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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
EVALUACIÓN DEL USO DE MEGADOSIS DE VITAMINA C EN OVINOS
MACHOS REPRODUCTORES A TRAVÉS DEL ESPERMATOGRAMA
Informe final de investigación presentado como requisito para optar el Título
de Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR
SANTIAGO ALEJANDRO LOZADA GARZÓN
TUTOR
Dr. JORGE MOSQUERA ANDRADE
Quito, Mayo 2016
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“Los ideales que iluminan mi camino y que una y otra vez me han dado
coraje para enfrentar la vida con alegría han sido: la amabilidad, la belleza y
la verdad”
Albert Einstein
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DEDICATORIA
A mi madre, por apoyarme desde el inicio hasta el final, por ser parte
de este sueño.
A toda mi familia por ayudarme a cumplir mis metas y ser apoyo
incondicional.
Santiago
iv
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, por sus palabras de aliento, apoyo incondicional y el gran
esfuerzo que realizaron como familia, lo que permitió cumplir este anhelado
sueño.
A mi tutor, Dr. Jorge Mosquera por su paciencia y sabiduría que permitió la
realización de este estudio.
A Bernard Nicolalde, por toda la ayuda recibida en la parte experimental y a
la Hacienda Zuleta por permitirme realizar el estudio en sus animales de gran
valor.
A mis maestros, Dr. Richard Salazar y Dr. Juan Vargas, gracias a sus
consejos y enseñanzas dentro y fuera del aula.
A todos los docentes de la Facultad, por proporcionarme su sabiduría dentro
de las aulas.
A mis amigos, por toda su ayuda brindada sin su ayuda no hubiese podido
realizarlo.
A la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por permitir superarme y
ser parte de ella.
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© DERECHOS DE AUTOR
Yo, Santiago Alejandro Lozada Garzón, en calidad de autor del trabajo de
investigación “Evaluación del uso de megadosis de vitamina C en ovinos
machos reproductores a través del espermatograma” autorizo a la
Universidad Central del Ecuador, hacer uso de todos los contenidos que me
pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente
académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio
virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior.
En la ciudad de Quito, 2016.
Santiago Alejandro Lozada Garzón
Cd. N° 172018073-4
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INFORME DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Investigación, presentado por el
señor: SANTIAGO ALEJANDRO LOZADA GARZÓN, para optar por el Título
o Grado de Médico Veterinario y Zootecnista, cuyo título es “EVALUACIÓN
DEL USO DE MEGADOSIS DE VITAMINA C EN OVINOS MACHOS
REPRODUCTORES A TRAVÉS DEL ESPERMATOGRAMA”, considero que
dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la
presentación pública y evaluación por parte del jurado examinador que se
designe.
Quito, Mayo 2016.
Dr. Jorge Mosquera
CI: 170260919-7
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INDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA……………… ….………………………………………………iii
AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………..iv
© DERECHOS DE AUTOR…………………………………………………….v
INFORME DEL TUTOR………………………………………………………..vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS……………………………………………………x
INDICE DE ANEXOS………………………………………………………….xii
INDICE DE FIGURAS…………………………………………………………xiii
INDICE DE TABLAS………………………………………………….……….xiv
RESUMEN………………………………………………………………..…….xv
ABSTRACT……………………………………………………………….……xvi
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………..…1
CAPITULO I
OBJETIVOS…………..………………………………………………………….4
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO……………………………………………………...………5
ANTECEDENTES………………...……………………...……………………..5
GENERALIDADES……..………………………………………………….……5
ACCIÓN FARMACOLOGICA DE LA VITAMINA C..…………….…….….…6
PRINCIPALES FUNCIONES DE LA VITAMINA C…………....………….….6
ESTRUCTURA DINAMICA DE LA MOLÉCULA……………………………..7
VITAMINA C EN LA LINEA GERMINAL DEL MACHO……….……...……...7
SELECCIÓN DE REPRODUCTORES……………………....………………..8
SISTEMA REPRODUCTOR DEL MACHO……………………………...…….9
SISTEMA HORMONAL DEL MACHO……………………………………...….9
ESPERMATOGÉNESIS…………………………………………….………….10
RECOLECCION SEMINAL…………………………………………..…...……11
ESPERMATOGRAMA…………………………………………..……………...12
ESTRÉS EN LA REPRODUCCION…………………………………………..12
xi
CAPITULO III
METODOLOGIA Y MATERIALES……......………………….….………….14
CARACTERÍSTICAS DE LA ZONA DE ESTUDIO………..........................15
MATERIALES……………………………….……………………….…………15
TIPO DE INVESTIGACIÓN…………………………………….….…………..16
FACTORES EN ESTUDIO……………………………….……………………16
SISTEMA DE MUESTREO DE OVINOS………….………..……………..16
PROCEDIMIENTOS……………………...…………………………………….17
EVAUACION MACROSCOPICA………………………..……………………19
EVALUACION MICROSCOPICA………………………...…………….……..20
Concentración………………………………...………………………...……20
Motilidad en masa……………………………………………………..……..20
Mótiles progresivos……………………………………………………..……21
Mortalidad………………………………………………………………..……21
ANALSIS ESTADÍSTICO…………………………….…………………..……..21
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………..22
CARACTERISTICAS SEMINALES MACROSCOPICAS…………………...22
CARACTERISTICAS SEMINALES MICROSCOPICAS…………………….23
CAPITULO V
CONCLUSIONES……………………………………………………………….28
BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………….29
ANEXOS…………………………………………………………………………33
xii
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Examen reproductivo del macho……………………………………..33
Anexo 2. Fotografías……………………………………………………………..34
xiii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química de la vitamina C……………………………..7
Figura 1. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Testículo………………………………10
Figura 3. Proceso de elaboración del estudio…………………………..…15
xiv
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ubicación geográfica del estudio……………………………….……..16
Tabla2. Unidades experimentales y tratamientos aplicados………………….17
Tabla 3. Dosis administrada de vitamina C, de acuerdo al peso del
animal…18
Tabla 4. Resultados de pruebas macroscópicas correspondientes a volumen
en semen ovino día 0, 10 y
60……………………………………………………22
Tabla 5. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a
concentración espermática en semen ovino día 0, 10 y 60…………………..23
Tabla 6. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a motiles
progresivos en semen ovino día 0, 10 y 60…………………………………….24
Tabla 7. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a motilidad
en masa en semen ovino día 0, 10 y
60…………………………………………25
Tabla 8. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a
mortalidad en semen ovino día 0, 10 y
60…………………………………………………...26
Tabla 9. Costos parciales por tratamiento………………………………………27
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“EVALUACIÓN DEL USO DE MEGADOSIS DE VITAMINA C EN OVINOS
MACHOS REPRODUCTORES A TRAVÉS DEL ESPERMATOGRAMA”.
