresan distrofina. Estos datos son concordantes con los obtenidos en ratones mdx con descensos de hasta un 50% del número de neuronas y menor tamaño de ciertas regiones del córtex y del tallo cerebral. Otros estudios histológicos muestran una menor densidad de receptores GABA-A en las células de Purkinje y en las neuronas del hipocampo. A nivel bioquímico se detecta también un metabolismo bioenergético alterado, con aumento de compuestos que contienen colina, lo que indica una patología del SNC; anomalías similares se encuentran también en ratones mdx. Los varones DMD presentan anomalías en el EEG y hay datos preliminares acerca de una función sináptica alterada por la deficiencia de distrofina. En ratones mdx, mediante estudios electrofisiológicos, se ha demostrado una mayor susceptibilidad de las neuronas del hipocampo a la hipoxia. Hallazgos que en conjunto deben ser tenidos en cuenta en el manejo clínico de los niños DMD (16,17).

Figura 1: Unión de la distrofina a los diferentes complejos proteicos.

El gen DM produce ocho diferentes proteínas (distrofinas) mediante el uso de promotores intragénicos alternativos: cuatro de ellas son isoformas de 427 KDa (Dp427) y defieren únicamente en la región N-terminal. Los cuatro restantes se clasifican de acuerdo con

5

sus pesos moleculares y sus localizaciones y son Dp260 localizada en la retina, Dp140 localizada en el sistema nervioso central y riñones, y Dp71 que se puede encontrar en cerebro, pulmones, hígado y riñones. Se cree que la Dp71 es la responsable del retraso mental de los pacientes con DMD (18,19).

4. PATOGENIA

Se han implicado hasta 5 posibles mecanismos patogénicos en el inicio del daño a las miofibrillas en los déficits del complejo distrofina-glicoproteínas (20):

1) Debilitamiento mecánico del sarcolema 2) Entrada anómala de calcio a la célula (21) 3) Señales celulares aberrantes 4) Incremento del estrés oxidativo (22) 5) Isquemia muscular recurrente, debiendo tener presente la naturaleza multifuncional del complejo distrofina-glicoproteina. Los 5 mecanismos enumerados, en modo alguno, son autoexcluyentes y pueden interaccionar entre sí en proporción significativa.

4.1. Papel del estrés oxidativo y nitrosativo en la distrofia muscular

4.1.1. Generalidades

Existen evidencias cada vez mayores que relacionan el estrés oxidativo/nitrosativo con la DMD. En un estudio encontraron un aumento de indicadores de estrés oxidativo en el músculo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Este estrés oxidativo puede contribuir al desgaste muscular (23) directamente, e indirectamente a través del daño e inhibición de la actividad mitocondrial, llevando a la muerte celular. La hipótesis de que la principal anomalía de la deficiencia de distrofina muscular es la vulnerabilidad al daño oxidativo, surgió inicialmente de dos tipos de observaciones. En primer lugar, la DMD y los ratones mdx muestran características bioquímicas de daño oxidativo en el músculo (24). Por supuesto, esto podría ser una característica secundaria inespecífica (25). En segundo lugar, las enfermedades musculares en las que el daño oxidativo puede jugar un papel primordial, entre las que está la DMD, mostraron características comunes (26). En otros estudios, se ha observado que hay muy poca necrosis en el ratón mdx antes de la degeneración muscular, que se produce alrededor de la tercera semana y durante este tiempo, tanto la creatinina sérica como la quinasa son normales (27). Para llevar a cabo estas observaciones, los autores analizaron marcadores de peroxidación lipídica y de expresión de genes que codifican enzimas antioxidantes en los músculos de ratones muy jóvenes. Se observó que estos marcadores aumentan en los músculos de ratones mdx a las 2 semanas de nacimiento. Los mismos investigadores estudiaron la diferente resistencia de los microtúbulos de ratones mdx y controles al daño oxidativo (28). De hecho, aunque no se conocen los factores que participan en la disminución de la capacidad de regeneración muscular en la DMD, la pérdida de expresión de la nNOS, secundaria a la deficiencia de la distrofina, el aumento de ROS, y la disminución de la capacidad de regeneración, parecen estar implicados en dicha patología. Se ha propuesto al estrés oxidativo como una causa importante de la patogenia de las distrofias

6

musculares, que se puede identificar incluso antes de la deficiencia de proteínas en estas patologías. Parece ser que las interacciones entre el defecto genético primario y la producción de radicales libres contribuyen a la fisiopatología de la distrofia muscular mediante tres rutas a través de las cuales la producción de radicales libres puede estar implicada en la deficiencia de la distrofina y, por tanto, contribuir a la patología posterior. En primer lugar, la producción de radicales libres puede interrumpir los procesos de señalización tanto en los músculos como en otros tejidos, con el consiguiente agravamiento de la patología. En segundo lugar, la respuesta de los tejidos a la patología puede provocar un cambio en la producción de los radicales libres que puede influir en el daño celular y en la disfunción. Por último, las diferencias en los comportamientos individuales pueden causar cambios en la producción y en la estequiometria de los radicales libres, contribuyendo así a la enfermedad (29).

Los radicales libres son capaces de atacar residuos aminoacídicos de proteínas, este ataque puede ser clasificado en dos categorías:

Ataques difusos, dando lugar a modificaciones generalizadas, entrecruzamientos catalíticos, alteraciones estructurales, agregaciones intra e intercatenarias, fragmentación y/o desnaturalización, cambios en la conformación y pérdida de funciones o

Ataques selectivos, dando lugar a modificaciones en sitios específicos Este daño es rápidamente eliminado por las proteasas, evitando la acumulación de proteínas dañadas, existiendo un adecuado balance entre daño y reparación (30).

Las modificaciones específicas son extremadamente selectivas, siendo los aminoácidos lisina, histidina, arginina y prolina los más frecuentemente atacados (31). En este tipo de daño oxidativo juegan un papel importante los metales de transición, siendo los enzimas que contienen dichos metales los que aparentemente presentan mayor riesgo de sufrir dichas modificaciones (32) Estas alteraciones se suelen llamar "oxidaciones catalizadas por metales" y casi siempre implican cambios covalentes, siendo estas proteínas las más susceptibles a la acción proteolítica de proteasas intracelulares específicas. Las reacciones del metabolismo oxidativo intracelular aumentan la producción de ROS, que producen una oxidación y peroxidación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, induciendo daño celular. Por tanto, un daño del tejido muscular se traduce en un aumento de CPK en sangre, así como de enzimas antioxidantes entre las cuales se encuentran la superóxido dismutasa (SOD), glutation peroxidasa (GPx) y reductasa (GRd), y la catalasa (CAT). La generación y acción incontrolada de los ROS se ha demostrado en múltiples patologías, incluyendo otras patologías musculares además de la de Duchenne y la de Becker, como es el caso de la distrofia miotónica (33). Sin embargo, la intervención farmacológica en la prevención y tratamiento de las enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo no ha encontrado una aplicación adecuada en la práctica clínica, y el mecanismo preciso que subyace al daño del músculo esquelético está aún por definir.

La presencia de un estrés oxidativo aumentado es una de las posibilidades patogénicas, sustentada por la demostración de la ocurrencia de una isquemia funcional durante la contracción muscular, con la subsiguiente reperfusión durante el descanso, dato que implicaría la existencia de un estrés oxidativo aumentado. Respecto a esto, en estudios sobre

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músculo de ratones mdx (deficientes en distrofina) se mostró: 1) Descenso de la concentración de GSH total, y elevación del cociente GSSG/GSH. 2) Mayor actividad de las enzimas del ciclo del GSH, como son la GPx y la GRd. 3) Menor concentración de isocitrato deshidrogenada unida a NADPH (ICDH) y de

aconitasa, dos enzimas sensibles a la inactivación por estrés oxidativo y que también participan en la producción de GSH.

Estos cambios son los mismos que se observan en músculos normales cuando son sometidos a un cuadro agudo de isquemia/reperfusión, En tales circunstancias, el músculo deficiente en distrofina apenas modifica los parámetros citados, de donde se deduce que la exposición crónica al estrés oxidativo induce cambios metabólicos para proteger (aunque parcialmente) al músculo de situaciones agudas de isquemia/reperfusión (33).

También se observó en el ratón mdx un elevado nivel de peroxidación lipídica (LPO) y de nitración, marcadores patológicos que van precedidos de una producción exagerada de óxido nítrico (NO•) durante la isquemia. El tratamiento con un inhibidor de la enzima óxido nítrico sintasa bloquea la interacción sinérgica entre la isquemia/reperfusión y el daño del sarcolema mediado por estrés traumático. Hay evidencias experimentales que integran varias de las hipótesis más importantes acerca de la etiología del daño de las fibras musculares del músculo deficiente en distrofina en una estructura fisiopatológica que integra interacción entre estrés oxidativo, regulación anormal del óxido nítrico e hiperfragilidad del sarcolema (34).

4.1.2. Estrés oxidativo mitocondrial y enfermedad de Duchenne

La mitocondria participa en la producción y conservación de la energía y tiene un mecanismo de desacoplamiento para lograr producir calor en vez de ATP. Además, las mitocondrias participan en la muerte celular programada y cada vez se dispone de mayores evidencias acerca de la participación de las mitocondrias en las enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares por alteraciones tanto del ADN nuclear (ADNn) como del mitocondrial (ADNmt). La mitocondria contiene su propio genoma como código genético modificado que se ha conservado, en gran medida inalterado, entre los mamíferos. El control de la expresión genética sugiere que la transcripción de ciertos genes puede regularse en respuesta al potencial redox de la membrana mitocondrial. Por otra parte, el ADNmt presenta una mayor tasa de fragmentaciones y mutaciones por modificaciones oxidativas de sus bases, siendo las razones propuestas para ello, las siguientes:

1) Por su localización en el entorno de la cadena de transporte de electrones (CTE) (Figura 2), principal fuente de especies reactivas del oxígeno

2) La mitocondria como se ha indicado es la estructura donde se generan la gran mayoría de ROS.

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3) El ADNmt carece de histonas protectoras (35). También se ha postulado durante mucho tiempo que la mitocondria carecía de un sistema de reparación de ADN. En la actualidad se reconoce la existencia de un sistema de reparación del ADNmt, que aunque todavía es un gran desconocido, se sabe que es capaz de reparar el daño oxidativo por ejemplo daño a bases y roturas de una sola cadena. El estrés oxidativo puede afectar al ADNmt de diversas formas, produciendo alteraciones oxidativas de las bases, aumento en el nivel de deleciones y aparición de mutaciones puntuales. Se ha establecido que las deleciones del ADNmt se producen fundamentalmente en tejidos postmitóticos, como el corazón, el músculo esquelético y el encéfalo que, además, son tejidos altamente dependientes de la respiración aeróbica, lo cual sucede en numerosas especies incluyendo humano, monos, roedores y nematodos. En estos casos, hay un mayor acumulo de mitocondrias anormales y una alteración en la cadena de transporte electrónico en el músculo estriado (requerimiento energético), aumentando los procesos oxidativos que incrementan el daño muscular. Debido a la proximidad física entre proteínas y lípidos, el daño oxidativo a las proteínas mitocondriales como resultado directo del estrés oxidativo, como una consecuencia de la peroxidación lipídica, puede dar lugar a entrecruzamiento, degradación y pérdida de función de las mismas. Numerosas proteínas de membrana como la ATPasa, el TNA, la COX, etc., son fácilmente inactivadas por el estrés oxidativo. Además, la oxidación de proteínas determina la apertura del poro mitocondrial de transición, clave en el proceso de apoptosis. En resumen, la alteración de las proteínas de la CTE tiene como consecuencia directa, una pérdida de la funcionalidad mitocondrial, e indirectamente una elevación de la producción de los ROS (36).

Figura 2: Cadena de transporte de electrones

La mitocondria posee un tipo de NOS denominada NOS mitocondrial, la cual está

asociada a la membrana mitocondrial interna y que genera NO•. Este NO• compite con el oxígeno para unirse al complejo IV y regular la respiración mitocondrial. El NO• producido por la mtNOS reacciona rápidamente con el O2¯• formando ONOO–, que da lugar a la

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liberación del citocromo c, a un incremento de la peroxidación de los lípidos de la membrana mitocondrial, y a un aumento del estrés oxidativo.

Por lo tanto, una hipótesis atractiva, pero no probada, es que el estrés oxidativo en la DMD, especialmente durante el ejercicio, conduce a la oxidación de enzimas respiratorios, reduciendo la actividad enzimática y la producción de ATP. La fibrosis de los músculos del corazón contribuye significativamente a defectos en la función cardiaca que causan la muerte en la DMD. Estos datos indican que la principal causa de la afectación cardíaca en la DMD es la acumulación progresiva de tejido conectivo que reemplaza a los miocitos cardíacos y a las fibras del sistema de Purkinje (37). Además, el resto de los miocitos en el corazón en la DMD quedan atrapados en el tejido conectivo, de modo, que el número de uniones es muy reducido, lo que puede contribuir aún más a los defectos de la conducción. Por otra parte, la mayoría de la fibrosis ocurre en las paredes pósterolaterales y laterales del corazón, que se convierten en focos de arritmias ventriculares. Como consecuencia, muchos defectos de la función cardíaca, que se observan en los pacientes con DMD, aparecen durante la sístole y son coherentes con la sustitución de las fibras de Purkinje en el miocardio ventricular izquierdo por tejido conectivo (38).

4.1.3 Factores inflamatorios y enfermedad de Duchenne:

La inflamación representa una respuesta del organismo a una serie de estímulos, es decir, la respuesta normal de un tejido a una agresión de tipo mecánico, químico o infeccioso. Tiene carácter de protección local cuya misión es destruir, diluir o aislar, bien al agente agresor o bien al tejido dañado. Hace veinte siglos, el médico romano Celsius la caracterizó en su forma aguda por la tetralogía: rubor, tumor, calor y dolor, con la pérdida asociada de funcionalidad. El que la inflamación sea aguda o crónica depende de la regulación humoral y de la respuesta celular.

La inflamación muscular, una característica prominente de distrofinopatía, proporciona un adicional fuente de radicales libres que pueden contribuir a la patología muscular. Los macrófagos son la población más común de leucocitos invasores, llegando a concentraciones tan altas como 105 macrófagos/mm3 de músculo. Los macrófagos son capaces de lisar directamente los microtúbulos in vitro a través de mecanismos dependientes de radicales libres, y los macrófagos de los músculos distróficos son altamente citolíticos (39).

El músculo esquelético normal contiene fibras musculares que se espacian uniformemente y con un tamaño relativamente uniforme, de tal forma que el tejido muscular forma un sincitio, donde hay múltiples núcleos situados en la periferia de la fibra. Los fetos con la DMD tienen una histología normal, excepto en algunas ocasiones, podemos encontrar fibras eosinofílicas hipercontraídas (40, 41,42). La necrosis o las fibras musculares degeneradas es una característica de todas las biopsias del músculo de DMD. Incluso, antes de observar clínicamente la debilidad muscular, las fibras en degeneración se ven a menudo en grupos (agrupados necrosis). Los estudios longitudinales y de serie de secciones del músculo transverso muestran que este proceso, a menudo, se limita a los segmentos de la fibra muscular (43,44). Estas fibras están sujetas necrosis y las biopsias musculares de pacientes

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con DMD revelan la presencia de células inflamatorias (45,46). Estas células son principalmente macrófagos y linfocitos CD4+ (47).

En varios estudios se ha demostrado que una vez que comienza la necrosis, los músculos de DMD y de mdx contienen un número creciente de una variedad de células inflamatorias (48, 49). En el ratón mdx, el curso temporal del aumento de CD4 y de linfocitos T y CD8 reflejan la necrosis, alcanzando un máximo entre la cuarta y octava semana antes de disminuir. Ahora bien la cuestión es que no se sabe si se trata de células reactivas que contribuyen a la muerte celular o hay algún otro rasgo patológico. Esta cuestión ha sido abordada por un gran número de investigadores mediante la manipulación genética o de otra índole para eliminar de forma específica las células inflamatorias o los mediadores de la inflamación (50). Varios investigadores han buscado las características de las fibras musculares que sufren apoptosis o muerte celular programada en las patologías con déficit de distrofina en el músculo (51, 52), ya que las microfibrillas necróticas son una característica de la distrofia muscular.

Los músculos de los ratones y de los seres humanos normales son capaces de regenerarse después de un daño extenso. Este proceso de regeneración esta inhibido en ratones mdx (53), que no es capaz de regenerar el músculo necrotizado. Los estudios que han comparado la regeneración del músculo normal con el de mdx después de los daños causados por las toxinas o similares parecen confirmar que los músculos mdx, sobre todo en animales de más edad, se regeneran menos de lo normal (54,55).

La nNOS que forma parte del complejo distrofina-glicoproteína produce NO•, participa en múltiples sistemas de regulación. Entre otros, participa en la homeostasis del estado redox, ya que puede reaccionar con los ROS producidos por las células inflamatorias. Por tanto, puede proteger el músculo del daño oxidativo, además de ser un regulador de las funciones musculares, como el transporte de glucosa, el aumento de la irrigación sanguínea, sobre todo durante el ejercicio aumentando el aporte de oxígeno y de nutrientes. Por otro lado, el NO• puede actuar como un agente anti-inflamatorio. Aunque el mecanismo del NO• sobre el músculo para reducir la inflamación es desconocido, se han identificados posibles vías que pueden dar explicación a este mecanismo de acción en músculo: por ejemplo, el NO• puede inhibir la expresión de moléculas de adhesión que sean necesarias para la diapédesis de los leucocitos (56); puede inhibir la actividad de enzimas que producen radicales libres como el radical superóxido y el ácido hipocloroso (57,58), y puede inducir apoptosis de los leucocitos (59). El NO• también puede reaccionar con otros radicales libres citotóxicos que contribuyen al daño celular (60), e influye en el metabolismo de la célula muscular inhibiendo la respiración mitocondrial. Este mecanismo regula la disponibilidad de oxígeno y de energía en los tejidos y se relaciona con la señalización intramitocondrial que desencadena el proceso de apoptosis (61).

