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Universidad de Cuenca
María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página I
UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
“CARACTERIZACIÓN DEL PROCESO TRADICIONAL DEL PELADO DE MAÍZ
CON CENIZA A SER UTILIZADO COMO ESTRATEGIA DE DETOXIFICACIÓN DE
AFLATOXINAS Y FUMONISINAS. CASO DE ESTUDIO: NABÓN – ECUADOR”.
Tesis previa a la obtención del título
de Bioquímica Farmacéutica
AUTORAS
MARÍA JOSÉ MOLINA CANDO
MARÍA CRISTINA OCHOA AVILÉS
DIRECTORA
Ph.D. JOHANA ORTIZ ULLOA
CUENCA-ECUADOR
2015
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página II
DEDICATORIA
A Dios
Por darme la oportunidad de vivir y estar conmigo en cada paso de mi carrera.
A mis padres y hermana
Que hicieron todo en la vida para que yo pudiera cumplir mi objetivo, por motivarme
y darme siempre su apoyo incondicional, a ustedes por siempre mi corazón y
agradecimiento.
A ti mi querida amiga , Cristina
Gracias por ver en mí la persona capaz de realizar éste sueño contigo, por
brindarme tu tiempo, cariño, confianza y fuerza para seguir adelante, por estar
conmigo siempre no solo como una amiga sino como una hermana.
María José
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A Dios, por mostrarme siempre el camino que debo seguir y acompañarme en cada
paso durante toda mi carrera.
A mis padres por su apoyo incondicional durante todo este tiempo, por todas las
veces en las que se levantaron a verificar que no dormía mientras estudiaba a altas
horas de la noche. Les debo a ustedes todo lo que soy ahora, gracias de todo
corazón.
A mi hermano Juan Pablo quien siempre ha estado conmigo en cada estapa de mi
vida; a mi hermana Angélica, mi mejor amiga, no solo por el apoyo incondicional
durante toda mi carrera sino por el brindado para la realización de ésta tesis. Gracias
a los dos por ser mis hermanos en toda la extensión de la palabra. A mi querido
sobrino Matías quien siempre pensó que estudié mucho durante mi carrera.
A mi esposo Jorge Luis, por todos los años junto a mi motivándome para que
alcance mis objetivos. Gracias por la paciencia y amor que me brindas todos los
días.
A mi querida amiga María José, podría escribir páginas enteras de por qué dedicarte
esta tesis a tí. Gracias por toda la confianza depositada en mí y por estar siempre a
mi lado académica y emocionalmente. Nada de esto hubiera sido posible sin tu
ayuda.
Cristina
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar agradecemos a Dios por habernos permitido llegar a este punto, por
guiarnos a lo largo de nuestra carrera y darnos la fortaleza para seguir adelante.
A la Doctora Johana Ortiz Ulloa por habernos permitido realizar éste trabajo de tesis
bajo su dirección. Gracias por la confianza depositada en nuestro trabajo, por todas
las valiosas enseñanzas impartidas como docente en la facultad; pero
especialmente le agradecemos por sus enseñanzas, apoyo y guía durante todo este
año de trabajo.
A la Md. Angélica Ochoa Avilés por su apoyo incondicional para la realización de
esta tesis. Gracias por todas las enseñanzas y valiosos consejos brindados como
amiga y como profesional.
Al Laboratorio de Alimentos y Nutrición del proyecto VLIR-IUC por habernos abierto
sus puertas y permitido realizar nuestros análisis dentro de sus instalaciones, por
facilitarnos siempre los medios necesarios para llevar a cabo todas las actividades
propuestas. De manera especial a la BQF. Gabriela Astudillo por su apoyo y ayuda
durante la realización de éste trabajo de tesis.
A nuestra amiga Belen Ortega, por su colaboración en el desarrollo de esta
proyecto.
Finalmente al Ing. José Egüez por brindarnos su apoyo y conocimiento para el
desempeño de éste trabajo.
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RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue caracterizar el proceso tradicional de pelado del
maíz con ceniza y evaluar su efectividad como estrategia de detoxificación de
micotoxinas. Particulamente, se evaluó la presencia de aflatoxinas B1 (AFB1), B2
(AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2) y fumonisinas B1 (FB1) y B2 (FB2) de 40 muestras de
maíz seco sin pelar y 40 muestras de maíz seco pelado con ceniza, provistas por
pequeños productores del cantón Nabón, a través de cromatografía liquida de alta
resolución con detección de fluorescencia (HPLC-FLD). En el maíz seco sin pelar se
observó una baja prevalencia de contaminación con aflatoxinas (2,5% AFG2, 12,5%
AFG1, 17,5% AFB2, 7,5% AFB1) y una importante prevalencia de contaminación con
fumonisinas (42,5% FB1, y 35% FB2); lo cual se redujo en el maíz pelado (10,5%
AFG1, 18% FB1 y 8% FB2). Ninguna de las muestras presentó concentraciones de
micotoxinas que excedan los límites máximos establecidos en Ecuador para
aflatoxinas o por la FDA para fumonisinas. La efectividad detoxificante del proceso
de pelado de maíz con ceniza se evaluó comparando las concentraciones de
micotoxinas antes y después del pelado, encontrando reducciones significativas
para AFB1 (P=0,004), AFB2 (P<0,001), FB1 (P=0,033) y FB2 (P=0,023).
Adicionalmente, se evaluó la influencia de las prácticas agrícolas en la
contaminación del maíz por aflatoxinas y fumonisinas, y se identificó que la cosecha
en los meses de julio a septiembre actuaría como factor protector para AFG1 (OR;
0,087; IC: 0,008-0,87; P=0,039) y AFB2 (OR= 0,128; P=0,027). Además, como
factores protectores para FB2, se identificaron al cultivo en zonas cálidas (OR=0,147;
IC: 0,03-0,62; P=0,010) y el riego con agua lluvia (0,111; IC: 0,01-0,66; P=0,016).
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ABSTRACT
The aim of this study was to characterize the process of dehulling maize using wood
ash and to evaluate its effectiveness as a detoxification strategy for mycotoxins.
Particurally, the presence of aflatoxins B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) and G2
(AFG2) and fumonisins B1 (FB1) and B2 (FB2) of 40 samples of dried and no-dehulled
maize and 40 samples of wood ash dehulled maize from small producercs from
Nabon were analyzed using high performance liquid chromatography with
florescence detection (HPLC-FLD). Low prevalence of contamination with aflatoxins
was observed in dried maize (2,5 % AFG2, 12,5% AFG1, 17,5% AFB2, 7,5%AFB1,)
and an important prevalence of contamination with fumonisins (42,5% FB1, y 35%
FB2); wich was reduced in dehulled maize (10,5% AFG1, 18% FB1 y 8% FB2). None
of the samples exceed the maximum limits for aflatoxins established in Ecuador or
FDA for fumonisin. The detoxifying effectiveness of the process of dehulling maize
using wood ash was assessed by contrasting the concentrations of mycotoxins
before and after the dehulling process, finding significant reductions in contamination
for AFB1 (P = 0.004 ), AFB2 (P <0.001), FB1 (P = 0.033) and FB2 (P = 0.023). In
addition, the influence of agricultural practices on aflatoxin and fumonisins
contamination of maize was evaluated. Harvest in the period July-September was
identified as a protective factor for AFG1 (OR; 0,087; IC: 0,008-0,87; P=0,039) and
AFB2 (OR= IC: 0,128; P=0,027) . Also, cultivation in warm zones (OR=0,147; IC:
0,03-0,62; P=0,010) and rainwater irrigation (0,111; IC: 0,01-0,66; P=0,016) were
identified as protective factors for FB2.
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ÍNDICE
RESUMEN ................................................................................................................ VII
ABSTRACT ............................................................................................................. VIII
LISTA DE TABLAS ................................................................................................... XII
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ XIII
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. XIV
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... XV
OBJETIVOS ........................................................................................................... XVII
1. MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 1
1.1 MAÍZ ................................................................................................................. 1
1.1.1 Generalidades del maíz .............................................................................. 1
1.1.2 Composición del grano de maíz ................................................................. 2
1.1.3 Cultivo del maíz .......................................................................................... 4
1.1.4 Manejo del periodo post-cosecha ............................................................... 6
1.1.5 Maíz en el Ecuador ..................................................................................... 7
1.1.6 Plagas y enfermedades del maíz ............................................................. 10
1.2 MICOTOXINAS ............................................................................................... 11
1.2.1 Introducción ............................................................................................. 11
1.2.2 Aflatoxinas ................................................................................................ 14
1.2.3 Fumonisinas ............................................................................................ 18
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1.3 NIXTAMALIZACIÓN ........................................................................................ 22
2. METODOLOGÍA ................................................................................................ 24
2.1. TIPO DE ESTUDIO ........................................................................................ 24
2.2. ÁREA DE ESTUDIO ...................................................................................... 24
2.3. MUESTREO Y TAMAÑO DE LA MUESTRA ................................................. 24
2.4. INFORMACIÓN SOBRE PRÁCTICAS AGRÍCOLAS ..................................... 26
2.5. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE MAÍZ ..................................................... 27
2.5.1. Tratamiento de las muestras: .................................................................. 27
2.5.2 Equipos, materiales y reactivos: ............................................................... 27
2.5.3. Análisis de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 ..................................................... 29
2.5.4 Análisis de fumonisinas B1 y B2 ................................................................ 32
2.5.5. Curvas de calibración .............................................................................. 34
2.6. ANÁLISIS DE DATOS .................................................................................... 37
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 39
3.1. PROCEDENCIA DE LAS MUESTRAS DE MAÍZ ........................................... 39
3.2. PRÁCTICAS AGRÍCOLAS ............................................................................. 40
3.3. CARACTERIZACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DEL PROCESO TRADICIONAL
DEL PELADO DE MAÍZ CON CENIZA ................................................................. 42
3.4 CONTAMINACIÓN DEL MAÍZ CON MICOTOXINAS ..................................... 48
3.4.1. Análisis de aflatoxinas ............................................................................. 48
3.4.2. Análisis de fumonisinas ........................................................................... 50
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3.5 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE PELADO DE MAÍZ CON CENIZA COMO
ESTRATEGIA DE DETOXIFICACIÓN .................................................................. 52
3.6 INFLUENCIA DE LAS PRÁCTICAS AGRÍCOLAS EN LA CONTAMINACIÓN 53
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................... 55
4.1. CONCLUSIONES .......................................................................................... 55
4.2 RECOMENDACIONES ................................................................................... 56
REFERENCIAS ........................................................................................................ 57
ANEXOS................................................................................................................... 60
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1.1. Superficie cosechada de maíz, en hectáreas (Ha), en las provincias de la
Sierra ecuatoriana. Fuente: (Peñaherrera, 2011). ...................................................... 8
Tabla 1.2. Composición química del porcentaje de proteína y de almidón. Fuente:
(Peñaherrera, 2011) ................................................................................................... 9
Tabla 1.3. Principales micotoxinas producidas por hongos contaminantes de
alimentos. Fuente: (FAO., 2009). ............................................................................. 12
Tabla 2.1. Programa de elución tipo gradiente. ........................................................ 31
Tabla 2.2. Características del método analítico de aflatoxinas ................................ 32
Tabla 2.3. Características del método analítico para fumonisinas ........................... 34
Tabla 2.4. Preparación de soluciones estándares para aflatoxinas. ........................ 35
Tabla 2.5. Preparación de soluciones estándares para fumonisinas. ...................... 36
Tabla 3.1. Procedencia de las muestras de maíz (n=40) ......................................... 39
Tabla 3.2. Prácticas Agrícolas relacionadas a la siembra del maíz en el cantón
Nabón (n=40) ........................................................................................................... 40
Tabla 3.3. Caracterización del pelado de maíz con ceniza (n=40) ........................... 42
Tabla 3.4. Estandarización del proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza . 45
Tabla 3.5. Prevalencia de muestras positivas y niveles de aflatoxinas en muestras
de maíz seco sin pelar y pelado. .............................................................................. 48
Tabla 3.6. Prevalencia de muestras positivas y niveles de fumonisinas en muestras
de maíz seco sin pelar y pelado. .............................................................................. 50
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Estructura del grano de maíz: corte longitudinal. Fuente: (Cordero Ruíz,
2012). ......................................................................................................................... 3
Figura 1.2. Estructura de Aflatoxinas B1, B2, G1, G2. Fuente: (Kralj Cigić & Prosen,
2009) ........................................................................................................................ 15
Figura 1.3. Estructura química fumonisina B1y B2. Fuente: Royal Society of
Chemistry (http://www.chemspider.com/) ................................................................. 19
Figura 1.4. a) Estructuras químicas de la esfingosina y esfinganina. b) Mecanismo
de acción de las fumonisinas. Fuente: (Magan & Olsen, 2004). ............................... 21
Figura 2.1. Mapa del catón Nabón y sus parroquias. Fuente: Municipalidad de
Nabón (http://www.nabon.gob.ec/portal/index.php/municipio/ubicacion-geografica). 26
Figura 2.2. Esquema de cálculo de gramos de muestra por mililitro al momento de la
inyección................................................................................................................... 38
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LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. Lista de los participantes y fecha de recolección de las muestras .......... 60
ANEXO 2. Consentimiento Informado ...................................................................... 62
ANEXO 3. Encuesta sobre prácticas agrícolas del maíz. ......................................... 64
ANEXO 4. Flujograma de análisis de aflatoxinas y fumonisinas. ............................. 68
ANEXO 5. Concentración de aflatoxinas en muestras de maíz seco sin pelar y
pelado. ...................................................................................................................... 69
ANEXO 6. Concentración de fumonisinas en muestras de maíz seco sin pelar y
pelado. ...................................................................................................................... 70
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INTRODUCCIÓN
Las micotoxinas son metabolitos secundarios de hongos que pueden contaminar un
sin número de alimentos de contenido acuoso medio y bajo. La presencia de
micotoxinas en la cadena alimentaria constituye un serio problema global pues da
lugar a importantes pérdidas económicas a nivel agrícola y puede causar diferentes
problemas en la salud animal y humana (FAO., 2009; Reddy et al., 2009; Wagacha
& Muthomi, 2008). El ser humano al consumir alimentos contaminados con
micotoxinas está expuesto a diversos efectos adversos que incluyen alteraciones
nerviosas, gastrointestinales, reproductivas, así como inmunodeficiencia. Además
existen micotoxinas que pueden causar efectos cancerígenos, genotóxicos y
citotóxicos (Brase, Encinas, Keck, & Nising, 2009).