Autor: Santiago Alejandro Lozada Garzón
Tutor: Jorge Mosquera.
Fecha: Mayo 2016
RESUMEN
El ovino (Ovis orientalis aries), al igual que todos los machos de todas las especies de mamíferos, necesita del 50% al 100% más de vitamina C en los testículos, que la que se encuentra en el plasma, para que inicie correctamente la espermatogénesis. Los objetivos del estudio están direccionados a determinar si la calidad espermática mejora con la administración endovenosa de Vitamina C. Los ovinos en estudio pertenecieron a la hacienda Zuleta ubicada en la parroquia de Angochagua, perteneciente al cantón Ibarra, provincia de Imbabura. Se formaron dos grupos experimentales (Inyección endovenosa de 300mg/kg y 600mg/kg de Vitamina C, respectivamente) y un grupo control (Sin inyección endovenosa de Vitamina C). Se colecto semen mediante electroeyaculador a los 10 y 60 días post administración de vitamina C se procedió a evaluar el semen. Se utilizó ANOVA y prueba de Tukey como prueba estadística para comparar los grupos. En las características seminales microscópicas y macroscópicas hubo diferencias significativas al 95% de confianza. Se determinó que la adición de 300mg/kg en una sola dosis endovenosa de vitamina C mejoró el volumen seminal a los 10 días post administrada y la motilidad progresiva de los espermatozoides también mejoro a los 10 días de administrar 300mg/kg de vitamina C. Palabras claves: Ovis orientalis aries / espermatogénesis/ semen/ electro eyaculador.
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CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE
CAREER OF VETERINARY MEDICINE
“EVALUATION OF USE OF MEGADOSES OF VITAMIN C IN SHEEP
THROUGH THE MALE REPRODUCTIVE SEMEN ANALYSIS."
Author: Santiago Alejandro Lozada Garzón
Tutor: Jorge Mosquera.
Date: May 2016
ABSTRACT
The sheep, like all males of all species of mammals, need 50% to 100% more vitamin C in the testes, than that found in plasma, to start correctly spermatogenesis. The study objectives are routed to determine whether sperm quality improves with intravenous administration of Vitamin C. Sheep study belonged to the Zuleta farm located in the parish of Angochagua, belonging to the canton Ibarra, Imbabura province. Two experimental groups (intravenous injection of 300mg / kg and 600mg / kg of Vitamin C, respectively) and a control group (without intravenous injection of Vitamin C) were formed. Semen was collected by electroejaculator at 10 and 60 days post administration of vitamin C was evaluated semen. ANOVA and Tukey test were used as a statistical test to compare the groups. In the microscopic and macroscopic characteristics seminal there were significant differences at 95% confidence. It was determined that the addition of 300mg / kg in a single intravenous dose of vitamin C improved seminal volume at 10 days post managed and progressive sperm motility also improved at 10 days by administering 300 mg / kg of vitamin C. Keywords: Ovis orientalis aries / spermatogenesis / sperm / electroejaculator
1
INTRODUCCIÓN En el Ecuador existe una población ovina de 651,686 (INEC, 2014). La
población ovina a nivel nacional ha disminuido de forma acelerada desde el
año 2009 en el que existía una población total de 820.000 cabezas. La
mayoría de ovinos en el país se encuentra distribuida de la siguiente manera:
Chimborazo (259,053), Cotopaxi (198,816), Azuay (78,311), Cañar (41,477),
Bolivar (33,705) y Pichincha (25,370).
La producción ovina mundial está experimentando importantes cambios y en
América Latina, paralelo al descenso del precio internacional de la lana y a la
disminución del censo ovino, emergen o se revalorizan otros productos del
sector. El futuro comercial del rubro está signado por un creciente predominio
del mercado de especialidades, tanto para las carnes como para la leche y
sus derivados, y la fuerte demanda de cambios de los sistemas de
producción y entre los más importantes, cambios en el sistema reproductivo
(Rubianes & Ungerfeld, 2002).
La falta de asesoramiento técnico en la explotaciones, la carencia de
sistemas de manejo de los rebaños, de las pasturas, alimentación deficiente
y en general, los problemas de sanidad animal son causa de la baja
rentabilidad (Salazar, 2011).
La reproducción de los ovinos es fundamental para su producción, en
especial para el abasto. Es fundamental tener una alta eficiencia
reproductiva, expresado por el número de corderos destetados por oveja
(Aguerrebere, 1981).
En el ovino (Ovis orientalis aries), el macho juega un papel fundamental en la
reproducción, ya que un animal, dependiendo del método utilizado, puede
dar servicios en relación borrego-oveja 1:30 hasta 1:100 y aún más si se
utilizan biotecnologías reproductivas. El éxito o fracaso dependerá de su
salud sexual, de su capacidad de detectar y montar ovejas, así como
también de la calidad y cantidad de espermatozoides producidos (Galina &
Valencia, 2008).
2
La esterilidad proviene de la interrupción de la espermatogénesis, cuyas
causas pueden ser traumáticas o infecciosas. La espermatogénesis necesita
de 63 días, de los cuales 49 días son para la formación de espermatozoides
y 14 para la maduración en el epidídimo, es decir, puede recuperarse un
carnero con esterilidad temporaria necesita alrededor de 2 meses, luego de
corregir las causas que provocaron (Edifarm, 2009).