Sin embargo, varios trabajos también ponen de relieve que el incremento de la expresión de la nNOS y, por tanto, de la producción de NO•, puede no ser suficiente para reducir la patología de la distrofia muscular. Estudios in vitro han demostrado que los cambios en la concentración de NO• pueden aumentar o disminuir la hidroxilación o provocar

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modificaciones oxidativas de determinadas moléculas, dependiendo de la estequiometria del NO• con otros radicales libres (60,61). Este aspecto puede ser importante para el desarrollo de la terapéutica de la DMD, donde se producen cambios en la nNOS, ya que la disminución de esta enzima puede favorecer el daño muscular y provocar arritmias cardiacas. Los pacientes con DMD que presentan una debilidad muscular progresiva, y con actividad física reducida, pueden presentar grandes cambios en la expresión y actividad de las enzimas que afectan a la producción de los radicales libres así como de los anti-oxidantes, por ejemplo, de la nNOS (63). Por otro lado, un aumento de estrés oxidativo en los músculos de DMD, que puede atribuirse a diferencias constitutivas en dichos músculos, a diferentes respuestas del músculo frente a la patología, e, incluso a cambios de comportamiento en personas con distrofia muscular, pueden participar en mayor o menor grado en la patogenia de la distrofia.

4.1.3.1. La paradoja del NO• en la patología de Duchenne

Durante la contracción muscular, se produce una compresión de los vasos que irrigan al músculo; para evitar que se produzca isquemia muscular, la distrofina activa la nNOS, aumentando la producción de NO•. Éste produce vasodilatación, manteniendo así el flujo sanguíneo normal en el músculo contraído. En la DMD, como no hay distrofina, no se activa la nNOS, que además se reduce a menos del 20% de la que hay en el músculo normal (64). En consecuencia, la ausencia de vasodilatación hace que la contracción muscular se acompañe de isquemia seguida de reperfusión cuando se relaja, lo que se traduce en un aumento de liberación de radicales libres en el músculo (65,66). La evidencia experimental demuestra la importancia de la deficiencia de nNOS, que se ve en la mayoría de los estudio histológicos, con una reducción aproximadamente del 80% en ratones mdx (67). La necrosis que sigue al estrés oxidativo promovido por la reperfusión desencadena una reacción inflamatoria con infiltración de macrófagos que es responsable de la inducción de la iNOS y producción masiva de NO•. En grandes cantidades, este NO• desencadena reacciones de desaminación y despurinización, mediante el N2O3 formado por su interacción con el O2¯•. Además, se produce una inducción de genes pro-inflamatorios debida a la activación de la vía del NF-κB por los ROS (68). En consecuencia, en la enfermedad de Duchenne se producen continuamente grandes cantidades de NO• derivado de la iNOS, mientras que se inhibe la producción de NO• dependiente de la nNOS. Ello favorece el proceso de isquemia/reperfusión y estado inflamatorio, manteniendo un estrés oxidativo/nitrosativo crónico que es responsable de la necrosis muscular.

5. DIGNOSTICO DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

El diagnóstico de la enfermedad de Duchenne se puede hacer mediante métodos directos e indirectos. El método directo se basa en las pruebas de laboratorio y consiste en el análisis de la actividad sérica de la CPK, que se encuentra muy elevada (20 a 100 veces por encima del valor normal). La electromiografía (EMG) mide la actividad eléctrica de los músculos y se estimulan los nervios para detectar dónde reside el problema. De forma normal cuando un músculo se contrae, se produce un flujo eléctrico en respuesta a una señal eléctrica el patrón de este flujo eléctrico se conoce muy bien en el músculo sano en base de esto se demuestra las características típicas de la miopatía (69). El diagnóstico de la enfermedad de Duchenne

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también se puede realizar mediante inmunoelectroflorescencia de muestras de biopsia muscular, donde se observan anomalías tanto en la cantidad como en el peso de la distrofina. Además, también se pueden realizar técnicas inmunocitoquímicas, utilizando anticuerpos contra la distrofina, para mostrar la ausencia o el déficit de esta proteína en la membrana sarcolémica.

El diagnóstico definitivo de la distrofia de Duchenne se realiza mediante análisis genético hay varias técnicas disponibles para el análisis de ADN, ARN o proteínas; cada una de ellas con ventajas y desventajas en razón de coste, sencillez y eficiencia; el método más usado es la reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) porque permite caracterizar de manera rápida y precisa el 98% de las mutaciones de tipo deleción o duplicación del gen. También se puede demostrar la mutación o mutaciones del gen de la distrofina basándose en el déficit de distrofina en el tejido muscular mediante biopsia muscular: se extrae una pequeña muestra de tejido muscular y se busca la presencia o ausencia de la distrofina, en los hallazgos de la biopsia se puede encontrar generalmente:

-Fibras musculares de varios tamaños, y pequeños grupos de fibras necróticas en fase de regeneración. El tejido conjuntivo y la grasa reemplazan las fibras musculares perdidas.

-Necrosis segmentaria, evidenciada principalmente por la presencia de fagocitos, cambios histológicos variables en las microfibrillas, un gran aumento de contracción de las fibras musculares (la longitud del sarcómero es varias veces mayor que su tamaño fisiológico normal) y daño en la membrana (éstos últimos observables por medio de microscopía electrónica).

-Regeneración después de los episodios de necrosis. El proceso de necrosis-regeneración vuelve y comienza, hasta que las células pierden su capacidad reproductiva (70)

6. CLÍNICA DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

Casi todos los lactantes afectados son varones, y es raro que tengan síntomas al nacer o en los primeros meses de vida, aunque algunos niños si pueden mostrar hipotonía progresiva, que es el signo clínico más característico y que condiciona el desarrollo psicomotor posterior. Sin embargo, hay un aumento en suero de CPK, que suele aparecer entre los tres y cinco años de edad (70,71). Los niños se caen con frecuencia y tienen dificultad para jugar con sus amigos al presentar alteraciones al correr y saltar. Hacia los cinco años, la debilidad muscular es evidente en las pruebas musculares, y la marcha se hace claramente patológica con balanceo de caderas, lo que se conoce como marcha de Trendelenburg. La falta de fuerza empieza en los miembros inferiores y, por tanto, el niño tropieza al andar, tiene dificultades para subir escaleras, caminar y levantarse del suelo (signo de Gower positivo). El paciente utiliza los brazos para subir las piernas y levantarse del suelo

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(72). Las contracturas de los tendones de Aquiles y de las bandas iliotibiales aparecen hacia los seis años y, al andar de puntillas, se asocia a una estructura lordótica. La pérdida de reflejos, con aspecto hipertrófico de la musculatura en general, no se limita a los músculos, sino también al deterioro mental y a la aparición de fibrosis muscular.

La pérdida de fuerza muscular es progresiva y afecta de manera predominante la musculatura proximal de los miembros y los músculos flexores del cuello; la afectación de las piernas es más intensa que de los brazos. Entre los ocho y los diez años de edad, el niño necesita muletas para caminar. Las contracturas articulares, la limitación de la flexión de la cadera y la limitación de extensión de rodillas, codo y muñeca empeoran cuando el paciente permanece sentado durante un periodo prolongado. Hacia los doce años, la mayoría de los enfermos permanecen confinados en una silla de ruedas. Las contracturas se estabilizan y a menudo aparece una escoliosis progresiva que puede causar dolor. La deformidad torácica con escoliosis altera todavía más la función pulmonar, que comienza a manifestarse con tos débil. Las infecciones pulmonares son frecuentes y hay una disminución de la capacidad respiratoria (72), ya que la mecánica pulmonar está comprometida por la debilidad muscular, por las contracturas y por la escoliosis. La hipertrofia de las pantorrillas, un signo típico de la enfermedad, se debe a la sustitución de las células musculares destruidas por tejido conectivo (fibrótico) y adiposo; con menos frecuencia se pueden hipertrofiar la lengua y los antebrazos.

Algunos pacientes presentan afectación intelectual, aunque entre leve y moderada, y pueden presentar crisis epilépticas. Hacia los dieciséis-dieciocho años, los pacientes tienen predisposición a infecciones pulmonares graves que a veces son letales. Otras causas de muerte son aspiración de alimentos y dilatación gástrica aguda. Es poco frecuente que la muerte tenga una causa cardíaca a pesar de que casi todos los pacientes presentan una miocardiopatía. Excepto en los casos de enfermedad grave como la neumonía, no es frecuente que haya insuficiencia cardiaca congestiva, y las arritmias cardíacas son raras. El electrocardiograma típico muestra un incremento neto de RS en la derivación V1 y una onda Q estrecha y profunda en las derivaciones precordiales derechas en V1. El cociente intelectual medio presenta aproximadamente una desviación estándar por debajo de la media. (73,74).

7. TRATAMIENTO DE LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

No existe, al día de hoy, tratamiento que pueda curar esta enfermedad, aunque el avance en las investigaciones de la genética en los últimos años y, en particular, las posibilidades de la terapia génica ofrecen grandes esperanzas (75). Teóricamente, si logramos introducir un gen sano en una célula que cuenta con una versión defectuosa del mismo, el gen sano reemplazara al gen mutado, proporcionando el código genético para la producción de la proteína deficitaria. Se están llevando a cabo importantes estudios relacionados con este tema, pero los resultados obtenidos hasta ahora han sido negativos (76).

También se llevan a cabo numerosos estudios relacionados con la fisiología de la contracción muscular, estructura y función de las membranas celulares e intracelulares, ultraestructura del músculo, relaciones mutuas de las interacciones nervio-músculo,

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bioquímica subyacente, y neurobiología de las enfermedades musculares. Con ello se trata de encontrar alternativas de tratamiento más eficientes que las disponibles en la actualidad.

El manejo médico y fisioterapéutico puede aumentar la movilidad, maximizar la independencia en actividades diarias, y puede aliviar la incomodidad del paciente. El uso de dispositivos ortopédicos y la terapia física, pueden permitir que el tratamiento de los pacientes sea de forma ambulatoria durante largos periodos, ya que se pueden minimizar las contracturas y se puede prevenir o, incluso, retardar la curvatura de la espina dorsal (escoliosis) estimulando el óptimo desarrollo del niño.

7.1. Medicamentos

La prednisona, a dosis de 0,75 mg/Kg/día, puede retrasar en cierto grado la progresión de la enfermedad, pudiendo provocar un retraso hasta de tres años. Sin embargo, un buen número de pacientes no toleran el tratamiento con glucocorticoides; el aumento de peso y la osteoporosis, representa un impedimento para ellos. No obstante, al no disponer de otro tratamiento, se aconseja su uso de modo generalizado. Entre otros estudios, en un grupo de 49 varones con DMD, entre 12-15 años de edad, y por un período de dos años, el tratamiento con corticoides (prednisona o deflazacor) posibilitó una mayor capacidad funcional y mejor realización de todos los test que los no tratados, sin que se observasen diferencias entre ambos corticoides. Ambos corticoides mejoraron la función pulmonar y afectaron favorablemente a la escoliosis. Los efectos secundarios fueron: cataratas, hipertensión, cambios de humor, ganancia excesiva de peso y facturas vertebrales. La prednisona y el deflazacor enlentecieron de modo significativo el desarrollo de la enfermedad, prolongando la deambulación y la función de los miembros superiores, mejorando además la función pulmonar y retrasando la necesidad de cirugía raquídea, con similar grado de eficacia para ambos esteroides (77).

Por otra lado, en 17 pacientes de 5-8 años de edad con DMD que conservaban la marcha, se realizó un estudio aleatorizado controlado, cruzado, de 6 meses de tratamiento con prednisona o placebo (0.75 mg/kg/día) durante los primeros 10 días de cada mes. El tiempo que precisaron los pacientes para correr 9 metros y para subir cuatro peldaños de una escalera estándar, mejoró significativamente durante el tiempo que estuvieron tratados con prednisona. El tratamiento enlenteció el deterioro de la función y de la fuerza muscular, aunque se presentaron efectos adversos que no afectaron la calidad de vida (78). Recientemente se ha publicado un metaanálisis respecto a la utilidad del tratamiento con corticoides en varones con DMD como único tratamiento posible de la enfermedad. (79).

En conclusión, se dispone de evidencias científicas procedentes de estudios aleatorizados y controlados de que el tratamiento con glucocorticoides en la DMD mejora la fuerza muscular y la función a corto plazo (6 meses a 2 años). La pauta más efectiva parece ser prednisona a 0.75 mg/kg/día. Los efectos secundarios fueron comunes pero no clínicamente graves. Los beneficios de los glucocorticoides a más largo plazo no pueden evaluarse con los estudios que se disponen en la actualidad (80). Además, se está evaluando

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el aporte exógeno de antioxidantes y/o de donantes de NO•, así como la suplementación dietética del sustrato de la NOS (L-arginina), que podrían ser útiles como tratamiento complementario de las distrofias musculares (81). No obstante, ya que dicho sustrato es común para la nNOS y la iNOS, su efectividad queda por demostrar.

7.2. Tratamientos concomitantes

Dieta: los niños afectados de DMD tienden a aumentar de peso, lo que disminuye su independencia funcional. Por ello, es importante una dieta balanceada, ajustada a sus requerimientos calóricos.

Tratamiento postural: El mantenimiento de una postura correcta desde el mismo momento en que se diagnostica la enfermedad, permite prevenir muchas de las complicaciones secundarias y mantener cierta independencia funcional.

Fisioterapia: Se adapta al momento evolutivo de la enfermedad, y debe realizarse de forma sistemática convirtiéndose en una rutina diaria.

II. LA MELATONINA

La melatonina o N-acetil-5-metoxitriptamina, es una indolamina, que fue descrita inicialmente por McCord y Allen en 1917 (82) y aislada por primera vez por Lerner en 1958 (83) a partir de extractos de glándula pineal de vaca. Un año más tarde, en 1959, este mismo grupo dilucidó su estructura química.

Figura 3. Estructura química de la molécula de melatonina

La melatonina pineal se libera durante la noche a través de la activación postsináptica de receptores adrenérgicos, cuya estimulación proviene de una vía multisináptica compleja que se inicia en la retina y viaja a través del núcleo supraquiasmático hasta la médula cervical.

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La luz inhibe dicha vía, evitando la activación adrenérgica de la glándula pineal, lo que produce una inhibición en la síntesis de melatonina. La célula parenquimal de la glándula pineal es el pinealocito, que responde a los cambios en la luminosidad ambiental durante el ciclo luz/oscuridad, lo que hace que su actividad metabólica se sincronice a un periodo de 24 horas denominado ritmo circadiano, de manera que, en sujetos normales, la mayor secreción de melatonina se produce entre las doce de la noche y las dos de la madrugada, y la mínima entre el mediodía y las dos de la tarde (84). Inicialmente, la melatonina se definió como la hormona que mediaba las variaciones anuales en la capacidad reproductora de animales con ciclos de reproducción estacionales. Actualmente se sabe que la melatonina influye en numerosos aspectos de la biología circadiana, algunos de los cuales se deben a acciones mediadas por la unión de la hormona a receptores de membrana para la hormona (85,86). Estudios posteriores han permitido relacionar a la melatonina con aspectos de la fisiología intracelular a través de mecanismos que son independientes de la acción de la hormona sobre dichos receptores. En este sentido, se han identificado y caracterizado receptores nucleares para la melatonina en órganos periféricos (87,88) y cerbero (89). Se ha demostrado también la capacidad de la melatonina para unirse a proteínas citosólicas como la proteín quinasa C (90) la calmodulina (91) y la calreticulina (92), modulando a través de estas interacciones las acciones intracelulares del calcio y la expresión génica, respectivamente. Hoy día se empieza a considerar a la melatonina, no como una hormona en el sentido clásico, sino como un protector celular conservado evolutivamente. Esta afirmación se basa en dos hechos:

1. No se sintetiza en un órgano específico. Se sabe que las enzimas requeridas para la biosíntesis de la melatonina se encuentran en otros tejidos además de la pineal, como la retina, el timo, el bazo, los linfocitos B, el ovario, el testículo y el intestino. De todas formas, la melatonina circulante deriva esencialmente de la producida por la pineal, que pasa tanto a la circulación cerebral y sistémica como al líquido cefalorraquídeo. La melatonina extrapineal es producida por órganos específicos para su uso y no sale a la circulación (93).

2. No actúa en un órgano diana específico. La melatonina alcanza todos los tejidos de la

economía (94,95) y, al ser muy lipofílica, puede actuar, al menos teóricamente, en todos los compartimentos de la célula. Además, diversas organelas acumulan melatonina, como el núcleo y la mitocondria (96).

En cuanto a su acción sobre el SNC, la melatonina regula tanto el ritmo de los

neurotransmisores como de sus receptores (97,98). La melatonina regula la neurotransmisión GABAérgica por mecanismos dependientes de receptores opioides y aumenta los niveles de GABA (99,100) y regula la excitabilidad neuronal a través de la regulación de la Na/K-ATPasa cerebral (101) e inhibe la activación de la nNOS a través de su interacción con el complejo Ca2+-CAM (102,103). Todo ello hace de la melatonina un modulador de la actividad cerebral (104).

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1. PROPIEDADES DE LA MELATONINA

1.1. Melatonina y estrés oxidativo

La melatonina tiene importantes propiedades antioxidantes. Esta característica, descrita inicialmente por Ianas y colbs. (105) y confirmada por Tan y colbs. (106), se ha demostrado en estos últimos años a través de innumerables estudios in vitro e in vivo. La melatonina tiene la capacidad de eliminar, depurar o neutralizar radicales libres, principalmente el radical hidroxilo (HO•) (106), pero también radicales peroxilo (ROO•) (107), peróxido de hidrógeno (H2O2) (108), NO• y ONOO¯ (109). Una de las principales características físico-químicas de la melatonina, para entender su gran eficacia como antioxidante, es su elevada capacidad de difusión. Se trata de una molécula muy lipofílica, capaz de atravesar cualquier membrana celular, y alcanzar las diferentes organelas subcelulares (110). Esta propiedad implica una función de la melatonina en todas las partes del organismo, dado que tiene acceso a todas las células y a todos sus compartimentos. En segundo lugar, tiene un potencial redox muy alto, de alrededor de 0.74 V, lo que le confiere una alta capacidad de ceder un electrón para reducir cualquier molécula que esté a su alcance (111). El mecanismo por el cual la melatonina puede neutralizar los ROS y fundamentalmente el radical HO•, consiste en que esta indolamina cede un electrón al radical eliminando su elevada reactividad, y por tanto, su toxicidad. De esta manera, la propia melatonina se convierte en un radical denominado radical catión indolilo (112). Éste interacciona con el O2¯•, precursor del HO•, para generar el metabolito no enzimático de la melatonina, la N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinurenamina (aFMK), que se elimina en la orina (Figura 4).

