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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Resistencia mono y poligénica de Botrytis cinerea a botricidas usados
en rosas de exportación
Trabajo de investigación previo a la obtención del Título de Ingeniero Agrónomo
AUTOR: Calderón Flores Daniela Alejandra
TUTOR: Ing. Jorge David Caicedo Chávez, MSc.
Quito, 2020
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, DANIELA ALEJANDRA CALDERÓN FLORES en calidad de autor y titular de
los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: “RESISTENCIA
MONO Y POLIGÉNICA DE Botrytis cinerea A BOTRICIDAS USADOS EN
ROSAS DE EXPORTACIÓN”, modalidad presencial, de conformidad con el Art.
144 del CODIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACION, CONCEDEMOS A FAVOR
DE LA Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no
exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos.
Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra establecida en la
normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
___________________________________
DANIELA ALEJANDRA CALDERÓN FLORES
C.C.: 1725140790
Correo: [email protected]
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APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por DANIELA
ALEJANDRA CALDERON FLORES, para optar por el Grado de Ingeniera Agrónoma;
cuyo título es: “RESISTENCIA MONO Y POLIGÉNICA DE Botrytis cinerea A
BOTRICIDAS USADOS EN ROSAS DE EXPORTACIÓN”, considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 29 días del mes de enero de 2020
___________________________
Jorge David Caicedo Chávez, MSc
DOCENTE – TUTOR
C.I.: 1719050682
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“RESISTENCIA MONO Y POLIGÉNICA DE Botrytis cinerea A
BOTRICIDAS USADOS EN ROSAS DE EXPORTACIÓN”
APROBADO POR:
Ing. Jorge Caicedo Chávez, MSc.
TUTOR:
Ing. Clara Iza Madruñero, M.Sc.
TRIBUNAL LECTOR
Ing. Carlos Ortega Ojeda, M.Sc.
TRIBUNAL LECTOR
2020
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DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que me permitió
alcanzar todos mis logros,
me puso en el lugar y momento adecuados
para alcanzar mis éxitos
Dios eres mi amor, fortaleza y sanidad.
A mi familia: mis amados padres Silvio y Gladys;
a mis queridos hermanos Kevin y Anderson
quienes me apoyaron en cada etapa de mi vida,
todo esto se los dedico a ustedes.
A mis abuelitos que siempre confiaron en mí,
Me apoyaron y forjaron en mí una persona de bien,
A mi enamorado Ramiro,
quien nunca dudó de mí y estuvo de principio a fin
apoyándome en todos los ámbitos.
Porque Dios nos puso en el mismo camino,
Te amo y este logro lo realizamos juntos.
A mis amigos y amigas que, pesar de las adversidades,
Me apoyaron, me aconsejaron y
Juntos tuvimos los mejores años de nuestras vidas
A mi prima Estefanìa Flores
quien fue un apoyo incondicional
en cada una de las etapas de mi vida
Gracias.
vi
AGRADECIMIENTOS
Al Ing. Jorge Caicedo, por el tiempo invertido en este trabajo, por inculcar en mí el
deseo de conocer más e investigar, puliendo a una persona de bien, le estaré
siempre agradecida.
A la Ingeniera Clara Iza, quien junto con el personal del Laboratorio de
Microbiología y Fitopatología contribuyeron con su tiempo, paciencia y
conocimiento en la primera etapa de esta investigación.
Al Ingeniero Héctor Andrade quien junto con el personal del Laboratorio de
Genética Vegetal contribuyeron con su tiempo, paciencia y conocimiento en la
segunda etapa de esta investigación
Al Ingeniero Carlos Ortega quien contribuyó con su tiempo, paciencia y
conocimiento en la revisión de esta investigación
Al personal de BASF quienes estuvieron conmigo durante el proceso de toma de
recolección de muestras, gracias por todo el cariño y paciencia.
A la Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Ciencias Agrícolas y a mis
maestros por el conocimiento que me han brindado, por el tiempo y esfuerzo
invertidos en mí.
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ÍNDICE DE CONTENIDO
Capítulos 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................ 3
2.1. El cultivo de rosa .............................................................................................. 3
2.1.1. Taxonomía .................................................................................................. 3
2.1.2. Descripción botánica .................................................................................. 3
2.1.3. Requerimientos edafoclimáticos del cultivo de rosas................................. 3
2.1.4. Importancia del cultivo ............................................................................... 3
2.2. Moho gris .......................................................................................................... 4
2.2.1. Clasificación taxonómica (Botrytis cinerea) .............................................. 5
2.2.2. Morfología .................................................................................................. 5
2.2.3. Epidemiología ............................................................................................. 5
2.2.4. Sintomatología y daños .............................................................................. 6
2.3. Sensibilidad de Botrytis cinerea a fungicidas ................................................. 6
2.3.1. La resistencia monogénica.......................................................................... 7
2.3.2. La resistencia poligénica ............................................................................ 8
2.3.3. La resistencia a multidrogas ....................................................................... 8
2.4. Importancia de la caracterización patogénica .............................................. 9
2.4.1. Expresión génica en Botrytis cinerea ....................................................... 10
2.4.2. Genes de resistencia de Botrytis cinerea a fungicidas .............................. 10
2.5. Principales mutaciones en Botrytis cinerea .................................................. 11
2.5.1. Aberrantes ................................................................................................. 11
2.5.2. Medianamente y poco aberrantes ............................................................. 12
2.6. Concentración efectiva del fungicida ........................................................... 12
2.7. Modelo de regresión Probit y Logit .............................................................. 13
3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 14
3.1. Material ........................................................................................................... 14
3.1.1. Materiales de campo ................................................................................. 14
3.1.2. Materiales y equipos de laboratorio.......................................................... 14
3.1.3. Medio de cultivo y reactivos .................................................................... 14
3.1.4. Equipos ..................................................................................................... 14
3.2. Métodos ........................................................................................................... 15
3.2.1. Ubicación .................................................................................................. 15
3.2.2. Análisis de sensibilidad a fungicidas ........................................................ 16
viii
3.2.3. Sensibilidad a fungicidas .......................................................................... 17
3.2.4. Unidad Experimental ................................................................................ 17
3.2.5. Análisis funcional ..................................................................................... 18
3.2.6. Determinación de la resistencia genética de Botrytis cinerea a fungicidas
18
3.2.7. Extracción de ADN fúngico ..................................................................... 18
3.2.8. Reacciones de PCR ................................................................................... 20
3.2.9. Determinación de las mutaciones que confieren resistencia .................... 22
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 23
4.1. FUNGICIDAS CON ACCIÓN MONOGÉNICA ....................................... 23
4.1.1. Determinación de la Eficiencia de Concentración 50 (EC50) ................... 23
4.1.2. Resistencia a multifungicida mono génico (MFRm) ................................ 28
4.1.3. Mutaciones contra fungicidas monogénicos............................................. 30
4.1.4. Efecto de la resistencia de B. cinerea a carboxamidas ............................. 34
4.1.5. Probabilidad de resistencia cruzada entre carboxamidas ......................... 37
4.2. FUNGICIDAS DE ACCIÓN POLIGÉNICA .............................................. 37
4.2.1. Determinación de la eficiencia de concentración 50 (EC50) ..................... 37
4.2.2. Análisis del EC50 de B. cinerea para fungicidas disruptores de membrana
y ATP 40
5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 43
6. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 44
7. RESUMEN ............................................................................................................ 45
8. REFERENCIAS ................................................................................................... 47
9. ANEXOS ............................................................................................................... 56
ix
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Codificación del material vegetal empleado en las pruebas de sensibilidad. 15
Cuadro 2. Concentraciones del ingrediente activo propuestas en esta investigación. .... 16 Cuadro 3. Formulación y concentración del ingrediente activo de cada fungicida. ....... 17 Cuadro 4. Cebadores usados para las reacciones de PCR en esta investigación. ........... 21 Cuadro 5. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea para 6 fungicidas monogénicos. . 28 Cuadro 6. Mutaciones identificadas para 14 aislamientos de B. cinerea en cuatro grupos
químicos de fungicidas monogénicos. ............................................................................ 33 Cuadro 7. Correlación de Pearson para la determinación de la probabilidad de
resistencia cruzada entre boscalid, fluxapyroxad y fluopyram....................................... 37
Cuadro 8. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea para dos fungicidas poligénicos. . 40 Cuadro 9. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea y tres fungicidas disruptores de
membrana y ATP. ........................................................................................................... 41
x
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Resistencia a multifungicidas monogénicos de Botrytis cinerea para boscalid,
pyraclostrobin, fenhexamid y metil thiophanato. ........................................................... 29 Gráfico 2. Resistencia a multifungicidas monogénicos de Botrytis cinerea para boscalid,
fluxapyroxad y fluopyram. ............................................................................................. 30 Gráfico 3. Sitios de acción de las carboxamidas en la proteína succinato deshidrogenasa
(SdHB) de B. cinerea. .................................................................................................... 34 Gráfico 4. Efecto de una mutación aberrante P225H y P225F en B. cinerea. ............... 35
Gráfico 5. Efecto de una mutación medianamente aberrante H272R y H272L. ............ 36 Gráfico 6. Efecto de una mutación medianamente aberrante H272R y H272L en B.