El maíz constituye un cereal susceptible a la contaminación con micotoxinas en
especial en países en vías de desarrollo, debido a la falta de normas regulatorias y
la falta de aplicación de tecnologías útiles para manejo y conservación de los
alimentos (FAO., 2009; Scussel, 2004). Además, en áreas rurales existe un mayor
riesgo de contaminación debido a que los cultivos se realizan y consumen sin
ninguna conciencia de seguridad alimentaria (Kimanya et al., 2008). Se han
propuesto varios mecanismos para disminuir la contaminación del maíz por
micotoxinas, los mismos que se pueden llevar a cabo tanto en las fases de pre-
cosecha y de pos-cosecha. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis fue caracterizar el
proceso de pelado de maíz con ceniza y evaluar su aplicabilidad como método de
detoxificación de aflatoxinas y fumonisinas en mote pelado como producto final en el
cantón Nabón de la Sierra Ecuatoriana.
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Los resultados de este trabajo constituyen la primera etapa del proyecto de
investigación “Assessment of the traditional wood ash nixtamalization as
detoxification strategy to reduce Fumonisin and Aflatoxin contamination of boiled
maize ("mote pelado"), Nabon-Ecuador” financiado por la Fundación Internacional de
Ciencia (IFS) (Research Grant E/5398-1).
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OBJETIVOS
Objetivo general
Caracterizar el proceso tradicional de pelado del maíz con ceniza y evaluar su
efectividad como estrategia de detoxificación de fumonisinas y aflatoxinas.
Objetivos específicos
Caracterizar y estandarizar el proceso tradicional de pelado de maíz con ceniza en el
área rural de Nabón, Ecuador mediante la aplicación de encuestas.
Evaluar el nivel de detoxificación proceso de pelado con ceniza mediante la
determinación de micotoxinas (fumonisinas y aflatoxinas) en maíz seco antes y
después del pelado con ceniza.
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1. MARCO TEÓRICO
1.1 MAÍZ
1.1.1 Generalidades del maíz
El maíz (Zea mays) es una planta monoica anual que pertenece a la familia de las
gramíneas. El cultivo de este cereal es uno de los más adaptables a diferentes
climas, por lo cual su producción, junto con el arroz y el trigo, son los más
importantes a nivel mundial (Mejía, 2005).
El cultivo del maíz es muy antiguo y se originó en el continente americano. Los
países en América del sur que registran una agricultura antigua de éste cereal son
Colombia, Perú, Ecuador, Bolivia y Chile (Pesantez, 2004).
La producción del maíz está ampliamente distribuida a nivel mundial con valores de
645’414,836.10 toneladas de maíz por año. La cosecha de maíz se ubica por debajo
de la cosecha de arroz y trigo a nivel mundial, pero en países con economías en
desarrollo como en Latinoamérica, la cosecha de éste cereal se ubica en primer
lugar. El principal continente productor es América con un 54,5% del total de la
producción mundial, seguido por Asia con el 27,3%, Europa con un 11,2% y
finalmente África y Oceanía con un 6,9% del total mundial. En el continente
americano los países con mayor producción son Estados Unidos, Brasil, México y
Argentina (INEC, 2009; Mejía, 2005). En la actualidad, consumo del maíz en países
de Latinoamérica se realiza en cantidades superiores a la mitad de su producción,
ya que éste cereal es considerado como una fuente importante de energía por su
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elevado contenido de carbohidratos, proteínas, aceites y fibra.(Peñaherrera, 2011) El
país con mayor volumen de consumo a nivel mundial es México con 12’996.136,96
(INEC, 2009).
Entre los países de América, el Ecuador se encuentra en cuarto lugar en lo que se
refiere a consumo de maíz según la CAN (Comunidad Andina de Naciones),
constituyendo un componente básico de la alimentación. Se ha estimado que el
consumo per cápita de maíz alcanza cifras de 82,9 Kg/persona/año. Hasta el 2009,
el consumo por habitante se ha incrementado en una tasa promedio de un 1,4%
(INEC, 2009).
1.1.2 Composición del grano de maíz
La semilla o grano del maíz está compuesto por la cubierta o pericarpio, el
endospermo amiláceo y el embrión o germen (Cordero Ruíz, 2012). La cubierta o
pericarpio se caracteriza por su elevado contenido de fibra (87%) constituida
principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. El endospermo es la porción
más grande del núcleo (82%) y se caracteriza por un elevado contenido de almidón
y gluten. Finalmente el embrión representa el 11.5% del peso total del grano y
contiene una elevada cantidad de grasa (aceite vegetal), proteínas y minerales
(Mejía, 2005; Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013).
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Figura 1.1. Estructura del grano de maíz: corte longitudinal. Fuente: (Cordero Ruíz,
2012).
El principal componente del grano de maíz es el almidón, aunque también son
comunes carbohidratos sencillos como glucosa, sacarosa y fructosa. El almidón se
encuentra principalmente en el endospermo y está constituido por amilasa y
amilopectina. (IICA-PROCIANDINO; Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013).
Las proteínas constituyen el segundo componente de importancia en el grano y se
encuentran principalmente en el endospermo y germen. Existen tres tipos principales
de proteínas: la zeína, la globulina y la glutenina. La zeína es considerada una
proteína imperfecta ya que carece de los aminoácidos esenciales lisina y triptófano
(deficiencia en la calidad nutricional). Por otro lado, la glutenina y la globulina se
ubican principalmente en el germen y están provistas de todos los aminoácidos
esenciales (IICA-PROCIANDINO).
Los lípidos se encuentran principalmente en el germen (80-85%), se presentan como
ácidos grasos saturados esteárico y palmítico; y ácidos insaturados linolénico y
araquidónico. En menor cantidad encontramos a los ácidos fórmico y acético (Angel,
2010; IICA-PROCIANDINO; Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013).
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El contenido de sustancias minerales (cenizas) del maíz oscila entre 1,2 a 1,7%, y se
encuentran en un 75% en el germen. El maíz es un cereal pobre en calcio y rico en
fosforo y hierro (IICA-PROCIANDINO; Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013). En
cuanto al contenido vitamínico el maíz presenta un elevado contenido de
carotenoides, vitamina A, tiamina y riboflavina. Las cantidades de ácido ascórbico y
vitamina D son despreciables (IICA-PROCIANDINO).
1.1.3 Cultivo del maíz
1.1.3.1. Época de siembra: generalmente inicia con el período de lluvia tanto en la
región Sierra como en la región Costa. En la Sierra, la siembra tiene lugar desde
septiembre a diciembre lo que permite obtener una mejor germinación y producción
(Eguez & Pintado, 2011; Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013).
1.1.3.2. Clima de cultivo: el maíz de altura (sierra) requiere de 760 a 1300 mm de
precipitación durante todo el ciclo y una temperatura de 10 a 20°C (Peñaherrera,
2011).
1.1.3.3 Suelo: el maíz necesita suelos profundos, ricos en materia orgánica, con un
pH entre 5.5 y 7.5; además se debe contar con buen drenaje para evitar
encharcamientos (Peñaherrera, 2011).
1.1.3.4. Siembra: es importante una buena selección de la semilla para la obtención
de una buena productividad. Las semillas óptimas para la siembra deben contar con
pureza genética, física, calidad sanitaria, poder de germinación y deben conservar
las características agronómicas propias de la variedad (Eguez & Pintado, 2011;
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Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013). Por otra parte el suelo debe prepararse dos
meses antes de la siembra a través de arado; con lo cual se consigue eliminar
malezas, plagas y facilita la descomposición de residuos de otras cosechas. El
surcado debe realizarse a una distancia de 80 a 90 cm entre surcos. A un costado
de los mismos, con ayuda de un gualmo (palo con punta), se realizan los hoyos con
una profundidad no mayor de 5cm, en los cuales se colocan dos semillas de maíz;
de ésta manera se asegura una buena germinación y que las plantas emerjan al
mismo tiempo (Eguez & Pintado, 2011; Peñaherrera, 2011).
1.1.3.5. Fertilización: es necesario realizar un análisis del suelo para conocer la
cantidad de nutrientes requeridos para el cultivo; en caso de no ser posible el
análisis, se han observado buenos rendimientos con la aplicación del abono 10-30-
10 al fondo del surco en la siembra (Eguez & Pintado, 2011).
1.1.3.6. Agua de riego: la mayoría de los productores realizan la siembra en el inicio
del período de lluvia, por lo cual no siempre es necesario el uso de un sistema de
riego. Si se dispone de un sistema, es recomendable el riego por aspersión o goteo
para un eficiente uso del agua; teniendo en cuenta que durante la etapa de
emergencia la planta requiere una humedad constante (Eguez & Pintado, 2011;
Peñaherrera, 2011).
1.1.3.7. Cosecha: la época de cosecha depende de la temperatura, altitud y
variedad del maíz usada (Cordero Ruíz, 2012; Peñaherrera, 2011). En general el
cultivo se encuentra maduro de 7-8 semanas luego de la aparición de las flores, en
éste período el grano contiene un 35-45% de humedad y el máximo contenido de
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materia seca, éste es el momento en el cual el cultivo debe ser cosechado para
evitar las pérdidas en el campo (FAO, 2003; Mejía, 2005).
Cuando el cultivo se destina a consumo como choclo, la cosecha se realiza cuando
el grano está bien formado y en estado lechoso; el almacenamiento se realiza en
sacos hasta su comercialización. La cosecha del grano seco se realiza cuando el
grano está en su madurez fisiológica, que se detecta con la presencia de una capa
negra en la base del grano. Para su comercialización se almacena el producto en
sacos, luego de 20 días adicionales en el campo (Eguez & Pintado, 2011;
Peñaherrera, 2011).
La cosecha debe realizarse en la época óptima ya que si se cosecha con un alto
contenido de humedad, se dificulta la conservación del producto; los granos se
rompen, deterioran y son más susceptibles a pudriciones y contaminación por
hongos (Cordero Ruíz, 2012).
1.1.4 Manejo del periodo post-cosecha
1.1.4.1. Secado: el secado de la mazorcas se debe realizar al sol sobre lonas,
volteando periódicamente el producto para que el secado sea uniforme, hasta
alcanzar una humedad de un 12% (Peñaherrera, 2011).
1.1.4.2. Limpieza, clasificación y desgrane: se deben eliminar las mazorcas
enfermas y las impurezas como tuzas, pelos de maíz, hojas y tallos ya que podrían
actuar como portadores de hongos e insectos. Antes del desgrane se deben
clasificar las mazorcas en aquellas destinadas para la comercialización, maíz para
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autoconsumo y maíz para semilla. Finalmente, para desgranar las mazorcas los
granos deben estar completamente secos (12% humedad) (Peñaherrera, 2011;
Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013).
1.1.4.3. Ensacado y almacenamiento: el grano debe almacenarse en sacos
limpios, en lugares frescos con temperaturas de 10-12°C, con una humedad inferior
al 13% y libres de insectos y roedores (Eguez & Pintado, 2011; Peñaherrera, 2011).
1.1.5 Maíz en el Ecuador
1.1.5.1. Producción de maíz ecuatoriano: en el Ecuador existe una elevada
producción de maíz, alcanzando anualmente cifras de 43.284 toneladas solamente
en la sierra ecuatoriana. Las provincias donde se ha observado una mayor presencia
del cultivo son Bolívar en primer lugar con un 31,8%, en segundo lugar Cotopaxi con
un 21,8% y finalmente la provincia de Azuay con 19,4% del total nacional. En lo que
se refiere al consumo per cápita de maíz, a nivel nacional es de 82,9
Kg/persona/año. Hasta el 2009, el consumo por habitante se ha incrementado en
una tasa promedio de un 1,4% (INEC, 2009).
La distribución del cultivo de los diferentes tipos de maíz depende de las costumbres
de los agricultores. En el norte del Ecuador; en las provincias de Carchi, Imbabura y
Pichincha se consume maíz de tipo amarillo harinoso, en la parte central (Bolívar y
Chimborazo), se cultiva el maíz blanco harinoso y; en el sur principalmente en las
provincias de Cañar y Azuay se cultiva el maíz blanco amorochado o Zhima
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(Peñaherrera, 2011). En la tabla 1.1 resume la superficie cosechada de maíz en la
Sierra ecuatoriana.