Figura 4: Mecanismo de neutralización de un radical hidroxilo y un anión superóxido por la melatonina.

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En este sistema directo de eliminación de radicales libres, la melatonina y su radical catión indolilo eliminan en realidad dos radicales libres a la vez, uno hidroxilo y otro superóxido. Por tanto, la capacidad de actuar como neutralizador de radicales HO• de la melatonina es altamente específica y depende, como hemos visto ya, de la estructura química de la molécula.

Esta acción directa como neutralizador de radicales libres se complementa con un efecto estimulante de la actividad de algunas enzimas antioxidantes de la célula (113), y de inducción de la expresión de estas enzimas, tales como la SOD, GPx y GRd (114). Debido a este efecto y a su elevada lipofilia, que le permite actuar a todos los compartimentos celulares (membrana, citosol, núcleo, mitocondria), su actividad antioxidante es más eficaz que la de otros antioxidantes ya conocidos (115).

1.2. Melatonina y sistema inmunológico

La relación entre la melatonina y el sistema inmune es cada vez más estrecha (116,117). En situaciones en las que se produce una inhibición en la producción de melatonina se observa un estado de inmunodepresión que desaparece cuando se administra la hormona. También ciertos efectos inmunodepresivos producidos por algunos fármacos son contrarrestados por la melatonina (118). Aunque está clara la relación entre la melatonina y el sistema inmune, no es así la forma en la cual se regula la producción de citoquinas. Lisoni y cols. (119), demostraron que la secreción de IL-2 aumenta durante la noche, de una forma concomitante a la melatonina, mientras que no existen evidencias de secreción circadiana de otras citoquinas. García-Maurino y colbs. (120) encontraron que in vitro, la melatonina es capaz de activar los linfocitos CD4+ aumentando la producción de IL-2 e IFN-γ, lo que podría sugerir que la melatonina pueda estar implicada en la regulación de las funciones inmunes en humanos modulando la actividad de las células CD4 y monocitos.

El origen primordial de la hormona se sitúa en la glándula pineal y su biosíntesis está

regulada por señales del sistema nervioso simpático (noradrenalina) que generan un ritmo circadiano sincronizado con las horas de luz (121). El pico de producción de melatonina ocurre durante la noche, con acrofase sobre las 3 a.m., mientras que las horas de luz se asocian con menores niveles de producción. Las acciones de la melatonina contribuyen a la regulación de los ciclos sueño-actividad y de otros ritmos biológicos, incluyendo los ritmos reproductores, sobre todo en animales sometidos a reproducción estacional (122). También parece tener relación esta melatonina pineal con la inmuno-modulación. En condiciones fisiológicas, la acrofase de la melatonina se ha vinculado con un aumento del cociente IFN-γ/IL-10, que depende a su vez del cociente Th1/Th2 (123). Por otro lado, la pinealectomía inhibe la producción de IL-2 y la actividad natural killer (124). En conclusión, el inicio del sueño favorece la actividad de las citoquinas Th1, que es reemplazado por un predominio más pronunciado de las Th2 durante las fases tardías del sueño (125).

El mecanismo por el cual la melatonina controla la producción de citoquinas depende de la activación de sus receptores de membrana en las células T-helper (126). La activación de dichos receptores la melatonina aumenta la producción de INF-γ, IL-2, IL-6 e IL-12

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(127,128). Además, la melatonina es sintetizada por los propios linfocitos, y participa en la regulación de la IL-2 (129). Ello indica que la melatonina endógena sintetizada por las células T humanas puede contribuir a la regulación de su propia producción de IL-2, ampliando la actividad biológica de la IL-2 (130).

1.3. Utilidad de la melatonina en la enfermedad de Duchenne

La melatonina ha sido objeto de múltiples estudios en los últimos años, algunos de ellos en sujetos de edad pediátrica. Las propiedades cronobióticas, antioxidantes y antiinflamatorias de la melatonina se han estudiado también en pacientes pediátricos, con resultados muy interesantes. Así, la melatonina regula los ritmos biológicos en niños (131, 132, 133, 134,135); ejerce importantes efectos anticonvulsivantes en niños con distintos tipos de epilepsia (136,137); disminuye el estrés oxidativo en neonatos con asfixia (138), distrés respiratorio (139), sepsis (140), y en aquellos sometidos a cirugía (141).

Los niveles plasmáticos de LPO, que están elevados en neonatos con asfixia (138) y sepsis (140), disminuyen significativamente tras el tratamiento con melatonina. De manera especial, el tratamiento con melatonina mejoró el pronóstico y supervivencia de los neonatos sépticos. En neonatos con síndrome de distrés respiratorio agudo (grado III-IV) tratados con melatonina, las concentraciones de IL-6, IL-8, y TNFα, así como de nitritos/nitratos, disminuyeron drásticamente tras la administración de melatonina (139). En otros estudios, el tratamiento con melatonina disminuyó los niveles de IL-6, IL-8 y TNFα en el aspirado traqueobronquial de neonatos con síndrome de distrés respiratorio sometidos a ventilación mecánica, mejorando el pronóstico clínico (142). Los neonatos no tratados con melatonina y que desarrollaron enfermedad pulmonar crónica, tenían concentraciones mucho más elevadas de estas citoquinas proinflamatorias que aquellos que no desarrollaron enfermedad pulmonar crónica (143).

Otros factores proinflamatorios de interés en la clínica humana son aquellos derivados de la activación de la respuesta inmune innata, como es el caso de la activación de la vía del NF-κB. Estudios in vivo indican que la actividad del factor de transcripción NF-κB en el tejido esplénico es menor durante la noche, cuando la concentración endógena de melatonina es elevada, que durante el día, cuando los niveles de melatonina son muy bajos. Asimismo, la administración de melatonina provoca un descenso significativo añadido de la actividad NF-κB (144). En diversos estudios in vivo se ha demostrado el efecto inhibidor de la melatonina sobre la expresión del NF-κB (142,143). La disminución de la expresión de la iNOS por la administración de melatonina podría deberse indirectamente a la disminución del NF-κB, ya que éste es necesario para la inducción de aquella (144, 145).

Además, se han demostrado las propiedades anti-inflamatorias de la melatonina y sus metabolitos (quinuraminas) en modelos experimentales (144). Otro dato importante proviene de que la melatonina puede ejercer una acción proinflamatoria, que se deduce de la alta concentración plasmática nocturna en pacientes con artritis reumatoide, y que los macrófagos de la sinovial de estos pacientes expresan un receptor específico para melatonina, con una mayor producción de IL-12 y de NO, que pudieran promover la sintomatología propia de la

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artritis reumatoide.

En consecuencia, la melatonina es un potente antioxidante y antiinflamatorio también en la clínica humana, lo que le habilita para su uso en aquellas situaciones clínicas que cursen con estrés oxidativo e inflamación, tanto como causa como consecuencia del proceso patogénico. Además, los efectos antiinflamatorios de la melatonina, reduciendo directamente la respuesta inmune, la hacen candidata para su aplicación clínica en dichas patologías. En concreto, la distrofia muscular de Duchenne cursa con estrés oxidativo e inflamación, activándose las vías de producción de radicales libres y de moléculas proinflamatorias que son dianas de la melatonina. Por ello, la administración de melatonina puede tener efectos muy beneficiosos en la patogenia de esta enfermedad, reduciendo la necrosis muscular y mejorando el status clínico del paciente.

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Hipótesis y Objetivos

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I. HIPÓTESIS

En la patogenia de la enfermedad de Duchenne convergen, entre otros mecanismos patogénicos, un aumento de estrés oxidativo e inflamación. Ambos, derivados del déficit de distrofina que induce aumento de ROS por la isquemia/reperfusión y reacción inflamatoria consiguiente por la infiltración del músculo por células inmunes, culminan en la necrosis muscular, que a su vez promueve más radicales libres e inflamación. La eliminación de este círculo vicioso puede tener una consecuencia importante para un mejor pronóstico de la enfermedad y una mejor calidad de vida de los pacientes.

Por ello, y ya que aún no hay ningún tratamiento eficaz frente a la DMD, las propiedades antioxidantes y antiinflamatorias de la melatonina pueden ser de gran interés para contrarrestar el daño oxidativo/nitrosativo, reducir la necrosis muscular y mejorar el pronóstico de la enfermedad.

II. OBJETIVOS

1.1. Objetivo General Valorar en un grupo seleccionado de pacientes afectos de DMD, el efecto de la

administración de melatonina durante 9 meses sobre su status oxidativo e inflamatorio. 1.2. Objetivos específicos

1.2.1. Valorar el estrés oxidativo y nitrosativo extracelular:

Determinación en plasma de marcadores de oxidación (LPO) y de niveles de NO• (nitritos). 1.2.2. Valorar el estrés oxidativo intracelular Determinación en hematíes marcadores de estrés oxidativo intracelular (índice GSH/GSSG), y de defensa antioxidante (enzimas antioxidantes y de detoxificación). 1.3.3 Valorar el status inflamatorio

Determinación en plasma los niveles de citoquinas proinflamatorias. 1.3.4. Valorar el daño muscular esquelético Determinación en plasma de marcadores de necrosis muscular

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Pacientes y Métodos

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I. PACIENTES Y TRATAMIENTO

El estudio se llevó a cabo en 10 pacientes pediátricos, con edades entre 12,8 ± 0,98 años, que fueron seguidos en la Unidad de Neuropediatría del Hospital Universitario San Cecilio de Granada. Estos pacientes fueron diagnosticados de DMD a los 4-5 años de edad por análisis genéticos. Sólo los pacientes que padecen DMD sin ninguna otra patología o tratamiento, a excepción de los corticoides, se incluyeron en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de todos los padres y del Comité de Ética del Hospital, de acuerdo con la Declaración de Helsinki 1983 revisada de 1975. El estudio final fue aprobado por la Junta de Andalucía éticas del Comité de Ensayos Clínicos (ref. 0191/06).

Todos los pacientes estaban bajo tratamiento con prednisona (0,75 mg/kg/día) antes de que fueran incluidos en el estudio y, debido a consideraciones éticas, el tratamiento con prednisona se mantuvo a lo largo del estudio. El tratamiento con melatonina consistió en la administración de dos dosis orales diarias de la melatonina durante 9 meses, una a las 09:00 h (10 mg de melatonina) y la otra a las 21:00 h (60 mg de melatonina). Esta pauta terapéutica se eligió para mantener la diferencia día/noche en los niveles de melatonina. Se eligió asimismo un grupo de niños sanos de la misma edad, sexo y peso, como grupo control. Se realizó una anamnesis detallada para todos los pacientes, recogiéndose los datos somatométricos, inicio de la enfermedad, evolución y signos clínicos.

II. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

2.1. Obtención del plasma y glóbulos rojos

Las muestras de sangre se extrajeron mediante punción venosa periférica en la vena anticubital, y siempre por la mañana a la misma hora (9:30-10 h). La sangre se obtuvo en vacutainers conteniendo EDTA-K3 como anticoagulante, se mantuvieron 4º C, y se centrifugó durante 15 minutos a 4000 rpm a 4º C. El plasma se distribuye en alícuotas que se procesan inmediatamente para los marcadores plasmáticos de necrosis muscular, o se congelan a -80° C hasta el posterior análisis de marcadores de estrés oxidativo e inflamación. Los hematíes se lavan dos veces en solución salina fría, y se alicuotan y congelan a -80° C hasta las determinaciones de marcadores redox.

2.2. Métodos analíticos

2.2.1. Método de determinación de hemoglobina

La hemoglobina se determinó según el método de la cianmetahemoglobina, que se basa en que el Fe++ de la hemoglobina, oxihemoglobina y carboxihemoglobina se oxidada a Fe+++ (III) por el ferrocianuro, dando lugar a la metahemoglobina que, en presencia de ión cianuro, origina la cianmetahemoglobina, compuesto de color rojo y estable, que puede determinarse fotométricamente a una longitud de onda de 540 nm. La concentración de hemoglobina se utiliza como variable independiente para referir los resultados de los parámetros determinados en los glóbulos rojos.

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2.2.2. Determinación de la actividad de la glutation peroxidasa (GPx) y reductasa (GRd)

Previamente a las determinaciones bioquímicas, en el día del ensayo se descongelan las alícuotas correspondientes de hematíes, se hemolizan en tampón de hemólisis (tampón fosfato sódico 10 mM, 1 mM EDTA-Na2, pH 6.25), se desproteinizan con ácido tricloroacético al 10% en tampón de hemólisis, y se centrifugan a 20000 g durante 15 min a 4º C, obteniendo el sobrenadante que se utilizó para las determinaciones (146).

Para medir la actividad de GPx, se toman 10 µl de cada sobrenadante y se añaden 240 µl de tampón fosfato conteniendo 4 mM de azida sódica, 60 mM GSH, 20 mM NADPH y 0.5 U/l GRd. Se preincuba 5 min a temperatura ambiente y la reacción se inicia añadiendo 10 µl de cumeno hidroperóxido (0.3%). La actividad GPx se determina siguiendo la oxidación del NADPH durante 3 min a 340 nm en un espectrofotómetro. Para la actividad GRd, se toman 35 µl de cada sobrenadante, se añaden 465 µl de tampón fosfato conteniendo 2.5 mM GSSG, y se incuban durante 5 min a temperatura ambiente. La reacción se inicia añadiendo 8.5 µl de NADPH 12 mM, y la actividad GRd se determina espectrofotométricamente durante 3 min a 340 nm.

La actividad de la GRd y GRd se expresan en μmol/min/g Hb.

2.2.3. Determinación de los niveles de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG)

El glutation oxidado y reducido se determinaron mediante un ensayo fluorimétrico (147, 148). Para ello, se hemolizó y desproteinizó la muestra con ácido tricloroacético al 10% en tampón de hemólisis (tampón fosfato-EDTA 10 mM, pH 6.25, EDTA-Na2 1 mM), centrifugándose a 20000 g durante 15 minutos a 4º C, obteniendo el sobrenadante que se utilizó para las determinaciones.

Para la medida de GSH, se incuban 10 µl del sobrenadante con 10 µl de una solución de oftalaldeido en etanol (1 g/l) y 180 µl de tampón fosfato 100 mM, conteniendo 5 mM EDTA-Na2, pH 8.0 durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación se mide la fluorescencia at 350 nm de excitación y 420 nm de emisión en un espectrofluorímetro (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, USA). Para la medida de GSSG, se usan 200 µl del sobrenadante y se preincuban con 80 µl de una solución de N-etilmaleimida en agua destilada (5 g/l) durante 40 min a temperatura ambiente. A continuación se alcaliniza la mezcla con 720 µl de NaOH 0.1 N; y se toman alícuotas de 30 µl y se incuban con 10 µl de la solución de oftalaldehido y 160 µl de NaOH 0.1 N durante 25 min a temperatura ambiente, midiéndose la fluorescencia a continuación

Los niveles de GSH y GSSH se expresan en µmol/g Hb.

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2.2.4. Determinación de la peroxidación lipídica (LPO)

El índice de peroxidación lipídica se determinó cuantificando el malonildialdehído (MDA) y 4-hidroxinonenal (4-HNE) presentes en el plasma, ambos productos importantes de descomposición de los peróxidos derivados de los ácidos grasos poliinsaturados y sus ésteres relacionados. Las concentraciones de MDA y 4-HNE proporcionan un índice apropiado de la peroxidación lipídica (149). Estos aldehídos reaccionan con el agente cromogénico, el N-metil-2-fenilindol (NMFI), a una temperatura de 45º C. La condensación de una molécula de MDA o 4-HNE con dos moléculas de NMFI produce un cromóforo estable que en presencia de ácido metanosulfónico tiene una absorbancia máxima a 586 nm. Se utilizó un kit comercial (Bioxytech LPO-586 Assay; OXIS International Inc., Portland, Oregón, USA) que contiene el reactivo cromógeno NMFI para la reacción. Para ello, se utiliza un kit comercial que mide ambos metabolitos (Bioxytech LPO-568, OxisResearch, Portland, OR, USA).

La concentración de LPO se expresa en µmol/l.

2.2.5. Determinación de los niveles plasmáticos de nitritos

Dado que el NO• es una molécula altamente inestable y de vida media muy corta, la medida directa de su concentración in vivo resulta difícil. La cuantificación de nitratos y nitritos (NOx), que son derivados más estables, en los fluidos orgánicos y en los tejidos, proporciona un método útil de estimación indirecta del NO• producido endógenamente.

El NO• reacciona rápidamente con el agua para producir nitritos, siendo la concentración de éstos directamente proporcional a la cantidad de NO•. A su vez, los nitritos se oxidan fácilmente en solución acuosa y a pH 7.4 a nitratos, lo que ocurre normalmente en el organismo en proporción variable. Para determinar nitritos usamos una técnica basada en la reacción colorimétrica de Griess (150). El reactivo de Griess, formado por naftil-etilendiamina (NEDA) y sulfanilamida, se combina con los nitritos para formar un compuesto nitrogenado coloreado. La intensidad del color púrpura producido es proporcional a la cantidad de cromógeno formado y, en consecuencia, a la cantidad de nitritos existentes en la muestra. Para determinar los nitratos de la muestra, se reducen a nitritos previamente, mediante la nitrato reductasa.

Para la determinación de NOx, se descongelan alícuotas de plasma, se desproteinizan con sulfosalicílico al 6%, y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. Las muestras se centrifugan a 10000 g durante 15 min, y se toman 50 µl del sobrenadante que se incuban con 4 µl NaOH 1.25%, 36 µl de fosfato deshidrogenasa 14 mM, 750 µM de glucosa-6-fosfato, 30 mU de nitrato reductasa, y 10 µl NADPH 3 µM durante 60 min a temperatura ambiente. La concentración final de NOx se determina espectrofotométricamente a 550 nm.

Los niveles plasmáticos de NOx se expresan en µmol/l.