cinerea. ........................................................................................................................... 36
xi
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Control del hongo Botrytis cinerea por fenhexamid....................................... 56 Anexo 2. Presencia de la mutación aberrante F412S. .................................................... 56 Anexo 3. Presencia de la mutación F412I, que inhibe el proceso de control de
fenhexamid. .................................................................................................................... 56 Anexo 4. Presencia de la mutación E198 del grupo de los benzimidazoles ................... 57
Anexo 5. Proceso de transportación de electrones para generar ATP sin la influencia de
fluazinam ........................................................................................................................ 57 Anexo 6. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluxapyroxad. ............................................................. 58 Anexo 7. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluazinam. ................................................................... 58 Anexo 8. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo cyprodinil + fludioxonil. ............................................ 59
Anexo 9. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo boscalid. ..................................................................... 59
Anexo 10. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fenhexamid. ................................................................ 60 Anexo 11. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo prochloraz................................................................... 60
Anexo 12. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo mefentri-fluconazole. ................................................. 61
Anexo 13. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo metil thiophanato........................................................ 61
Anexo 14. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo pyrimetanil. ................................................................ 62 Anexo 15. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluopyram + pyrimethanil. ......................................... 62
Anexo 16. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo pyraclostrobin............................................................. 63 Anexo 17. Frecuencias de aislamiento de cepas de B. cinerea MDR de regiones
vitivinícolas francesas y alemanas de 1994 a 2008 (Kretschmer et al., 2009). .............. 63
xii
TÍTULO: Resistencia mono y poligénica de Botrytis cinerea a botricidas usados en
rosas de exportación
Autora: Daniela Alejandra Calderón Flores
Tutor: Jorge David Caicedo Chávez
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo estudiar la sensibilidad y la resistencia
mono y poligénica de 14 aislamientos de Botrytis cinerea a los principales fungicidas
utilizados en la floricultura ecuatoriana. En este sentido, mediante el algoritmo Probit se
calculó el EC50 de los aislamientos, y mediante secuenciación se determinó las
principales mutaciones en genes constitutivos que confieren resistencia a fungicidas. El
análisis de sensibilidad indicó que, 8 aislamientos mostraron un perfil bajo de
sensibilidad a fungicidas monogénicos, especialmente para las estrobilurinas,
benzimidazoles y carboxamidas; adicionalmente, todos los aislamientos mostraron alta
sensibilidad a fungicidas poligénicos. Por otro lado, en la mayoría de los aislamientos se
detectó las mutaciones P225H y P225F (aberrantes para carboxamidas), H272R y
H272L (medianamente aberrantes para carboxamidas), F412S (aberrante para
hidroxyanhilidas), L195F y V309M (poco aberrantes para hidroxyanhilidas), E198A
(aberrante para benzimidazoles) y G143A (aberrante para estrobilurinas).
PALABRAS CLAVE: FUNGICIDAS MONOGÉNICOS / POLIGÉNICOS / EC50 /
MUTACIÓN / SENSIBILIDAD / RESISTENCIA
xiii
TITLE: Mono and polygenic resistance of Botrytis cinerea to fungicides used in export
roses
Author: Daniela Alejandra Calderón Flores
Tutor: Jorge David Caicedo Chávez
Abstract
The aim of this research was to study the sensitivity and resistance of 14 isolates of
Botrytis cinerea to mono and polygenic fungicides used in the Ecuadorian floriculture.
In this sense, using the Probit algorithm the EC50 of the isolates was calculated, and by
sequencing the main mutations in constitutive genes that confer resistance to fungicides
were determined. Sensitivity analysis indicated that 8 isolates showed a low sensitivity
profile to monogenic fungicides, especially for strobilurins, benzimidazoles and
carboxamides; additionally, all isolates showed high sensitivity to polygenic fungicides.
On the other hand, in the most isolates the mutations P225H and P225F (aberrant for
carboxamides), H272R and H272L (moderately aberrant for carboxamides), F412S
(aberrant for hydroxyanhilides), L195F and V309M (low aberrant for
hydroxyanhilides), E198A (aberrant for benzimidazoles) and G143A (aberrant for
strobilurins) were detected.
Keywords: MONOGENIC FUNGICIDES / POLYGENIC / EC50 / MUTATION /
SENSITIVITY / RESISTANCE
Yo, Jorge David Caicedo Chávez, certifico haber revisado y corregido el abstract del
trabajo de titulación “Resistencia mono y poligénica de Botrytis cinerea a botricidas
usados en rosas de exportación”.
Quito, 28 de enero de 2020
___________________________
Jorge David Caicedo Chávez, MSc
DOCENTE – TUTOR
C.I.: 1719050682
1
1. INTRODUCCIÓN
La rosa es uno de los cultivos más importantes de exportación en el Ecuador,
considerado como una de las principales fuentes económicas para el sector floricultor.
Según el MAGAP (2019), existen más de 511 fincas productoras de rosas de
exportación y consumo nacional, siendo consideradas la zona norte en las provincias de
Carchi e Imbabura con 205 ha, la zona centro con la provincia de Pichincha con 3845 ha
y la zona sur en la provincia de Cotopaxi con 973 ha, el resto de provincias de la sierra
están repartidas con 102 ha.
En los años comprendidos entre el 2004 y 2008, la producción de flores vio un
desarrollo significativo con un crecimiento aproximado de 59,36 %, pasando de USD
354 millones en el año 2004 a USD 565 millones en el año 2008 (Expoflores, 2010).
Durante este período, Ecuador estableció mercados seguros en el extranjero, siendo el
de mayor concurrencia el de la flor cortada en el 2008, donde el 74 % de las
exportaciones se destinó a Estados Unidos, 10 % a Rusia, 6 % a países bajos (Holanda)
y el 10 % restante se exportó al resto del mundo (Ministerio de Agricultura y Ganadería
del Ecuador, 2010).
Sin embargo, el cultivo de rosas se ve afectado por gran variedad de enfermedades y
plagas insectiles durante su ciclo biológico, afectando principalmente la calidad de la
flor para exportación (Ministerio de Agricultura y Ganadería del Ecuador, 2005)
representado grandes pérdidas económicas para los floricultores nacionales e
internacionales. Los problemas fitosanitarios pueden ser de origen fúngico, bacteriano y
viral, pero entre ellos destaca los problemas causados por hongos fitopatógenos
causantes de las mayores pérdidas económicas en el mundo (Agrios, 2005). Entre los
hongos fitopatógenos más frecuentes en el cultivo de rosa están Botrytis, Diplocarpon,
Phragmidium y Sphaerotheca, los cuales provocan graves daños en el cultivo (Cabrera
et al., 2006).
Específicamente Botrytis cinerea conocido comúnmente como el causante del “moho
gris”, es observado mediante la presencia de pequeñas manchas circulares de color
marrón/violeta, seguido de un micelio de color grisáceo que puede ocasionar
podredumbres en los botones florales, divisadas fácilmente por los técnicos de las fincas
(Williamson et al., 2007). Esta enfermedad es la causa de la mayor pérdida económica
para la industria de rosa a nivel mundial y en el Ecuador, afectando a más de 200
distintas especies vegetales, siendo un problema antes y después de la recolección de la
flor (Benito et al., 2000). Por otro lado, durante los últimos años en el Ecuador se ha
visto una considerable pérdida de sensibilidad del hongo a ciertos ingredientes activos
(fungicidas mono y poligénicos), por lo que es necesario dilucidar en específico la
pérdida de sensibilidad y la consecuente resistencia a las moléculas comúnmente
usadas.
La pérdida de sensibilidad de los hongos fitopatógenos a fungicidas, ha sido
desarrollada por la adaptación del hongo a ciertos grupos químicos, generando una
disminución de la acción del mismo sobre el fitopatógeno. En el Ecuador se han
desarrollado pocos trabajos de sensibilidad y resistencia a fungicidas, buscando
identificar el EC50 en la que el fungicida controla el 50 % del crecimiento del hongo.
Estos estudios se han basado en la “Metodología de evaluación de la sensibilidad a
2
fungicidas QOi fenamidone: caso de estudio Phytophthora infestans (Mont.) de Bary”,
donde se destaca claramente el uso e importancia del estudio de la sensibilidad a
fungicidas para mantener un control de los patógenos presentes en la planta (Escudero
et al., 2009).
La resistencia genética a fungicidas, es una de las principales limitantes de la
producción de las fincas florícolas en el Ecuador, debido a que se reduce las
herramientas para realizar un control efectivo de un determinado hongo, aumentando los
riesgos de pérdidas económicas para el sector florícola. Este tipo de resistencia se da por
una selección disruptiva del hongo mediante la aplicación constante de un determinado
fungicida, creando mutaciones genéticas que le permiten al hongo resistir la acción del
ingrediente activo. Existen varios estudios a nivel mundial que analizan los efectos de la
presión de selección (mediante la aplicación de fungicidas), gracias a esto se ha
detectado a lo largo de los años diferentes tipos de resistencias adquiridas por B.
cinerea, entre ellas se tiene las resistencias monogénicas, poligénicas y multidrogas
(Orellana, 2011).