Tabla 1.1. Superficie cosechada de maíz, en hectáreas (Ha), en las provincias de la
Sierra ecuatoriana. Fuente: (Peñaherrera, 2011).
Provincia Superficie cosechada
(Ha)
Carchi
964
Imbabura 6.789
Pichincha 13.199
Cotopaxi 38.840
Tungurahua 4.682
Chimborazo 12.906
Bolívar 31.620
Cañar 3.252
Azuay 28.270
Loja 61.184
Total 201.706
1.1.5.2. Valor nutritivo del maíz ecuatoriano: Existen diferentes variedades de
maíz cultivadas en el Ecuador y el contenido de proteínas y almidón en el maíz
puede ser diferente de una variedad a otra. En la tabla 1,2 se detalla el valor nutritivo
de las principales variedades de maíz ecuatoriano (Peñaherrera, 2011).
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Tabla 1.2. Composición química del porcentaje de proteína y de almidón. Fuente:
(Peñaherrera, 2011)
Raza % Proteína
(En base seca)
% Almidón
(En base seca)
Blanco Blandito (INIAP-102)
8,3
73,1
Guagal (INIAP-111) 8,1 72,1
Chaucho (INIAP-122) 9,1 74,6
Mischca (INIAP-124) 8,0 74,0
Cuzco ecuatoriano 8,8 73,6
Chulpi (INIAP-192) 10,2 64,3
1.1.5.3. Clasificación del maíz: existen alrededor de 200 variedades diferentes de
maíz, que se clasifican de acuerdo a las características del endospermo. De éstas,
cinco son las más importantes: reventador, duro, blando, dentado y dulce (Mejía,
2005).
En el Ecuador, las principales variedades cultivadas son aquellas obtenidas de
cruces entre diferentes especies que son el cuzco ecuatoriano (Zhima), guagual
blanco blandito, mischa, chulpi, morochón y canguil morado. Estas variedades
conservan las mismas características de la mazorca y el grano que el material
original, así como la adaptación agroecológica pero con rendimientos que superan a
las variedades tradicionales (Cordero Ruíz, 2012; Mejía, 2005; Peñaherrera, 2011).
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Las principales variedades de la sierra ecuatoriana son (Encalada, Muñoz, & Ortiz,
2006; Peñaherrera, 2011):
INIAP-101: Blanco harinoso precoz.
INIAP-102: Blanco suave “Blanco blandito”
INIAP-111: Blanco harinoso tardío “Guagal mejorado”
INIAP-122: Amarillo suave precoz “Chaucho mejorado”
INIAP-124: Amarillo suave precoz “Mishca mejorado”
INIAP-130: Amarillo suave precoz.
INIAP-192: Chulpi mejorado.
INIAP-153: Blanco semi duro de precocidad intermedia “Zhima mejorado”
INIAP-180: Amarillo duro de alto rendimiento
INIAP-176: Amarillo cristalino.
1.1.6 Plagas y enfermedades del maíz
Existe una gran variedad de plagas que pueden afectar a la planta desde la
germinación hasta la cosecha, causando enfermedades que pueden producir
importantes pérdidas del cultivo. Los principales métodos para el control de plagas y
enfermedades son el uso de plaguicidas, aceite vegetal (mariposa y mosca), uso de
semilla libre de enfermedades y limpieza de residuos de cosechas anteriores
(Cordero Ruíz, 2012; Eguez & Pintado, 2011; Peñaherrera, 2011).
Los insectos cumplen un rol importante en la contaminación del maíz por
micotoxinas, tanto en la etapa de cultivo como en el almacenamiento del producto.
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 11
Al afectar la planta el insecto actúa como vector, facilitando la entrada de la espora
en la mazorca y aumentando la infección al dañar el pericarpio del grano (García &
Heredia, 2006; Magan & Olsen, 2004; Peñaherrera, 2011).Particularmente el
gorgojo, que es una plaga de almacenamiento, se puede encontrar en el interior de
los granos almacenados de ciclos anteriores y al almacenar nuevas cosechas el
insecto se dirige a los granos sanos. El gorgojo ataca al grano produciendo
alteraciones en el germen y desaparición de una gran cantidad de endospermo;
además facilita el desarrollo de hongos en el grano lo cual aumenta el riesgo de
producción de sustancias tóxicas (micotoxinas) (Mejía, 2005; Peñaherrera, 2011).
1.2 MICOTOXINAS
1.2.1 Introducción
La palabra micotoxina proviene del griego mico que significa hongo y toxicum que
significa veneno. Las micotoxinas son productos del metabolismo secundario de los
hongos toxigénicos, es decir que no son requeridos para el normal crecimiento y
desarrollo de los hongos. Químicamente, las micotoxinas son productos no volátiles,
de relativo bajo peso molecular, que presentan estructuras similares con abundantes
grupos oxigenados y compuestos heterocíclicos (Brase et al., 2009; FAO., 2009;
Méndez‐Albores, Villa, Rio‐García, & Martinez, 2004).
Las principales especies productoras de micotoxinas corresponden a los géneros
Aspergillus, Penicillium, Claviceps, Fusarium, Stachybotrys y Myrothecium. Las
micotoxinas pueden ser exclusivas de una especie, pero la mayoría de ellas son
producidos por más de una especie (Brase et al., 2009). Entre las micotoxinas más
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estudiadas y de importancia mundial están las aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxinas,
patulina, zearanelona, alcaloides de ergot y tricotecenos (Brase et al., 2009; FAO.,
2009). A continuación se resume en la Tabla 1.3 los principales metabolitos tóxicos
producidos por hongos contaminantes de alimentos.
Tabla 1.3. Principales micotoxinas producidas por hongos contaminantes de
alimentos. Fuente: (FAO., 2009).
Especie de moho Micotoxinas producidas
Aspergillus parasiticus
Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2
Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 y B2
Fusarium sporotrichioides Toxina T-2
Fusarium graminearum Deoxinivalenol, nivalenol,
Zearalenona
Fusarium moniliforme (F. verticillioides) Fumonisina B1
Penicillium verrucosum Ocratoxina A
Aspergillus ochraceus Ocratoxina A
La producción de estos metabolitos secundarios depende completamente de la
presencia de condiciones óptimas de temperatura y humedad en el ambiente, así
como del contenido de humedad en el alimento, madurez de la colonia, presencia de
otro hongo o microorganismo y del daño físico del sustrato provocado por insectos.
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Normalmente, los hongos crecen entre 10 y 40°C, en un rango de pH de 4 a 8, y con
niveles de actividad de agua (Aw) por encima de 0,70 (a veces puede crecer en
superficie muy secas) (Brase et al., 2009; FAO., 2009).
Una vez que se ha producido la micotoxina, ésta se encontrará en todos los lugares
de la colonia (hifa, micelio, esporas) así como en el sustrato en donde creció la
colonia. El desarrollo de micotoxinas pueden ocurrir en cualquier etapa de la cadena
alimenticia: antes de la cosecha, entre la cosecha y el secado, y durante el
almacenamiento de los productos. Las micotoxinas pueden encontrarse en una
amplia gama de alimentos de contenido acuoso medio y bajo que incluyen frutas,
granos de cereales, frutos secos, frijoles y guisantes (Tabla 4) (FAO., 2009).
La Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO) estima que hasta un
25% de los productos agrícolas del mundo están contaminados con micotoxinas a
un cierto grado (Köppen et al., 2010). El ser humano y los animales al consumir
alimentos contaminados con micotoxinas están expuestos a diversos efectos
adversos que incluyen alteraciones nerviosas, gastrointestinales, reproductivas,
inmunológicas así como efectos cancerígenos, mutagénicos y teratogénicos.
En la actualidad se considera que los países en vías de desarrollo son los más
expuestos al consumo de alimentos contaminados con micotoxinas en comparación
con los países desarrollados, lo cual se puede relacionar a la escasa regulación
gubernamental y a la falta de aplicación de tecnologías útiles para el manejo y
conservación de los alimentos. Sin embargo, es importante señalar que incluso con
la aplicación de buenas prácticas de agricultura y un adecuados sistemas de análisis
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 14
de peligros y detección de puntos críticos de control (HACCP), no ha sido posible
conseguir la completa eliminación de micotoxinas en alimentos (Brase et al., 2009;
FAO., 2009).
1.2.2 Aflatoxinas
El nombre de aflatoxinas deriva de la combinación de “a” de Aspergillus, “fla” de la
especie y toxina que significa veneno. Las aflatoxinas son metabolitos secundarios
producidos principalmente por Aspergillus flavus y A. parasiticus que se desarrollan
en climas tropicales y subtropicales donde las condiciones de temperatura y
humedad son óptimas para la producción de las mismas. Se encuentran
especialmente en cultivos de cereales (maíz, arroz, trigo, sorgo), frutos secos (nuez,
almendras, pistachos), especias, algodón y semillas oleaginosas. También se
pueden encontrar en leche, productos lácteos (queso yogurt), huevos y carnes por
consumo de piensos contaminados con aflatoxinas por parte del animal.(FAO.,
2009)
1.2.2.1 Propiedades físico-químicas de las aflatoxinas: las aflatoxinas son
metabolitos de baja solubilidad en agua pero solubles en soluciones acuosas de
metanol, acetonitrilo y acetona. Son relativamente inestables a la luz, susceptibles a
la hidrólisis alcalina y estables a un rango de pH entre 3 y 10 (Campos, 1994).
Químicamente las aflatoxinas son compuestos formados por anillos heterocíclicos
oxigenados, que contienen una anillo de lactona que los hace susceptibles a la
hidrólisis alcalina (Torres, Guzmán-Ortiz, & Ramírez-Wong, 2001).
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Hasta el momento se han identificado alrededor de 18 clases de aflatoxinas, de las
cuales las más importantes incluyen aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 que se originan de
manera natural. Las demás aflatoxinas (M1, M2, P1, Q1, aflatoxicol, etc.) se han
encontrado como productos metabólicos de sistemas microbianos o animales
(Contreras & Flórez, 2009; Smith & Henderson, 1991). (Ver figura 2).
Figura 1.2. Estructura de Aflatoxinas B1, B2, G1, G2. Fuente: (Kralj Cigić & Prosen,
2009)
Las toxinas tipo B se caracterizan por la fusión de un anillo ciclopentanona a un
anillo lactona de la estructura cumarina, mientras las toxinas G contienen un anillo
lactona fusionado en lugar del anillo ciclopentanona (Figura 2). La nomenclatura B y
G, hace referencia a sus propiedades físico-químicas, dado que las aflatoxinas de
tipo B presentan fluorescencia azul (blue) y las de tipo G fluorescencia verde (green)
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 16
cuando se les observa bajo luz ultravioleta a 365 nm (Brase et al., 2009; Contreras &
Flórez, 2009).
Las especies como Aspergillus flavus son productores de AFB1 y AFB2 mientras
Aspergillus parasiticus producen AFG1 y AFG2 así como AFB1 y AFB2. Otros tipos de
aflatoxinas M1 (metabolito producido por AFB1), M2, B2A y G2A han sido aisladas de
cultivos A. flavus y A. parasiticus pero su producción es mínima (Bhat, Rai, & Karim,
2010).
El desarrollo del hongo productor de aflatoxinas dependerá de las condiciones de
temperaturas en la que se encuentre, por ejemplo para A. parasiticus el rango
temperatura de crecimiento oscila entre 6 a 8 °C y el máximo es de 44 a 66 °C,
siendo óptima de 25 a 35 ◦C mientras que A. flavus puede producir la toxina entre 12
y 42 °C y su óptima es de 28 a 30 ◦C (FAO., 2009).
1.2.2.2. Efectos toxicológicos de las aflatoxinas: la exposición a aflatoxinas se da
principalmente a través de la ingestión de alimentos contaminados ya sean por parte
del animal o persona. También la absorción puede darse por vía dérmica, pero ésta
es lenta e insignificante (Bhat et al., 2010; Brase et al., 2009; García & Heredia,
2006; Gnonlonfin et al., 2013).
Las aflatoxinas son conocidas principalmente por causar enfermedades hepáticas
agudas y crónicas, así como de poseer efectos inmunosupresores, mutagénicos
teratogénico. (Brase et al., 2009) Según la Agencia Internacional de Investigación de
Cancer (IARC), las aflatoxinas son clasificadas como carcinógenos humanos de tipo
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1(IARC, 2004). El consumo de comida y piensos contaminados con altos niveles de
aflatoxinas ha sido relacionado con el retraso de crecimiento y pérdida de peso en
niños, y en algunos casos ha llevado al desarrollo de cáncer hepatocelular. Además
las aflatoxinas han sido relacionadas con el síndrome de kwashiorkor y como co-
factores en la incidencia de cáncer de hígado en pacientes que poseen el virus de la
Hepatitis-B (Bhat et al., 2010; Wagacha & Muthomi, 2008).
Su acción carcinogénica se basa en la biotransformación por el sistema hepático
microsomal P450 a AFB1-8,9-epóxido, un intermediario altamente reactivo capaz de
unirse a las proteínas, a los ácidos ribonucleico y desoxirribonucleico; formando un
compuesto estable con los residuos guanil que puede causar mutaciones en el gen
p53 supresor de tumores. Esta alteración es característica de varios carcinomas,
especialmente del carcinoma hepático en el hombre. (Urrego Novoa & Díaz, 2006).