Uno de los principales factores que afectan a la economía y a los sistemas
de producción es la tasa reproductiva, que se expresa en el número de
descendientes viables producidos anualmente por animal. Siendo uno de los
importantes la participación del macho y de sus gametos, ya que al ser de
mayor calidad permite que en un proceso de inseminación artificial o de
monta natural, exista alta probabilidad de llegar a una preñez, llegando al
objetivo de tener el número más alto de crías por año y por animal (Rubianes
& Ungerfeld, 2002).
La deficiencia de vitamina C equivale a falta de carnitina. En los animales, la
carnitina se sintetiza principalmente en el hígado y el riñón a partir de los
aminoácidos lisina (a través de trimetil lisina) y metionina, utilizando ácido
ascórbico como uno de los principales cofactores (Rua, 2008), la que
determina que la movilidad de los espermatozoides sea satisfactoria (Pinto,
2013).
Las plantas fabrican ácido ascórbico y lo almacenan en gran cantidad en los
frutos carnosos como conservante para evitar su oxidación, ya que la
vitamina C es un poderoso reductor y antioxidante (Instituto de Metabolismo
Celular, 2011).
La vitamina C es un potente antioxidante que previene el estrés oxidativo en
los tejidos. Esta vitamina es un micronutriente esencial para la mantención y
el normal desarrollo de la línea germinal masculina y previene el daño
oxidativo de los espermatozoides (Pulgar, 2009).
3
La carnitina, al igual que la vitamina C, tiene características antioxidantes
sobre el líquido seminal, dando protección frente al estrés oxidativo de las
membranas de los espermatozoides y, por lo tanto, afectando a la movilidad
de los espermatozoides y a la capacidad de los mismos de penetrar la
membrana de los ovocitos (González & Mach, 2013).
El tracto reproductor del macho es un sitio inmunológicamente privilegiado
donde la barrera hematotesticular, iones entre las células de Sertoli, protege
los estadios tardíos de las células germinales testiculares y los
espermatozoides, que expresan antígenos únicos que pueden estimular la
respuesta autoinmune. El plasma seminal contiene grandes cantidades de
estos factores inmunológicos que ejercen un efecto potente sobre los tipos
celulares involucrados en la inmuno vigilancia contra organismos patógenos;
todo este sistema de protección es vitamino C dependiente. Además, el
moco cervical también es importante para la supervivencia de
espermatozoides en su migración al útero y trompas de Falopio. Este fluido
también sirve de soporte para la migración de los espermatozoides y tiene
función similar a los componentes del esperma; el moco cervical está
compuesto por agua, azúcares, electrolitos, lípidos, enzimas e
inmunoglobulinas (vitamino C dependiente), y está estrechamente
relacionado a la trama glucoproteína, la cual también es vitamino C
dependiente (Pinto, 2013).
Por lo anteriormente señalado, y por la revisión bibliográfica sustentada, la
suplementación de altas dosis de vitamina C podría conllevar a una mejora
en la tasa reproductiva, ya que esta vitamina actúa a nivel testicular
mejorando su calidad y cantidad espermática, siendo el objetivo de esta
investigación evaluar y comparar el espermatograma de ovinos machos
reproductores con y sin administración de megadosis de vitamina C y el
análisis de sus costos parciales, trabajo que no ha sido realizado en toda la
región americana.
4
CAPÍTULO I
OBJETIVOS
General:
• Evaluar el efecto de la administración de megadosis de vitamina C en
el espermatograma de ovinos machos reproductores.
Especifico
• Evaluar y comparar el espermatograma de ovinos machos
reproductores antes de la aplicación y después de la aplicación de
megadosis de vitamina C.
• Evaluar económicamente a través de costos parciales.
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes
La adición de vitamina C en diluyentes seminales como antioxidantes,
demostró que tiene efecto significativo en el mantenimiento de la motilidad
espermática al congelar y descongelar, lo cual contrasta con lo reportado por
autores que encontraron que la adición de antioxidantes no mejora
significativamente el mantenimiento de esta característica espermática. En
otros estudios con vitamina C, su suplementación como antioxidantes en el
agua de bebida en conejos mejoró notablemente la calidad seminal al reducir
la producción de radicales libres, ya que produce una estabilidad oxidativa
del semen relacionada directamente con el consumo de vitamina C
(Membrillo-Ortega, Córdova-Izquierdo, Hicks-Gómez, Valencia-Méndez, &
Castillo-Juárez, 2011).
Estudios recientes han mostrado mejoramientos significativos en la
viabilidad, motilidad y disminución del daño a la membrana, en
espermatozoides de bovino congelados con vitamina C, al utilizarla como
antioxidante en el diluyente (Paudel et al., 2008), efectos beneficiosos de una
dieta adecuada en cantidades altas de antioxidantes (vitamina C y E)
aumentan considerablemente la calidad espermática, específicamente en
movilidad y mejoran la cantidad o evitan que se reduzca en condiciones de
mala alimentación o de estrés (Zudaire, 2012).
El ácido ascórbico protege las células espermatogénicas, meióticas y post-
meióticas, del daño oxidativo por radicales libres (Pulgar, 2009).
Generalidades
Las vitaminas son nutrientes orgánicos, de suma importancia para el
metabolismo de otras sustancias, que mantienen procesos fisiológicos como:
6
producción de energía, crecimiento y regeneración celular, formación de
hormonas y células sanguíneas, producción de sustancias bioquímicas del
sistema nervioso y para el normal funcionamiento de órganos (Pinto, 2013).
Acción farmacológica de la vitamina C
Las vitaminas actúan como coenzimas y precursores de las mismas regulan
procesos metabólicos y regenerativos a nivel celular. Todas las células del
organismo, sufren fallas en su funcionamiento al verse afectados por la
deficiencia de vitamina C (Oro & Donnamaría, 2006).
Principales funciones de la vitamina C:
1. Esencial para el sistema inmunológico, participa en la actividad de
células de defensa y en la producción del interferón.