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2.2.6. Determinación de glutation transferasa (GST)

Los eritrocitos lavados se hemolizan 1:20 en tampón fosfato (10 mM fosfato sódico, 1 mM EDTA-Na2, pH 6.25. Se toman 5 ml del hemolizado y se mezclan con 5 ml de Sephadex CM-50 en el mismo tampón. Esta mezcla se agita durante 3 min y se centrifuga a 6500 g durante 10 min. El sobrenadante se mantiene a 4° C para calcular la actividad GST total (151), usando 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno 30 mM como sustrato. La actividad enzimática se determinó espectrofotométricamente durante 3 min a 340 nm.

La actividad de la GST se expresa por μmol/min/g Hb.

2.2.7. Determinación de la actividad superóxido dismutasa (SOD)

La actividad SOD se mide en el hemolizado de hematíes según el método de Misra y Fridovich (152). EL método se basa en la inhibición de la autooxidación de la adrenalina en medio alcalino en presencia de SOD. Para la determinación enzimática, se toma una alícuota del hemolizado que se incuba en tampón Na2CO3 50 mM conteniendo0.1 mM EDTA, pH 10,2, and 200 µl de una solución 6 mM de adrenalina en1 m ClH. La reacción se mide espectrofotométricamente a 480 nm durante 10 min.

La actividad SOD se expresa en unidades de adrenalina (U/g Hb).

2.2.8. Determinación de citoquinas

Se utilizó el kit Milliplex Human Cytokine Immunoassay kit (Millipore Corp. Ma, USA) para medir la concentración de cinco citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-2, IL-6, IFN-γ y el TNF-α). El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del kit. En resumen, se añaden 50 µl de una solución de trabajo que contiene microesferas ligadas a cada uno de los anticuerpos específicos frente cada una de las citoquinas mencionadas, a los pocillos de una microplaca, se lava dos veces, con 200 µl de solución buffer de lavado, y se filtra hasta la sequedad. A continuación se añaden 25 µl de plasma diluidas 1:4 con el diluyente del kit, y se incuban durante 60 min a temperatura ambiente. Tras diferentes lavados e incubaciones, se determinó la concentración de cada citoquina mediante un lector fluorimétrico (LincoPlex Analyzer) frente a una curva estándar realizada para cada citoquina.

Los niveles de citoquinas se expresan en pg/ml.

2.2.9. Determinación de la concentración de melatonina en plasma.

Los niveles de melatonina en plasma se determinaron mediante HPLC con detección por fluorescencia. Previamente, se extrae la melatonina agregando 1 ml de triclorometano a 500 μl de plasma. Esta solución se agita a 1400 rpm durante un min, se centrifuga a 5000 g. Se elimina la fase acuosa y la fase orgánica se lava tres veces con 500 μl de CO3HNa 50 mM, pH 10.25. Finalmente, 500 μl de esta muestra se colocan en un evaporador-concentrador

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(SpeedVac System) durante 33 minutos a una presión de vacío de 5.1 torr. El residuo seco así obtenido se congelan a -80º C hasta su uso para medir melatonina.

En el día de la determinación, se descongelan y resuspenden los extractos de plasma con fase móvil (100 μl de fosfato sódico 100 mM, 0.1 mM EDTA, conteniendo 25% acetonitrilo). La melatonina se mide por HPLC (Shimazdu Europe GmbH, Alemania) con una columna C18 5 µm Waters Sunfire de 150 x 4.5 mm (Waters Chromatography, Barcelona, Spain). Una vez estabilizada la columna con la fase móvil, se inyectan las muestras (20 µl) en el sistema de HPLC a un flujo de 1 ml/min, usando 5-fluorotriptamina como estándar interno. La fluorescencia de la melatonina se determinó mediante un detector de fluorescencia (Shimadzu RF-10A XL fluorescence detector), con una longitud de onda de excitación y emisión de 285 nm and 345 nm, respectivamente. El tiempo de retención de la melatonina es de 8.9 min. Para el cálculo de la concentración, se construyó una curva estándar de melatonina con 4.45, 8.9, 17.9, 35.9, 71.6 y 143.2 ng/l. La concentración de melatonina se calculó de acuerdo al área del pico.

Los niveles de melatonina se expresan en ng/l.

2.2.10. Determinación de marcadores plasmático de daño muscular

Dentro de las 24 h siguientes a la extracción de sangre, se analizaron las muestras de plasma para la determinación de marcadores de daño muscular: creatin quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH); aspartato aminotransferasa (AST); alanina aminotransferasa (ALT); γ-glutamiltransferasa (γGT); aldolasa, y la mioglobina. Estas determinaciones se llevaron a cabo por las técnicas de rutina del Laboratorio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario San Cecilio de Granada.

III. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todos los datos se expresan como valor de la media ± error estándar (SEM). Se utilizó un test de ANOVA seguido por el test de la t de Student. El nivel de significación estadística se estableció en P < 0.05.

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Resultados

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I. RESULTADOS DEL ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO

Estos resultados se corresponden con el Trabajo Nº 1:

Chahbouni M, Escames G, López LC, Sevilla B, Doerrier C, Muñoz-Hoyos A, Molina-Carballo A, Acuña-Castroviejo D. Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes of patients suffering from Duchenne muscular dystrophy. Clin Biochem doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001, 2011.

En este trabajo se relacionan los parámetros de estrés oxidativo determinados en hematíes de los pacientes de DMD tratados con melatonina.

1.1. Niveles de GSH y GSSG en hematíes de los pacientes con DMD

La Figura 5 (y figura 1 del trabajo nº 1) representa los niveles de GSH (A), GSSG (B), cociente GSSG/GSH (C), y glutatión total (GSH+GSSG) en hematíes del grupo control y en pacientes de DMD antes y durante 3, 6, y 9 meses de la administración de melatonina.

Podemos observar que los pacientes sin tratamiento mostraron niveles significativamente mayores de GSSG (P<0.001) y más bajos de GSH (P<0.01) que el grupo control. Como consecuencia, el cociente GSSG/GSH está significativamente más alto en pacientes (P<0.001).

Figura 5: Variación en el metabolismo intracelular de glutatión. Niveles de GSH (A), GSSG (B), cociente GSSG/GSH (C), y glutatión total (D) en glóbulos rojos de los grupos control(C) y de pacientes con DMD sin y con tratamiento con melatonina. *P<0.05 y **P<0.001 vs. control group; # #P<0.01 and # # #P<0.001 vs. 0.

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Tras tres meses de tratamiento con melatonina, el cociente GSSG/GSH se normaliza, y se mantiene así durante los 9 meses de tratamiento. Este efecto se debe tanto al aumento de GSH como al descenso de GSSG. Al final del tratamiento, existe también un aumento del contenido total de glutatión, a expensas del aumento de GSH.

1.2. Actividad eritrocitaria de GPx y GRd

En la Figura 6 (figura 2 del trabajo nº 1) se representa la actividad de la GPx (arriba) y GRd (abajo) en el grupo control, y en pacientes tratados con melatonina.

Puede observarse principalmente un descenso de la actividad de GRd en los pacientes antes del tratamiento, con respecto al grupo control (P<0.001), y una tendencia no significativa al aumento de la actividad de la GPx. Tras la administración de melatonina, la actividad de la GRd se recupera parcialmente, siendo esta recuperación tiempo-dependiente, recuperándose prácticamente en su totalidad a los 9 meses de la terapia con melatonina (P<0.001). La GPx sigue un curso inverso, disminuyendo su actividad con el tiempo de tratamiento, siendo más baja que el control a los 9 meses (P<0.05).

Figura 6: Actividad de las enzimas GPx (arriba) y GRd (abajo) en el grupo control (C) y en pacientes antes y después de 3,6 y 9 meses de tratamiento con melatonina. *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001 vs. grupo control; # #P<0.01 y # # #P<0.001 vs. 0.

1.3. Actividad eritrocitaria de la GST

En la Figura 7 (figura 3 del trabajo nº 1), se representa la actividad de la GST, determinada en hematíes de los sujetos de estudio.

La actividad de la GST está elevada en los pacientes de Duchenne antes de iniciar el tratamiento, que en los controles. Dicha actividad disminuye significativamente a los 3 meses

C 0 3 6 90

10

20

30

40

GP

x (µ

mol

/min

• g

Hg)

C 0 3 6 9

Duration of treatment (mo.)

0

1

2

3

4

GR

d (µ

mol

/min

• g

Hg)

*****# #

**# #

*# # #

# # *# # #

#

32

de administración de melatonina (P<0.001), y continua bajando hasta los 9 meses (P<0.001), alcanzando valores por debajo de la actividad del grupo control (P<0.001).

Figura 7: Niveles de GST, determinados en glóbulos rojos en el grupo control (C) y pacientes antes y a los 3,6y 9 meses de la administración de melatonina. **P<0.01 y ***P<0.001 vs. grupo control; # # # P<0.001 vs 0.

1.4. Actividad eritrocitaria de la superóxido dismutasa (SOD)

En la Figura 8 (figura 4 del trabajo nº 1), se representa la actividad de la SOD en hematíes de los sujetos analizados. Al igual que la GST, la actividad de la SOD está elevada en los pacientes antes del tratamiento, y se reduce ya a los 3 meses significativamente (P<0.001), manteniéndose en niveles bajos a lo largo de todo el tratamiento.

Figura 8: Actividad de la SOD determinada en glóbulos rojos en el grupo control (C) y en pacientes antes y tras tratamiento con melatonina. ***P<0.001 vs. control; # # #P<0.001 vs 0.

Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes ofpatients suffering from Duchenne muscular dystrophy

Mariam Chahbouni a,b, Germaine Escames a,b, Luis C. López a,b, Belén Sevilla c, Carolina Doerrier a,b,Antonio Muñoz-Hoyos c, Antonio Molina-Carballo c,⁎, Darío Acuña-Castroviejo a,b,c,d,⁎⁎a Instituto de Biotecnología, Centro de Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Universidad de Granada, Granada, Spainb Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, Granada, Spainc Unidad de Gestión Clínica de Pediatría, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, Spaind Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, Spain

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:Received 23 February 2011Received in revised form 17 March 2011Accepted 2 April 2011Available online xxxx

Keywords:Oxidative stressMelatonin therapyMuscular dystrophyErythrocytes

Objectives: To analyze whether the antioxidant melatonin could reduce the hyperoxidative status in theblood of patients with Duchenne's muscular dystrophy.

Design and methods: Ten patients aged 12.8±0.9 years were treated with melatonin (60 mg at 21:00 hplus 10 mg at 09:00 h) for 9 months, and erythrocyte markers of oxidative stress were determined at 3, 6, and9 months of treatment. Healthy age- and sex-matched subjects served as controls.

Results: Prior to treatment, the patients had higher glutathione disulfide/glutathione ratio and higherglutathione transferase and superoxide dismutase activities, and lower glutathione reductase activity thancontrols. After 3 months ofmelatonin treatment, the hyperoxidative status of these patientswas counteracted,being reduced to the normal redox state between 3 and 9 months.

Conclusion: These results, together with the reduction in the inflammatory process and in muscle injuryrecently reported in the same patients, support the efficacy of melatonin therapy in DMD patients.

© 2011 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Duchenne muscular dystrophy (DMD), a disease linked to X chro-mosome and affecting 1 in 3500 newborns, is a lethal disorder char-acterized by progressive muscle weakness [1,2]. The DMD is causedby different mutations of the gene that encodes the dystrophin, aprotein of 427 kDa that usually locates in the cytoplasmic face of thesarcolemma [1,3,4]. The role of dystrophin in the muscle is unclear,and it was related to the prevention of free radical generation [5,6].Among other considerations, dystrophic muscles show a functionalischemia during muscle contraction, with subsequent reperfusionduring rest, which may imply the existence of an increased oxidativestress [7].

In this regard, increased levels of 8-hydroxy-2′-deoxy-guanosine,protein and lipid peroxidation, and lipofuscin accumulation indystrophic muscles have been reported [8–12]. In supporting thesedata, an enhanced sensitivity of dystrophin-deficient muscle cells to

oxidative damage was reported [13]. A hyperoxidative status was alsoshowed in themuscle ofmdxmice (deficient in dystrophin), includingthe reduction in the total glutathione content and an increase inthe disulfide glutathione (GSSG)/glutathione (GSH) ratio; increasedactivities of the GSH cycle, glutathione peroxidase (GPx) andreductase (GRd), and reduced concentration of hydrogen isocitratecoupled with NADP (ICDH) and aconitase, two enzymes sensitive toinactivation by oxidative stress and also involved in the production ofGSH [14]. Thus, the progressive loss of muscle fibers in DMD patientsmay involve a chronic oxidative injury that surpasses the ability ofmuscle regeneration [6].

Although the factors involved in the reduced ability of muscleregeneration in DMD are yet unclear, a relationship between the lossof the neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression secondary todystrophin deficiency, and increased reactive oxygen species (ROS)production, seem to be involved [15]. In this regard, there is aninduction of pro-inflammatory genes by ROS including cytokinesthrough the activation of NF-kB in DMD patients [16]. Besides, nNOS, amember of the dystrophin-glycoprotein complex, produces nitricoxide (NO●), a gas involved in multiple regulatory pathways. Amongothers, NO● participates in the homeostasis of the redox statusbecause it can scavenge ROS produced by inflammatory cells [17],protecting the muscle from oxidative damage [18]. We recentlyreported that patients suffering from DMD showed a noteworthy pro-inflammatory status coursing with high levels of NO● and pro-

Clinical Biochemistry xxx (2011) xxx–xxx

⁎ Correspondence to: A. Molina-Carballo, Unidad de Gestión Clínica de Pediatría,Hospital Universitario San Cecilio, Avenida Dr. Olóriz 12, 18012 Granada, Spain.⁎⁎ Correspondence to: D. Acuña-Castroviejo, Instituto de Biotecnología, Centro de

Investigación Biomédica, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Universidad deGranada, Avenida del Conocimiento s/n, 18100 Armilla, Granada, Spain.

E-mail addresses: amolinac@ugr.es (A. Molina-Carballo), dacuna@ugr.es(D. Acuña-Castroviejo).

CLB-07652; No. of pages: 6; 4C:

0009-9120/$ – see front matter © 2011 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001

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Please cite this article as: Chahbouni M, et al, Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes of patients sufferingfrom Duchenne muscular dystrophy, Clin Biochem (2011), doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001

inflammatory cytokines including IL-1β, IL-2, IL-6, TNF-α and INF-γ[19]. The pro-inflammatory status in these patients was absolutelycounteracted after 9 months of treatment with melatonin, a knownantioxidant and anti-inflammatory molecule [20]. Here, we analyzedin these patients the intracellular oxidative stress status of erythro-cytes before and after melatonin therapy, looking for a beneficialeffect of melatonin in reducing the hyperoxidative status of thesepatients. Erythrocytes were used in this study because red bloodcells do not contribute to oxidative damage, andwe can unequivocallymeasure those antioxidants able of crossing the plasma membraneinto the intracellular space. Therefore, the intracellular redox statusobtained from erythrocytes measurement indirectly reflects the redoxstatus of the skeletal muscle cells [21,22].

Patients and methods

Patients

The study was carried out on 10 ambulant pediatric patients,aged 12.8±0.98 years, who were followed in the Neuropediatric Unitof the Granada's University Hospital (Granada, Spain). These patientswere diagnosed of DMD at 4–5 years of age by genetic analyses.Only those patients suffering from DMD with no other pathology ortreatment, except for corticoids, were included in the study. Informedconsent was obtained from all parents and from the Hospital's EthicalCommittee, according to the 1983 revised Helsinki Declaration of1975. The final study was approved by the Andalusian's EthicalCommittee of Clinical Assays (ref. 0191/06). The following data weresystematically collected: age, sex, onset, and type of clinical signs;laboratory data (muscle biopsy results), skeletal muscle enzyme as-sessments, and genetic diagnosis. The patients were under treatmentof prednisone at least 5 years ago (0.75 mg/kg/day) before they wereenrolled in the study and, due to ethical considerations, prednisonetreatment wasmaintained along the study. Melatonin (Fagrón Ibérica,Barcelona, Spain) therapy consisted in the administration of two oraldaily doses of the indoleamine for 9 months, one at 09:00 h (10 mgmelatonin) and the other at 21:00 h (60 mg melatonin), respectively.The daily schedule of melatonin administration was chosen to main-tain the night/day bloodmelatonin concentration differences. A groupof 10 healthy age-, sex-, and weight-matched group of children wasused as a control group (C).

Samples

Blood samples were obtained from the antecubital vein in allpatients at 9:00 am before starting with melatonin therapy, and 3, 6,and 9 months during melatonin treatment. Samples were centrifugedat 3000 g for 10 min and erythrocytes were separated, washed twicewith cold saline, and frozen at −80 °C until the biochemical assayswere performed. On the day of the experiment, washed erythrocyteswere hemolized in phosphate buffer (10 mM sodium phosphate,1 mM EDTA-Na2, pH 6.25), deproteinized with ice-cold 10% trichlor-oacetic acid, and centrifuged at 20000 g for 15 min. Supernatants werethen used for the measurements.

Glutathione assay

For glutathione measurement, 10 μL supernatant was incubatedwith 10 μL of ethanol ophthalaldehyde solution (1 g/L) and 180 μLphosphate buffer (100 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA-Na2, pH8.0) for 20 min at room temperature. Then, the fluorescence of thesamples was measured at 350 nm excitation and 420 nm emissions ina plate-reader spectrofluorometer (Bio-Tek Instruments, Inc., Winoo-ski, USA) [21]. For glutathione disulfide measurement, 200 μl aliquotsof supernatants were preincubated with 80 μL N-ethylmaleimidesolution (5 g/L in distilled water) for 40 min at room temperature

and then alkalinized with 720 μl sodium hydroxide 0.1 N. Aliquots of30 μL were then incubated with 10 μL ophthalaldehyde solution and160 μl sodium hydroxide 0.1 N for 25 min at room temperature, andthe fluorescence was then measured [23]. Glutathione concentrationswere calculated according to standard curves previously prepared.Levels are expressed in μmoL/g Hb.