1.2.2.3. Regulaciones de aflatoxinas en maíz: Actualmente, el límite máximo
permitido en alimentos de consumo humano por parte de la FDA (Food and Drug
Administration) es de 20 µg/kg de alimento (ppb) para el total de aflatoxinas (AFB1,
AFG1, AFB2, y AFG2). Si las concentraciones exceden los límites establecidos, estos
alimentos son destinados para el consumo animal. Por otra parte, el Comité
Regulador Europeo establece un límite máximo de 4 µg/kg para el total de
aflatoxinas y 2 µg/kg solo para AFB1. En lo que refiere a Ecuador, el INEN permite
un contenido máximo de 20 µg/kg de aflatoxinas totales (Bhat et al., 2010; Brase et
al., 2009; INEN, 1995; Normalización, 1995).
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1.2.3 Fumonisinas
Las fumonisinas son una familia de 10 micotoxinas más recientemente aisladas,
producidas por varias especies del género Fusarium (Bhat et al., 2010; Brase et al.,
2009). Las distintas especies de éste género pueden desarrollarse en una gran
variedad de ambientes, principalmente por su habilidad para vivir en ausencia de
oxígeno, y son considerados uno de los patógenos más importantes que afectan a
cereales (Brase et al., 2009).
Las fumonisinas fueron aisladas por primera vez de Fusarium verticillioides y
Fusarium proliferatum; contaminantes comunes del maíz y productos derivados del
maíz a nivel mundial (Bhat et al., 2010; Magan & Olsen, 2004).
La producción de fumonisinas en el maíz generalmente está asociada a factores que
causan estrés en la planta tales como: daños por insectos, elevado contenido de
humedad en el suelo, elevadas temperaturas y falta de nutrientes en el suelo.
Existen reportes de contaminación luego de la cosecha que han sido asociados a
almacenamiento en condiciones de humedad y temperatura inadecuadas (Magan &
Olsen, 2004).
1.2.3.1. Propiedades físico-químicas de las fumonisinas: las fumonisinas son
compuestos con un peso molecular promedio de 721.8 Da; tienen carácter polar,
solubles en agua y soluciones acuosas de metanol y acetonitrilo, y son insolubles en
solventes orgánicos (Bhat et al., 2010; Magan & Olsen, 2004).
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A diferencia de la mayoría de micotoxinas, las fumonisinas no presentan una
estructura cíclica. Son derivados policétidos que contienen aminas primarias y dos
grupos tricarboxílicos. Se caracterizan por una cadena aminopolihidroxialquil de 19-
20 carbonos que presenta dos esterificaciones con grupos propano 1-2-3 ácido
tricarboxilico (ácido tricarbalílico). Estructuralmente se asemejan a los esfingolípidos
(Brase et al., 2009; Magan & Olsen, 2004).
Las fumonisinas se dividen en cuatro series relacionadas químicamente entre sí (A,
B, C y P). De estas series, la serie B (FB1-3) se caracteriza por un grupo amino libre,
y es la más relacionada a contaminaciones en alimentos (Figura 3). La fumonisina B1
(FB1), conocida también como macrofusina, generalmente es responsable de un 70-
80% de las contaminaciones. Las fumonisinas B2 y B3 suelen ser responsables de
un 15-25% y 3-8% de contaminación, respectivamente (Brase et al., 2009; Magan &
Olsen, 2004).
Figura 1.3. Estructura química fumonisina B1y B2. Fuente: Royal Society of
Chemistry (http://www.chemspider.com/)
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1.2.3.2. Efectos toxicológicos de las fumonisinas: el consumo de alimentos
contaminados con fumonisinas ha sido asociado a neurotoxicidad, aumento de la
incidencia de cáncer esofágico, cáncer hepático, efectos inmunosupresores y
defectos en el tubo neural en ratas (Bhat et al., 2010; Blandino, Reyneri, Colombari,
& Pietri, 2009; Magan & Olsen, 2004).
El efecto carcinogénico de las fumonisinas ha sido comprobado en animales. En el
caso de los humanos, dicho efecto ha sido evaluado y la IARC ha designado a las
fumonisinas B1 y B2 como posibles agentes cancerígenos en humanos debido a que
la mayoría de efectos toxicológicos en la salud humana no se encuentran claros
((IARC), 2002; Magan & Olsen, 2004; Palencia et al., 2003).
La mayoría de los efectos tóxicos de las fumonisinas provienen de su capacidad de
alterar el metabolismo de los esfingolípidos. La fumonisina B1 inhibe a la enzima
ceramida sintetasa responsable de la acetilación de la esfinganina y la esfingosina
(bases esfingoides) (Figura 4) (Magan & Olsen, 2004; Palencia et al., 2003).
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a
b
Figura 1.4. a) Estructuras químicas de la esfingosina y esfinganina. b) Mecanismo
de acción de las fumonisinas. Fuente: (Magan & Olsen, 2004).
La alteración de ésta vía metabólica resulta en un aumento de los niveles de los
precursores de esfingolípidos y una disminución de los niveles de esfingolípidos
complejos responsables de la comunicación celular y la transmisión de señales. Por
su parte, los elevados niveles de esfiganina (en menor proporción esfingosina)
inician una cascada de alteraciones celulares (apoptosis y proliferación celular) que
podrían resultar en toxicidad y carcinogenicidad (Bhat et al., 2010; Magan & Olsen,
2004).
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1.2.3.3. Regulaciones de fumonisinas en maíz: En base a la información
toxicológica de las fumonisinas, la FDA ha establecido el límite máximo permitido de
fumonisinas totales (FB1+FB2+FB3) en maíz y productos derivados de maíz 4000
µg/kg de alimento (Magan & Olsen, 2004). En Europa, la normativa es más estricta,
siendo de 1000 µg/kg para la suma de FB1+FB2 (Bhat et al., 2010; Magan & Olsen,
2004). En países de Latinoamérica, los niveles permitidos para fumonisinas totales
son de 2000 µg/kg de alimento (Palencia et al., 2003). En el Ecuador no existe un
reglamento vigente que controle los niveles de fumonisinas en alimentos (Bhat et al.,
2010; FAO, 2003; Magan & Olsen, 2004; Palencia et al., 2003).
1.3 NIXTAMALIZACIÓN
La nixtamalización es un proceso térmico alcalino, desarrollado por civilizaciones
nativas americanas, para la elaboración de tortillas como producto final. El proceso
consiste en la cocción del grano de maíz por 45-60 min en una solución alcalina al
1% (2-3 litros de agua /kg de maíz procesado con 1-3% de Ca(OH)2 -cal-), seguido
de un remojo por 14 horas. Luego de trascurrido éste tiempo el líquido de remojo se
desecha y los granos cocinados son lavados para eliminar el pericarpio y el exceso
de cal. Finalmente los granos nixtamalizados se muelen para formar una masa que
se hornea o fríe para producir tortillas como producto final (Bullerman & Bianchini,
2007; De La Campa, Miller, & Hendricks, 2004; García & Heredia, 2006; Magan &
Olsen, 2004; Tosi Vélez, 2012).
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Se ha comprobado que el proceso de nixtamalización puede reducir la
contaminación del maíz por aflatoxinas en un 83% y de fumonisinas en un 94%; sin
afectar el valor nutricional del producto final (De La Campa et al., 2004; García &
Heredia, 2006).
En el Ecuador, el maíz se consume directamente como grano cocido. El pelado del
grano se realiza usando un proceso similar a la nixtamalización, en el cual se utiliza
cal, ceniza o una mezcla de ambos. El producto del tratamiento alcalino es sometido
a una nueva cocción que permite que el grano reviente (mote), lo cual constituye el
producto final del proceso. (Tosi Vélez, 2012) El pelado de maíz con ceniza es una
técnica ancestral de las regiones rurales de la sierra ecuatoriana, que confiere al
grano especiales propiedades sensoriales, incluyendo mejor sabor y textura (Pappa,
de Palomo, & Bressani, 2010; Tosi Vélez, 2012). Además, este proceso confiere
diferentes propiedades fisicoquímicas como una mejora en la absorción de agua de
los granos y el pH del líquido de cocción (Pappa et al., 2010).
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2. METODOLOGÍA
2.1. TIPO DE ESTUDIO
El presente estudio fue de tipo cuantitativo, analítico, descriptivo de corte transversal
que incluyó la caracterización del pelado de maíz con ceniza en el cantón Nabón, la
determinación de la contaminación de micotoxinas en el maíz y evaluación de la
reducción de la contaminación por el pelado con ceniza.
2.2. ÁREA DE ESTUDIO
El estudio se llevó a cabo en el cantón de Nabón, localizado en la provincia del
Azuay al sur de la Sierra ecuatoriana a 3.000 metros sobre el nivel del mar. La
mayoría de los habitantes de Nabón (93%) viven en áreas rurales y el 35% se
consideran a ellos mismos como indígenas. Este cantón fue elegido por ser el más
pobre de la provincia del Azuay (96.5%) en el cual uno de los principales cultivos es
el maíz (Gobierno-Autonomo-Desentralizado-Municipal-Nabon, 2012; Nabón, 2012;
Ortiz et al., 2013).
2.3. MUESTREO Y TAMAÑO DE LA MUESTRA
Se adoptó un muestreo por conveniencia, por el cual se recolectó la información y
las muestras de maíz de un total de 40 participantes. La toma de muestras se llevó a
cabo durante el período Septiembre-Octubre de 2014 para lo cual se realizaron
reuniones para socializar los objetivos y la metodología del estudio con las
autoridades y agricultores de la zona. Finalmente se obtuvo la colaboración
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voluntaria de 40 participantes (Anexo 1) provenientes de Nabón centro y sus
alrededores (Figura 2.1.), quienes fueron informados de forma verbal y escrita a
través del consentimiento informado (Anexo 2) sobre los objetivos, actividades,
remuneración por la entrega de muestras de maíz, beneficios y riesgos del estudio.
A cada productor se solicitó un total de 10 kg de maíz del mismo lote de producción,
el cual fue dividido en dos partes:
Muestra 1: granos secos sin pelar (4 kg)
Muestra 2: granos secos pelados con ceniza. (6 kg)
En una primera visita, se recolectó la muestra 1 debidamente homogenizada; la
misma se transportó en saquillos etiquetados y cerrados para evitar posibles
contaminaciones por humedad. Se solicitó al agricultor realizar el proceso de pelado
de maíz con ceniza (muestra 2) y realizar el secado posterior de la misma. Una
semana después de la primera visita, se recolectó la mitad de la muestra 2, la misma
que se transportó en iguales condiciones que la muestra 1. Ambas muestras
provinieron del mismo lote y por lo tanto del mismo proveedor. La otra mitad de la
muestra 2 fue finalmente cocinada por el mismo proveedor. Esta muestra no fue
objeto de estudio del presente trabajo de tesis.
Las muestras fueron trasladadas al Laboratorio de Alimentos y Nutrición de la
Universidad de Cuenca y se almacenaron apropiadamente hasta su procesamiento y
análisis.
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Figura 2.1. Mapa del catón Nabón y sus parroquias. Fuente: Municipalidad de
Nabón (http://www.nabon.gob.ec/portal/index.php/municipio/ubicacion-geografica).
2.4. INFORMACIÓN SOBRE PRÁCTICAS AGRÍCOLAS
Junto con las muestras, se recolectó información sobre las prácticas agrícolas antes
y después de la cosecha (época de siembra y cosecha, uso de pesticidas y
fertilizantes, tratamiento en caso de contaminación con mohos u otro
microorganismo), tipos de secado del maíz, caracterización del maíz y sobre el
proceso de pelado de maíz con ceniza. Estos datos se recolectaron mediante la
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 27
aplicación de encuestas (previamente diseñadas y probadas) durante la etapa de
muestreo (Anexo 3).
2.5. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE MAÍZ
2.5.1. Tratamiento de las muestras: Las muestras de maíz (muestra 1 y 2) fueron
almacenadas en condiciones secas y a temperatura ambiente (20°C) en saquillos
plásticos para simular las mismas condiciones de almacenamiento de los
productores. Una vez recolectadas todas las muestras, fueron finamente molidas y
almacenadas en fundas de papel debidamente etiquetadas a temperatura ambiente
hasta su análisis.
2.5.2 Equipos, materiales y reactivos: Instalaciones, equipos, reactivos,
estándares y la mayoría de los materiales para preparación de muestras fueron
provistos por el Laboratorio de Alimentos y Nutrición (Proyecto IFS Grant E/5398-1 y
Proyecto “Alimentación, Nutrición y Salud” VLIR-IUC, Facultad de Ciencias
Químicas, Universidad de Cuenca).
2.5.2.1 Equipos
HPLC con detector de fluorescencia (Agilent 1200, US)
Generador de nitrógeno (Domnick Hunter, US).