2. Favorece la absorción intestinal de hierro no hémico.
3. Protege al organismo de radicales libres.
3.1. Los radicales libres constituyen un mecanismo molecular
común de daño cuando los animales son sometidos a altas
presiones de oxígeno y a radicales ionizantes.
3.2. El desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes producían
los efectos tóxicos.
3.3. La producción de radicales libres es un fenómeno continuo
con implicaciones en el envejecimiento y la carcinogénesis
(Oxilia, 2014).
4. Participa en la metabolización de las grasas, por lo que se la
considera un factor importante para mantener los niveles adecuados
de “lipoproteinas de baja densidad” (Low Density Lipoproteins, LDL) y
de “lipoproteínas de alta densidad” (High Density Liporoteins, HDL).
5. actúa como coenzima en la síntesis del colágeno, una proteína que
es el principal constituyente de los tendones y que también se
7
encuentra presente en la piel, huesos, dientes, ligamentos, cartílagos
y vasos sanguíneos.
6. Es indispensable para el buen funcionamiento de las hormonas
producidas por las glándulas suprarrenales.
7. Es esencial en la biosíntesis de neurotransmisores en el sistema
nervioso y de carnitina en los músculos (Oro & Donnamaría, 2006).
Estructura dinámica de la molécula
La vitamina C es una lactona, derivada del ácido gulónico, sintetizada a partir
de la glucosa; bioquímicamente la vitamina C o ácido L-ascórbico es un
polvo cristalino, inodoro y blanquecino, altamente soluble en agua e insoluble
en disolventes orgánicos. Protegido de la luz y en estado seco es estable
durante tiempos prolongados (Valdés, 2006).
Figura 1. Estructura química de la vitamina C.
.
Fuente: Cea (2006)
Vitamina C en la línea germinal del macho
La vitamina C es una vitamina hidrosoluble derivada del metabolismo de la
glucosa. Los primates, conejillos de indias e inclusive los humanos no
pueden sintetizar vitamina C (Valdés, 2006). La deficiencia genética de la
enzima L-gulonolactona oxidasa impide la síntesis de ácido ascórbico a partir
8
de glucosa (Manela-Azulay, Mandarim-de-Lacerda, Perez, Filgueira, & Cuzzi,
2003).
La vitamina C es un potente antioxidante que previene el estrés oxidativo en
los tejidos. Esta vitamina es un micronutriente esencial para la mantención y
el normal desarrollo de la línea germinal masculina y previene el daño
oxidativo de los espermatozoides (Pulgar, 2009).
El semen del ovino se caracteriza, normalmente, por eyaculados de bajo
volumen (0.8 a 1.2 ml en promedio) pero con alta concentración espermática
(3 a 5 millones de espermatozoides por ml). La producción espermática está
influenciada por varios factores: nutrición y fotoperiodo entre los más
importantes. En cuanto a espermatozoides anormales, en ovinos no son
comunes estas alteraciones en los espermatozoides, considerándose valores
normales por debajo del 20% de anormalidades totales. El plasma seminal
juega el papel más importante en la capacitación espermática, debido a sus
características físico químicas que permiten la viabilidad por mayor tiempo
del espermatozoide (Galina & Valencia, 2008).
Es necesaria la valoración del semen previa a la monta, ya que mediante
esta valoración se puede conocer todas las características físicas y químicas
del eyaculado. Existen varios aspectos a valorar en un eyaculado los que se
los puede analizar mediante técnicas microscópicas y macroscópicas. Las
características que se analizan en un test macroscópico van desde volumen
hasta la movilidad en masa; en cuanto a técnicas microscópicas se puede
analizar morfología de espermatozoides, número de anormalidades totales,
concentración y pureza (Edifarm, 2009).
Selección de reproductores
El uso de ovinos machos con semen de alta calidad es una de las principales
características para mejorar la tasa reproductiva, por lo tanto la obtención de
un mayor número de corderos destetados al año (Aguerrebere, 1981).
9
Para obtener unos eyaculados de óptima calidad, debe prestarse una
atención especial a los ovinos machos seleccionados como sementales, los
cuales precisan un manejo adecuado (Evans y Maxwell, 1990).
Sistema reproductor del macho
Está formado por un conjunto de órganos que tienen a su cargo la formación
de espermatozoides
Testículos: Suspendidos por el divertículo del abdomen por una bolsa
llamada escroto localizada en la región inguinal. Estos órganos primarios
producen los espermatozoides que son células encargadas de la
reproducción y hormonas sexuales como la testosterona que lo diferencian
de la hembra (Vera, 1993).
Sistema hormonal en el macho
El control hormonal de la actividad reproductora en el macho se realiza por
el eje hipotálamo-hipófisis-testículos, en el que la hormona luteinizante (LH)
induce la producción de andrógenos en conjunto con la hormona folículo
estimulante (FSH) (Vera, 1993).
La GnRH estimula la secreción de la FSH (folículo estimulante) y LH
que en los machos recibe el nombre de hormona estimulante de las células
intersticiales. Estas hormonas son transportadas por la circulación sistémica
hacia los testículos, donde la FSH actúa a nivel de las células germinales y
células de Sertoli (túbulo seminíferos) provocando la espermatogénesis, La
inhibina es producida por las células de Sertoli y producen un efecto de
retroalimentación negativa sobre la FSH (Ptaszynska, 2007).
La LH al actuar sobre las células de Leydig, estimula la producción de
testosterona, la cual produce un efecto de retroalimentación negativa sobre
la secreción de LH, provocando la eliminación pulsátil de GnRH
(Ptaszynska, 2007).
10
La testosterona, hormona esteroide producida por las células de Leydig, es
esencial para el mantenimiento y la restauración de la espermatogénesis, y
para controlar y mantener las características secundarias masculinas
(Galina & Valencia, 2008).