Con esta premisa, este proyecto buscó establecer una línea base de sensibilidad a
fungicidas en aislamientos de B. cinerea obtenidos en las principales zonas productoras
del cultivo de rosas. Adicionalmente, una vez obtenidos los resultados del análisis de
sensibilidad, mediante análisis molecular se buscó determinar las posibles mutaciones
dentro de genes analizados del hongo, que otorguen resistencia monogénica a los
fungicidas probados en esta investigación. Con esta información, las empresas florícolas
podrán implementar un adecuado sistema de rotación de fungicidas con base en la
sensibilidad de sus aislamientos de B. cinerea, que mitigue el impacto que este patógeno
causa anualmente. Por otro lado, se espera proveer el estatus de resistencia a fungicidas
en cada una de las fincas participantes del proyecto, mejorando el sistema de manejo de
la enfermedad, además de la mejora consecuente de la calidad sanitaria del producto de
exportación, permitiéndole al floricultor conocer las mejores alternativas de control en
la actualidad en Ecuador.
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. El cultivo de rosa
En el Ecuador el cultivo de rosa se desarrolla en la región sierra dividida en las zonas:
norte, centro y sur de país, su mayor concentración está en las provincias de Pichincha y
Cotopaxi, donde el clima característico de la zona se encuentra entre los 2600 a 3000
msnm. Este cultivo se caracteriza por sus largos y gruesos tallos, además de sus colores
extravagantes que le caracterizan en el mercado internacional, las características
climáticas y de luminosidad propias de la región proveen a las rosas estos rasgos únicos
con un promedio de 15 días de vida en florero (ProEcuador, 2016).
2.1.1. Taxonomía
Según el Integrated Taxonomic Information System (ITIS) (2017), la clasificación
botánica de la rosa es la siguiente:
Reino: Plantae
División: Tracheophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Rosales
Familia: Rosaceae
Género: Rosa
2.1.2. Descripción botánica
La rosa posee raíz pivotante, vigorosa y profunda, tallo semi leñoso, crecimiento erecto
o sarmentoso, hojas compuestas de cinco a siete foliolos, flores con cáliz de cinco
sépalos y corola de un número variado de pétalos, frutos carnosos y anaranjados que
contienen numerosos aquenios (Yong, 2004).
2.1.3. Requerimientos edafoclimáticos del cultivo de rosas
Según Yong (2004), los requerimientos edafoclimáticos del cultivo de rosa son:
Luminosidad: 6 a 8 horas luz
Temperatura: 17 - 25 °C
Humedad relativa: 60 – 80 %
CO2: 1200 ppm
Suelos: textura franca, buen drenaje
pH: 5.5 – 6.5
2.1.4. Importancia del cultivo
Según el Expoflores (2014), el Ecuador posee grupos de exportación no tradicionales
como son las flores de corte, desarrollándose a través de los años con un alto índice de
crecimiento a nivel nacional, esto se debe a que el Ecuador posee microclimas con
buena luminosidad que le atribuyen a la flor los colores y características que el mercado
4
demanda hasta el día de hoy, considerándose uno de los productos más cotizados a nivel
internacional.
En el país, las rosas tienen como principal fuente de comercialización el mercado
internacional; sin embargo, alberga millones de empleados encargados del ciclo de
producción, manejo fitosanitario, cosecha, poscosecha y tiempo de vida en el florero,
con lo que le permite mantener estándares rigurosos para obtener un producto de calidad
aumentando su monto de exportación cada año y contribuyendo al PIB nacional, esta
actividad es una fuente importante del agro en el Ecuador (Expoflores, 2014).
La rosa en el Ecuador es un cultivo de importancia al ser un producto de exportación,
por lo tanto, su manejo fitosanitario debe ser muy riguroso, para mantener la calidad de
la flor en campo, poscosecha y en florero, pues el cultivo es afectado por varias plagas
de artrópodos como nematodos, ácaros e insectos, así como fitopatógenos
comprendidos entre bacterias, hongos y virus, de los cuales los mayores problemas de
las fincas ocurren por hongos (Yong, 2004).
Este cultivo alberga trabajadores principalmente del sector rural, contribuyendo una
principal fuente económica de las familias del campo, principalmente de la sierra
ecuatoriana, dividida en cada uno de los sectores de mayor concentración debido a las
características climáticas, que le permiten el mejor desarrollo de este cultivo obteniendo
cosechas durante todo el año; además, les permite a cada una de las fincas planificar la
obtención de rosas para cada uno de sus mercados a nivel internacional. En este sentido,
este cultivo constituye una de las plazas con mano de obra indirecta, cuya principal
función es ayudar a constituir el marco de exportación del cultivo como la industria del
cartón, papel, plástico, madera, agroquímicos, transporte, pallets, entorno legal, entre
otros (Grinstein et al., 1997).
Al ser un cultivo de gran importancia en el país existe mayor riesgos en su producción y
distribución, por ello es necesario mantener los estándares de calidad hasta que la flor
termine con su ciclo de vida en el florero; por otro lado, si este sector se vendría
vulnerable ante cualquier riesgo, las principales florícolas afectadas serían las pequeñas
por no tener adecuadas alianzas en los canales de distribución, por eso es necesario
evitar cualquier posible mutación de agentes causales de enfermedades que deterioran la
calidad del producto (Cabrera et al., 2006).
2.2. Moho gris
El “moho gris” es causado por el hongo Botrytis cinerea (Whetzel, 1945), orden
Helotiales y familia Sclerotiniaceae, el cual representa un gran problema en la
producción de rosas tanto en cultivo como en poscosecha. Dicha enfermedad tiene que
ser controlada a tiempo ya que puede generar grandes pérdidas a las empresas florícolas
sobre todo en la poscosecha (Glazebrook, 2005).
El hongo B. cinerea se desarrolla bajo ciertas condiciones ambientales, principalmente
una humedad relativa óptima del 90-95 % y una temperatura de 20-25 °C (Agrios,
2005). En el cultivo de rosa además de afectar a tallos y hojas, ataca también al botón
floral, presentándose como pequeños puntos marrones y rojizos en los pétalos; sin
embargo, el ataque más significativo ocurre en el tocón del corte de la flor, donde los
síntomas fluctúan dependiendo del nivel de infección del invernadero y la resistencia de
cada una de las variedades de rosas presentes en el Ecuador (Glazebrook, 2005).
5
Este tipo de hongo se puede dispersar por el viento, y posee micelio que se puede
multiplicar hasta en temperatura de 0 °C (Agrios, 2005). Botrytis cinerea presenta
diferentes fases infectivas una de las cuales es la formación de conidióforos que actúan
libremente en el sustrato colonizado, donde los cuerpos de resistencia del hongo se
conocen como esporodoquios. Además, el hongo se caracteriza por la formación de
micelio gris y cuerpos fructíferos unicelulares y ovoides, conocidos como conidios y
conidióforos ramificados que le permiten al hongo fácilmente desarrollarse en el tejido
infectado (Agrios, 2005).
2.2.1. Clasificación taxonómica (Botrytis cinerea)
Según el ITIS en el 2017, la clasificación taxonómica de Botrytis es:
Reino: Fungi
División: Ascomycota
Clase: Leotiomycetes
Orden: Helotiales
Familia: Sclerotiniaceae
Género: Botrytis
Especie: cinerea
2.2.2. Morfología
Botrytis forma en el sustrato conidióforos de forma libre o estructuras de resistencia
llamados esporodoquios, este patógeno se caracteriza por la forma de sus conidios
hialinos unicelulares de forma ovoide engrosadas cuyas ramificaciones le permiten la
colonización de sustrato en el que se encuentran (Agrios, 2005). Además, el patógeno
puede formar esclerocios de color negro de forma irregular (Ángel, 2017); dichos
esclerocios presentan un anillo oscuro y médula central blanquecina (Kerssies, 1994);
por otro lado, la forma sexual Botryotinia fuckeliana tiene apotecios, que contienen
ascos y ascosporas (Kerssies, 1994; Giraud, 1997).
2.2.3. Epidemiología
La epidemiología describe la interacción entre el patógeno, ambiente y hospedante;
además, es el estudio de la enfermedad en poblaciones que influencias la cantidad y
distribución del patógeno en un tiempo y un espacio determinados (Castaño, 2002).
Para esto es importante conocer el comportamiento del patógeno y sus cuerpos de
resistencia.
El micelio está constituido por un conjunto de hifas, que le permiten la multiplicación
por división citoplasmática, presentando varios núcleos, sin alterar la división, el
diámetro y coloración de las hifas es variable, dependiendo en qué condiciones se
desarrolle el micelio. Los macroconidióforos y macroconidios se originan en el micelio
o en los esclerocios, están formados de microfilamento que en la zona apical se ramifica
de forma alterna, presentando cada ramificación una vesícula globosa donde se
encuentran los macroconidios o conidios. Los microconidióforos y microconidios son
6
esféricos similares a los macronidios, pero de tamaño inferior entre 2 y 4 µm, sirven de
gametos masculinos en el ciclo sexual del hongo (Castaño, 2002).