Sistema de extracción al vacío (Heidolph, Alemania)
Potenciómetro (Mettler Toledo, Suiza)
Centrífuga (Hettich, Alemania)
Homogeneizador horizontal (VWR, US)
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Purificador y destilador de agua (Barnstead, US)
Micropipeta (Brand, Alemania)
Micropipeta (Boeco, Alemania)
Baño ultrasónico (Branson, US)
2.5.2.2 Materiales e insumos
Papel filtro Whatman No. 1
Filtros de membrana de fluoruro de polivinildeno (PVDF) (0.45 µm x 13 mm)
Cartuchos para extracción de fase sólida de intercambio aniónico fuerte (SAX)
Cartuchos para extracción de fase sólida de inmunoafinidad (IAC) para
aflatoxinas B1, B2, G1 y G2
Material de vidrio
Papel aluminio
Microtubos
2.5.2.3 Reactivos y estándares
Fosfato de sodio dihidrogenado
Metanol (MeOH)
Acetonitrilo (MeCN)
Cloruro de sodio (NaCl)
Solución buffer de fosfato (PBS)
Hexano
Ácido trifluoroacético
Ácido ortofosfórico
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Ácido acético glacial (HAc)
Tetraborato de sodio
B-mercaptoetanol
Orto-phtaldehido
Estándares de extractos sólidos puros de aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1,
AFG2)
Estándares de extractos sólidos puros de fumonisinas (FB1, FB2)
2.5.3. Análisis de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2
Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 fueron determinadas a través de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa con detección por fluorescencia
siguiendo el método analítico estandarizado por el Laboratorio de Alimentos y
Nutrición, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Cuenca.
2.5.3.1. Preparación de la muestra
Extracción: en un una botella de vidrio tapa rosca se colocó 20 g. de maíz
finamente molido con 40 mL de una mezcla metanol/agua (80:20, v/v). Se
agitó vigorosamente por un minuto y se adicionó 2 g. de NaCl. Agitamos
nuevamente por un minuto. Seguidamente, la mezcla se colocó en el agitador
horizontal por 10 minutos a 300 rpm. Una vez transcurrido el tiempo, se filtró
la mezcla (papel filtro Whatman No.1) y el filtrado fue centrifugado por 10
minutos a 5000 rpm.
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Dilución: Se tomó 5mL del sobrenadante y se añadió 25mL de PBS (pH de
7.4).
Lavado (clean-up): la muestra diluida fue purificada por medio de cartuchos
de inmunoafinidad (IAC), los cuales fueron previamente lavados con 1 mL de
PBS. A continuación se hizo pasar el extracto diluido a través del cartucho a
una velocidad de flujo de 2-3 mL/min. Se realizó un lavado posterior con 10
mL PBS seguido de 10 mL de H2O a una velocidad de flujo de 5 mL/min. Se
aplicó una ligera corriente de vacío en el cartucho (10 segundos). Finalmente
las aflatoxinas fueron eluídas del cartucho con 1 mL de metanol en 2 pasos
de 0.5 mL cada uno dejando en contacto el metanol con el cartucho por 1
minuto antes de la elución. Finalmente, se hizo pasar por el cartucho 0.5 mL
de H2O que se recolectaron conjuntamente con el eluido. El extracto final (1.5
mL) fue evaporado a sequedad bajo una corriente de nitrógeno.
Derivatización: El extracto puro y seco fue redisuelto con 200 µL de hexano y
se añadió 50 µL de ácido trifluoroacético (TFA). La mezcla fue
homogeneizada usando un vortex por 30 segundos. Finalmente el extracto
derivatizado fue evaporado a sequedad bajo una corriente de nitrógeno.
2.5.3.2. Análisis por HPLC
Para el análisis de aflatoxinas, el residuo seco fue reconstituido con 1000 µL de una
mezcla MeCN/H2O (1:1, v/v) y homogeneizado en un baño ultrasónico a 30°C por 10
minutos. El extracto reconstituido fue filtrado (0.45 µm) y colocado en un vial de
HPLC. Finalmente, un volumen de 5 µL fue inyectado en el HPLC. La separación
cromatográfica se realizó en una columna ZORBAX Eclipse Plus C18 (250 mm x 4.6
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 31
mm x 5 µm tamaño de poro). La temperatura de la columna para el análisis fue 40
°C. La separación se consiguió con una elución de tipo gradiente a una velocidad de
flujo de 1,2 mL min-1 usando las siguientes fases móviles: A. mezcla de
H2O/MeOH/HAc (89:10:1, v/v/v); B. MeOH y C. MeCN (tabla 2.1). Las aflatoxinas
fueron detectadas a una longitud de onda de 365 nm de excitación y 455 nm de
emisión para AFG2 y AFB2 y 432 nm de emisión para AFG1 y AFB1. El análisis tuvo
una duración total de 18 minutos.
Tabla 2.1. Programa de elución tipo gradiente.
Solvente
Fase Móvil
A B C
Minutos
H2O/MeOH/HAc (89:10:1, v/v/v)
MeOH MeCN
0-1 59 % 25 % 16 %
1-10 14 % 70 % 16 %
10-13 14 % 70 % 16 %
13-13.5 59 % 25 % 16 %
18 59 % 25 % 16 %
El método estandarizado presenta las siguientes características analíticas:
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Tabla 2.2. Características del método analítico de aflatoxinas
Características del método analítico de aflatoxinas
AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
Límite de detección µg/kg 0,86 0,67 0,61 0,92
Límite de cuantificación µg/kg 1,72 1,34 1,23 1,84
Precisión intra-día
(repetibilidad) % CV 9 10 4 9
Precisión inter-día % CV 10 15 10 19
Rango lineal µg/kg 0,2 - 4 0,2 - 4 0,2 - 4 0,2 - 4
Linealidad (R2) - 0,989 0,9908 0,9947 0,9881
Recuperación (recovery) % 75 31 67 43
2.5.4 Análisis de fumonisinas B1 y B2
Las fumonisinas B1 y B2 presentes en el maíz fueron determinadas mediante
cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con detección por
fluorescencia siguiendo el método analítico optimizado por el Laboratorio de
Alimentos y Nutrición, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Cuenca.
2.5.4.1. Preparación de la muestra
Extracción: Las fumonisinas se extrajeron a partir de 20 g de la muestra de
maíz finamente molida con 50 mL de una mezcla metanol/agua (75:25, v/v)
en una de botella de vidrio de 100 mL. Se agitó vigorosamente por dos
minutos. Posteriormente, se colocó la muestra en un agitador horizontal por
10 minutos a 300 rpm. La suspensión se filtró a través de papel de filtro
Whatman No. 1 y fue sometida a centrifugación por 10 minutos a 4000 rpm. El
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pH del filtrado debía estar entre 5,8 y 6,5, caso contrario el pH fue ajustado
con NaOH 0.1M o HCl 0.1N.
Lavado: para limpiar la muestra se utilizaron cartuchos de intercambio
aniónicos fuerte (SAX) que fueron pre-lavadas con 5 mL de metanol y 5 mL
de metanol/agua (75:25, v/v). Se hizo pasar una alícuota de 10 mL del
extracto a través de los cartuchos SAX a una velocidad de flujo de 1 mL min-1.
A continuación se realizó un lavado posterior con 8 mL metanol/agua (75:25,
v/v) seguido de 3 mL de metanol a una velocidad de flujo de 5 mL/min. Se
aplicó una ligera corriente de vacío en el cartucho (10 segundos). Finalmente
las fumonisinas fueron eluídas muy lentamente (<1 mL min-1) con 10 mL de
metanol/ácido acético (99:1, v/v). El eluído fue recogido y evaporado a
sequedad bajo una corriente de nitrógeno.
Derivatización (in situ): El extracto seco se disolvió en 200 µL mL de metanol
y se añadió 200 µL del reactivo derivatizante OPA (disolver 0,02 g de orto-
ftaldehído en 0,5 mL de metanol, y añadir 2,5 mL de tetraborato de disodio
0,1 M y 25 µL de 2-mercaptoetanol). La solución se homogenizó por 30
segundos con un vortex y fue transferida inmediatamente en un vial para el
análisis por HPLC. La solución derivatizada fue inyectada en un lapso total de
2min 30 segundos.
2.5.4.2. Análisis por HPLC
Un total de 20 µL de muestra fue inyectado en el HPLC en fase inversa. La
separación cromatográfica se realizó en una columna ZORBAX Eclipse Plus C18
(150 mm x 4.6 mm y de 5 µm tamaño de poro). La temperatura de trabajo de la
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columna fue de 23°C. La separación se consiguió con una elución isocrática a una
velocidad de flujo de la fase móvil de 1 mL min-1. Se utilizó como fase móvil una
mezcla de metanol/ buffer de fostato (NaH2PO4.H2O) 0,1 M (75:25, v/v). El pH de la
fase móvil se ajustó con ácido ortofosfórico hasta un pH de 3,35. Las Fumonisinas
fueron detectadas por fluorescencia a longitudes de onda de 335 nm de excitación y
400 nm de emisión. El análisis tuvo una duración total de 18 minutos.
El método optimizado presenta las siguientes características analíticas:
Tabla 2.3. Características del método analítico para fumonisinas
Características del método analítico de fumonisinas
FB1 FB2
Límite de detección µg/kg 2,37 3,95
Límite de cuantificación µg/kg 4,73 7,90
Rango lineal µg/kg 12,5 -125 12,5 -125
Linealidad (R2) - 0,9878 0,9955
Recuperación (recovery) % 99 99
2.5.5. Curvas de calibración
2.5.5.1 Preparación de los estándares a partir de la solución madre
Se partió de una solución madre de 0.1 mg/mL de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, y
fumonisinas B1 y B2 respectivamente. Los estándares fueron reconstituidos con
acetonitrilo excepto para FB1 que se utilizó una mezcla de acetronitrilo/agua 1:1.
Para la curva de calibración de aflatoxinas se partió de una mezcla de estándares
secos de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 de 100 µL a 5000 ng/mL y se redisolvió con
1000 µL de acetonitrilo (dilución 1/10) obteniendo una solución estándar de 500
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ng/mL, de la cual se partió para realizar las siguientes diluciones: 75, 50, 40, 25,
20,15, 10, 7,5, 5,2,5,1,0,5 y 0,1 ng/mL (Tabla 2.4).
Para la curva de calibración de fumonisinas se partió de estándares secos de
fumonisinas B1 y B2 de 100 µL a 0.1 mg/mL, respectivamente. Se redisolvió cada
uno con 1000 µL de MeCN/H2O. Se realiza una mezcla 1:1 de los estándares (500
uL FB1 + 500 uL FB2) obteniendo una concentración final de 5000 ng/mL. A partir de
ésta concentración se realizó las siguientes diluciones (tabla 2.5).
Tabla 2.4. Preparación de soluciones estándares para aflatoxinas.
Concentración (ng/µL)
Stock
MeCN/H2O (1:1) 500 ng/mL
75
150
850
50 100 900
40 80 920
25 50 950
20 40 960
15 30 970
10 20 980
10 ng/mL
7,5 750 250
50 ng/mL
5 100 900
5 ng/mL
2,5 500 500
1 200 800
0,5 100 900
1 ng/mL
0,1 100 900
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Tabla 2.5. Preparación de soluciones estándares para fumonisinas.
Concentración (ng/µL)
Stock
Metanol:H2O (1:1) (5000 ng/mL)
1000 (500)*
200
800
600 (300) 120 880
300 (150) 60 930
160 (80) 32 968
100 (50) 20 980
160 ng/mL
80 (40) 500 500
80 ng/mL
40 (20) 500 500
30 (15) 375 625
20 (10) 250 750
15 (7.5) 187,5 812,5
10 (5) 125 875
5 (2,5) 62,5 937,5
20 ng/mL
2,5 (1,25) 125 875
Nota: * significa que la concentración entre paréntesis corresponde a la concentración final del estándar considerando la dilución final (1:1) con el reactivo derivatizante OPA.
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2.6. ANÁLISIS DE DATOS
El cálculo del nivel de contaminación de aflatoxinas y fumonisinas se hizo siguiendo
la siguiente ecuación:
C (ng/g) =C1(ng/mL)
g (g/mL)
donde C1 = concentración de micotoxina presente en la alícuota inyectada; g =
gramos de muestra por mililitro en la inyección.
Los gramos por mililitro al momento de la inyección fueron 2,5 g para aflatoxinas y
10 g para fumonisinas, lo que deduce de los siguientes esquemas de extracción y
preparación de las muestras:
Aflatoxinas Fumonisinas
20g/40mL
2,5g/5 mL
2,5 g (seco)
2,5g/0,2 mL Hexano + 0,05 mL TFA (redisuelto y seco)
2,5g/1mL MeCN/H2O
(redisuelto)
2,5 g/mL
20g/50mL
4g/10 mL
4g (seco)
4g/0,2 mL MeOH + 0,2 mL OPA(redisuelto)
4g/0,4 mL
10g/mL
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Figura 2.2. Esquema de cálculo de gramos de muestra por mililitro al momento de la
inyección.
El análisis de los resultados incluyó estadística descriptiva para presentar las
características de la población de pequeños productores de maíz de Nabón y sus
prácticas agrícolas. Los resultados se presentaron con medidas de tendencia central
y con tablas de contingencia.
La evaluación de la eficiencia del proceso de pelado con ceniza como estrategia de
detoxificación de micotoxinas se llevó a cabo comparando el nivel de contaminación
antes y después del pelado tests de Student pareado de una cola (one side paired t-
test). Finalmente se evaluó la influencia de las prácticas agrícolas en el presencia
de micotoxinas en el grano de maíz sin pelar. Esta evaluación se realizó utilizando
regresiones logísticas bivariadas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con
un nivel de significancia del 5% (P<0.05).
Los datos de las encuestas fueron ingresados por duplicado en el programa EpiData
versión 3.1 y fueron analizados en el programa Stata versión 13.0.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. PROCEDENCIA DE LAS MUESTRAS DE MAÍZ
En total se analizaron 40 muestras de maíz seco sin pelar y 40 muestras de maíz
pelado con ceniza provistas por 40 pequeños productores de maíz del cantón Nabón
y sus alrededores (Tabla 3.1.)