Figura 2. Eje hipotálamo-hipófisis-testículos
Fuente: Arrondo (2004)
Modificaciones: Autor
Espermatogénesis
Antes de la pubertad, la diferenciación celular se manifiesta primero por la
presencia de espermatocitos primarios, los que se degeneran, en general, en
la fase de paquiteno por falta de estímulo hormonal. Al acercarse la
pubertad, las espermatogonias empiezan a dividirse aceleradamente por
mitosis, mientras en el espacio intersticial las células mesenquimales también
11
empiezan a diferenciarse y dar origen a las células de Leydig (Galina &
Valencia, 2008).
En la formación del espermatozoide se distinguen 3 fases:
espermatocitogénesis, mitosis y meiosis y la maduración.
Está bien establecido que el control de la espermatogénesis depende de la
función del eje hipotálamo-hipófisis-testicular. Sin embargo, muchos estudios
indican la importancia de La regulación de la espermatogénesis a nivel
paracrina-autocrina, o sea, a nivel local.
Aunque la FSH aumente la viabilidad del epitelio seminífero y la proliferación
de las espermatogonias, y los andrógenos sean esenciales para la
diferenciación del aparato reproductivo masculino, no son suficientes para
inducir el desarrollo normal de la espermatogénesis. El desarrollo de la
función testicular requiere también una producción de factores locales y una
interacción de célula a célula que regula el crecimiento y la diferenciación del
tejido(Galina & Valencia, 2008).
Recolección del semen
La colecta seminal no solo sirve para la obtención de eyaculados de óptima
calidad sino también para la utilización adecuada de los sementales
empleados en tales programas, consiguiéndose así una vida sexual
prolongada para los mismos (Garde, 1992)
Colectar el semen con electroeyaculador proporciona un mayor volumen de
semen pero con menos concentración de espermatozoides que la vagina
artificial y existe peligro de contaminación del semen con la orina (Fallis,
2013). Al colectar y evaluar el semen no existe una sola característica en el
semen que de por sí sea capaz de evaluar la fecundidad del macho, la
valoración potencial del poder fecundante incluye diversas pruebas, cada
una de ellas de gran valor pero que solamente todas juntas permiten
alcanzar conclusiones más valederas (Hafez 1990).
12
Espermatograma
Es un examen de diagnóstico sencillo e importante de realizar para
determinar la fertilidad del macho, en el que se evalúan aspectos físicos
como olor, color, volumen o pH y aspectos celulares, macroscópicos y
microscópicos. también ofrece información sobre células como macrófagos,
linfocitos, leucocitos u hongos, además el líquido seminal puede ser
analizado desde el punto de vista inmunológico y bioquímico (Vázquez-R &
Vázquez-Echeverri, 2007).
La obtención y fraccionamiento del eyaculado ovino, para su utilización
posterior, de un macho reproductor genéticamente superior, nos permite
acelerar el mejoramiento de las características productivas de las manadas,
al aumentar el número de crías logradas con respecto a las que se
obtendrían en servicio natural (Hafez, 1990).
Estrés en la reproducción
El estrés se conoce como la pérdida del estado de homeostasis. Esta
mediada por una red de estructuras neurológicas, anatómicas y de órganos
periférico, produciendo cambios fisiológicos para reestablecer el equilibrio
normal del organismo. Las dos respuestas fisiológicas al estrés más
importantes son el estímulo del sistema nervioso simpático y del eje
hipotalámico pituitario (Hernández, 2005).
Frente al estrés, se provoca la liberación de catecolaminas como adrenalina
y noradrenalina, las cuales preparan al organismo para una respuesta activa
(huida o lucha). La actividad neuroendocrina activa la respuesta del eje
hipotálamo-hipófisiscorteza adrenal (HPA), que empieza con la liberación de
las hormonas liberadora de corticotropina, luego la adrenocorticotrópica y se
traduce en una liberación periférica de glucocorticoides (cortisol ó
corticosterona, dependiendo de la especie) que conservan y prolongan las
13
acciones metabólicas iniciadas por la respuesta a las catecolaminas (Knol,
1991).
Existe evidencia de que la activación del eje del estrés afecta el
funcionamiento del eje reproductivo en machos, los glucocorticoides
disminuyen directamente el contenido de receptores testiculares a LH y
reducen la producción de testosterona, además de su papel alterando el
número de receptores a gonadotropinas, su acción negativa sobre la
esteroidogénesis testicular incluye la reducción del número de células de
Leydig al promover la apoptosis e inactiva enzimas deshidrogenasas e
hidroxilasas, claves en el proceso de esteroideogénesis (Álvarez, 2008).
14
CAPITULO III
MEODOLOGIA Y MATERIALES
Características de la zona de estudio
El presente trabajo se realizó en la parroquia de Angochagua, ubicada en el
suroriente de la provincia de Imbabura y al sur del Cantón Ibarra, cuya
superficie es de 12.392 ha (123 km2); Angochagua se encuentra entre los
2800 msnm y los 3800 msnm de altitud, cuenta con dos pisos climáticos
(páramo y vegetación arbustiva) que determinan temperaturas y
precipitaciones propias de cada ecosistema. La precipitación oscila entre los
700 mm y 1.500 mm, observándose la presencia de frecuentes neblinas y
lluvias en la zona. La temperatura varía entre los 10°C y 16° C (GAD, 2014).
El presente estudio fue realizado en la Hacienda Zuleta, ubicada en la
parroquia Angochagua, con una extensión total de 2,000 hectáreas, de las
que 60 están destinadas a la producción ovina.
Tabla 1. Ubicación Geográfica del estudio
Provincia Imbabura
Cantón Ibarra
Parroquia Angochagua
Lugar de estudio Hacienda Zuleta y Anexas
Altitud 2.870 msnm
Latitud 0º 12' 00" N
Longitud 78º 04' 59" W
Fuente: GAD Imbabura (2014)
15
Figura 3. Proceso para elaboración del estudio
Materiales
Animales
•12 ovinos machos reproductores, Poll Dorset x Ramboulliet
De campo
•Balde pequeño
•Sogas
•Guantes de látex
Equipos
•Microscopio óptico
•Porta objetos
•Cubre objetos
•Cámara de Neubauer
•Pipetas
•Tubos colectores
•Cooler térmico
•Tubos de ensayo
Selección de lugar del estudio, con iguales condiciones en el
manejo de los reproductores.