Glutathione peroxidase and reductase assays

To measure glutathione peroxidase activity, 10 μL of each super-natant were added to 240 μL of working solution containing bufferA plus 4 mM sodium azide, 60 mM glutathione, 20 mM reducednicotinamide adenine dinucleotide phosphate and 0.5 U/L glutathionereductase. After incubation for 5 min at room temperature, the re-action was started by adding 10 μL of cumene hydroperoxide (0.3%)and the glutathione peroxidase activity was determined following theoxidation of the reduced nicotinamide adenine dinucleotide phos-phate for 3 min at 340 nm in an UV spectrophotometer (ShimadzuDeutschland GmBH, Duisburg, Germany) [24]. To measure glutathi-one reductase activity, 35 μL of each supernatant were added to465 μL of working solution containing buffer A plus 2.5 mM disulfideglutathione. After incubation for 5 min at room temperature, thereaction was started by adding 8.5 μL of reduced nicotinamideadenine dinucleotide phosphate 12 mM and the glutathione reduc-tase activity was spectrophotometrically determined for 3 min at340 nm [24]. Glutathione peroxidase and reductase activities areexpressed as nmoL/min • g Hb. In both cases, non-enzymatic reducednicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidation was sub-tracted from the overall rates.

Glutathione transferase assay

Washed erythrocytes were hemolized in 1:20 phosphate buffer(10 mM sodium phosphate, 1 mM EDTA-Na2, pH 6.25). Five mL ofhemolisate were mixed with 5 mL Sephadex CM-50 with the samebuffer (1:100); vortex for 3 min, and centrifuged at 6500 g for 10 min.The supernatant was maintained at 4 °C to calculate the total GSTactivity, following the procedure of Habig et al. [25], using 30 mM1-chloro-2,4-dinitrobenzene as substrate. The activities were spec-trophotometrically measured for 3 min at 340 nm, and expressed asμmoL/min • g Hb).

Superoxide dismutase assay

SOD activity was measured in washed and hemolized erythrocytesfollowing the method of Misra and Fridovich [26]. This method isbased on the inhibition of adrenaline autooxidation in alkalinemedium by the enzyme. Briefly, an aliquot of hemolized erythrocyteswas incubated in 50 mM Na2CO3 buffer containing 0.1 mM EDTA, pH10.2 and 200 μL of a solution of 6 mM epinephrine in 1 mL HCl. Thereaction was followed a 480 nm by 10 min in a spectrophotometer(Shimadzu Deutschland GmBH, Duisburg, Germany). SOD activitywas expressed in adrenaline units (U/g Hb).

Statistical analysis

Data are expressed as the mean±SEM. ANOVA followed byStudent's t-test were used to compare the means between groups(before and after the treatment). A P value of less than 0.05 wasconsidered statistically significant.

Results

The levels of plasma melatonin were in the normal range both inhealthy controls (6.7±0.5 pg/mL) and in DMD patients (9.67±0.7 pg/mL). During the treatment, plasma levels of melatonin were

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stable and maintained at a pharmacological level (947±57 pg/mL)(data not shown, see Ref. 19).

Compared with the control group (C), DMD patients had increasedratio of the erythrocyte GSSG/GSH before melatonin treatment(group 0) (Fig.1C, Pb0.001), which was mainly dependent on thehigh levels of erythrocyte GSSG found in the patients (Fig. 1B).Melatonin reduced the erythrocyte GSSG/GSH ratio to control valuesafter 3 months of treatment (Pb0.001), due to a reduction in GSSGand increase in GSH levels in erythrocytes (Fig. 1A and B). The effectsof melatonin were maintained up to 9 months later. Erythrocyte GSHincreased in a time-dependent manner, reaching the highest valuesat the end of treatment (Fig. 1A, Pb0.001). At this time, i.e., 9 monthsof melatonin treatment, the levels of total GSH increased significantly(Fig. 1D, Pb0.001).

The enzymes of the GSH redox cycle in erythrocytes also changedsignificantly. Whereas GPx activity was similar in DMD patients andcontrols (Fig. 2A), GRd activity was significantly reduced in the former(Fig. 2B, Pb0.001). Melatonin treatment reduced GPx and increasedGRd activities in a time-dependent manner, with the highest effectsobtained after 9 months of treatment (Pb0.001).

DMD patients had the erythrocyte GST activity above the healthysubjects (Fig. 3A). Melatonin reduced erythrocyte GST activity alongthe treatment, remaining below the controls 9 months later. Eryth-rocyte SOD activity was higher in patients than in controls (Fig. 4,Pb0.001), but after melatonin administration, the activity of SOD wassignificantly reduced during the 9 months of treatment.

Discussion

Our results show an increased oxidative stress in erythrocytes ofDMD patients compared with healthy subjects. These patients alsoshowed a significant reduction in their antioxidative defense ability.Because erythrocytes do not contribute to oxidative damage, and itwas reported that biochemical abnormalities in DMD are reflected inalterations in erythrocytes, the intracellular redox status obtainedfrom erythrocytes measurement indirectly reflects the redox statusof the skeletal muscle cells [21,22]. Together, the data support the

existence of an intracellular hyperoxidative status in erythrocytes ofDMD patients, probably reflecting the oxidative damage present inthe dystrophic skeletal muscle. Of note, the redox status in DMDpatients returned to values found in healthy subjects after melatonintreatment. These results, together with those elsewhere reported[6,19], support the hypothesis of a pathogenic role for oxidativestress/inflammation in DMD, and they confirm the utility of melatoninin counteracting the oxidative stress and inflammatory status inDMD patients. Melatonin therapy also reduced the plasma levels ofcreatine kinase by 50% [19], supporting that blood reduction of theoxidative/nitrosative stress reflects a reduction in dystrophic muscledamage.

Fig. 1. Erythrocyte levels of GSH (A), GSSG (B), total glutathine (D), and GSSG/GSH ratio (C), before (0) and 3, 6 and 9 months after melatonin treatment, compared with the levels inthe control group (C). *Pb0.05, **Pb0.01, and ***Pb0.001 vs. C; # #Pb0.01 and # # #Pb0.001 vs. 0; ‡‡Pb0.05 vs. 3 months.

Fig. 2. Erythrocyte activities of GPx (A) and GRd (B) before (0) and 3, 6 and 9 monthsafter melatonin treatment, compared with the levels in the control group (C). *Pb0.05,**Pb0.01, and ***Pb0.001 vs. C; # #Pb0.01 and # # #Pb0.001 vs. 0.

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Because DMD seems to involve oxidative stress-dependent muscleinjury [6], the progress of this disease could be clarified with thedetermination of biomarkers of free radicals in blood. Although GSHis one of the most abundant and physiologically important antioxi-dants in the skeletal muscle [14], no information regarding the keycomponents of the GSH system in dystrophin-deficient muscle andtheir response to oxidative stress in DMD patients is yet available.Here, we analyzed in detail the GSH cycle and themetabolic pathwaysinvolved in the regeneration of GSH. According with previous studiesinmdxmice, our data further support the existence of an imbalance inthe redox status in the blood of patients with DMD [9,13,19,27,28].Our study is consistent with the observation that the levels of GSSGand the GSSG/GSH ratio are higher in dystrophic patients than inhealthy subjects, coinciding with a decline of GSH [14]. Because theGSSG/GSH ratio is the best index of oxidative stress status into de cell[29], our data are consistent with a high intracellular hyperoxidativestatus in DMD patients.

Changes in GSSG and GSH levels in the blood may also reflectchanges in the enzymes of the GSH redox cycle [30], GPx and GRd. GPxplays a key role for the elimination of peroxides, oxidizing GSH toGSSG, whereas GRd recycles GSSG back to GSH [30,31]. Since GSHcan also act as a direct scavenger of free radicals through electrondonation [32], keeping a suitable activity of GRd is critical to yield asufficient GSH pool for the antioxidant defense of the cell. The slightincrease in GPx activity in DMD patients here found was reportedelsewhere [33], and it could reflect a compensatory mechanism ofthe organism against oxidative damage. Nevertheless, the importantinhibition of the GRd activity found in erythrocytes of DMD patientsexplains the high GSSG levels and high GSSG/GSH ratio in thesepatients. Even more, the disruption of the GSH cycle supports theinability of dystrophic subjects to defend themselves against freeradical damage, which accounts for the significant membrane damageelsewhere reported in DMD patients [19].

Glutathione S-transferase (GST) is a subgroup of GST family es-sential in the detoxification of products derived from oxidative stress[34,35]. Under normal conditions GST, along with other antioxidant

enzymes, such as SOD and GPx, provide the cell with protectionagainst a range of harmful electrophiles produced during oxidativedamage [36]. The increased activities of both GST and SOD in DMDerythrocytes suggest the existence of an elevated redox status [37,38]that, in the case of SOD, reflects the high production of O2

_• by the

patients, which is dismutated to H2O2. The slight increase in GPxactivity found in DMD patients confirms this pathway.

Thus, we can consider that the increased activities of GST and SODand, in a lesser extent, GPx, found in DMD patients constitute oneof the first responses of the organism against free radical attack. It isimportant to note that the activity of the GST and GPx enzymesrequires GSH and, thus, their effectiveness depends on the GSH poolin the cell [36]. In turn, the GSH pool in the cell depends on the activityof GRd, which reduces GSSG to GSH. The DMD patients showed areduced activity of GRd, which explains the diminished GSH levelsin their erythrocytes. Thus, the detoxifying efficiency of GST and GPxis overlapped by the decreased GSH availability and thus, reactiveoxygen species remain active [36]. This explains also the high levelsof lipoperoxidation elsewhere reported [12,19,37,38], and the highGSSG/GSH ratio here showed.

From these data we suggest that the main cause in reducing theefficacy of the endogenous antioxidative system in DMD patientsdepends on their inability to maintain the GSH homeostasis. Con-sequently, an antioxidant therapy should include a compound able torestore the GSH pool in the cell. A molecule that fulfills this featureis melatonin, an endogenous antioxidant. Although originally identi-fied as a product of the pineal gland with chronobiotic properties, it isnow known that most of the organs and tissues of the human bodyalso produce melatonin [39]. There are now substantial evidencessupporting the antioxidative and anti-inflammatory properties of theindoleamine. Melatonin scavenges both oxygen and nitrogen species[40–42], yielding a series of metabolites that are also free radicalscavengers [43,44], constituting the so-called the antioxidant melato-nin's cascade [40]. Moreover, melatonin and its metabolites do notonly scavenge ROS and RNS directly, but also induces the expression ofthe antioxidant enzymes including GPx, SOD, GRd [41,45].

In vitro and in vivo studies have reported a protective role ofmelatonin againstmuscle oxidative/inflammatory damage in differentmodels of disease including aging and sepsis [46–48]. Additionally,melatonin also reduces inflammatory injury in cardiac muscle dueto acute exercise [49]. The main locus of melatonin action is themitochondria, increasing their bioenergenetic activity and reducingthe oxygen toxicity [50,51], thus reducing mitochondrial permeabilitytransition andmuscle cell death [52]. Altogether, these studies provideenough scientific bases for the clinical use of melatonin in DMD [53].

Our results show that 3 months of melatonin administration wereenough to increase GSH levels even upon the control levels. Severalmechanisms involve the high efficiency of melatonin on GSHhomeostasis. Firstly, melatonin scavenges ROS directly, reducing theconsumption of GSH by GST and GPx [54]. Secondly, melatoninincreases GRd activity, supporting an increase in the available GSH.Thirdly, melatonin increases the activity of the gamma-glutamyl-cysteine-synthase, an enzyme required for GSH synthesis [55]. Allthese features of melatonin allow it to maintain the GSH pool of thecell, reducing the oxidative stress [56]. Consequently, the GSSG/GSHratio, the main intracellular redox index [29], returned to normalvalues after melatonin therapy, suggesting that the intracellularoxidative stress is now under control. Although 3 months of treatmentwere enough to reduce the redox status to control values in DMDpatients, melatonin further increased the GSH pool up to 9 months oftreatment, probably reflecting the increase in GSH synthesis [55]. Thatmelatonin therapy maintains the ROS production under control wasfurther supported because the activities of the detoxifying enzymes,GPx, GST and SOD, decreased with the treatment. Normalization ofthe redox status in DMD patients by melatonin was followed by asustained reduction in the markers of muscle necrosis, including

Fig. 3. Erythrocyte activities of GST (A) and termostable GST (GSTt, B) before (0) and 3,6 and 9 months after melatonin treatment, compared with the levels in the controlgroup (C). **Pb0.01, and ***Pb0.001 vs. C; # # #Pb0.001 vs. 0.

Fig. 4. Erythrocyte activities of SOD before (0) and 3, 6 and 9months after melatonintreatment, comparedwith the levels in the control group (C). ***Pb0.001vs. C;###Pb0.001vs. 0; ‡Pb0.05 vs. 3 months.

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Please cite this article as: Chahbouni M, et al, Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes of patients sufferingfrom Duchenne muscular dystrophy, Clin Biochem (2011), doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001

50% reduction in creatine kinase, 28% reduction in lactate dehydro-genase, and 13% reduction in myoglobin [19], suggesting a reductionin muscle necrosis.

From a therapeutic point of view, established interventions inDMD include pharmacological use of glucocorticoids, psychosocialmanagement, physical therapy, skeletal muscle, respiratory andcardiac managements, and exercise and nutritional considerations[57,58]. Emergent therapies to restore the dystrophin expression,such as antisense oligonucleotide therapies [59,60] and stem celltherapy [61], are being evaluated. The results of this study, and thosereported elsewhere in the same patients [19], and in other children'soxidative stress status [62], suggest that melatonin therapy may sig-nificantly improve the course of the disease in DMD patients. Where-as there is no current treatment for DMD, melatonin should beimplemented as routine therapy of DMD.

Acknowledgments

The authors thank ASEMGRA (Asociación de Enfermos MuscularesdeGranada) for the promotion of the study. This researchwas partiallysupported by grants from the Instituto de Salud Carlos III (RD06/0013/0008 and PI08-1644), from the Servicio Andaluz de Salud (422/2006),and from the Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta deAndalucía (P07-CTS-03135, CTS-190, and CTS-101). LCL is a postdoc-toral fellow from the Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa(Junta de Andalucía, Spain).

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6 M. Chahbouni et al. / Clinical Biochemistry xxx (2011) xxx–xxx

Please cite this article as: Chahbouni M, et al, Melatonin treatment counteracts the hyperoxidative status in erythrocytes of patients sufferingfrom Duchenne muscular dystrophy, Clin Biochem (2011), doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.04.001

33

II. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE DAÑO INFLAMATORIO

Estos resultados se corresponden con el Trabajo Nº 2:

Chahbouni M, Escames G, Venegas C, Sevilla B, García JA, López LC, Muñoz-Hoyos A, Molina-Carballo A, Acuña-Castroviejo D. Melatonin treatment normalizes plasma pro-inflammatory cytokines and nitrosative/oxidative stress in patients suffering from Duchenne muscular dystrophy. J Pineal Res 2010; 48:282-289.

En este trabajo se analizan distintos marcadores de inflamación en los pacientes de Duchenne, incluyendo citoquinas proinflamatorias, óxido nítrico, y comparándolos con unos marcadores de daño de membranas como es la LPO.

2.1. Niveles plasmáticos de peroxidación lipídica (LPO)

En la Figura 9 (figura 1 del trabajo nº 2) se muestran los niveles plasmáticos de LPO en los grupos estudiados. Los niveles de LPO están significativamente elevados (P<0.001) en los pacientes antes del tratamiento, con respecto al grupo control. A los tres meses de administración de melatonina, los niveles de LPO descienden a valores normales (P<0.01), disminuyendo todavía más al final del tratamiento (P<0.001).

Figura 9: Niveles plasmáticos de LPO en el grupo control (C) y en pacientes antes y tras el tratamiento con melatonina. *P <0.05 y ***P<0.001 vs. control; # #P <0.01 y # #

#P<0.001 vs. 0.

34

2.2. Niveles plasmáticos de IL-1β, IL-2 e IL-6

En la Figura 10 (figura 2 del trabajo nº 2) se representan los niveles plasmáticos de IL-1β, IL-2 e IL-6 en el grupo control y el grupo de pacientes de DMD. Tanto la IL-1β (P<0.01) como IL-2 e IL-6 (P<0.001), están elevadas en los pacientes antes de iniciar el tratamiento, comparadas con el grupo control. A los tres meses de la administración de melatonina, las tres citoquinas descienden drásticamente (P<0.001) a valores incluso por debajo del control en el caso de la IL-1β (P<0.01) e IL-2 (P<0.05). A los 6 y 9 meses de iniciado el tratamiento, todas las citoquinas siguen descendiendo, alcanzando los valores mínimos al final del tratamiento (P<0.001).

Figura 10: Niveles plasmáticos de IL-1β, IL-2 e IL-6 en el grupo control y en pacientes antes y durante el tratamiento con melatonina.*P<0.05, **P <0.01 y ***P<0.001 vs. control; # #

#P<0.001 vs 0; ‡‡P<0.01 y ‡‡‡P<0.001 vs. 3 y 6.

2.3. Niveles plasmáticos de TNF-α, INF-γ

En la Figura 11 (figura 3 del trabajo nº 2) se observan las variaciones en los niveles plasmáticos de TNF-α e INF-γ en los grupos analizados. Ambas citoquinas están muy elevadas en los pacientes antes del tratamiento, comparado con el grupo control (P<0.001). A los tres meses de la administración de melatonina, tanto el TNF-α (P<0.01) como el INF-γ (P<0.001), bajan a niveles controles. El TNF-α se mantiene estable a los 6 meses de la melatonina, y desciende por debajo del control a los 9 meses (P<0.001). Por su parte, el INF-γ desciende muy significativamente a los 6 meses, manteniéndose bajo al final del tratamiento (P<0.001).

35

Figura 11: Niveles plasmáticos de TNF-α e INF-γ en el grupo control y en pacientes antes y después del tratamiento con melatonina. *P<0.05, **P<0.01 y***P <0.001 vs. control; # #

#P<0.001 vs 0; ‡‡P<0.01 y ‡‡‡P<0.001 vs. 3 y 6.

2.4. Niveles plasmáticos de nitritos (NOx)

La Figura 12 (figura 4 del trabajo nº 2) se muestran los niveles plasmáticos NOx en el grupo control y el grupo de pacientes. Los niveles de NOx están elevados en los pacientes antes de iniciar el tratamiento (P<0.05), y bajan significativamente a los 3 meses (P<0.01), manteniéndose bajos hasta el final del tratamiento...