Tabla 3.1. Procedencia de las muestras de maíz (n=40)
Parroquia de Nabón
% del número total
de muestras (n=40)
Yacudel
40
Progreso 12.5
Chayaurco 7.5
Buenavista 5
Nabón 5
Hermano Miguel 5
La Paz 2.5
La Ramada 2.5
Buravalle 2.5
Pucallpa 2.5
Rañas 2.5
Romerillo 2.5
Rosas 2.5
Tamboloma 2.5
Trancapata 2.5
Bellavista-Tamboloma 2.5
La mayoría de las muestras de maíz provinieron de la parroquia de Yacudel
(40%), seguida de El progreso (12.5%). Esto se debió a que en Yacudel y El
Progreso se practica el monocultivo del maíz. En estas parroquias se alcanza
un promedio de 20°C, a diferencia de otras parroquias (Nabón centro,
Cochapata, etc.) en donde se alcanzan temperaturas de 10°C como máximo.
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La temperatura en dichos lugares es considerada como óptima para el cultivo
de maíz (Gobierno-Autonomo-Desentralizado-Municipal-Nabon, 2012; Nabón,
2012). Además, la colaboración por parte del dirigente de la comunidad de
Yacudel fue mucho mayor en comparación a otras, lo que hizo mucho más
sencillo brindar la información necesaria a los agricultores, y por ende, su
participación en este estudio.
3.2. PRÁCTICAS AGRÍCOLAS
Se recolectó información sobre las prácticas agrícolas relacionadas al cultivo del
maíz en las distintas parroquias del cantón Nabón de los mismos proveedores de las
muestras de maíz. La información recolectada hizo referencia particularmente al uso
de fertilizantes, tipo de fertilizantes, uso de pesticidas, periodo de siembra y
cosecha, tipo de maíz cultivado, prácticas de riego y secado, almacenamiento,
identificación del grano en mal estado y destino del grano dañado. Además, se
consultó sobre las preferencias de pelado de maíz. (Tabla 3.2)
Tabla 3.2. Prácticas Agrícolas relacionadas a la siembra del maíz en el cantón
Nabón (n=40)
Variable
% prevalencia (n=40)
Uso de fertilizante
Si
90
Tipo de fertilizante Orgánico natural 91.7
Orgánico artificial 5.6
Orgánico natural y artificial 2.8
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Variable
% prevalencia (n=40)
Mes de siembra
Octubre-diciembre
82.5
Julio-sept
Enero-marzo
10
7.5
Mes de cosecha Julio-septiembre 80
Abril-junio 20
Tipo de maíz
Zhima
92.5
Amarillo 5
Maíz morocho 2.5
Tipo de riego
Agua lluvia
Aspersión
Riego canal por vertiente
Agua por tubería del cerro
70
17.5
5
2.5
Agua de vertedero 2.5
Lluvia de agua de aspersión 2.5
Tipo de secado
Desgranado esteras al sol
Desgranado en esteras bajo techo
Mazorcas en esteras directo al sol
Mazorca esteras bajo techo
47.5
22.5
17.5
5
Mazorca y desgranado abiertos bajo techo 2.5
Desgranado en carpa directo al sol 2.5
Desgranado en saquillos al sol 2.5
Tipo de
almacenamiento
Sacos
35
Tanques de plástico
Tanque de lata
32.5
20
Sacos y tanques de plástico 7.5
Tanque de acero inoxidable 2.5
Se mantiene colgado 2.5
Tiempo de
almacenamiento
6-12 meses
0-6 meses
60
32.5
Más de 12 meses 5
Mal estado del
grano
Granos rotos
2.5
Granos podridos 22.5
Presencia de insectos 60
Granos podridos y presencia de insectos 5
Presencia de insectos y moho 5
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Variable
% prevalencia (n=40)
No se altera 5
Destino de los
granos dañados
Alimento para animales
80
Se desecha 15
Se tuesta y se come 2.5
Pelado de maíz
Con ceniza
15
Con cal 77.5
Con ceniza y cal 7.5
3.3. CARACTERIZACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DEL PROCESO TRADICIONAL
DEL PELADO DE MAÍZ CON CENIZA
La información sobre el proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza en las
distintas comunidades del cantón Nabón también fue recolectada mediante dos
encuestas aplicadas durante la primera toma de muestra (maíz sin pelar) y durante
la segunda toma (maíz pelado). Cabe indicar que a pesar de que solo un 15% de la
población practicaba el pelado con ceniza, para este estudio se solicitó hacerlo de la
manera tradicional, por lo tanto en la segunda toma de muestra todos los
participantes proveyeron la información exacta del proceso. La información
recolectada de los distintos participantes se muestra en la Tabla 3.3.
Tabla 3.3. Caracterización del pelado de maíz con ceniza (n=40)
Variable
% prevalencia (n=40)
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Variable
% prevalencia (n=40)
Remojo del maíz antes
del pelado
Si
No
25
75
Ceniza
Leña de monte
Leña de penco y monte
Leña de tusa y monte
90
5
5
Tipo de olla
Aluminio
Barro
Paila de cobre
Barro y aluminio
Paila de bronce
50
28
15
2.5
2.5
Tipo de calentamiento
Leña
Gas
Leña y Gas
95
2,5
2,5
Orden de adición de los
ingredientes
1) agua en ebullición; 2) ceniza más maíz
49
1) agua caliente; 2) ceniza más maíz 18
Otros 33
Cantidad de
ingredientes
Maíz (gramos)
Agua (litros)
Ceniza (gramos)
2500
4,8
1452
Tipo de mezcla
Movimiento constante
92
Tiempo de cocción
Ausencia de movimiento
<0,5 hora
0,5-1 hora
>1 hora
8
36
43
21
Tipo de remoción de la
cáscara
Lavado y pelado de maíz
Otros
87
13
Remojo posterior al
pelado
Si
51
Tiempo de Remojo
(n=20)
12h 75
Secado posterior al
pelado
Si
No (consumo inmediato)
64
36
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Variable
% prevalencia (n=40)
Tiempo de secado
(n=25)
48-72h
42
La caracterización del proceso tradicional de pelado de maíz con ceniza podría
resumirse con las siguientes observaciones:
(i) la mayoría de las personas no realizan un remojo del grano antes de
pelarlo (75%)
(ii) la obtención de ceniza para el pelado se realiza en su mayoría a partir de
leña del monte (90%)
(iii) la cocción del grano tiene lugar usando ollas de aluminio (50%) y la
principal fuente de calentamiento usada es la leña (95%)
(iv) Durante la cocción, la mayoría de los participantes remueven
constantemente la mezcla (92%) por un período de 0.5-1hora (43%)
(v) Para la remoción de la cáscara, un 87% de los encuestados describió que
el lavado y pelado de maíz es simultáneo y manual (refregado con los
dedos).
(vi) Después del pelado, la mayoría de los participantes no consumía el maíz
inmediatamente (64%) sino que prefieren realizar un remojo de los granos
pelados (51%) por el lapso de 12 horas (75%) antes de su cocción
posterior.
(vii) En el caso de que el maíz no se consuma luego del remojo posterior, se
suelen secar los granos pelados (64%) por un período de 48-72 horas
(42%).
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(viii) Con respecto a los ingredientes: a) se coloca el maíz y la ceniza
simultáneamente en agua en ebullición (49%); y b) las cantidades
promedio de ceniza y agua por cada 2500 gramos de maíz son 1500
gramos y 4.8 litros respectivamente.
Para la estandarización del proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza se
partió de los datos presentados en la caracterización, los cuales fueron muy
variables y de selección compleja. Los pasos seleccionados fueron aquellos que se
repetían en más de un 50%, con excepción de: orden de adición de los ingredientes
(49%), tiempo de cocción (43%) y tiempo de secado (42%).
El proceso estandarizado se presenta en la tabla 3.4.
Tabla 3.4. Estandarización del proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza
Estandarización del proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza
Remojo del maíz antes del pelado
No
Ceniza Leña de monte
Tipo de olla Aluminio
Tipo de calentamiento Leña
Orden de adición de los ingredientes 1) Agua en ebullición
2) Ceniza más maíz
Cantidad de ingredientes 1 galón de maíz (2.500 g)
1,5 galón de agua (4.8 L)
0,6 galón de ceniza (1.450 g)
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Estandarización del proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza
Tipo de mezcla Movimiento constante
Tiempo de cocción 0,5-1 hora
Tipo de remoción de la cáscara Lavado y pelado de maíz
Remojo posterior al pelado Si
Tiempo de Remojo 12h
Secado posterior al pelado Si
Tiempo de secado 48-72h
El proceso tradicional de pelado de maíz con ceniza estandarizado en este estudio
difiere en algunos pasos con otro proceso ecuatoriano referido como “proceso
convencional de nixtamalización ecuatoriano” (Tosi Vélez, 2012). Según este
proceso convencional, para la remoción del pericarpio se utiliza agua 2:1 en relación
a la cantidad de maíz, 1% de cal y 1% de ceniza. Los granos de maíz se calientan
en el agua alcalinizada hasta que ésta hierva y se deja en reposo la mezcla durante
8 horas. Luego de transcurrido éste tiempo, se realiza la prueba de desprendimiento
del pericarpio, tomando un grano y frotándolo con los dedos hasta que se desprenda
con facilidad. Finalmente se desecha el agua residual y se lavan los granos 2 o 3
veces para remover la cáscara y los residuos de cal y ceniza.
Con lo que respecta a los ingredientes, para la remoción del pericarpio, en el
proceso tradicional de pelado de maíz estandarido se usa únicamente ceniza,
mientras que el proceso convencional usa una mezcla de cal y ceniza. Además, las
cantidades de agua y maíz usadas en ambos procesos son similares; pero con
respecto a la ceniza, el proceso convencional usa un 1% de cal y 1% de ceniza en
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relación al peso del maíz (25g de cal y 25g de ceniza / 2500g de maíz); mientras que
el proceso tradicional usa una elevada cantidad de ceniza (1450g de ceniza / 2500g
de maíz). Por lo tanto, a pesar de que el proceso tradicional permite la remoción del
pericarpio, es menos eficiente que el proceso convencional ya que requiere el uso
de más material (ceniza) para la obtención de buenos resultados.
En el proceso tradicional de pelado con ceniza, la cocción tiene lugar en olla de
aluminio con un movimiento constante, mientras que en el proceso convencional se
usa principalmente una olla de barro sin realizar movimiento alguno. El tiempo de
cocción en el proceso convencional es menor (0,3 a 0,6 horas) en comparación al
tradicional (0,5 a 1 hora).
Finalmente, el proceso convencional realiza un remojo del maíz durante 8 horas en
el agua de cocción para la posterior remoción de la cáscara a través del lavado,
mientras que en el proceso tradicional se desecha el líquido de cocción e
inmediatamente se procede a la remoción de la cáscara con agua adicional. Sin
embargo, la mitad de los participantes (51%) refirieron realizan un remojo de los
granos de maíz pelado (12h) luego de desechar el líquido de cocción.
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3.4 CONTAMINACIÓN DEL MAÍZ CON MICOTOXINAS
El grado de contaminación con aflatoxinas y fumonisinas se evaluaron en 40
muestras de maíz seco sin pelar y 40 muestras de maíz pelado con ceniza,
provenientes del mismo lote.
3.4.1. Análisis de aflatoxinas
Las tasas de contaminación, media, SD y todos los rangos de aflatoxinas en las
muestras de maíz analizadas se presentan en la tabla 3.5.
Tabla 3.5. Prevalencia de muestras positivas y niveles de aflatoxinas en muestras
de maíz seco sin pelar y pelado.
Maíz seco sin pelar (n=40)
Aflatoxinas Positivas/Total LOD-LOQ >LOQ Media (µg/kg) SD Min-Max (µg/kg)
AFG2 1/40 1/40 - - - -
AFG1 5/40 4/40 1/40 - - 0,50 a
AFB2 7/40 5/40 2/40 0,6 0,2 0,50 – 0,77
AFB1 3/40 3/40 - - - -
Maíz seco pelado con ceniza (n=38)
AFG2
0/38
-
-
-
-
-
AFG1 4/38 4/38 - - - -
AFB2 0/38 - - - - -
AFB1 0/38 - - - - -
Nota: a Valor único.
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 49
El 38% de las muestras de maíz seco sin pelar (n=15) estuvo contaminada con al
menos con un tipo de aflatoxina.
En general, los resultados obtenidos de aflatoxinas totales (AFB1, AFG1, AFB2, y
AFG2) no exceden los niveles máximos establecidos para el consumo humano en
Latinoamérica y en Ecuador (20 ug/kg) (INEN, 1995). De igual manera, los
resultados no superan los límites establecidos según las normas europeas para
aflatoxinas totales (4ug/kg) ni para AFB1 (2ug/kg) (Bhat et al., 2010; Brase et al.,
2009).
El 11% de las muestras de maíz pelado (n=4) estuvo contaminada solamente con
AFG1 a niveles que no excedieron a los límites máximos establecidos para el
consumo humano.