Los esclerocios son estructuras de resistencia del hongo que le permiten la
supervivencia del mismo, estas estructuras están formadas por la fusión,
entrecruzamiento de hifas que generan un tejido compacto oscuro, su tamaño varía entre
1 a 5 mm de ancho y 1 a 15 mm de largo, dependiendo de factores como la temperatura,
la luz, la composición y el pH del tejido sobre el que se desarrollen. Por último, el
patógeno posee apotecios que son cuerpos fructíferos responsables de la reproducción
sexual del mismo, tiene un estípite y un himenio o tecio que se ensancha como embudo,
donde se encuentran las ascas que contiene en su interior un total de ocho ascosporas, lo
que le permite al hongo completar su fase sexual (Agrios, 2005).
La formación de estas estructuras se da a temperaturas entre 11 y 15 °C, días cortos y
alta humedad relativa. En cualquier época del año, alrededor del 90 % de los esclerocios
originados permanecen viables y esporulando (Moraga et al., 2003). Botrytis puede
permanecer como saprófito sobre restos vegetales, restos de poda y tejidos muertos de
planta hasta que encuentra las condiciones favorables para la germinación de los
esclerocios, las cuales son: formación de condensación (que pueden darse por lluvia,
llovizna, rocío o neblina densa), altas humedades relativas, luz difusa y fuertes
fluctuaciones de temperatura (máximas de 35,5 °C; óptimas de 15 – 25 °C y cerca de 0
°C como mínima) (Ángel, 2017). Según Agrios (2005), en condiciones favorables, los
esclerocios pueden evolucionar de dos formas: en forma de apotecios o en forma de
conidióforos.
2.2.4. Sintomatología y daños
En el cultivo de rosa los síntomas aparecen durante los primeros estadios del cultivo, en
tallos paralelos al suelo o en flores de tallos basales, el inóculo presente en el
invernadero se incrementa con las condiciones favorables para su crecimiento y afecta a
nuevos tejidos como tallos en crecimiento o pedúnculos de la flor, presentando
abundante esporulación por parte del hongo. Sin embargo, en las hojas se presenta
siempre y cuando la enfermedad presenta gran cantidad de inóculo que no ha sido
controlado a tiempo dentro del invernadero o en lesiones causadas por deshidratación
(golpe de sol) (Ángel, 2017).
Los síntomas que causan mayores pérdidas económicas del hongo están ubicados en los
pétalos de las rosas, debido a su rechazo por parte del mercado nacional e internacional,
presentándose como pequeñas pecas en pétalos externos de las flores más maduras del
cultivo, luego, colonizan el tejido de la flor y finalmente esporulan (Ángel, 2017).
Deteriorando drásticamente la calidad de la flor, pues son causa de rechazo durante el
proceso de clasificación en pos cosecha (Arbeláez et al., 2002)
2.3. Sensibilidad de Botrytis cinerea a fungicidas
En época lluviosa cuando el microclima se presenta apropiado para el crecimiento del
hongo, incrementan las infecciones y la probabilidad de aparecimiento de razas
mutantes del hongo. En este sentido, durante los últimos años este hongo ha ido
perdiendo sensibilidad a varios fungicidas, principalmente debido al constante uso de
ingredientes activos específicos para proteínas fúngicas. Cabe mencionar que Botrytis
7
tiene un amplio rango de hospederos secundarios en el Ecuador como son la frutilla, la
uva, entre otros. Gracias a las cualidades de adaptación del hongo a su medio, se han
manifestado diferentes varios tipos de resistencia adquirida a fungicidas (Agrios, 2005).
El grupo del fungicida determina si la sensibilidad y la resistencia puede ser
monogénica o poligénica, dentro de la resistencia monogénica está la resistencia
cruzada, y dentro de la resistencia poligénica está la resistencia a multidrogas. La
resistencia a los fungicidas puede estar gobernada por genes mayores únicos (resistencia
monogénica u oligogénica), así como como la gobernada por genes menores (resistencia
poligénica, mutaciones alélicas secuenciales).
2.3.1. La resistencia monogénica
Es la más rápida en aparecer, debido a que se presenta cuando se produce una mutación
en un solo gen constitutivo o codificante del hongo. Entre los principios activos que
causan este tipo de resistencia se encuentran las estrobirulinas (azoxystrobin), los
benzimidazoles (carbendazim y metil thiophanato) y las carboxamidas (boscalid); estos
ingredientes activos pueden incurrir en la mutación o cambio de cualquier aminoácido
en la secuencia de ADN del hongo B. cinerea (Gaspar, 2013), confiriéndole resistencia
a este tipo de moléculas químicas. Por lo tanto, al tener una estrecha relación química y
modo de acción, puede presentar el desarrollo de resistencia cruzada unos con otros
(Panebianco, 2012).
La resistencia monogénica o específica, presenta diferentes clases de susceptibilidad o
niveles de resistencia de tipo específicos relativamente simple, generando aislamientos
con una resistencia de tipo reversible, debido a que, la transferencia de la resistencia es
específica sobre un sitio de acción, es decir, se realiza de un germoplasma al otro; sin
embargo, las formas de resistencia específicas se rompen fácilmente con la mutación de
un solo gen o, a veces, de pocos genes (Niks et al., 1993). Renfro (1985), nos menciona
que, la resistencia específica realiza gran presión sobre el patógeno para su
supervivencia, el cual cambia su especificidad por acción de una mutación.
Adicionalmente, es importante señalar que la resistencia a fungicidas monogénicos es
de tipo reversible como se mencionó antes, es decir, que transcurrido cierto periodo de
tiempo sin el uso de fungicidas, tendremos una población de B. cinerea sensibles hasta
un 95 % al grupo químico (Billard et al., 2012), lo que según Leroch et al. (2013), nos
mencionan que, la pérdida de sensibilidad a fungicidas monogénicos se da por su modo
de acción en las proteínas, generando aislamientos resistentes, los cuales interactúan con
aislamientos silvestres, por ejemplo, si existe 40 % de aislamientos resistentes existirá
60 % de silvestres, esta proporción dependerá del tipo de mutación y presión de
selección sobre el patógeno, corroborando con esto, existen estudios en hortalizas y
frutales que demuestran que después de cierto tiempo sin el uso del grupo químico
aislamientos han generado sensibilidad al fungicida (Veloukas et al., 2011; Fernandez-
Ortuno et al., 2012)
2.3.1.1. Resistencia cruzada
La resistencia cruzada puede ser parcial o completa dependiendo de la presencia de uno
o más mecanismos que confieren la resistencia a los fungicidas, además esta se ha
desarrollado con frecuencia en aislamientos cuyo control químico del hongo presentan
8
el mismo modo de acción o se ven afectados por el sitio o mecanismo donde se va a
generar la resistencia. Un aislamiento adquiere la resistencia de varios grupos de
fungicidas pertenecientes al mismo grupo o familia como es el caso de las
carboxamidas, hidroxianhilidas, entre otros (FAO, 2012).
La resistencia conferida de un fungicida a otro, se debe a la presión de selección
disruptiva ejercida en el hongo, confiriéndole resistencia cruzada aun cuando el
patógeno no haya sido expuesto a uno de los productos involucrados en este tipo de
resistencia, parcialmente estudios han demostrado la presencia de resistencia cruzada
entre grupos de las carboxamidas, tales como boscalid, fluxapyroxad y pentiophyrad
(Brent & Hollomon, 2007b). Los principales factores para determinar la presencia de
este tipo de resistencia son por su modo de acción en el hongo, por lo tanto, no siempre
se relacionan químicamente; sin embargo, los tipos de mecanismos de cada uno de los
fungicidas pueden generar resistencia a compuestos de diferentes grupos químicos
(Damicone, 2007). En algunos casos la resistencia cruzada negativa ocurre cuando un
mecanismo de resistencia convierte a un organismo resistente a un fungicida en
susceptible a otro fungicida (casos aun por estudiar (FAO, 2012).
2.3.2. La resistencia poligénica
Aparece de forma más lenta, ya que esta surge por la mutación de uno o más genes
constitutivos o codificantes. Dentro de estas se encuentran los triazoles,
anilinopirimidinas, fenilpirroles, entre otros. El uso de dosis completas minimiza la
selección de aislamientos con sensibilidad intermedia cuando la resistencia es
poligénica (resistencia cuantitativa) (Gaspar, 2013). La resistencia cruzada implica que
moléculas fungitóxicas que pertenecen al mismo grupo químico con el mismo MoA
(modo de acción) (gobernados por el mismo factor génico), tienen mayor probabilidad
de no ser efectivas contra un aislamiento que ha generado resistencia contra otra
molécula del mismo grupo, aun cuando nunca fueron utilizadas contra ese patógeno
(Brent & Hollomon, 1998; Carmona, 2007a). Por el contrario, cuando un hongo se torna
resistente a moléculas de diferentes MoA, se denomina resistencia múltiple (Gaspar,
2013).
La resistencia poligénica o no específica, cuantitativa u horizontal, es difícil de manejar,
debido a que en la misma participan un gran número de genes de confieren la resistencia
del patógeno al grupo de fungicidas poligénicos. Las clases de resistencia generan una
susceptibilidad difícil de reconocer por el efecto de cada uno de los genes involucrados
de tipo limitado. La resistencia poligénica no es reversible, es decir, presenta una gran
estabilidad y durabilidad, por el efecto amortiguador del sistema poligénico
(Vanderplank, 1984).