Figura 12: Niveles en plasma de NOx en el grupo control y en pacientes antes y después del tratamiento con melatonina. *P <0.05 y **P<0.01 vs. control; # #P<0.01 vs. 0.

36

2.5. Niveles plasmáticos de melatonina

En la Figura 13 (figura 5 del trabajo nº 2) se representa la evolución de los niveles plasmáticos de melatonina durante el tratamiento. La concentración plasmática de melatonina es baja, similar al control, antes de iniciarse su administración, subiendo ya a los tres meses a valores farmacológicos, que se mantienen a .lo largo del tratamiento (P<0.001).

Figura 13: Niveles plasmáticos de melatonina en el grupo control y en pacientes antes y durante el tratamiento con melatonina. ***P<0.001 vs. 0.

III. RESULTADOS DE LOS MARCADORES DE DAÑO MUSCULAR

En paralelo a las determinaciones de marcadores de estrés oxidativo e inflamación, se determinaron en plasma diferentes marcadores de daño muscular, así como otros sistémicos.

La Tabla 1 (tabla 1 del trabajo nº 2) representa los niveles de: creatin quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH); aspartato aminotransferasa (AST); alanina aminotransferasa (ALT); γ-glutamiltransferasa (γGT); aldolasa, y mioglobina. Los niveles de CK disminuyeron a la mitad al final del tratamiento, concomitantemente con el descenso de la AST, ALT, LDH y mioglobina.

37

Tabla 1. Dtaos bioquímicos obtenidos de los pacientes de DMD y controles.

Parámetro

Control

(n = 10)

Tratamiento

Tiempo 0

(n = 10)

3 meses

(n = 9)

6 meses

(n = 7)

9 meses

(n = 5)

CK 114 ± 45 7301 ± 2219 4912 ± 2007 6149 ± 1827 3969 ± 1617

AST 23 ± 5 143 ± 37 110 ± 32 131 ± 26 103 ± 34

ALT 24 ± 3 200 ± 52 170 ± 55 192 ± 39 159 ± 50

γGT 25 ± 2 16 ± 2 15 ± 2 21 ± 2 17 ± 3

LDH 345 ± 22 1362 ± 313 7881 ± 313 1119 ± 263 982 ± 325

Aldolase 6 ± 2 27 ± 7 33 ± 13 27 ± 6 24 ± 8

Myoglobin 50 ± 10 654 ± 127 450 ± 98 505 ± 96 ----

Los datos se expresan como media ± EE. Las actividades enzimáticas se expresan en U/L, y la concentración de mioglobina en ng/l.

Melatonin treatment normalizes plasma pro-inflammatorycytokines and nitrosative/oxidative stress in patients sufferingfrom Duchenne muscular dystrophy

Introduction

Duchenne muscular dystrophy (DMD), the second mostcommon genetic disease in humans, is a lethal disorder

characterized by lack of dystrophin that results in chronicinflammation, sarcolemmal damage, and skeletal muscledegeneration [1]. The genetic basis of DMD is well known

but the dystrophic process, i.e., necrosis, exhaustive regen-eration, and secondary fibrosis, is unclear. DMD is causedby different mutations of the gene encoding dystrophin, a

protein of 427 kDa usually located in the cytoplasmic faceof the sarcolemma [2]. In the normal muscle, dystrophin is

associated with a multimolecular complex of glycoproteins,the dystrophin glycoprotein complex (DGC), which innormal muscle forms a link between the extracellular

matrix and the cytoskeleton to protect against contraction-induced membrane lesions and to regulating cell signaling[3, 4]. Moreover, DGC also plays a role of �scaffolding� thatintegrates into the membrane proteins such as nitric oxidesynthase (NOS) [3].Among the multiple pathogenic mechanisms proposed in

the DMD [1, 3, 5], increasing evidence suggest the

involvement of oxidative stress and inflammation to explainthe dystrophic process [6, 7]. In turn, the occurrence of a

Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD), a lethal disorder

characterized by dystrophin absence, courses with chronic inflammation,

sarcolemmal damage, and skeletal muscle degeneration. Among the multiple

pathogenic mechanisms proposed for DMD, oxidative stress and

inflammation are directly involved in the dystrophic process. Unfortunately,

there is no current treatment for DMD, and the inflammatory process is an

important target for therapies. Based on the antioxidant and anti-

inflammatory properties of melatonin, we investigated whether melatonin

treatment may reduce the dystrophic process. Ten DMD patients aged

12.8 ± 0.98 yr, were treated with melatonin (60 mg at 21:00 hr plus 10 mg

at 09:00 hr), and plasma levels of lipid peroxidation (LPO), nitrites (NOx),

interleukin (IL)-1b, IL-2, IL-6, tumor necrosis factor-a, interferon-c, andplasma markers of muscle injury, were determined at 3, 6 and 9 months of

treatment. Healthy age- and sex-matched subjects were used as controls. The

results show a significant increase in LPO, NOx, and cytokine levels in

plasma of DMD patients compared with controls. Melatonin administration

reduced these values to control levels at 3 months of treatment, decreasing

further 9 months later. In parallel, melatonin also reduced plasma levels of

creatine kinase (CK; 50%), lactate dehydrogenase (28%), aspartate

aminotransferase (28%), alanine aminotransferase (20%), and myoglobin

(13%). These findings strongly support the conclusion that melatonin

administration significantly reduced the hyperoxidative and inflammatory

process in DMD patients, reducing the muscle degenerative process.

Mariam Chahbouni1,2, GermaineEscames1,2, Carmen Venegas1,2,Belen Sevilla3, Jose AntonioGarcıa1,2, Luis C. Lopez1,2,Antonio Munoz-Hoyos3, AntonioMolina-Carballo3 and DarıoAcuna-Castroviejo1,2,4

1Instituto de Biotecnologıa, Centro de

Investigacion Biomedica, Parque Tecnologico

de Ciencias de la Salud, Universidad de

Granada, Armilla, Granada, Spain;2Departamento de Fisiologıa, Facultad de

Medicina, Universidad de Granada, Granada,

Spain; 3Unidad de Gestion Clınica de

Pediatrıa, Hospital Universitario San Cecilio,

Granada, Spain; 4Servicio de Analisis Clınicos,

Hospital Universitario San Cecilio, Granada,

Spain

Key words: antioxidant, cytokines,

inflammation, melatonin therapy, muscular

dystrophy, oxidative stress, pediatric patients

Address reprint requests to Dario Acuna-

Castroviejo, Instituto de Biotecnologıa, Centro

de Investigacion Biomedica, Parque Tec-

nologico de Ciencias de la Salud, Universidad

de Granada, Avenida del Conocimiento s/n,

18100 Armilla, Granada, Spain.

E-mail: dacuna@ugr.es; or Antonio Molina-

Carballo, Servicio de Pediatrıa, Hospital Uni-

versitario San Cecilio, Avenida Dr. Oloriz 12,

18012 Granada, Spain.

E-mail: amolinac@ugr.es

Received November 25, 2009;

accepted January 11, 2010.

J. Pineal Res. 2010; 48:282–289Doi:10.1111/j.1600-079X.2010.00752.x

� 2010 The AuthorsJournal compilation � 2010 John Wiley & Sons A/S

Journal of Pineal Research

282

Mo

lecu

lar,

Bio

log

ical

,Ph

ysio

log

ical

an

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lin

ical

Asp

ects

of

Mel

ato

nin

functional ischemia during muscle contraction, with thesubsequent reperfusion during rest, support the free radicalgeneration responsible for the hyperoxidative status and

muscle damage [8]. Moreover, recent data support theparticipation of free radicals in gene induction [9]. Amongothers, nuclear factor-kappaB (NF-kB) immunoreactivitywas detected in plasma, macrophages and in the cytoplasm

of all fibers in regeneration and in the 20–40% of necroticfibers in muscle specimens of DMD patients, suggestingthat NF-kB is active in the DMD [10, 11]. NF-kB is one of

the transcription factors that seems to be regulated by theredox status of the cell [12, 13]. In turn, NF-kB modulatesthe cellular immune responses, inflammation, and prolifer-

ation in the skeletal muscle, and it plays a key role in theexpression of the inducible genes, including tumor necrosisfactor (TNF)-a and interleukin (IL)-1b [14]. In turn, TNF-acan also stimulate the production of mitochondrial reactive

oxygen species (ROS), thus creating a positive feedbackloop whereby the increased ROS cause further activation ofNF-kB as well as having their own deleterious effects on the

muscle [15]. Using mdx mice as an animal model of DMD[16], treatment with inhibitors of the NF-kB pathway [17]or with anti-TNF-a antibodies [18], resulted in a reduction

in muscle necrosis and inflammation. NF-kB is alsoactivated in response to pro-inflammatory molecules suchas IL-1b, IL-6, and TNF-a. These cytokines as well as NF-

kB have been found increased in DMD [7, 19]. Recent datasuggest that the inhibition of lipid peroxidation (LPO),which reflects the oxidative damage to membranes, bluntsNF-kB activation and reduces TNF-a in mdx mice,

reducing muscle degeneration and necrosis, increasing itsregeneration and reducing creatine kinase (CPK) concen-tration [20].

Nitric oxide (NO•) can scavenge ROS produced byinflammatory cells [21]. But in mdx muscle, the inhibitionof neuronal NO synthase (NOS) leads to a reduction in

NO• levels, which may increase the ROS damage [7]. Thesignificance of the reduced NO• levels in dystrophic muscleis unclear, although a reduction in muscle damage, inflam-

mation and plasma CK levels after the upregulation of NO•in muscles of mdx mice, was reported [7].

Despite extensive research into the genetic and cellularmechanisms underlying DMD, and the promising gene

therapy, there are no effective treatments for this disease todate. The existence of a hyperoxidative status and inflam-mation suggest that antioxidant and/or anti-inflammatory

therapy may have beneficial effects in DMD. Melatonin, anendogenous antioxidant with anti-inflammatory properties,is a good candidate for this type of therapy. Melatonin, as

well as its metabolites, directly scavenges reactive oxygen(ROS) and nitrogen (RNS) species, thus improving mito-chondrial function and reducing the redox status of the cell[22–26]. But more importantly, melatonin induces the

expression and activity of antioxidant enzymes such a asglutathione peroxidase and reductase [27, 28], thus increas-ing intracellular reduced glutathione (GSH) pool [29, 30].

The consequence of these actions is the LPO reduction bymelatonin administration [31, 32], a finding that may berelated to inhibition in NF-kB levels elsewhere described

[20, 33]. Melatonin administration also inhibits the expres-sion of some of the NF-kB-dependent genes including

iNOS and COX-2 [32, 33], thus reducing the inflammatoryresponse. These anti-inflammatory actions of melatonin areaccompanied by a reduction in pro-inflammatory cytokines

such as IL-1b, IL-6, TNF-a, and interferon (INF)-c [34].With these considerations in mind, we evaluated whether

melatonin administration could reduce the oxidative stressand inflammation in DMD patients. Our study showed that

DMD patients had increased levels of LPO and IL-1b,IL-2, IL-6, TNF-a and INF-c, and melatonin treatmentduring 9 months inhibited these values in a time-dependent

manner.

Materials and methods

Patients

The study was carried out on 10 pediatric patients, aged

12.8 ± 0.98 yr, who were followed in the NeuropediatricUnit of the Granada�s University Hospital (Granada,Spain). These patients were diagnosed of DMD at 4–5 yr

of age by genetic analyses. Only those patients sufferingfrom DMD with no other pathology or treatment, exceptfor corticoids, were included in the study. Informed consent

was obtained from all parents and from the Hospital�sEthical Committee, according to the 1983 revised HelsinkiDeclaration of 1975. The final study was approved by the

Andalusian�s Ethical Committee of Clinical Assays (ref.0191/06). The patients were under treatment of prednisone(0.75 mg/kg/day) before they were enrolled in the studyand, due to ethical considerations, prednisone treatment

was maintained along the study. Melatonin therapyconsisted in the administration of two oral daily doses ofthe indoleamine for 9 months, one at 09:00 hr (10 mg

melatonin) and the other at 21:00 hr (60 mg melatonin),respectively. The daily schedule of melatonin administra-tion was chosen to maintain the night/day blood melatonin

concentration differences. A group of 10 healthy age- andsex-matched subjects was used as a control group (C).Blood samples were obtained from the antecubital vein in

all patients at 9:00 hr before and 3, 6, and 9 months after

melatonin administration. Samples were centrifugated at3000 g for 10 min and plasma was separated and frozen at)80�C until the biochemical assays were performed.

Lipid peroxidation assay

Plasma samples were thawed and centrifugated at 5000 gfor 5 min, and 200 lL of the supernatants were used forLPO measurements. For this purpose, a commercial LPO

assay kit that estimated both malondialdhehyde (MDA)and 4-hydroxyalkenals (4HDA) was used (Bioxytech LPO-568 assay kit; OxisResearch, Portland, OR, USA) [35]. LPOconcentrations are expressed in lmol/L.

Nitrite plus nitrate determination

Thawed plasma samples were deproteinized with ice-cold6% sulfosalicylic acid, incubated at room temperature for30 min and centrifuged at 10,000 g, 15 min; then, 50 lLsupernatant were incubated with 4 lL NaOH 1.25%, 36 lLof a 14-mm phosphate dehydrogenase, 750 lm glucose-6-

Melatonin and Duchenne dystrophy

283

phosphate, and 30 mU nitrate reductase, and 10 lLNADPH 3 lm for 60 min at room temperature. Theconcentration of nitrites was measured following the Griess

reaction which coverts nitrite into a colored azo compoundspectrophotometrically detected at 550 nm [36]. Plasmalevels of NOx are expressed in lmol/L.

Plasma cytokine assay

The Milliplex Human Cytokine immunoassay kit (Milli-

pore Corp., Billerica, MD, USA) was used to profileexpression of three inflammatory mediators (IL-1b, IL-2,IL-6, TNF-a, and INF-c). The assay was performed

according to the manufacturer�s instructions. Briefly,50 lL of working solution containing multiple microbeadslabeled with specific antibodies against each of the afore-mentioned cytokines were added into each well, washed

twice with 200 lL of Linco-Plex wash buffer and filtered todryness. Then 25 lL thawed plasma aliquots diluted 1:4with the specific Linco-Plex sample diluents were added to

each well and incubated for 60 min at room temperature.After a wash step (twice) with 200 lL Linco-Plex washbuffer, the beads were incubated with 25 lL of the detection

antibody cocktail for 30 min at room temperature, eachantibody specific to a single cytokine. After another twotime wash step with 200 lL Linco-Plex wash buffer, the

beads were incubated with 25 lL of the streptavidin–phycoerythrin solution for 30 min at room temperature andwashed twice again. The beads were resuspended in eachwell with 100 lL of the Linco-Plex Sheath fluid and the

concentration of each cytokine was determined using thearray reader. A parallel standard curve was constructed foreach cytokine. Levels are expressed in ng/L.

Plasma melatonin determination

Melatonin was determined by HPLC with ultravioletdetection. Briefly, 500 lL plasma were extracted with1 mL trichloromethane. The mixture was vortex for 1 minat 1400 rpm, and then centrifuged for 1 min at 5000 g.

Aqueous phase was removed and the organic phase waswashed thrice with 500 lL NaHCO3, 50 mm, pH 10.25.Finally, 500 lL of sample was placed in a Speed Vac

System for 33 min (vacuum pressure 5.1), and the dryextracts obtained were frozen at )80�C until melatoninassay. On the day of the assay, dry extracts were

resuspended in 100 lL of mobile phase consisting of100 mm sodium phosphate, 0.1 mm EDTA and acetonitrile25%. Melatonin was then measured by HPLC (Shimazdu

Europe GmbH, Duisburg, Germany) with a 150 mm · 4.5mm Waters Sunfire C18 5 lm column (Waters Chroma-tography, Barcelona, Spain). After stabilizing the columnwith the mobile phase, samples (20 lL) were injected

onto the HPLC system at a 1 mL/min flow rate, with5-fluorotryptamine as internal standard, and the fluores-cence of melatonin was measured in a fluorescence detector

(Shimadzu RF-10A XL fluorescence detector) with anexcitation and emission waves of 285 nm and 345 nm,respectively. Retention time was 8.9 min. A standard curve

for melatonin was constructed with 4.45, 8.9, 17.9, 35.9,71.6 and 143.2 ng/L, and the concentration of melatonin in

the samples was calculated according to the peak area.Melatonin levels were expressed in ng/L.

Biochemical analysis

Blood samples were analyzed within 24 hr by the labora-tory of biopathology of the Granada University�s Hospital

for plasma levels of the following markers for muscleinjury: creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH),aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransfer-

ase (ALT), gamma-glutamyltransferase (cGT), aldolase,and myoglobin.

Statistical analysis

Data are expressed as the mean ± S.E.M. ANOVAfollowed by Student�s t-test were used to compare the

means between groups (before and after the competition).A P value of less than 0.05 was considered statisticallysignificant.

Results

The changes in plasma LPO levels are illustrated in Fig. 1.Compared with the control group (C), DMD patients hadincreased levels of LPO before melatonin treatment (group

0) (7.73 ± 0.25 lmol/L versus 9.84 ± 0.31 lmol/L,P < 0.001). Three months of melatonin treatment wereenough to reduce this difference (P < 0.01), restoring thelevels of LPO in the DMD patients to control values

(7.67 ± 0.16 lmol/L). Six months later, the LPO levelsdecreased significantly below the controls (5.92 ±0.21 lmol/L, P < 0.05).

Fig. 2 shows the changes in plasma levels of the pro-inflammatory cytokines IL-1b, IL-2, and IL-6 in DMD

Fig. 1. Plasma lipid peroxidation (LPO) levels before (0) and 3, 6and 9 months after melatonin treatment, compared with LPOlevels in the control group (C). *P < 0.05 and ***P < 0.001versus C; ##P < 0.01 and ###P < 0.001 versus 0.

Chahbouni et al.