La aflatoxinas de mayor prevalencia fueron AFB2 (17,5%) seguida de AFG1 (12,5%),
AFB1 (7,5%) y AFG2 (2,5%). Estos resultados fueron menores a los encontrados en
algunos estudios reportados en Latinoamérica, sobre todo en aquellos países con
clima tropical y subtropical que favorece el desarrollo de Aspergillus en el maíz
(Brase et al., 2009; FAO., 2009). Por ejemplo, se ha reportado que muestras de
maíz de Monterrey y Sonara (México) estuvieron contaminadas en un 89% con AFG1
y en un 20% con AFB1; de las cuales, 59% y 1% de las muestras contaminadas
excedían los límites permitidos para aflatoxinas (García & Heredia, 2006). En un
estudio colombiano se observó que el 12,5% de muestras de maíz estuvo
contaminada por AFB1 en niveles entre 2,4 y 12,5 µg/kg, 8,3% con AFB2 en niveles
inferiores a 2 µg/kg; mientras que no se detectaron aflatoxinas G1 y G2. El valor
medio de aflatoxinas totales fue de 9,2 µg/kg, sin superar el límite máximo aceptado
en la mayoría de países (Morris Navarro, 2011).
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 50
En lo que se refiere a Ecuador, existe poca información sobre niveles de
contaminación de aflatoxinas en maíz, sin embargo un estudio realizado en la costa
y sierra ecuatoriana, ha demostrado que las concentraciones de aflatoxinas en las
muestras provenientes de la región costa son relativamente más altas que en la
sierra, siendo aflatoxinas B1 y G1 las de mayor prevalencia. Solo una muestra
analizada presentó una concentración de 8,6 μg/Kg de AFB1, excediendo el límite
permitido en la Unión Europea, pero no el límite dado por la normativa ecuatoriana ni
los valores establecidos por la FDA (Sandoval Cañas, 2013).
3.4.2. Análisis de fumonisinas
Los niveles de contaminación, media, SD y todos los rangos de fumonisinas en las
muestras de maíz analizadas se presentan en la tabla 3.6.
Tabla 3.6. Prevalencia de muestras positivas y niveles de fumonisinas en muestras
de maíz seco sin pelar y pelado.
Maíz seco sin pelar (n=40)
Fumonisinas Positivas/Total LOD-LOQ >LOQ Media (µg/kg) SD Min-Max (µg/kg)
FB1 17/40 1/40 16/40 6,05 8,3 0,66 – 34,65
FB2 14/40 2/40 12/40 1,60 0,6 0,87 – 2,93
Maíz seco pelado con ceniza (n=38)
FB1 7/38 1/38 6/38 3,73 3,9 0,8 – 10,98
FB2 3/38 1/38 2/38 3,08 2,2 0,53 – 4,63
De las 40 muestras de maíz seco sin pelar, el 42,5% de las muestras (n=17) estuvo
contaminado al menos con FB1. Los niveles de fumonisinas B1 y B2 no excedieron los
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 51
límites máximos establecidos por la FDA o la Unión Europea para el consumo
humano.
Con respecto al maíz pelado, el 20% de las muestras (n=8) estuvo contaminado con
al menos FB1. Los niveles de fumonisinas FB1 y FB2 fueron menores a los del maíz
sin pelar y no excedieron los límites máximos establecidos por la FDA o la Unión
Europea para el consumo humano.
La fumonisina B1 fue la de mayor prevalencia tanto para maíz seco sin pelar (42,5%)
como pelado (7,9%) y una concentración promedio de 6,1 µg/kg y 3,7 µg/kg
respectivamente. Estos resultados fueron muy inferiores a lo reportado en otros
estudios Latinoamericanos. En uno de ellos ser reporta que todas las muestras
analizadas en 20 localidades del estado mexicano resultaron positivas para FB1 con
concentraciones entre 6,6 y 269 µg/kg (García & Heredia, 2006). En otro estudio
realizado en Argentina se reporta que del 90- 100% de muestras de grano de maíz
(n=3246) recolectadas en diferentes regiones de Argentina estaban contaminadas
con fumonisinas con niveles promedios (suma de FB1, FB2) de entre 1773 a 9093
μg/kg (Martinez & Moschini, 2012).
A nivel nacional no existe información sobre niveles de contaminación de maíz con
fumonisinas, pero los resultados obtenidos en éste proyecto se podría relacionar con
un estudio realizado en la parroquia San Juan – Gualaceo donde la flora micológica
con segunda mayor prevalencia en el maíz fue el género Fusarium (26%) que es
género productor de fumonisinas B1 y B2. Además, en este estudio se demostró que
el desarrollo de éste género en granos de maíz estaba relacionado
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María José Molina Cando María Cristina Ochoa Avilés Página 52
significativamente a factores climáticos como la temperatura y humedad relativa
(Pérez Culcay & Zárate Ochoa, 2013). Otros factores relacionados con el desarrollo
de este género fúngico en el maíz y que causan estrés en la planta tales son daños
por insectos o falta de nutrientes en el suelo (Magan & Olsen, 2004; Martinez &
Moschini, 2012).
3.5 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE PELADO DE MAÍZ CON CENIZA COMO
ESTRATEGIA DE DETOXIFICACIÓN
Las diferencias en el grado de contaminación entre maíz pelado y sin pelar sugieren
una reducción considerable de la contaminación de aflatoxinas y fumonisinas
después del proceso de pelado con ceniza. Para verificar esta reducción se aplicó la
prueba estadística T de Student pareada, obteniendo una diferencia significativa
entre los niveles de contaminación antes y después del pelado para AFB2 (P<0,001),
AFB1 (P=0,004), FB2 (P=0,023) y FB1 (P=0,033).
En otros estudios se ha descrito la efectividad de la nixtamalización (proceso similar
al pelado con ceniza) como técnica de detoxificación para aflatoxinas y fumonisinas
(De La Campa et al., 2004; Magan & Olsen, 2004; Pappa et al., 2010). Aunque no
existen datos acerca de la efectividad del pelado de maíz con ceniza, su similitud
con la nixtamalización (cocción alcalina) sugiere que la tasa de reducción podría ser
similar en ambos procesos.
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3.6 INFLUENCIA DE LAS PRÁCTICAS AGRÍCOLAS EN LA CONTAMINACIÓN
Para la evaluación de la influencia de las prácticas agrícolas en la contaminación del
maíz por aflatoxinas y fumonisinas se realizaron regresiones logísticas con cada una
de las prácticas agrícolas y la presencia de contaminación por aflatoxinas y
fumonisinas antes del pelado con ceniza. Se observó que cultivar en los lugares más
cálidos en Nabón resultó ser un factor protector para FB2 (OR=0,147; IC: 0,03-0,62;
P=0,010). Esto se contrapone al hecho que a mayor temperatura y humedad
relativa, mayor es la incidencia del desarrollo de Fusarium y subsecuente producción
de fumonisinas (De la Campa, Hooker, Miller, Schaafsma, & Hammond, 2005). Sin
embargo, en este estudio los lugares con mayor temperatura (Yacudel, El progreso)
fueron aquellos en donde se practica el monocultivo del maíz pues la temperatura
de dichas zonas es la más óptima para el cultivo. Este efecto protector podría
deberse a que en los lugares donde se siembra el maíz como monocultivo suelen
recibir apoyo (socializaciones, charlas sobre buenas prácticas agrícolas, etc.) por
parte de las autoridades del cantón Nabón. Por otro lado, se observó que el riego
con agua lluvia fue también un factor protector para la contaminación con FB2
(0,111; IC: 0,01-0,66; P=0,016). Elevados niveles de fumonisinas han sido
observados en lugares con clima cálido y seco, pero niveles bajos de la misma se
han observado en lugares cálidos con abundantes lluvias durante el cultivo(De la
Campa et al., 2005). Por otro lado, existen estudios que indican que el cultivo de
maíz bajo riego aumenta la incidencia de producción de aflatoxinas y fumonisinas,
ya que podrían desarrollarse condiciones predisponentes para la contaminación
(Chavarri et al., 2009).
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En general, el cultivo de maíz países tropicales está recomendado en los meses de
mayo a septiembre debido a una disponibilidad adecuada del agua de riego (agua
lluvia) (Chavarri et al., 2009). Sin embargo, más estudios son necesarios para
comprobar que el uso de agua lluvia como mecanismo de riego reduce el riesgo de
contaminación para FB2 y si está directamente relacionada con el tipo de clima de la
zona.
Con respecto a aflatoxinas, se observó que el mes de cosecha en el periodo seco
(julio a septiembre) actúa como un factor protector que disminuye el riesgo de
producción de AFB2 (OR= 0,128; IC: 0,02-0,79; P=0,027) y AFG1 (OR; 0,087; IC:
0,008-0,87; P=0,039). Éste comportamiento podría deberse a que en dichos meses
en la mayoría de países tropicales se llega a una temporada de sequía y al realizar
la cosecha se podría evitar que la planta sufra de estrés y sea más propensa a la
contaminación. Además una de las ventajas de realizar cultivos en países tropicales
con respecto a aquellos que tienen cuatro estaciones es que es posible cultivar
prácticamente durante todo el año obteniendo casi siempre buenos resultados
(Chavarri et al., 2009). Es necesaria la realización de más estudios que permitan
confirmar éstos resultados y evaluar una posible relación con otras prácticas
agrícolas realizadas en la zona.
En lo que se refiere a AFB1, AFG2 y FB1, no se observaron relaciones
estadísiticamente significativas entre las prácticas agrícolas y el grado de
contaminación. Sin embargo, estudios adicionales podrían reflejar interacciones
entre las diferentes prácticas que favorezcan la producción de dichas toxinas en
maíz.
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4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. CONCLUSIONES
El presente trabajo de tesis constituye la primera etapa del proyecto de investigación
“Assessment of the traditional wood ash nixtamalization as detoxification strategy to
reduce Fumonisin and Aflatoxin contamination of boiled maize ("mote pelado"),
Nabon-Ecuador” financiado por la Fundación Internacional de Ciencia (IFS). El
objetivo final de este proceso es la optimización del proceso de pelado con ceniza
como método de detoxificación de micotoxinas, la evaluación sensorial del producto
final y la diseminación del proceso en las comunidades rurales del cantón azuayo
Nabón.
En el presente trabajo de tesis se reporta la caracterización y estandarización del
proceso tradicional del pelado de maíz con ceniza, lo que incluyó la estandarización
de las cantidades de agua y ceniza necesarios para pelar una cantidad determinada
de maíz, así como también los pasos a seguir para el pelado de manera tradicional.
En el presente trabajo de tesis también se evaluó la capacidad de este proceso de
pelado para reducir micotoxinas en el maíz. Los resultados demostraron una
diferencia significativa entre los niveles de contaminación antes y después del
pelado particularmente para AFB2 (P<0,001), AFB1 (P=0,004), FB2 (P=0,023) y FB1
(P=0,033). Además se observó que algunas prácticas agrícolas resultaron como
factores protectores de la contaminación AFG1 (cosecha en periodo seco), AFB2
(cosecha en periodo seco) y FB2 (clima cálido y riego con agua de lluvia).
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4.2 RECOMENDACIONES
Los resultados obtenidos demostraron que el proceso pelado de maíz con ceniza
podría ser considerado como una estrategia de detoxificación para aflatoxinas y
fumonisinas, sin embargo, es necesario realizar más estudios que permitan
optimizar el método para así garantizar una máxima reducción de las toxinas.
Por otro lado en lo que se refiere a las prácticas agrícolas, serían necesarios más
estudios en un mayor número de muestras, lo que permitirá reflejar de mejor manera
la influencia de las prácticas agrícolas y la interacción entre las mismas en la
producción de toxinas en maíz.
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ANEXOS
ANEXO 1. Lista de los participantes y fecha de recolección de las muestras
ID Dirección (parroquia/ comunidad) Muestra 1 Muestra 2
01 La ramada 04/09/14 10/09/14
02 Buravalle 04/09/14 10/09/14
03 Romerillo- Buravalle 04/09/14 10/09/14
04 Chayaurco 04/09/14 10/09/14
05 Tamboloma 04/09/14 10/09/14
06 Nabón Centro 04/09/14 10/09/14
07 La Paz 04/09/14 10/09/14
08 Pucallpa 04/09/14 10/09/14
09 Chayaurco 04/09/14 10/09/14
10 Chayaurco 04/09/14 10/09/14
11 Progreso 10/09/14 23/09/14
12 Buena vista (Progreso) 10/09/14 23/09/14
13 Yacudel 10/09/14 23/09/14
14 Yacudel 10/09/14 23/09/14
15 Yacudel 10/09/14 23/09/14
16 Yacudel 10/09/14 23/09/14
17 Yacudel 10/09/14 23/09/14
18 Progreso Centro 10/09/14 23/09/14
19 Yacudel 10/09/14 23/09/14
20 Yacudel centro 10/09/14 23/09/14
21 Buena vista (Progreso) 10/09/14 23/09/14
22 Progreso Centro 10/09/14 23/09/14
23 Progreso Centro 10/09/14 23/09/14
24 Progreso 10/09/14 23/09/14
25 Bellavista 10/09/14 23/09/14
26 Rañas 10/09/14 23/09/14
27 Yacudel 23/09/14 23/09/14
28 Yacudel 23/09/14 23/09/14
29 Yacudel 23/09/14 23/09/14
30 Yacudel 23/09/14 23/09/14
31 Yacudel Centro 23/09/14 23/09/14
32 Yacudel Centro 23/09/14 23/09/14
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ID Dirección (parroquia/ comunidad) Muestra 1 Muestra 2
33 Yacudel Centro 23/09/14 23/09/14
34 Yacudel Centro 23/09/14 23/09/14
35 Yacudel Centro 23/09/14
36 Bellavista 24/09/14 24/09/14
37 Rosas 24/09/14 24/09/14
38 Hermano Miguel 24/09/14
39 Hermano Miguel 24/09/14 24/09/14
40 Trancapata 01/10/14 01/10/14
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ANEXO 2. Consentimiento Informado
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Título de la investigación: Evaluación del pelado tradicional con ceniza como estrategia de descontaminación de micotoxinas (fumonisinas y aflatoxinas) en el mote pelado, Nabón-Ecuador. Introducción Usted ha sido invitado a participar en el presente estudio. Este formulario incluye un resumen de la información que los investigadores analizarán con usted. Si usted decide participar en el estudio recibirá una copia de este formulario. Objetivo El estudio se realiza para evaluar si el proceso tradicional de pelado de maíz con ceniza puede ser usado como estrategia de descontaminación de toxinas producidas por hongos del ambiente (micotoxinas). Actividades del estudio
La ejecución de este proyecto está prevista para un periodo de 2 años. Año 1: Se aplicarán dos encuestas previamente diseñadas y debidamente probadas: 1. La encuesta 1 incluye preguntas sobre las prácticas agrícolas del maíz y el procedimiento de
pelado de maíz con ceniza. Esta encuesta se aplicará durante la recolección de la muestra de maíz pelado seco.