2.3.3. La resistencia a multidrogas
Se detecta mediante una prueba de sensibilidad cuyo EC50 debe ser menor a 0,50
μg/cm³. Debido al uso de subdosis en los grupos químicos para el control del patógeno,
generando una posible mutación en el hongo que le permite desarrollar grupos de
resistencia. Existen tres grupos estudiados en el cultivo de uva que se asocia a los demás
cultivos donde B. cinerea se establece, el grupo 1 de resistencia multidroga (MDR1)
asociado a la pérdida de sensibilidad a los fenilpirroles (fludioxonil) con un incremento
en algunas zonas especialmente en la VI Región, de los niveles mínimos necesarios de
9
IBES (índice de bienestar económico sostenible) para controlar las poblaciones del
patógeno; el grupo 2 (MDR2) tiene una resistencia leve a moderada a
anilinopyrimidinas y a dicarboximidas, y en el grupo 3 (MDR3) tiene una alta
sensibilidad a hydroxyanilidas (Esterio et al., 2009). Estos tres tipos de grupos
resistentes a diferentes compuestos químicos está asociado a una sobrexpresión de
ciertas proteínas de la membrana citoplasmática de B. cinerea, permitiéndole impedir el
ingreso de moléculas externas y entre éstas los fungicidas, dándole una característica de
desintoxicación, cuyo efecto del fungicida es menor, inhibiendo su ingrediente activo o
bloqueando el efecto que se produce para el control del hongo (Gaspar, 2013).
Según Esterio et al. (2009), entre las principales moléculas que se ocupan dependen del
tipo de resistencia como:
Resistencia monogénica-cruzada
Carboxamidas
Benzimidazoles
Estrobilurinas
Resistencia poligénica
Triazoles
Anilinopirimidinas
Fenilpirroles
Resistencia multidrogas
Anilopirmidinas
Dicarboxamidas
Fenilpirroles
Hidroxianhilidas
2.4. Importancia de la caracterización patogénica
Botrytis cinerea principalmente actúa como necrótrofo o saprófito de la planta
hospedera, donde se localiza inicialmente en el tejido en descomposición o plantas
debilitadas para su colonización y posteriormente coloniza el tejido sano. B. cinerea es
un hongo capaz de actuar como un invasor secundario, es decir, coloniza plantas
infectadas por algún otro patógeno, pero su principal característica es la rápida
colonización primaria en un hospedero a través de la cutícula de la planta, por medio de
la producción de enzimas degradantes de los componentes de la cutícula. En el caso de
la rosa, el hongo ataca a diferentes tejidos, incluyendo flores, tallos, hojas sanas o
ligeramente en descomposición, por eso el control es muy importante durante la fase de
campo, cosecha, pos cosecha, transporte y almacenamiento de la rosa. Una práctica muy
común para limitar el avance de este hongo sobre los tejidos senescentes, es retirar los
mismos de la rosa, ya que estos facilitan la colonización del hongo de manera muy
eficiente, afectando a los tejidos vecinos que permanecen aún sanos (Gaspar, 2013).
10
Actualmente, el potencial evolutivo de las poblaciones de B. cinerea se han visto
reflejadas en su estructura genética, adquirida a través de su ciclo evolutivo. Estas
nuevas poblaciones de Botrytis con un potencial alto evolutivo ha tenido más
posibilidades de adquirir resistencia genética en cada uno de los hospederos debido a su
presión de selección por el uso de fungicidas sistémicos; esto se explica por medio del
tipo de reproducción que tiene el hongo en su fase asexual y sexual, es decir mixta,
permitiéndole desarrollar un alto flujo genético, tasas de mutaciones muy altas y
tamaños de población efectivamente grandes por su alto número de hospederos al nivel
mundial (Mc Donald & Linde, 2002).
En estudios realizados al hongo se estableció que la fase sexual de B. cinerea no tiene
un papel importante dentro del alto potencial evolutivo que presenta el hongo,
principalmente debido a que posee un rango muy amplio de hospederos, y la
distribución geográfica que tiene el Ecuador generando microclimas, le han permitido al
hongo adaptarse y adquirir resistencia de forma natural, además, de la presión de
selección causada por la aplicación de fungicidas. Según Gindle (1979), la variabilidad
presentada por B. cinerea se debe a la anastomosis que producen el micelio entre sus
hifas, dando lugar a células heterocarióticas casi siempre y multinucleadas. Bowen,
(2002), observó que los núcleos de los aislamientos presentes del hongo pueden migrar
al interior de las células de hifas vecinas por la anastomosis, formando así un micelio
heterocariótico capaz de adquirir resistencia.
2.4.1. Expresión génica en Botrytis cinerea
Botrytis cinerea tiene una amplia variedad de elementos genéticos extracromosómicos,
incluyendo los plásmidos, elementos transponibles y los cromosomas de las
mitocondrias. Estas variaciones se dan por la dinámica poblacional existente de B.
cinerea, debido a los transposones que son elementos móviles que poseen los genes del
hongo (Elad, 2007). Según Bowen (2002), estos elementos transposones son secuencias
genómicas abundantes, repetitivas y ubicuas en organismos que son capaces de moverse
de una localización cromosómica a otra, como el caso de Botrytis, permitiéndole
replicarse a sí mismo, siendo este la esencia del éxito evolutivo del hongo, adquiriendo
implicaciones importantes entre los elementos del hongo y sus hospederos.
2.4.2. Genes de resistencia de Botrytis cinerea a fungicidas
Los genes de resistencia de B. cinerea se describieron inicialmente en dos patotipos,
basados en la presencia o ausencia de retrotransposones: la primera la “Transposa” que
presenta dos retrotransposones “Boty” y “Flipper” y la segunda “Vacuma” la cual no
presenta retrotransposones (Diolez et al., 1995; Levis et al., 1997). Fournier y
colaboradores, en el 2005, mencionan que la diferenciación genética determinada
mediante múltiples secuencias de genes no es concordante con los patotipos
previamente descritos. Por lo tanto, B. cinerea se divide en Grupo I y Grupo II,
mostrándose como especies filogenéticamente crípticas. Este grupo de genes muestran
una resistencia al fungicida fenhexamid, por lo cual se le conoce como FenR (resistente)
Grupo I y FenS (Sensible) Grupo II.
En el Grupo I se han detectado los patotipos “Vacuma”, solo “Flipper” o solo “Boty”,
mientras que en el Grupo II se han detectado todos los tipos de transposones (Isenegger
et al., 2008). La virulencia de los patotipos de Botrytis cinerea ha sido ampliamente
11
estudiada en uva; sin embargo, en Rosa sp., hasta el momento no se han encontrado
estudios al respecto.
Chamorro (2005), reporta la única investigación realizada en Ecuador sobre la detección
de patotipos de B. cinerea en rosa; en este estudio se encontró una prevalencia del 90 %
para el patotipo “Transposa” y el 10 % restante para el patotipo “Vacuma”, de un total
de 21 aislados obtenidos en las provincias de Cayambe y Cotopaxi.
En Chile se realizó un análisis del comportamiento de sensibilidad a la dicarboxamida
(iprodione) en aislamientos del hongo, detectando que el genotipo Transposa es aquel
que genera resistencia a este fungicida (Esterio et al., 2011). Esterio et al. (2006),
determinaron el porcentaje mayor de fenotipos resistentes dados por el genotipo
Transposa y en menor proporción al genotipo Flipper, los que adquieren resistencia a
los fungicidas benomyl, vinclozolin, dichlofluanid, pyrimetanil, fenhexamid y
fludioxonil.
2.5. Principales mutaciones en Botrytis cinerea
En Botrytis cinerea se puede presenciar mutaciones aberrantes (mutación con mayor
eficacia y rango de acción), o puntual cruzada completa, medianamente aberrantes
(mutaciones con espectro medianamente de eficacia de acción) o puntual cruzada
incompleta y poco aberrantes (mutaciones con menor espectro de eficacia de acción) o
puntual (Amiri et al., 2014)
2.5.1. Aberrantes
2.5.1.1. P225
La mutación P225 es aquella que se presenta en el grupo de las carboxamidas,
cambiando la estructura de la proteína para que el sitio de reconocimientos del grupo
químico no enlace sus puentes de hidrógeno por lo tanto inactiva la eficiencia del
producto para el control de Botrytis cinerea esta mutación es considerada aberrante ya
que imposibilita la acción del fungicida en su totalidad (Satammler, 2008).
2.5.1.2. F412
Según Billard et al. (2012), en general, si se presentan 100 aislados bajo condiciones de
mal manejo de fenhexamid cuyo grado de sensibilidad es mayor de 100 la posibilidad
de encontrar la mutación es del 90 %. Las mutaciones F412S y F412V fueron
registradas por Esterio (2012), en aislados chilenos de uva de mesa, afirmando que el
grado de supervivencia para los aislados de Botrytis cinerea bajo condiciones de
invernadero son altas por que cambia el sitio de reconocimiento y fenhexamid ya no
entra a actuar en el mitocondrio por lo que baja la eficiencia del fungicida.