284

patients. Compared with their respective controls, the levels

of IL-1b (0.79 ± 0.03 ng/L versus 0.93 ± 0.08 ng/L,P < 0.01), IL-2 (2.47 ± 0.28 ng/L versus 4.25 ±0.39 ng/L, P < 0.001), and IL-6 (12.01 ± 3.11 ng/L ver-

sus 22.10 ± 2.61 ng/L, P < 0.001) were significantly high-er in DMD patients before melatonin treatment (group 0).Melatonin reduced IL-1b (0.53 ± 0.07 ng/L, P < 0.01)and IL-2 (1.82 ± 0.26 ng/L, P < 0.05) below controls,

and IL-6 (13.14 ± 3.30 ng/L) to control values after3 months of treatment. IL-2 and IL-6 decreased in atime-dependent manner, reaching the lowest values at the

end of treatment (IL-2, 1.11 ± 0.02 ng/L and IL-6,2.48 ± 0.28 ng/L, P < 0.001). At this time, i.e., 9 monthsof melatonin treatment, the levels of IL-2 and IL-6 were

significantly lower than those found at 3 months oftreatment (P < 0.001).

Changes in plasma levels of TNF-a and INF-c are shownin Fig. 3. The levels of TNF-a (2.9 ± 0.29 ng/L versus

4.43 ± 0.61 ng/L, P < 0.001) and INF-c (17.32 ±2.78 ng/L versus 22.10 ± 32.29 ng/L, P < 0.01) weresignificantly elevated in DMD patients compared with the

control group (C) before melatonin administration. Mela-tonin treatment reduced these cytokines to control values at3 months of treatment, reaching TNF-a (2.10 ± 0.29 ng/L,

P < 0.001) and INF-c (2.48 ± 0.039 ng/L, P < 0.001) thelowest values after 9 months of melatonin therapy. At thistime, the levels of both cytokines were significantly lower

than those found at 3 months of treatment (P < 0.001).Fig. 4 shows that the levels of nitrite and nitrate (NOx) in

DMD patients were significantly higher than controls(27.68 ± 0.41 lmol/L versus 23.46 ± 0.32 lmol/L, P <

0.01). Melatonin reduced NOx to control levels along thetreatment.

Fig. 5 displays the plasma levels of melatonin measured

along the study. Control group (C) and DMD patients hadlow morning levels of melatonin, compatible with normallevels of the indoleamine at this time of the day. As it was

expected, at 3, 6, and 9 months of treatment, the levels ofmelatonin during the day remained elevated.

Table 1 shows the time-dependent decrease in plasmaCK, AST, ALT, cGT, LDH, aldolase, and myoglobin in

DMD patients treated with melatonin. Although no statis-tical significances were found in these parameters, a trendtowards decrease in the levels of these parameters was

detected with melatonin treatment. Mainly, CK decreasedby almost 50%, AST by 28%; ALT by 20%; LDH by 28%;and myoglobin by 13%.

Discussion

The data obtained in this study provide the first evidence to

support the beneficial effect of melatonin in DMD patients.The results demonstrated the significant reduction in theinflammatory response and hyperoxidative status in these

patients after 3 months of melatonin therapy, an effectthat was maintained or even increased after 9 months of

Fig. 2. Plasma levels of IL-1b, IL-2, andIL-6 before (0) and 3, 6, and 9 monthsafter melatonin treatment, compared withthe control group (C). *P < 0.05,**P < 0.01, and ***P < 0.001 versus C;###P < 0.001 versus 0; ��P < 0.01 and���P < 0.001 versus 3 months.

Fig. 3. Plasma levels of TNF-a and INF-c before (0) and 3, 6, and9 months after melatonin treatment, compared with the controlgroup (C). *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 versus C;##P < 0.01 and ###P < 0.001 versus 0; ��P < 0.01 and���P < 0.001 versus 3 months.

Melatonin and Duchenne dystrophy

285

treatment. Melatonin administration also reduced the

presence of CK, AST, ALT, LDH, and myoglobin inblood of DMD patients. Together, these results support amuscle dysfunction improvement in DMD patients after

melatonin therapy.The pathogenic mechanisms of multi-systemic involve-

ment of DMD are still unclear. Mechanical injury and

membrane defects are important factors promoting dystro-phic disease, but they do not fully explain the onset andprogression of DMD. Increasing evidence support that

aberrant intracellular signaling cascades that regulate theinflammatory processes, contribute substantially to thedegenerative process [10, 37, 38]. In this regard, intracellu-

lar signaling pathways are chronically activated in dystro-phic muscle as results of lost of intact DGC signaling,calcium influx through stretch activated channels, and thegeneration of ROS [10, 38, 39]. Moreover, mechanical

stretch as a result of DGC impairment causes the activationof NF-kB, which regulates the expression of many inflam-matory genes, including cytokines, in both immune cells

and muscle fibers [10, 14, 40]. Thus, inflammation andoxidative stress are important pathophysiological eventscausing muscle injury in DMD.

According to previous reports, our results support theexistence of a redox imbalance in the blood of DMDpatients [6, 7, 41], as assessed by LPO measurement.Because LPO is a marker for oxidative damage to cell

membranes, the high levels of LPO detected in DMDpatients compared with controls may reflect an hyperox-idative status affecting muscular fibers in the former that

may be responsible, at least in part, of the skeletal muscledysfunction in these patients. Moreover, oxidative stress/LPO represents one of the mechanisms of activation of

NF-kB, resulting in the inflammatory cascade in DMD[20]. TNF-a, another inflammatory mediator, is believedto be produced in the initial steps of DMD because even

minor trauma to muscle increases its levels. TNF-acontributes to muscle necrosis, because anti-TNF-a ther-apy protects dystrophic skeletal muscle from necrosis[18]. Although TNF-a is mainly synthesized in macro-

phages, it can be also produced by muscle cells andassociated with muscle regeneration [42]. Moreover,TNF-a also inhibits myogenesis by activating NF-kB

[14, 43]. This cytokine is known to inhibit contractilefunction of skeletal muscle, and it may be related to NO!

production [44]. Additionally, TNF-a may increase mito-

chondrial production of ROS, that in turn regulate TNF-a/NF-kB signaling [45]. Finally, TNF-a seems to have abiphasic effect on muscle: high levels of the cytokine

promote muscle catabolism, probably by a NF-kB-med-iated effect, whereas low levels of TNF-a, which do notinduce NF-kB, stimulate myogenesis [4]. Our results showthat LPO and TNF-a, which were elevated in DMD

before melatonin administration, were reduced in a time-dependent manner up to 9 months of treatment, reachinglevels lower than controls. The melatonin-dependent

decrease in both LPO and TNF-a probably reducedNF-kB activation, leading to a improvement of theDMD patients. Although we cannot know whether the

low levels of TNF-a after melatonin treatment promotedmyogenesis, the reduction in blood CK and myoglobinobserved in our study probably reflects the protectiveeffect of melatonin against muscle catabolic processes in

these patients.Together with TNF-a, our data show that IL-1b levels

are also elevated in DMD patients, supporting previous

data suggesting that this cytokine contribute to inflamma-tion in inflammatory myopathies [46, 47]. Whereas TNF-aand IL-1b induce NF-kB and NF-kB-induced inflamma-

tory mediators such as cytokines and chemokines, IL-1balso inhibits insulin-like growth factor (IGF)-I stimulated

Fig. 4. Plasma nitrite plus nitrate (NOx) levels before (0) and 3, 6and 9 months after melatonin treatment, compared with the con-trol group (C). *P < 0.05 and **P < 0.01 versus C; ##P < 0.01versus 0.

Fig. 5. Plasma levels of melatonin before (0) and 3, 6 and 9 monthsafter its administration to Duchenne patients, compared with thecontrol group (C). ***P < 0.001 versus C.

Chahbouni et al.

286

protein synthesis [48, 49]. So, IGF-I regulation by IL-1bmay be important in dystrophic muscle impairment. Cyto-

kine networks are complex, and when TNF-a is removedfrom an in vivo system, as in mdx/TNF-/- mice, otherproinflammatory cytokines such as IL-12 and IFN-c may

be up-regulated to overcome the TNF-a deficiency [18, 50].Besides INF-c and IL-2, IL-6 levels were also elevated inour study prior to melatonin treatment, which was relatedto the dystrophy progress in DMD patients [19, 51]. In our

hands, melatonin treatment also inhibited these cytokinesin a time-dependent manner, collaborating with the down-regulation of NF-kB inflammatory cascade. Thus, melato-

nin could interfere with inflammatory cascades activatedduring the dystrophic process.

Another interesting aspect of this study is the role of

NO• on the dystrophic process. NO• is generated by twotypes of NOS enzymes, i.e., constitutive and inducible.Constitutive NOS such as nNOS is a Ca2+-calmodulin-

dependent enzyme. It is now accepted that in dystrophicfibers the high cytosolic levels of Ca2 + may increasesnNOS activity and NO• production [4]. Some studies,however, suggest that nNOS is not involved in dystrophin

deficiency [4, 46, 47], although other data showed that theloss of normal levels of NO• production by dystrophicmuscle exacerbates inflammation and membrane injury in

muscular dystrophy [4, 48]. Cytokines play an importantrole in the regulation of iNOS in dystrophic muscle [4] andso, whereas TNF-a and IFN-c stimulate the expression of

iNOS, IL-4 and IL-10 decrease iNOS it [14, 50, 51].However, although dystrophin-deficient muscles show areduction in the expression of nNOS, the inflammatory

process in dystrophic muscle due to NF-kB activation leadto an increased expression of iNOS, the inducible, Ca2+-independent NOS enzyme, that in turn produces highamounts of NO•. NO• can function as an anti-inflamma-

tory/antioxidant and even cytoprotective molecule at lowconcentrations, corresponding to the NO• produced bynNOS. But, after induction of iNOS, the high amounts of

NO• are responsible for cytotoxic effects, mainly due tothe inhibition of mitochondria respiration and the nitro-sation/nitrosylation effects on proteins [52, 53]. So, the

beneficial effects of the nNOS-dependent NO• productionin dystrophic muscle are surpassed when cytotoxic levelsof NO• are reached after iNOS induction. This explainswhy l-arginine given to mdx mice may have beneficial

effects: l-arginine acts as a substrate for nNOS yielding

cytoprotective NO• levels, but impedes iNOS expressionblocking NF-kB [54]. Other studies, however, showed that

l-arginine supplementation may promote iNOS-mediatedmuscle damage [50]. Anyway, during chronic dystrophicprocess there is a significant inflammatory reaction

involving NF-kB-dependent iNOS expression and NO•production. The elevated levels of NO• reported in ourstudy may reflect the chronic activation of iNOS, an effectthat was counteracted after melatonin administration. The

inhibitory effect of melatonin on iNOS expression andactivity has been extensively reported [55–57], and specif-ically reported in skeletal, diaphragmatic, and cardiac

muscles [58, 59].Because NF-kB plays a central role in DMD and free

radicals influence its activation, antioxidants have been

tested in experimental models of DMD such as the mdxmice [4]. Among them, epigallocatechin gallate, a compo-nent of green tea extract [60], and curcumin, a dietary

component of the spice turmeric [61], haven shown protec-tive effects reducing NF-kB activation and iNOS expres-sion, decreasing TNF-a and IL-1b levels. Other nutritionalinterventions, including CoQ administration, did not show

significant effects on NF-kB levels and/or improvement inDMD patients [62]. Together, these studies suggest thaninhibitors of NF-kB may be useful for DMD therapy.

Herein, our study shows the inhibitory effects of melatoninon the NF-kB inflammatory cascade. Because NF-kB inmacrophages and myofibers promotes muscle degeneration

in DMD [14], the inhibition of NF-kB in the early stage ofdystrophy can reduce the inflammatory burden, whichmight in turn slow initial exhaustion of the regenerative

capacity in dystrophic muscles [7]. Thus, sustained inhibi-tion of the NF-kB pathway by melatonin at the time ofDMD diagnosis could allow dystrophic muscles to recu-perate and reinitiate muscle repair in the late phase of the

disease [7].Overall, our results indicate that compared with normal

muscles, the following changes are present in the dystrophic

muscles: (i) a hyperoxidative status reflecting a membranemuscular damage as assessed by LPO levels, (ii) a nitrosa-tive status depending on the iNOS induction in degenerated

muscles, and (iii) an inflammatory status reflecting themuscle degenerative process. These degenerative events inDMD patients seem to be controlled, at least in part, bymelatonin administration, suggesting the utility of melato-

nin therapy in DMD patients.

Table 1. Biochemical data obtained from DMD patients and controls

Biochemicalparameter

Control(n = 10)

Treatment

Time 0 (n = 10) 3 months (n = 9) 6 months (n = 7) 9 months (n = 5)

CK 7301 ± 2219 4912 ± 2007 6149 ± 1827 3969 ± 1617AST 143 ± 37 110 ± 32 131 ± 26 103 ± 34ALT 200 ± 52 170 ± 55 192 ± 39 159 ± 50cGT 16 ± 2 15 ± 2 21 ± 2 17 ± 3LDH 1362 ± 313 7881 ± 313 1119 ± 263 982 ± 325Aldolase 27 ± 7 33 ± 13 27 ± 6 24 ± 8Myoglobin 654 ± 127 450 ± 98 505 ± 96 –

Data are expressed as the mean ± S.E.M. Enzyme activities are expressed in U/L, and myoglobin concentration in ng/L.

Melatonin and Duchenne dystrophy

287

Acknowledgements

The technical assistance of Araceli Puertas is appreciated.

The authors thank Asociacion de Enfermos Musculares deGranada (ASEMGRA) for promoting the study. Thisresearch was partially supported by grants form the

Instituto de Salud Carlos III (RD06/0013/0008 and PI08-1644), from the Servicio Andaluz de Salud (422/2006), andfrom the Consejerıa de Innovacion, Ciencia y Empresa,

Junta de Andalucıa (P07-CTS-03135, CTS-190, and CTS-101). JAG is a fellow from the Instituto de Salud Carlos III(Spain), and LCL is a postdoctoral fellow from the

Consejerıa de Innovacion, Ciencia y Empresa (Junta deAndalucıa, Spain).

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Melatonin and Duchenne dystrophy

289

38

Discusión

39

I. ASPECTOS GENERALES

Muchos datos experimentales y clínicos apoyan la hipótesis de que la producción, la distribución o las interacciones de los radicales libres pueden promover y quizás iniciar la mayor parte de los la patología de la DMD. Sin embargo, gran parte de las evidencias que apoyan esta hipótesis se basan en las correlaciones entre el grado d DMD y los niveles de marcadores del daño oxidativo o la respuesta al estrés oxidativo.

Antes de la identificación de las mutaciones del gen de la distrofina, como causa de DMD, se pensaba que la DMD podría resultar, al menos en parte, de la influencia del estrés oxidativo sobre el músculo. Las primeras sospechas de que la DMD estaba mediada por los radicales libres se basaba en la similitudes con la patología muscular que se produce por deficiencia de vitamina E, que estaba directamente atribuido a un aumento de los radicales libres y daño oxidativo (154). Paralelamente, los estudios histopatológicos relacionaron el daño oxidativo con el proceso patogénico (155).

Actualmente, la controversia sigue siendo respecto a si el estrés oxidativo es una condición previa necesaria para la muerte de los músculos distróficos, o es una consecuencia de la patología ya avanzada. Por una parte se observó que el músculo de ratones mdx, antes de la aparición de la patología distrófica, mostró niveles elevados de enzimas antioxidantes, tales como CAT, GPx, y SOD, indicando que el estrés oxidativo posiblemente pudo ser una de las primeras causas necesarias para desencadenar la necrosis muscular en la DMD (155). Por otra parte, los estudios en tejido muscular de ratones mdx después del inicio de la patología mostró una pobre relación entre los niveles de expresión de enzimas antioxidantes y el grado de distrofia.

En definitiva, los mecanismos patogénicos de la DMD están todavía por esclarecer. Las lesiones mecánicas del músculo y los defectos del sarcolema constituyen factores importantes en la génesis de la patología distrófica, aunque no son suficientes para explicar su inicio ni la progresión de la DMD. Hay ahora evidencias importantes que sugieren la alteración de una serie de vías intracelulares de señalización, que pueden estar crónicamente activadas en el músculo distrófico como resultado de la falta de señalización el complejo DAG, aumentando la entrada de Ca2+ y la generación de ROS (156, 157,158).

Los datos obtenidos en esta Tesis Doctoral proporcionan la primera evidencia que apoya el efecto beneficioso del tratamiento con melatonina en los pacientes de DMD. Los resultados demostraron una reducción significativa del estado hyperoxidativo así como de la respuesta inflamatoria en estos pacientes, que se manifestó ya a los 3 meses de iniciado el tratamiento. Este efecto beneficioso se mantuvo e incluso aumentó después de 9 meses de administración diaria de melatonina. Además, la melatonina también disminuyó los niveles de CK, AST, ALT, LDH, y mioglobina en la sangre de los pacientes con la DMD. En conjunto, estos resultados demuestran una mejora significativa de la disfunción muscular en pacientes con DMD después del tratamiento con melatonina. Aunque en la DMD coexisten múltiples mecanismos patogénicos, el estrés oxidativo y la inflamación constituyen los principales

40

mecanismos relacionados con la necrosis muscular. La reducción de ambos procesos tras la administración de melatonina proporciona un aumento significativo de la calidad de vida de los pacientes.

II. MELATONINA, ESTRÉS OXIDATIVO Y DMD (Trabajo 1 de resultados)

Existen cada vez más evidencias experimentales y clínicas que avalan la existencia de alteraciones en ciertas vías de señalización intracelular en la DMD. Dichas vías estarían crónicamente activadas en el músculo distrófico como resultado de la pérdida de la distrofina, con la consiguiente entrada de Ca2+ y generación de ROS (159). En cualquier caso, nuestros resultados muestran un aumento del estrés oxidativo en los hematíes de los pacientes de DMD, comparado con sujetos normales. Dichos pacientes también muestran una reducción significativa en su capacidad de defensa antioxidante.

En conjunto, nuestros resultados demuestran la existencia de un estado hyperoxidativo intracelular en los hematíes de los pacientes con DMD, lo que refleja probablemente el daño oxidativo presente en el músculo distrófico. De especial importancia es el hecho que el estado redox de estos pacientes vuelve a valores normales tras el tratamiento con melatonina. Nuestros resultados confirman la hipótesis del papel patogénico del estrés oxidativo en la DMD (160,68), y confirman la utilidad de la melatonina para contrarrestarlo. Además, como resultado del tratamiento con melatonina, los niveles plasmáticos de marcadores de necrosis muscular, como la CK (161), disminuyen notablemente. Todo ello avala una mejora funcional del músculo esquelético tras la terapia con melatonina en los pacientes con DMD.