2. La encuesta 2 incluye preguntas sobre las preferencias de consumo del maíz y forma de cocción del maíz pelado. Esta encuesta será aplicada durante la recolección de la muestra de maíz cocido.
En las muestras de maíz recolectadas se analizará la presencia micotoxinas en el Laboratorio de Alimentos y Nutrición, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Cuenca.
Año 2: Se propondrán algunas modificaciones físicas al proceso tradicional de pelado de maíz con ceniza para aumentar su capacidad de descontaminación de micotoxinas. Se realizarán pruebas de aceptabilidad sensorial del maíz cocido utilizando el proceso modificado de pelado con ceniza, para lo cual se ofrecerán a los participantes de muestras de maíz cocido de inocuidad comprobada (libre de micotoxinas) para su degustación. Finalmente se difundirá a la comunidad el proceso de pelado con ceniza más eficaz para la decontaminación de micotoxinas y que haya sido aceptado desde el punto de vista sensorial. Participantes Este estudio prevé la participación de un total de 30 a 45 familias provenientes de todas las comunidades del cantón Nabón. Los participantes serán los mismos que accedan a proporcionar las muestras de maíz que serán remuneradas. El jefe de familia responderá las preguntas de las encuestas. Cualquier miembro de la familia puede participar en las pruebas sensoriales.
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Costos de participación No se debe pagar por la participación en este estudio. Por proporcionar las muestras de maíz, el participante recibirá por parte de los investigadores un pago total de $30.00 que incluye un lote de 10 kilos de maíz y los costos de mano de obra por el pelado y cocción del maíz. Dicho lote será entregado en 3 partes: 1) maíz crudo seco (4 kilos), 2) maíz seco luego de ser pelado con ceniza (3 kilos), y 3) maíz pelado cocido (3 kilos). El 50% del pago será al inicio del estudio y el 50% restante a la entrega de la última muestra de maíz. Aparte del pago de las muestras de maíz, no habrá retribución monetaria por la participación en el estudio. Beneficios Los beneficios de este estudio están dirigidos a las comunidades productores y consumidoras de maíz del cantón Nabón. Si se demuestra una alta efectividad del proceso de pelado estudiado, los resultados se pueden difundir a otras zonas rurales y urbanas del país como estrategia para fomentar la inocuidad del maíz. Riesgos El estudio no representa un riesgo para el participante. Confidencialidad Ninguna persona fuera del proyecto tendrá acceso a la información obtenida del participante. La información tendrá un código para proteger su privacidad. Si alguno de los resultados en este estudio es publicado no se incluirán los nombres de los participantes. Derechos La participación en este estudio es voluntaria. El participante no perderá nada si decide no formar parte del estudio. Sin embargo, si decide participar del estudio desde el principio, el participante se compromete a proporcionar el lote de 10 kilos de maíz distribuidos en 3 partes. Luego de la entrega del lote total de muestra de maíz, el participante puede retirarse del estudio si lo desea, lo que deberá notificado a la persona que esté a cargo del estudio. No habrá sanciones ni pérdida de beneficios si usted decide no participar de las pruebas sensoriales (segunda parte del estudio). Preguntas o problemas Si el participante tiene alguna pregunta acerca de este estudio se puede contactar con la Dra. Johana Ortiz, investigadora principal del proyecto, al teléfono de la Universidad de Cuenca (07) 4051000 Ext. 4124, celular 0995341151 o por correo electrónico [email protected]. Consentimiento informado: Comprendo mi participación y los riesgos y beneficios de participar en este estudio. He tenido el tiempo suficiente para revisarlo y el lenguaje del consentimiento fue claro y comprensible. Todas mis preguntas como participante fueron contestadas. Me han entregado una copia de este formulario de consentimiento informado. Acepto voluntariamente participar en este estudio de investigación.
_______________________________________________________ _______________ Nombre y Firma del participante Fecha
_______________________________________________________ _______________ Nombre y Firma del investigador que obtiene el consentimiento Fecha
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ANEXO 3. Encuesta sobre prácticas agrícolas del maíz.
ENCUESTA SOBRE PRÁCTICAS AGRÍCOLAS DEL MAÍZ
Proyecto Evaluación del pelado tradicional con ceniza como estrategia de descontaminación de micotoxinas (fumonisinas y aflatoxinas) en el mote pelado, Nabón-Ecuador ”
Número de registro
Fecha de la encuesta (dd/mm/aa) ___/___/___
DATOS GENERALES:
Nombre del cultivador:
Dirección:
Teléfono:
PRÁCTICAS AGRÍCOLAS:
1. ¿Usted usa fertilizantes?
1. Si
2. No Ir a pregunta # 3
9. No Sabe Ir a pregunta # 3
2. ¿Qué fertilizante usa (principal)?
1. Abono de gallina
2. Abono de cuy
3. Abono de chancho
4. Úrea
5. Otro (especifique)
9. No Sabe
3. ¿Usted usa pesticidas?
1. Si
2. No Ir a pregunta # 5
9. No Sabe Ir a pregunta # 5
4. ¿Qué pesticida usa (principal)?
Especifique: 9. No Sabe
5. ¿En qué mes siembra el maíz?
Especifique: 9. No Sabe
6. ¿En qué mes cosecha el maíz?
Especifique: 9. No Sabe
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7. ¿Qué tipo de maíz siembra? Especifique:
9. No Sabe
8. ¿Cuál es el tipo de riego para el sembrío del maíz?
1. Agua lluvia
9. No Sabe
2. Otro (especifique)
9. ¿Cómo seca el maíz? 1. Mazorca, en esteras bajo techo 9. No Sabe
2. Mazorca, en esteras directo al sol
3. Desgranado, en esteras bajo techo
4. Desgranado, en esteras directo al sol
5. Otro (especifique)
10. ¿Cómo almacena el maíz?
1. Sacos
9. No Sabe
2. Esteras
3. Tanques plásticos
4. Otro (especifique)
11. ¿Cuánto tiempo almacena el maíz seco?
Especifique (meses):
9. No Sabe
12. ¿Cuando considera usted que el maíz está en mal estado?
1. Granos rotos
2. Granos podridos
3. Presencia de insectos
4. Presencia de moho
9. No Sabe
5. Otro (especifique)
13. ¿Qué hace usted cuando el grano está dañado?
1. Alimento de animales
9. No Sabe
2. Se desecha
3. Se usa como abono
4. Se muele
5. Se limpia y come
6. Otro (especifique)
14.
¿Cómo Ud. suele pelar el maíz?
1. Con cal
9. No Sabe
2. Con ceniza
3. Otro (especifique)
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PELADO DEL MAÍZ CON CENIZA
15. ¿Remoja el maíz antes de pelarlo?
1. Si
2. No Ir a pregunta # 17
9. No Sabe Ir a pregunta # 17
16. ¿Cuánto tiempo deja en en remojo el maíz antes de pelarlo?
Especifique:
9. No Sabe
17. ¿Cómo obtiene la ceniza para el pelado de maíz?
9. No Sabe
18. ¿Qué cantidad de ceniza utiliza para el pelado de maíz?
Especifique:
9. No Sabe
19.
¿Qué cantidad de agua utiliza para el pelado de maíz con esa cantidad de ceniza?
Especifique:
9. No Sabe
20. ¿Cómo realiza el pelado del grano de maíz?
Detallar el proceso completo, paso a paso hasta que el grano esté pelado
Incluir información con respecto al tiempo, tipo de fuente de calentamiento, escurrido, etc.
21.
Durante la etapa de cocción, ¿cuánto tiempo deja en contaco el maíz con la ceniza ?
Especifique :
9. No Sabe
22. ¿Despúes del pelado, cuántos lavados del maíz con agua realiza?
Especifique:
9. No Sabe
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23. ¿Después del pelado, deja en remojo el maíz en el agua de lavado?
1. Si - lavado inicial
2. Si - lavado final
3. No Ir a pregunta # 24
9. No Sabe Ir a pregunta # 24
24. ¿Cuánto tiempo deja en en remojo el maíz después de pelarlo?
Especifique:
9. No Sabe
25. ¿Para pelar el maíz, qué tipo de olla utiliza?
1. Olla de barro
9. No Sabe
2. Olla de acero inoxidable
3. Otro (especifique)
GRACIAS POR SU COLABORACIÓN!
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ANEXO 4. Flujograma de análisis de aflatoxinas y fumonisinas.
Preparación(20 g de muestra
molida)
Extracción(MEOH/H2O)
Derivatización
ColumnasSAXClean up
ColumnasIAC
OPATFA
HPLC en fase reversa, detector FLD
FumonisinasAflatoxinas
75:2580:20
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ANEXO 5. Concentración de aflatoxinas en muestras de maíz seco sin pelar y
pelado.
Muestra
Maíz seco sin pelar Maíz pelado seco
Concentración (µg/kg) Aflatoxinas
totales (µg/kg)
Concentración (µg/kg) Aflatoxinas
totales (µg/kg)
AFG2 AFG1 AFB2 AFB1 AFG2 AFG1 AFB2 AFB1 01 - - - - - - - - 02 - - - - - - - - 03 - - - - - - - - 04 - - 0,32 - 0,32 - - - - 05 - - - - - - - - 06 - - 0,29 - 0,29 - 0,35 - - 0,35 07 - - 0,30 - 0,30 - - - - 08 - - - - - 0,39 - - 0,39 09 - - - - - - - - 10 - - - - - - - - 11 - - - - - - - - 12 - - - - - - - - 13 - 0,50 - - 0,50 - - - - 14 - - 0,58 - 0,58 - - - - 15 - 0,27 - - 0,27 - - - - 16 - 0,39 - - 0,39 - 0,32 - - 0,32 17 - - - - - - - - 18 - - 0,49 - 0,49 - - - - 19 - - - - - - - - 20 - - - - - - - - 21 - - - - - - - - 22 - - - - - - - - 23 - - 0,27 - 0,27 - - - - 24 - - - - - - - - 25 - - - - - - - - 26 - - - - - - - - 27 - 0,29 - - 0,29 - - - - 28 - 0,28 - - 0,28 - - - - 29 - - - - - - - - 30 - - - - - - - - 31 - - - - - - - - 32 - - - - - - - - 33 - - - - - - - - 34 - - - - - 0,46 - - 0,46 35 - - - - - - - - 36 - - - 0,44 0,44 - - - - 37 - - - 0,41 0,41 - - - - 38 - - - - - - - - 39 0,41 - 0,77 - 1,18 - - - - 40 - - - 0,46 0,46 - - - -
Nota: (-) significa menor al límite de detección (LOD)
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ANEXO 6. Concentración de fumonisinas en muestras de maíz seco sin pelar y
pelado.
Muestra
Maíz seco sin pelar Maíz pelado seco
Concentración (µg/kg)
Fumonisinas totales (µg/kg)
Concentración (µg/kg)
Fumonisinas totales (µg/kg)
FB1 FB2 FB1 FB2 01 - - - - 02 - - - - 03 - - - - 04 - - - - 05 - - - - 06 4,63 2,93 7,56 5,43 0,53 5,96 07 1,64 0,68 2,32 - - 08 5,58 0,94 6,52 - 4,63 4,63 09 2,61 0,96 3,57 2,16 - 2,16 10 11,37 2,03 13,4 1,03 - 1,03 11 0,66 2,01 2,67 - - 12 0,84 2,17 3,01 10,98 - 10,98 13 34,65 - 34,65 - - 14 10,27 1,22 11,49 0,80 - 0,8 15 7,28 1,27 8,55 - - 16 1,40 1,54 2,94 - - 17 2,50 1,53 4,03 - - 18 3,22 0,87 4,09 - - 19 2,07 - 2,07 - - 20 5,26 0,74 6,00 1,99 1,53 3,52 21 2,74 1,68 4,42 - - 22 - - - - 23 - - - - 24 - - - - 25 0,30 - 0,30 0,42 - 0,42 26 - - - - 27 - - - - 28 - - - - 29 - - - - 30 - - - - 31 - - - - 32 - - - - 33 - - - - 34 - - - - 35 - - - - 36 - - - - 37 - - - - 38 - - - - 39 - - - - 40 - - - -
Nota: (-) significa menor al límite deg detección (LOD)