2.5.1.3. G143A y E198A
Las mutaciones G143A y E198A están presentes en los grupos de estrobilurinas y
benzimidazoles que han adquirido un alto grado de sensibilidad al hongo de Botrytis sp.
debido a una presión de selección direccional, generando adaptabilidad de todos los
aislamientos del hongo a los grupos químicos. G143A afecta el citocromo b que es una
proteína del mitocondrio cuya función principal está presente en la cadena respiratoria,
12
estas mutaciones generan sustituciones de aminoácidos individuales en el citocromo b
que confieren resistencia a QoIs, teniendo la capacidad de generar mayor cantidad de
micelio y mayor porcentaje de colonización impidiendo que el fungicida actué en el
hongo (Grasso et al., 2006).
2.5.2. Medianamente y poco aberrantes
2.5.2.1. L195F y V309M
Estas mutaciones se presentan en el grupo químico de las hidroxianhilidas por el mal
uso de fenhexamid sin embargo están presentes en las proteínas cuya función o
estructura no afecta la forma principal ni el sitio de reconocimiento a fenhexamid por lo
que el fungicida no pierde su porcentaje de efectividad en el hongo (Esterio et al.,
2012).
2.5.2.2. H272
La mutación H272 según Veloukas et al. (2011), afecta la susceptibilidad a todos los
SDHI, afectando la respiración al disminuir la actividad de “SDH”. Es una mutación
medianamente aberrante, es decir que los aislados que presentan la mutación H272R/Y
presentan ciertos parámetros de adaptabilidad característicos de la mutación, como es la
capacidad de formar esclerocios, el crecimiento del micelio y la esporulación,
generando en el hongo un gasto metabólico que le permite generar adaptabilidad en sus
futuras generaciones.
2.6. Concentración efectiva del fungicida
Para medir la sensibilidad de un hongo a un fungicida, se utiliza la concentración
referencial a la que el fungicida inhibe el crecimiento, germinación o alguna otra
variable relevante del hongo. Para confirmar la resistencia de un manejo en las
dosificaciones de cada fungicida utilizadas en campo, generando una respuesta a las
dosis que vendrían a ser las requeridas para reducir el 50 % o más la infección del
patógeno (EC50) (Hollomon, 2015).
En este sentido, la concentración efectiva 50 (CE50 o EC50) es la concentración que
inhibe el 50 % del crecimiento del hongo en un medio artificial. Si se quiere determinar
la pérdida de sensibilidad a una molécula química, se deben comparar aislados que
nunca hayan sido expuestos al fungicida y otros que, si hayan sido expuestos al mismo,
para de esta manera establecer esta relación entre ellos. La relación entre la EC50 del
aislado resistente y la EC50 del aislado sensible, se lo llama factor de resistencia (FR)
(Arauz, 1998).
Un patógeno es resistente y tiene una posible mutación si el valor del EC50 es al menos
dos veces mayor al EC50 de los aislados silvestres sensibles al fungicida (Delp &
Dekker, 1985), esto es posible identificar si las variables del ambiente se encuentran
rigurosamente controladas y los datos experimentales de los ensayos son sometidos a un
análisis estadístico (Grindle & Faretra, 1993).
13
2.7. Modelo de regresión Probit y Logit
Si la variable en estudio es dicotómica es decir la respuesta ante algún estímulo es
positivo o negativo, la mayor parte del tiempo se requiere conocer estimaciones de este
con diferentes niveles de probabilidad, así como también sus intervalos de confianza.
Las frecuencias de respuesta positiva se expresan en proporciones respecto al tamaño
del grupo por cada categoría del estímulo; ejemplos de estímulos son: tiempo de
exposición, dosis de un plaguicida, precio de un producto, etc. Los modelos
relacionados con este tipo de variables tienen aplicaciones muy diversas; en el campo de
la biología, por ejemplo, son importantes para la determinación del EC50 que es, la
“concentración media efectiva a la cual un único tóxico inhibe el 50 % del crecimiento
de un organismo”, es decir, que produce el efecto deseado en un 50 % de los
organismos expuestos al estímulo. Una aplicación relacionada es la determinación del
DL50 que corresponde a la dosis letal media para insectos (Otero,2015).
Entre los diferentes modelos de regresión que relacionan la proporción de respuesta con
los valores de estímulo están los Probit y los Logit.
• En los modelos Probit la relación mencionada se estudia transformando cada
proporción observada en valores z (puntuaciones de la normal estándar).
• En los modelos Logit cada proporción observada (p) es transformada en ln (𝑝1−𝑝).
Por otro lado, la variable estímulo es muchas veces transformada a su logaritmo de base
10 o a su logaritmo natural, esperando que los resultados de la regresión sean similares
aplicando uno u otro modelo (Otero, 2015).
14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Material
3.1.1. Materiales de campo
Cajas plásticas de 25 x 15 cm
Cajas petri plásticas 9 x 0,15 cm
Papel toalla
Agua destilada
Marcador permanente
3.1.2. Materiales y equipos de laboratorio
Cajas Petri de plástico (9 cm de diámetro)
Vaso de precipitación de 100 cm³
Mechero de alcohol
Aguja de disección
Bisturí
Escalímetro
Pipetas Pasteur
Frascos autoclavables de 500 cm³
Cámara de flujo laminar
Incubadora 25 °C
Autoclave
Balanza Ap: + 0.01 kg
Micro pipetas: Ap: +1000 µl, 10-100 µl, y puntas
3.1.3. Medio de cultivo y reactivos
PDA (Papa-dextrosa-agar)
Agua destilada esterilizada
Hipoclorito de sodio 2.5 %
Alcohol 96 %
Fungicidas: Mefentrifluconazole, Fluxapyroxad, Prochloraz, Fluopyram +
Pyrimethanil, Pyraclostrobin, Cyprodinil + Fludioxonil, Fluazinam, Fenhexamid,
Boscalid, Pyrimethanil y Thiophanato methyl.
Kit de amplificación para PCR punto final “Platinum SuperFi DNA
Polymerase” (Thermo Fisher Scientific).
Agua ultrapura con DEPC (Invitrogen)
Buffer 10X (Invitrogen)
Agarosa (Invitrogen)
TBE 1X
3.1.4. Equipos
Cámara de bioseguridad (BIOBASE)
Cámara de electroforesis horizontal (C.B.S. Fisher Scientific)
Termociclador en tiempo real CFX96 Touch™ Real-Time (BioRad)
Centrífuga (Eppendorf)
Incubadora (Memmert)
Bloque de calefacción (Heallux®)
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3.2. Métodos
3.2.1. Ubicación
Fase de campo
Se trabajaron con 14 muestras de botones de rosas afectados por Botrytis cinerea con
leves pústulas color marrón oscuro característico del patógeno, recolectadas de las
principales florícolas en la provincia de Pichincha y Cotopaxi en la sierra ecuatoriana.
Estas muestras fueron llevadas para su procesamiento al Laboratorio de Fitopatología de
la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador.
Cuadro 1. Codificación del material vegetal empleado en las pruebas de sensibilidad.
Código aislamiento Provincia Cantón
A1 Pichincha Cayambe
A2 Pichincha Cayambe
A3 Pichincha Cayambe
A4 Pichincha Tabacundo
A5 Pichincha Tabacundo
A6 Cotopaxi Lasso
A7 Pichincha Cayambe
A8 Pichincha Cayambe
A9 Pichincha Cayambe
A10 Pichincha Tabacundo
A11 Pichincha Machachi
A12 Pichincha Cayambe
A13 Pichincha Tabacundo
A14 Silvestre Tumbaco
Fase de laboratorio
En el laboratorio se procedió a realizar el aislamiento primario y la purificación del
hongo Botrytis en medio de cultivo PDA acidulado (Papa Dextrosa Agar). Los botones
florales de rosas con presencia de manchas pardas de las 14 fincas de evaluación, se
colocaron en cámaras húmedas elaboradas en bandejas plásticas con papel toalla y
humedecidas con agua destilada, para favorecer la esporulación del hongo sobre el
tejido vegetal. A continuación, se detallan los pasos que se usaron para el aislamiento
según (Orellana, 2011):
a. Se preparó PDA (39 g/L), esterilizándose a 15 psi y 121 °C durante 15 minutos.
En la cámara de flujo laminar, se dispensaron 20 cm³ de PDA aproximadamente,
en cada caja Petri.
b. Posteriormente, se aislaron pétalos de rosa con manchas pardas, cortando
segmentos pequeños de 5 a 10 mm a partir del borde de la lesión, tratando de
que contenga tanto tejido sano como enfermo.
c. Luego se desinfectaron los segmentos en una solución de hipoclorito de sodio al
2.5 %, durante 3 minutos, además se realizaron tres enjuagues con agua
destilada estéril, para eliminar o reducir los contaminantes de la superficie que
pudieran interferir con el aislamiento de Botrytis.