Debido precisamente a la participación del estrés oxidativo en la patogenia de la DMD (160), una vía indirecta para evaluar el progreso de la enfermedad es la determinación de biomarcadores de radicales libres en sangre. Aunque el GSH es uno de los más importantes antioxidantes en el músculo esquelético (33), no existe información en relación a su participación en el músculo distrófico. En nuestro estudio hemos realizado un análisis detallado del ciclo del GSH y, al igual que se había observado en el ratón mdx, encontramos un desbalance en el estado redox en los hematíes de pacientes con DMD (161, 162, 163, 164,165). Nuestros resultados son consistentes con el hecho de que los niveles de GSSG y el cociente GSSG/GSH están más altos en pacientes con DMD que en sujetos normales, lo que se asocia a un descenso del SGH (33). Ya que el cociente GSSG/GSH es el mejor índice del estrés oxidativo intracelular (33), los resultados de nuestro estudio reflejan un estado hyperoxidativo intracelular en dichos pacientes.

La alteración del cociente GSSG/GSH en los hematíes también refleja cambios en la actividad de las enzimas del ciclo redox del glutatión, GPx y GRd (166). La GPx juega un papel fundamental en la depuración de peróxidos, oxidando GSH a GSSG, mientras que la GRd recupera los niveles de GSH a partir de GSSG (166,167). EL GSH también puede depurar directamente radicales libres a través de la donación de un electrón (168), lo que implica que la actividad de la GRd es crítica para proporcionar suficiente GSH para la defensa antioxidante de la célula. El pequeño aumento de la GPx que detectamos en pacientes de

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DMD con respecto al grupo control, y que había sido descrito previamente (169), podría reflejar un mecanismo compensatorio del organismo contra el daño oxidativo, ante un exceso de peróxidos. No obstante, la significativa inhibición de la actividad de la GRd que también encontramos en los hematíes de los pacientes, reduciendo su capacidad de regenerar GSH, se traduce en los altos niveles de GSSG y por tanto del aumento del cociente GSSG/GSH en estos pacientes. Más aún, la alteración del ciclo del GSH explica la incapacidad de los sujetos con DMD para defenderse ellos mismos frente al daño oxidativo, que afecta de manera importante a las membranas celulares, también previamente descrito (161).

La GST es una enzima esencial en la detoxificación de los productos derivados del estrés oxidativo (170,171). En condiciones normales, la GST, junto con otros enzimas antioxidantes como GPx y SOD, forma parte de una estrategia integrada de defensa contra el estrés oxidativo (172). El aumento de la actividad de la GST, así como de la SOD, en los hematíes de pacientes de DMD, refleja un estado redox elevado (173,174) que, en el caso de la SOD, se debe a una alta producción de O2¯• en esos pacientes, que es transformado en H2O2, y el ligero aumento de la GPx antes comentado, confirma esta vía metabólica.

Estos resultados nos llevan a considerar que el aumento de las actividades de GST y SOD y, en menor proporción, de GPx en los pacientes de DMD constituye una de las primeras respuestas del organismo frente al ataque por los radicales libres. Es importante tener en cuenta que las actividades de la GST y GPx necesitan GSH y, por tanto, la eficiencia de esas enzimas depende del nivel de GSH en la célula (172). A su vez, el GSH depende de la actividad de la GRd. Los pacientes con DMD tienen una actividad de GRd reducida, lo que disminuye la actividad GST y GPx, manteniendo unos niveles altos de radicales de oxígeno. Estos datos también explican los altos niveles de LPO que presentan los pacientes de DMD (161, 173, 174,175), así como el elevado cociente GSSG/GSH.

Todo ello nos permite deducir que la principal causa de la poca eficacia del sistema antioxidante endógeno en los pacientes de DMD es su incapacidad de mantener la homeostasis del GSH. En consecuencia, la instauración de una terapia antioxidante en estos pacientes debe ir dirigida hacia la normalización de la concentración intracelular de GSH. La melatonina es una molécula que cumple esos preceptos perfectamente. Producida en la mayoría de los órganos y tejidos de la economía (176), esta hormona tiene unas importantes acciones antioxidantes y antiinflamatorias. La melatonina depura tanto radicales de oxígeno como de nitrógeno (177,106), dando lugar a otros metabolitos también con capacidad antioxidante (178,179). Además, la melatonina y sus metabolitos también aumentan la expresión y actividad de enzimas antioxidantes como GPx, GRd, y SOD (180,114). Numeroso estudios in vitro e in vivo avalan el efecto protector de la melatonina frente al daño oxidativo en múltiples modelos de enfermedad (181,182), y en diversos tejidos como el músculo cardíaco, esquelético y diafragmático (181, 183, 184,185, 186,187). La principal diana terapéutica de la melatonina es la mitocondria, donde aumenta su eficiencia bioenergética y reduce la generación de ROS (188,189), lo que frena la muerte celular (190). Estos datos aquí resumidos avalan la utilidad clínica de la melatonina frente al estrés oxidativo en la DMD.

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Los resultados del tratamiento con melatonina a los pacientes de DMD indican que 3 meses de terapia son suficientes para elevar los niveles de GSH sobe el control. Los mecanismos por los que la melatonina ejerce estos efectos son múltiples. Por un lado, ya hemos dicho que la melatonina depura ROS directamente, lo que reduce el consumo de GSH por parte de los enzimas GST y GPx (191). En segundo lugar, la melatonina aumenta la actividad GRd, lo que implica un aumento de la regeneración del GSH disponible. En tercer lugar, la melatonina también aumenta la actividad de la γ-glutamil cisteína sintasa, enzima requerida para la síntesis de GSH de novo (192). En resumen, la suma de todas esas acciones hace que la melatonina recupere el contenido celular de GSH. En consecuencia, el cociente GSSG/GSH, reflejo del estado redox intracelular (193), se normaliza, lo que indica que dicho estado redox está ahora bajo control. Aunque a los 3 meses de tratamiento la melatonina consigue ya restaurar el control redox. Los efectos de la melatonina se mantienen y aún aumentan a lo largo del tiempo, hasta alcanzar el máximo al final del tratamiento, a los 9 meses de su inicio. En este momento, los datos indican ya un aumento de la síntesis endógena de GSH (192). Que la melatonina mantiene controlado el estado redox y, por tanto, el daño oxidativo, se demuestra también porque las actividades de los enzimas GPx, GST y SOD disminuyen con el tratamiento.

La normalización del estado redox de los pacientes de DMD durante el tratamiento con melatonina se refleja en una mejora significativa de los marcadores de necrosis muscular, como la reducción del 50% de la CK, 28% de la LDH, y 13% de la mioglobina (161). Todo ello refleja una reducción de la necrosis muscular.

III. MELATONINA, INFLAMACIÓN Y DMD (Trabajo 2 de resultados)

A la vez que se reducía el estrés oxidativo en los pacientes con DMD por la administración de melatonina, nuestros datos también reflejan por primera vez un control manifiesto sobre el proceso inflamatorio que estos pacientes presentan. En su conjunto, podemos hablar de una mejora sustancial de los pacientes de DMD tras la terapia con melatonina.

La existencia de un proceso inflamatorio crónico en los pacientes de DMD viene determinada por la activación de las vías de la respuesta inmune innata, probablemente debida a la acción de los ROS sobre el NF-κB. A su vez, el daño mecánico en el sarcolema debido al déficit de distrofina causa también la activación de NF-κB. La suma de ambos factores impulsa una reacción inflamatoria importante, con la producción de citoquinas proinflamatorias por parte de las células del sistema inmunológico y del músculo (156, 194,195). En consecuencia, el proceso inflamatorio constituye también, junto a los ROS, un mecanismo patogénico importante en la DMD.

La relación ROS-NF-κB en la DMD viene dada, entre otros factores, por el aumento de la LPO que anteriormente vimos. La LPO representa uno de los mecanismos de la activación de NF-κB en la DMD (175). El TNFα, otro medidor inflamatorio, participa en las etapas iníciales de la DMD, ya que esta citoquina se produce ante cualquier mínimo trauma

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(196). A su vez, el TNF-α contribuye a la necrosis muscular ya que la terapia anti-TNF-α, protege el músculo esquelético distrófico de la necrosis (196). Aunque el TNF-α se sintetiza principalmente en los macrófagos, puede también producirse por las células musculares y asociarse a la regeneración muscular (157). Por otra parte, el TNF-α también inhibe la miogénesis mediante la activación de NF-kB (194,197). Esta citoquina se sabe que inhibe la función contráctil del músculo esquelético, y puede estar relacionada con la producción de NO• (158). Por su lado, el TNF-α puede aumentar la producción mitocondrial de ROS, que a su vez regulan la señalización TNF-α/NF-kB (198). Por último, el TNF-α parece tener un efecto bifásico en los músculos: altos niveles de la citoquina promueven el catabolismo muscular, un efecto probablemente mediado por el NF-kB, mientras que los niveles bajos de TNF-α, que no inducen NF-kB, pueden estimular miogénesis (199).

Nuestros resultados muestran que los niveles de LPO y TNF-α, que estaban elevados en pacientes de DMD antes de la administración de melatonina, se redujeron durante los 9 meses de tratamiento, llegando a niveles inferiores de los controles. La disminución de los niveles de LPO y TNF-α depende probablemente de que la melatonina reduce la activación del NF-kB. Aunque no podemos saber si los bajos niveles de TNF-α después del tratamiento con melatonina promueven la miogénesis, la reducción en la sangre de CK y la mioglobina observados en nuestro estudio probablemente refleja el efecto protector de la melatonina contra los procesos catabólicos en el músculo de estos pacientes.

Junto con el TNF-α, nuestros datos muestran que los niveles de la IL-1β también están elevados en los pacientes con DMD, apoyando datos anteriores que indican que esta citoquina contribuye a la inflamación en la miopatías inflamatorias (200,201). Mientras que el TNF-α y la IL-1β inducen el NF-kB y éste a su vez induce mediadores de la inflamación como citoquinas y quimiocinas, la IL-1β por su parte también inhibe el IGF-I, que estimula la síntesis de proteínas (196,202). Por lo tanto, la regulación del IGF-I por la IL-1β puede ser importante en el deterioro del músculo distrófico. Las interconexiones de las citoquinas son complejas, de manera que cuando hay deficiencia de TNF-α en un sistema in vivo, como en el ratón mdx, otras citoquinas proinflamatorias tales como IL-12 e IFN-γ pueden ser inducidas para superar dicha deficiencia (196,203).

Además, los niveles de INF-γ, IL-2 e IL-6 también estaban elevados en los pacientes de nuestro estudio antes del tratamiento con melatonina, lo que los relaciona con el progreso de la distrofia en dichos (204,205). En nuestro estudio, el tratamiento con la melatonina disminuyó los niveles de las citoquinas de manera tiempo-dependiente, colaborando en el descenso de la cascada proinflamatoria del NF-kB. Por tanto, la melatonina podría interferir con la cascada inflamatoria activada durante el proceso distrófico.

Otro aspecto interesante de nuestro estudio es el papel del NO• en el proceso distrófico. El NO• se produce por dos tipos de NOS, la neuronal y la inducible. La nNOS es un enzima Ca2 +-calmodulina dependiente. Se sabe que en las fibras del músculo distrófico existen altos niveles citosólica de Ca2 + que pueden elevar la actividad nNOS y la producción de NO• (199). Sin embargo, algunos estudios sugieren que la disminución de la expresión de la nNOS no está involucrada la deficiencia de la distrofina (194, 200,201), aunque otros

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estudios indican que la pérdida de los niveles normales de NO• por el músculo distrófico exacerba la inflamación y la lesión de la membrana en la distrofia muscular (199,202). Las citoquinas desempeñan un papel importante en la regulación de la iNOS en la distrofia muscular (199), y así, mientras que el TNF-α e IFN-γ estimulan la expresión de iNOS, la IL-4 e IL-10 la disminuyen (194, 203,205). Sin embargo, a pesar de que los músculos deficientes en distrofina muestran una reducción en la expresión de nNOS, debido al proceso inflamatorio activado por el NF-kB, hay un aumento de la expresión de la iNOS, que a su vez produce grandes cantidades de NO•. Si bien el NO• puede funcionar como anti inflamatorio y antioxidante, actuando como una molécula citoprotectora incluso a bajas concentraciones, que se corresponde al NO• producido por nNOS. Pero, después de la inducción de la iNOS, las altas cantidades de NO• producidas son responsables de los efectos citotóxicos, que se deben principalmente a la inhibición de la respiración mitocondrial y al efecto de la nitrosación/nitrosilación de las proteínas (206,207).

Así, los efectos beneficiosos de la producción del NO• que dependen de la nNOS en el músculo normal, en el músculo distrófico son contrarrestados cuando se alcanzan niveles citotóxicos del NO• derivado de la iNOS. Este mecanismo explica por qué la L-arginina administrada a los ratones mdx puede tener efectos beneficiosos: L-arginina actúa como sustrato de nNOS para la obtención de niveles citoprotectores de NO•, pero impide la expresión de iNOS bloqueando el NF-kB (208). Sin embargo, otros estudios demostraron que los suplementos de L-arginina pueden promover en el músculo dañado la iNOS (203). De todos modos, en el proceso distrófico crónico hay una reacción inflamatoria significativa que implica al NF-kB, la expresión de iNOS, y la producción de NO•. El aumento de los niveles de nitritos en nuestro estudio puede reflejar la activación crónica de la expresión de la iNOS, efecto que fue contrarrestado por de la administración de melatonina. El efecto de la melatonina para inhibir la expresión de la iNOS ha sido muy estudiado (144,209), y específicamente evaluado en el músculo esquelético, diafragma y músculo cardíaco (181,185).

Debido a que NF-kB desempeña un papel central en la DMD y los radicales libres influyen en su activación, se han utilizado antioxidantes en modelos experimentales de la DMD, como en los ratones mdx (199). Entre ellos, el galato de epigalocatequina, un componente del extracto de té verde (210), y la curcumina, un componente de la dieta de la especia cúrcuma (211), demostraron efectos protectores reduciendo los niveles de NF-kB, la expresión de la iNOS, y los niveles de TNF-α e IL-1β. Otras intervenciones nutricionales, como la administración de CoQ, no dieron resultados significativos sobre los niveles de NF-kB y mejora den los pacientes con DMD (212). Todos estos datos sugieren que los inhibidores del NF-kB pueden ser útiles para el tratamiento de la DMD. En nuestro estudio podemos observar los efectos inhibidores de la melatonina sobre la cascada inflamatoria derivada del NF-kB. Debido a que el NF-kB de los macrófagos y las microfibrillas promueve la degeneración muscular en la DMD (194), la inhibición del NF-kB en los primeros estadios del proceso distrófico puede reducir la cascada inflamatoria, lo que podría a su vez iniciar una lenta regeneración de los músculos distróficos (208). Por lo tanto, la inhibición sostenida del

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NF-kB si se administra melatonina en el momento del diagnóstico de DMD, podría permitir la recuperación de los músculos distrófico y reiniciar la reparación del mismo (208).

IV. ASPECTOS GLOBALES DEL TRATAMIENTO CON MELATONINA EN LA DMD

Desde el punto de vista terapéutico, se han hecho diversos intentos terapéuticos para el tratamiento de la DMD: tratamiento farmacológico, basado en el uso de glucocorticoides; manejo psicosocial del paciente; terapia física, principalmente sobre el músculo esquelético, respiratorio y cardíaco; el ejercicio, y el control nutricional (213,214). Además, en la actualidad se están ensayando terapias emergentes dirigidas hacia la restauración de la producción de distrofina, como las terapias con oligonucleótidos antisentido (215,216) y de células madre (217). Sin embargo, ninguna de ellas ha dado resultados positivos hasta la fecha.

En base a los resultados de nuestro estudio, y los que muestran la reducción tanto de estado pro-inflamatorio y del daño muscular de pacientes con la DMD (161), así como en otros en niños con patologías que cursan con estrés oxidativo e inflamación (218), se debe considerar el uso clínico de la melatonina en la DMD.

De forma general, al comparar los músculos distróficos con músculos normales, nuestros resultados indican los cambios siguientes:

a) Estado hyperoxidativo en los pacientes, reflejado en el daño de la membrana muscular evaluado por los niveles de LPO.

b) Estrés inflamatorio en dichos pacientes, a consecuencia de la inducción de la iNOS en los músculos afectados.

c) Necrosis del músculo esquelético reflejada en los marcadores plasmáticos de daño muscular.

d) Todos estos eventos degenerativos en pacientes con DMD parecen haberse controlados por la administración de melatonina.

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Conclusiones

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1. Nuestros resultados ponen de manifiesto que existe un aumento de daño oxidativo extra e intracelular en pacientes con DMD, que se refleja en altos niveles de marcadores específicos plasmáticos y eritrocitarios.

2. Asimismo, nuestro estudio pone de manifiesto un elevado estado inflamatorio en dichos pacientes, que también se refleja en niveles altos de NO• y citoquinas pro-inflamatorias en plasma.

3. Los pacientes aquí estudiados presentaban un grado elevado de necrosis muscular, como queda reflejado en los índices bioquímicos analizados, especialmente la CPK.

4. La administración oral de melatonina mejoró significativamente el estrés oxidativo y la inflamación, reduciéndolos a niveles incluso por debajo de los sujetos sanos. Este efecto de la melatonina se manifestó ya de manera significativa a los 3 meses de tratamiento, manteniéndose e incluso aumentando 6 meses después.

5. Paralelamente a su efecto antioxidante y antiinflamatorio, la melatonina redujo también de manera importante los marcadores plasmáticos de daño muscular.

6. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los índices de estrés oxidativo e inflamación medidos en sangre periférica, constituyen eficaces marcadores del grado de distrofia muscular, así como de la bondad del tratamiento farmacológico de la DMD, en nuestro caso, la melatonina.

7. La melatonina, a dosis de 10-0-60 mg/día, constituye el mejor tratamiento terapéutico actualmente existente frente a la distrofia muscular de Duchenne, y nuestros resultados avalan su uso en estos pacientes, independientemente de la realización de un ensayo clínico amplio que proprocione datos más definitivos.

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