Descanso de un mes despues de la temporada de
montas.
Seleccion de reproductores.
Extraccion seminal
mediante electroeyaculado
r y análsis del mismo.
Administracion de vitmina c
Extraccion seminal post
administracion y análsis del
mismo.
Cálculos estadisticos:
ANOVA, Tukey y costos parciales
Análisis de datos
16
Materia prima e insumos
•Vitamina C inyectable
•Suero fisiológico 0,9% NaCl
•Catéter intravenoso 18 pulgadas
•Equipo de venoclisis
•Colorante eosina
Tipo de investigación
Estudio experimental de campo y laboratorio.
Factores en estudio
En esta investigación se evaluó y comparó el efecto de la administración de
megadosis de vitamina C en el espermatograma y como esta afecta las
características seminales macroscópicas y microscópicas, en cada uno de
los grupos formados y la influencia a nivel testicular que tiene la
administración de una sola megadosis de vitamina C.
Características de las unidades de estudio
Ovinos machos reproductores de la raza Ramboulliet x Poll Dorset,
comprendidos entre 2 y 3 años de edad, libres de enfermedades, con buena
condición corporal comprendida entre 2,5 y 3 (INIA, 2015).
17
Tabla 2. Unidades experimentales y tratamientos aplicados
Testigo R. J. D. 01
R. J. D. 11 R.H.Z. 07 ANCO 01
Tratamiento
1 (300mg/kg)
R.H.Z. 08
ANCO 03
ANCO 04
ANCO 09
Tratamiento
2 (600mg/kg)
R.J.D. B044
R.J.D. B039
R.J.D. B078
R.J.D. B08
Procedimientos
Trabajo de campo
Día 1:
Se realizó la primera colecta de limpieza, a los 12 ovinos machos
reproductores, mediante electroeyaculador; de las cuales no se registraron
datos de esta colecta.
Día 10:
Se realizó la segunda extracción de semen y análisis mediante técnicas
macroscópicas y microscópicas.
A posterior, se procedió a la administración de vitamina C de forma
endovenosa, calculando la dosis de acuerdo al peso del animal (Tabla 3).
Para la administración de vitamina C, se la diluyó en suero de cloruro de
sodio al 0,9% de 250ml, el que fue administrado mediante un catéter N.- 18,
a 80 gotas por minuto.
18
Tabla 3. Dosis administrada de vitamina C, de acuerdo al peso del animal.
Día 25:
Se procedió a extraer el semen por tercera ocasión y a la evaluación
macroscópica y microscópica del mismo, con el objetivo de identificar si
existen cambios en la maduración de los espermatozoides.
Día 60:
Se realizó la última extracción y valoración de semen, en la cual se pretendió
identificar cambios en la espermatogénesis.
Trabajo de laboratorio
Colecta seminal
Para el análisis macroscópico y microscópico del semen se implementó un
pequeño laboratorio de campo.
Arete Tratamiento Peso
(kg)
Vitamina C administrada Volumen
(ml)
R.H.Z. 08 Experimental 1
300mg/kg
56 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
112
ANCO 03 Experimental 1
300mg/kg
55 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
110
ANCO 04 Experimental 1
300mg/kg
46 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
92
ANCO 09 Experimental 1
300mg/kg
53 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
106
R.J.D. B044 Experimental 2
600mg/kg
48 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
192
R.J.D. B039 Experimental 2
600mg/kg
60 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
240
R.J.D. B078 Experimental 2
600mg/kg
68 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
272
R.J.D. B08 Experimental 2
600mg/kg
53 Bio C, Laboratorio James
Brown 150mg/ml
212
19
1. Se realizó el examen reproductivo a cada macho (Anexo 1), previo a la
extracción seminal, en la que se registraron todos los datos del animal
a experimentar.
2. Se realizó una toma de las constantes fisiológicas de cada animal,
previa a cada extracción.
3. Después de realizado el examen reproductivo del macho, se limpió
con abundante agua y jabón la zona prepucial externa y con solución
fisiológica la parte interna del prepucio.
4. Se preparó los materiales de laboratorio para la colecta (Tubos de
ensayo, pipetas, cámara de Neubauer, porta y cubre objetos y
reactivos para medir la mortalidad espermática).
5. Se sostuvo al animal en decúbito lateral y se introdujo el
electroeyaculador lubricado, evitando lesiones que provoquen estrés
en el animal.
6. Para la recolección, el animal debe estar acostado en decúbito lateral
e introducir el estimulador vía tras rectal a una profundidad de 15 a 20
cm (Evans y Maxwell, 1987).
7. Se calibró el electro eyaculador a voltaje mínimo (3 – 4 voltios) y
pulsaciones con intervalos de un segundo; se modificaron los voltajes
y las pulsaciones de acuerdo a cada animal.
8. Se colocó el tubo colector al momento de la salida del pene, si el
animal no protruía el pene era necesario manipularlo desde el asa
sigmoidea.
9. El eyaculado fue protegido del sol y colocado en una caja de
herramientas aclimatada a 38 grados centígrados, hasta su
evaluación.
Evaluación macroscópica
Se tomaron datos de pH utilizando tiras reactivas de pH introduciéndolas en
el semen y leyendo y anotando los resultados, volumen mediante tubo
20
graduado y color dependiendo si es blanco-lechoso, o cremoso pálido, si
existen alteraciones en color se las registrarían (Cueto, Gibbons, Garcia,
Wolff, & Arrigo, 2013).
Evaluación microscópica
Concentración espermática:
1. Se utilizó una cámara de Neubauer, porta objetos, cubre
objetos y solución fisiológica para dilución del semen.
2. Se procedió a diluir el semen (1:400), homogenizar la muestra
para colocarla en la cámara de Neubauer y colocar un cubre
objetos.