16
d. Bajo la cámara de flujo laminar, se sembraron cinco segmentos de pétalos en
cada una de las cajas con PDA, se rotuló y selló respectivamente.
e. Después se incubaron las cajas a 25 oC durante 7 días. Pasado este tiempo, se
verificó la presencia de conidios típicos de Botrytis, usando para ello el
microscopio óptico. De los aislamientos obtenidos, se procedió a realizar la
purificación o aislamiento secundario.
f. Se purificaron los aislamientos, con la ayuda de una aguja de inoculación
tomando una pequeña porción de micelio de Botrytis, se sembró en el centro de
una caja Petri con medio de cultivo PDA. Posteriormente se incubó a 25 °C
durante 6 a 7 días, tiempo al que a contraluz se observaron las colonias de
conidios germinadas
g. Finalmente, mediante un microscopio óptico se confirmó la identidad del hongo
3.2.2. Análisis de sensibilidad a fungicidas
Preparación de soluciones madre del fungicida según (Orellana, 2011)
Se esterilizaron frascos con 500 y 100 cm³ de agua destilada a 121 °C y 15 PSI por 20
minutos, para preparar la solución madre # 1 de 1000 ppm de concentración de cada
fungicida en los 100 cm³ de agua esterilizada. Se tomaron en cuenta cinco
concentraciones para cada fungicida en estudio (0; 0.1; 1; 10 y 100 ppm), por lo que a
partir de la concentración a la cual se encuentra cada ingrediente activo, se determinó la
cantidad de fungicida a utilizarse en cada tratamiento.
Dosificaciones: Las dosificaciones se calcularon con base en la concentración del ingrediente activo.
Cuadro 2. Concentraciones del ingrediente activo propuestas en esta investigación.
Código Concentración ppm Concentración en 500 cm³
D1 0 0
D2 0.1 50 μl
D3 1 500 μl
D4 10 5 cm³
D5 100 50 cm³
Las dosis se obtuvieron tomando como base las concentraciones de cada ingrediente
activo, descritas en la ficha técnica de los productos, y convirtiéndolas mediante
cálculos matemáticos a partes por millón (ppm) para cada dosis requerida. A
continuación, tomando como ejemplo el fungicida fluazinam de concentración 300 g.L-1
de ingrediente activo, se describe el cálculo realizado para una dosis:
(10000) ppm=1%
500g/L→50,0%→ (500000) ppm
Solución Madre 1
C1V1=C2V2
(500000ppm) *V1=(1000ppm) (100cm³)
V1=0,200 cm³
Dosis 1
17
C1V2=C2V2
(1000ppm) *V2=(100ppm) (500 cm³)
V2=50 cm³
3.2.3. Sensibilidad a fungicidas
Se utilizó la metodología propuesta por Borja (2011), la misma que es modificada por
los autores de esta investigación:
• En las concentraciones de 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm, 0,1 ppm y 0 ppm para cada
fungicida en medio PDA y Agar Extracto de Malta (Extracto de malta: 30 g/l,
Peptona: 3 g/l, y Agar: 15 g/l) (específicamente para el todo el grupo químico de las
carboxamidas), se inoculó una sección de aproximadamente 5 mm de diámetro con la
ayuda de una pipeta Pasteur y se colocó en el centro de cada caja para su
correspondiente evaluación.
• Se incubaron los tratamientos a 28 oC, hasta que el testigo en cada fungicida y en
cada finca llene todo el diámetro de la caja.
A continuación, se describe los fungicidas seleccionados para esta investigación:
Cuadro 3. Formulación y concentración del ingrediente activo de cada fungicida.
Código Ingrediente activo Formulación Concentración
I.A.
F1 Pyrimethanil Suspensión concentrada (SC) 400 g/L
F2 Mefentrifluconazole Suspensión concentrada (SC) 400 g/L
F3 Boscalid Gránulos dispersables (GD) 500 g/L
F4 Fluxapyroxad Suspensión concentrada (SC) 300 g/L
F5 Prochloraz Concentrado emulsionable (EC). 450 g/L
F6 Fluopyram +
Pyrimethanil
Suspensión Concentrada (CS). 125 g/L P 375
g7L F
F7 Pyraclostrobin Concentrado emulsionable (EC) 250 g/L
F8 Cyprodinil +
Fludioxonil
Gránulos Dispersables (WG) 250 g/L +375
g/L
F9 Fluazinam Suspensión Concentrada (SC). 500 g/L
F10 Fenhexamid Suspensión Concentrada (SC). 500 g/L
F11 Metil thiophanato Suspensión concentrada SC 500 g/L
3.2.4. Unidad Experimental
La unidad experimental de esta investigación está constituida por dos cajas Petri para
cada tratamiento.
Número de fincas: 14
Número de fungicidas: 11
Número de concentraciones: 5
Total de unidades experimentales: 770
18
3.2.5. Análisis funcional
Con los datos obtenidos del crecimiento micelial para cada fungicida en las cinco dosis
evaluadas, se calculó el EC50 mediante modelos de regresión Probit y logaritmo natural
(Ln). Todos los cálculos se realizaron con el programa estadístico Infostat Versión
Estudiantil 2018.
La ecuación que se utilizó para transformar los valores de cada observación se describe
en el siguiente ejemplo:
Cálculo de los coeficientes de regresión:
( )( )
( )
( )( )
( )
( )
Probit (pi)=0,1969+0,68866 In(d)
Determinación del EC50:
Probit (0,5) = 0,1969+0,68866 In(d)
( )
( ) 𝑝𝑝
3.2.6. Determinación de la resistencia genética de Botrytis cinerea a fungicidas
Una vez determinado el EC50 y el factor de resistencia para cada fungicida de las fincas
analizadas, se procedieron a seleccionar los aislamientos que muestren escasa o nula
sensibilidad hacia un determinado ingrediente activo. En ese sentido, los aislamientos
fueron multiplicados en PDA acidulado, y se procedió a realizar la extracción de ADN
de los mismos.
3.2.7. Extracción de ADN fúngico
La extracción de ADN se realizó mediante el método de “Lisado Preparación (hongos
que crecen en placas o cultivo)” según el kit de extracción de ADN genómico de
levadura para hongos (NORGEN) que ha sido modificado por Caicedo y Calderón en
2019:
a) Añadir aproximadamente 5 cm³ de “Collection Buffer” (0,9 % de NaCl) dentro
de la caja de Petri con el hongo (el volumen del buffer puede ser ajustado en
19
base a densidad del micelio del hongo). Con la ayuda de un asa de platino
recoger suavemente las esporas y el micelio, asegurando de no recoger cualquier
residuo de medio de cultivo.
b) Transferir hasta 1 cm³ de la solución de esporas y micelio a un tubo de
microcentrífuga nuevo esterilizado (proporcionado en el kit).
c) Centrifugar el tubo a 14.000 rpm durante 1 minuto para precipitar un pellet
fúngico. Retirar el sobrenadante precautelando de no tocar el pellet que se
sedimenta en la base del tubo.
d) Añadir 500 µl de “Lysis Buffer L” al pellet fúngico. Resuspender el pellet
mediante con el buffer mediante agitación suave. Si se requiere que el ADN
genómico quede libre de ARN, añadir el equivalente a 10 unidades de la RNasa
A la suspensión celular.
e) Transferir toda la suspensión a un “Lysis Tube” (proporcionado en el Kit), y
proceder a agitar horizontalmente en el vórtex durante 10 minutos a velocidad
máxima.
Nota: La formación de espuma durante la homogeneización es común. Esto se
debe a la presencia de detergentes en el “Lysis Buffer L”. Esto no afectarán los
resultados del protocolo.
f) Después de homogenizar la solución, incubar el “Lysis Tube” a 65 oC durante
10 minutos. Mezclar ocasionalmente el tubo (2 o 3 veces durante la incubación)
cada 3 minutos.
g) Transferir todo el contenido lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga
esterilizado.
h) Centrifugar el tubo durante 2 minutos a 14.000 rpm, y transferir cuidadosamente
el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga (proporcionado por el
usuario) sin tocar el pellet. Hay que tomar en cuenta el volumen del
sobrenadante retirado.
i) Añadir un volumen de etanol al 96 al 100 % (provisto por el usuario),
equivalente al sobrenadante retirado anteriormente (Ej. 100 µl de etanol se añade
a cada 100 µl de sobrenadante). Adicionalmente, añadir 300 cm3 de “Solución
BX” y agitar brevemente la mezcla.
j) Dentro de un tubo “Spin Column”, colocar un volumen de 650 µl de la mezcla
con etanol y centrifugar durante 1 minuto a 10.000 rpm.
k) Repetir el paso anterior hasta terminar de filtrar toda la mezcla a través de la
columna. Nota: Si todo el volumen de la mezcla no ha pasado, centrifugar el
tubo durante un minuto adicional a 10.000 rpm.
l) Aplicar 500 µl de “Wash Buffer A” al “Spin Column” y centrifugar durante 1
minuto a 10.000 rpm. Nota: Asegúrese de toda el Wash Buffer A haya pasado a
través del filtro del tubo. Si todo el volumen de lavado no ha pasado, centrifugar
el mismo durante un minuto adicional a 10.000 rpm.
m) Para secar el filtro del “Spin Column” de residuos de buffer, centrifugar durante
2 minutos a 14.000 rpm. Desechar el tubo de recolección y conservar la
columna.
n) Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección suministrado con el kit.