3. Se observó las cuadrículas de la cámara de recuento, que miden
1 x 1 mm, y tiene una profundidad de 0,01 mm, y está subdividida
en 100 cuadros de 0,1 x 0,1 mm, cada uno, por lo que el volumen
total en una cámara de Neubauer es 0,01 μl(Cardona-Maya,
Berdugo, & Cadavid, 2008). Se transfirieron a la cámara 3-5 μl de
muestra de semen previamente inmovilizada por dilución. El
recuento fue realizado después de 5 minutos en 10 cuadrados de
la cámara. El número total de esperma contado es la
concentración final expresada como 10x6 espermatozoides/ml.
El conteo de los espermatozoides se lo realiza en el cuadrado
grande, con divisiones internas y se repite el conteo en otro
cuadrante elegido al azar, hasta el total de 5 cuadrantes. Se
calcula multiplicando la suma de los 5 cuadrados por 12.800.000
(Cueto & Gibbons, 2014).
Motilidad en masa
1. Se retiró una gota de semen del eyaculado con la ayuda de una
varilla de cristal.
21
2. Se colocó en un porta objetos, previamente temperado, se observó y
se analizó con el microscopio a 10 y 40 x.
3. Se calificó de 1 a 5 (1=Muy mala, 5=Excelente).
Mótiles progresivos
1. Se diluyó el semen con citrato de sodio al 3% en una proporción 2:1
2. Se homogenizó la muestra en el porta objetos y se observó con la
lente de 40x.
3. Para su valoración se contaron 100 espermatozoides y el resultado
se expresó en porcentaje.
Mortalidad
Técnica utilizada, descrita por Evans & Maxwell (1987).
1. Se colocó una gota de semen en el porta objetos.
2. Se adicionó la misma cantidad de colorante eosina
3. Se observó con lente de 40x y se contabilizo 100
espermatozoides
4. Los resultados fueron expresados en porcentaje, (toman
coloración los espermatozoides muertos).
Análisis estadístico
Para comparar los espermatogramas de los tres grupos experimentales, se
colocaron los datos en una tabla de Excel y se realizó el análisis de varianza
(ANOVA), para determinar si existe diferencia significativa entre
espermatogramas de ovinos machos reproductores sin tratamiento y los dos
grupos experimentales y, a posterior, se utilizó la prueba de Tukey para
conocer qué tratamiento dio mejores resultados.
También se analizaron costos parciales entre los tratamientos.
22
CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Características seminales macroscópicas
Tabla 4. Resultados de pruebas macroscópicas correspondientes a volumen
en semen ovino día 0, 10 y 60.
Los resultados obtenidos reflejan un aumento significativo (p= <0,05)
después de administrar megadosis de vitamina C; al realizar prueba Tukey
para comparar y enfrentar los distintos tratamientos refleja que, una sola
megadosis de vitamina C en 300mg/kg aumenta en mayor volumen el
eyaculado ovino a los 10 días post administrada.
Testigo Día 0, Volumen
(ml)
p Día 10, Volumen (ml)
p Día 60, Volumen
(ml)
p
R. J. D. 01 0,3
> 0,05 a
0,5
< 0,008 b
0,5
> 0,05 a
R. J. D. 11 0,8 0,8 1
R.H.Z. 07 0,5 0,6 0,6
ANCO 01 0,9 0,7 0,8
Promedio 0,625 0,65 0,725
E1
R.H.Z. 08 0,5 0,8 0,8
ANCO 03 0,6 0,9 0,7
ANCO 04 0,9 1,1 1
ANCO 09 1,1 1,3 0,9
Promedio 0,775 1,025 0,85
E2
R.J.D. B044
0,8 1,1 1
R.J.D. B039
1,2 1,4 1
R.J.D. B078
0,9 1,1 1
R.J.D. B08 0,5 1 0,9
Promedio 0,85 1,15 0,975
23
En los trabajos de (Paul et al., 2013) se muestran resultados de colectas
seminales, en los que, durante un mes del animal en reposo (sin monta o
colecta seminal), se obtuvieron valores inferiores (0,8 ml de semen promedio)
en contraste a los obtenidos en esta investigación con la adición de mega
dosis de vitamina C.
En investigaciones similares realizadas por (Saravia, 2008) durante 6 meses
de investigación y realizando colectas cada 2 meses, se obtuvieron
promedios de 0,9 ml de semen, promedio similar al obtenido en esta
investigación 10 días después de agregada la vitamina C (1,08 ml ).
Características seminales microscópicas:
Tabla 5. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a
concentración espermática en semen ovino día 0, 10 y 60.
Testigo Día 0, Concentración
(x 106)
p Día 10,
Concentración
(x 106)
p Día 60,
Concentración
(x 106)
p
R. J. D. 01 3420,5
> 0,05
a
3080
> 0,05
a
3120
> 0,05
a
R. J. D. 11 3809 4100,4 4960
R.H.Z. 07 5500,6 6890,9 6380
ANCO 01 6800 3200,6 3400,8
Promedio 4882,525 4317,975 4465,2
E1
R.H.Z. 08 5980,8 6800,8 6080,8
ANCO 03 4080,4 4002 3900,4
ANCO 04 6430,9 6320,2 6280,8
ANCO 09 5920 5800 6400
Promedio 5603,02 5730,75 5665,5
E2
R.J.D. B044
3970 3820 4900
R.J.D. B039
5008,8 6080,9 5840,8
R.J.D. B078
4800,4 5180,2 5090,9
R.J.D. B08 6480,8 5880,8 6200,2
24
Al realizar el análisis estadístico de la concentración espermática a los días
0, 10 y 60, medida con la cámara de Neubauer, se determinó que no existe
diferencia significativa (p= >0,05), por lo que no se realizó Tukey. Sin
embargo se encontró diferencia matemática entre tratamientos, siendo los
mejores el E1, seguido del E2 a los días de administrada la vitamina C.
Tabla 6. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a motiles
progresivos en semen ovino día 0, 10 y 60.
La tabla 4 indica resultados obtenidos en las distintas colectas, al realizar
ANOVA muestra diferencia altamente significativa (p= <0,05), al realizar
Tukey para comparar que grupo arroja mejores resultados, nos indica que el
tratamiento E1 a los 10 días de administrada la vitamina C muestra una
Promedio 5065 5240,475 5507,975
Testigo Día 0
(%)
p Día 10
(%)
p Día 60
(%)
p
R. J. D. 01 51
> 0,05
a
60
< 0,05 b
64
> 0,05 a
R. J. D. 11 69 68 65
R.H.Z. 07 60 73 65
ANCO 01 50 70 70
Promedio 57,5 67,75 66
E1
R.H.Z. 08 65 78 69
ANCO 03 70 79 74
ANCO 04 60 86 79
ANCO 09 70 79 75
Promedio 66,25 80,5 74,25
E2
R.J.D. B044
65 68 70
R.J.D. B039
75 70 64
R.J.D. B078
80 77 80
R.J.D. B08 70 74 68
Promedio 72,5 72,25 70,50
25
mejora en la motilidad progresiva de los espermatozoides. Al comparar con
trabajos como el de (Oaxaca, Silvia, Liera, & Práctica, 2006), quienes
obtuvieron un 60,4% de motilidad progresiva, existe diferencia significativa de
medias con un 20% menor, en relación al E1.
Tabla 7. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a motilidad
en masa en semen ovino día 0, 10 y 60.
Los resultados (tabla 7) indican que a una probabilidad de (p= >0,05) no
existe diferencia significativa en cuanto a motilidad en masa en los distintos
días de colecta seminal en ninguno de los dos tratamientos, pero
encontramos un aumento matemático de un punto, entre el testigo y E2 a los
días de administrada.
Testigo Día 0
(1-5)
p Día 10
(1-5)
p Día 60
(1-5)
p
R. J. D. 01 4
> 0,05
a
4
> 0,05 a
4
> 0,05 a
R. J. D. 11 4 3 3
R.H.Z. 07 4 4 4
ANCO 01 3 4 3
Promedio 3,75 3,75 3,5
E1
R.H.Z. 08 4 5 4
ANCO 03 4 4 4
ANCO 04 3 4 4
ANCO 09 4 3 3
Promedio 3,75 4 3,75
E2
R.J.D. B044
4 5 5
R.J.D. B039
5 4 4
R.J.D. B078
4 5 4
R.J.D. B08 4 4 4
Promedio 4,25 4,5 4,25
26
Tabla 8. Resultados de pruebas microscópicas correspondientes a
mortalidad en semen ovino día 0, 10 y 60.
Según el ANOVA para la mortalidad espermática (tabla 8), no existen
diferencias significativas (p= >0,05) al 95% de confianza, por lo que no se
realizó prueba Tukey.
Testigo Día 0
%
p Día 10
%
p Día 60
%
p
R. J. D. 01 30
> 0,05 a
28
> 0,05 a
32
> 0,05 a
R. J. D. 11 20 16 17
R.H.Z. 07 10 13 12
ANCO 01 10 12 13
Promedio 17,5 17,25 18,50
E1
R.H.Z. 08 25 14 25
ANCO 03 30 19 17
ANCO 04 24 19 16
ANCO 09 28 15 20
Promedio 26,7 16,75 19,50
E2
R.J.D. B044
23 14 12
R.J.D. B039
19 18 14
R.J.D. B078
18 12 15
R.J.D. B08 26 16 15
Promedio 21,5 15,00 14,00
27
Tabla 9. Costos parciales por tratamiento
La administración de vitamina C en el tratamiento 1 (300mg/kg), tuvo un
costo total de 84 dólares americanos por grupo; la administración de vitamina
C en el tratamiento 2 (600mg/kg) tuvo un costo de 183 dólares americanos
por grupo, siendo el costo por animal de 45,8 dólares americanos del E2 el
más costoso.
Tratamiento Dosis Vitamina C
(ml)
Costo Vitamina C (50 ml)
$
Costo parcial
Vitamina C por grupo
$
Costo parcial de Vitamina C por
animal $
Testigo 0 0 0 0
Experimental 1 420 10,00 84 21
Experimental 2 916 10,00 183,2 45,8
28
CAPITULO V
Conclusiones
No existieron diferencias significativas al inicio del experimento entre
los grupos y distintos tratamientos, lo cual nos dice que se formaron
grupos homogéneos.
Se demostró que al administrar 300mg/kg de vitamina C por vía
endovenosa, mejora el volumen seminal significativamente (p= 0,008)
a los 10 días post administración, por el contrario la adición de
600mg/kg de vitamina C, no produjo diferencias significativas post
administración.
Se demostró que al administrar 300mg/kg de vitamina C por vía
endovenosa, mejora la motilidad progresiva espermática de forma
significativa (p= 0,009) a los 10 días post administración, por el
contrario la adición de 600mg/kg de vitamina C, no produjo diferencias
significativas en cuanto a motilidad progresiva.
Se comprobó que la administración de 300mg/kg y 600mg/kg vía
endovenosa, para los parámetros macroscópicos restantes (pH y
color) no existieron diferencias significativas (p= >0,05).
Se comprobó que la administración de 300mg/kg y 600mg/kg vía
endovenosa, para los parámetros microscópicos restantes (motilidad
en masa y concentración) no existieron diferencias significativas (p=
>0,05).
Existieron diferencias matemáticas, mas no estadísticas en cuanto a
concentración y motilidad en masa, siendo mejor el tratamiento
experimental 1 en ambos parámetros.
29
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http://www.consumer.es/web/es/alimentacion/aprender_a_comer_bien/
adulto_y_vejez/2012/03/27/208 350.php#.T39fTSgTXOY.twitter
33
Anexos
Anexo 1. Examen reproductivo del macho
34
Anexo 2. Fotografías
Selección de reproductores
Toma de constantes fisiológicas y registro reproductivo del macho
Administración intravenosa de vitamina C
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Extracción seminal mediante electroeyaculador
Análisis del semen