Añadir 50 µl de “Elution Buffer B” en el centro de la columna y dejar reposar de
45 segundos a 1 min. Luego centrifugar durante 2 minutos a 10.000 rpm.
o) Los ácidos nucleicos purificados pueden ser almacenadas a -20 °C durante unos
pocos días. Se recomienda que las muestras se colocan a -70 °C para
almacenamiento a largo plazo.
20
3.2.8. Reacciones de PCR
El DNA se cuantificó y su calidad fue determinada mediante nanofotometría. Las
reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando la Master Mix Platinum Super Fi de
Invitrogen.
Los genes para el estudio fueron los siguientes: sdhB (dehydrogenase), erg27 (3-
ketoreductase), β tubulin (beta tubulina) y cyt b (citocromo b). Estos genes son
específicos para B. cinerea, cada gen se ha desarrollado para detectar cierto grupo de
aminoácidos que son característicos del hongo, estos genes amplifican en diferentes
pares de bases, permitiéndonos determinar diferentes regiones de ADN que pueden
presentar mutación a grupos químicos de los fungicidas, cada gen además, es especifico
a diferentes grupos químicos que presentan los fungicidas, en este estudio se va
analizaron los grupos químicos de carbozamidas con el gen sdhB (dehydrogenase),
Hydroxyanilidas con el gen erg27 (3-ketoreductase) estrobilurinas con el gen cyt b
(citocromo b) y metil thiophanato con el gen β tubulin (beta tubulina) (Caicedo, 2019).
Las reacciones de PCR tuvieron un volumen final de 25 µl, mismo que quedó
compuesto de 12,5 µl de 2X Platinum Super Fi Master Mix, 1,25 µl de cada cebador (10
uM), 2 µl del ADN a una concentración de (10 ng/µl) y 5ul de SuperFi GC Enhancer.
Las condiciones de PCR estuvieron compuestas de una desnaturalización inicial a 98oC
durante 30 segundos, seguida de una desnaturalización de 98 oC durante 10 segundos,
una temperatura de hibridación de los cebadores (Cuadro 4) durante 10 segundos, una
temperatura de extensión de 72 oC durante 23 segundos, estos 3 últimos pasos se
repitieron 35 ciclos, para finalmente llegar una temperatura de extensión final de 72 oC
durante 5 minutos. Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al
1.2 % en buffer TBE1X. Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit
“PureLink PCR Purification Kit de Invitrogen” siguiendo las instrucciones del
manufacturero. Las muestras purificadas fueron secuenciadas utilizando facilidades
comerciales de la empresa Macrogen en los Estados Unidos.
21
Cuadro 4. Cebadores usados para las reacciones de PCR en esta investigación.
Cebador Secuencia Familia química Gen objetivo TM* Referencia
Primer
forward:
IpBcBeg
CCACTCCTCCATAA
TGGCTGCTCTCCGC
Carboxamide sdhB
dehydrogenase
60 (Esteriol et
al., 2017)
Primer
reverse:
IpBecEnd2
CTCATCAAGCCCCC
TCATTGATATC
Carboxamide sdhB
dehydrogenase
60 (Esteriol et
al., 2017)
Primer
forward:
erg27Beg
TGGGATTACCACCA
TGGGAGACAAGTG
Hydroxyanilide erg27
3-ketoreductase
68 (Grabke et
al., 2013)
Primer
reverse:
erg27End
CAATGGTTCCGCAT
TTCTTTGCCTCCC
Hydroxyanilide erg27
3-ketoreductase
68 (Grabke et
al., 2013)
Primer
forward:
erg1800
down
CCGCCACTTATTCC
GCAGATGTT
Hydroxyanilide erg27
3-ketoreductase
68 (Grabke et
al., 2013)
Primer
reverse:
erg2000up
TCGGAGGGTTTGGC
TTGTTTTG
Hydroxyanilide erg27
3-ketoreductase
68 (Grabke et
al., 2013)
Primer
forward:
BcAR-F
GGCAAATGTCACT
GTGAGC
Estrobilurinas cyt b
citocromo b
55 (Esteriol et
al., 2017)
Primer
reverse:
BcAR-R
ACCATCTCCATCCA
CCATACCT
Estrobilurinas cyt b
citocromo b
55 (Esteriol et
al., 2017)
Primer
forward:
Bcb-F
CACTGAGGGTGCT
GAGCTTGT
Benzimidazoles β-tubulin 53 (Mekwilai y
Nalumpang,
2017)
Primer
reverse:
Bcb-R
GAAGCGGCCATCA
TGTTCTTA
Benzimidazoles β-tubulin 53 (Mekwilai y
Nalumpang,
2017)
Primer
forward:
N230I-fw
GACCCAGCACCAG
AAGGAAAAG
Carboxamides SdhB
dehydrogenase
61 (Esteriol et
al., 2017)
Primer
reverse:
N230I-rev
GATAGCTGGTCCCA
AGTACTCCTCACGG
Carboxamides sdhB
dehydrogenase
61 (Esteriol et
al., 2017)
TM*(Temperatura de melting del cebador): Es la temperatura a la cual el 50 % de los
cebadores están unidos y el 50 % están en solución, esta es dependiente de la
concentración del cebador, la composición de la secuencia y de la composición del
solvente y es diferente a la temperatura de disociación (Esterio et al., 2017)
22
3.2.9. Determinación de las mutaciones que confieren resistencia
Las secuencias obtenidas de los genes analizados fueron editadas mediante el uso del
programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), usando para ello
información de genes de aislamientos sensibles y resistentes, obtenidas del banco
mundial de genes (GenBank). Para el alineamiento y traducción de la secuencia de
nucleótidos a aminoácidos, se usó el algoritmo MUSCLE (http://guidance.tau.ac.il/)
(Penn et al., 2010) del programa MEGA 10.0.5 (http://www.megasoftware.net/).
23
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. FUNGICIDAS CON ACCIÓN MONOGÉNICA
4.1.1. Determinación de la Eficiencia de Concentración 50 (EC50)
Al evaluar los 14 aislamientos de Botrytis cinerea con los 11 fungicidas, se determinó la
existencia de aislamientos poco sensibles para los fungicidas boscalid, fluxapyroxad,
fluopyram. fenhexamid, pyraclostrobin y metil thiophanato, debido a que su EC50 estuvo
entre 50 y 100 µg/cm³, que de acuerdo a lo que menciona Rupp et al. (2017), cuando
aislamientos de un hongo tienen un valor de EC50 mayor a 50 µg/cm³ son considerados
como resistentes (poco sensibles) al fungicida aplicado. La pérdida de sensibilidad en
un hongo, es un proceso que puede deberse entre otras cosas a la presencia de
mutaciones en genes constitutivos o taxonómicos, que son originados por efecto de un
proceso de selección disruptiva que da como resultado dos o más tipos de poblaciones
del hongo (una población resistente y otra sensible) en el mismo ambiente (Assadollahi,
2013). Específicamente, este reemplazo genético en los nucleótidos provoca que el
hongo adquiera una mayor capacidad para tolerar una fuerte presión por efecto del
fungicida u otros agentes externos que amenacen su sobrevivencia. Por su lado, Delp &
Dekker (1985) mencionan que, un patógeno es considerado como resistente a un
fungicida, si el valor del EC50 es al menos dos veces mayor al EC50 de los aislados
silvestres sensibles al fungicida.
Por otro lado, también existieron aislamientos sensibles y altamente sensibles para los 6
ingredientes activos probados con acción monogénica, debido a que su EC50 estuvo
entre 0,05 y 7,80 µg/cm³. Se presume que estos aislamientos no han adquirido
mutaciones contra los químicos probados, por lo que aún se observa efecto sobre el
crecimiento micelial del hongo. Según Assadollahi (2013), nos menciona que B. cinerea
tiene la capacidad de generar alta variabilidad de poblaciones sensibles (silvestres) a los
fungicidas aplicados, es decir, supone un correcto manejo del fungicida en cada uno de
los aislamientos altamente sensibles; sin embargo, en esta investigación fue necesario
analizar la posible presencia de resistencia cruzada (RC) y multifungicida (MFR),
dentro de los fungicidas monogénicos, descritos por Billard et al. (2012) en su
investigación.
4.1.1.1. Carboxamidas
Las carboxamidas son un grupo químico que tiene efecto preventivo y curativo sobre
hongos patógenos del suelo y follaje, que además puede tener un efecto inhibitorio
sobre la germinación de esporas. Su modo de acción está enfocado en la inhibición de la
acción de la enzima succinato deshidrogenasa en hongos filamentosos como B. cinerea.
Este grupo químico ha perdurado en el ámbito florícola, sin embargo, durante los
últimos años se ha visto una disminución considerable de la eficacia de control del
grupo frente a ciertos aislamientos de B. cinerea causantes de la enfermedad
denominada “podredumbre gris” en la rosa. Nuestros resultados indicaron que, para las
tres carboxamidas analizadas 4 de los 14 aislamientos (A2, A3, A6 y A11) presentaron
un EC50 <10 µg/cm³ (Cuadro 5), sugiriendo que el manejo de la enfermedad provocada
por el hongo con respecto al tiempo, ha impedido la generación de posibles mutaciones
que le confieran resistencia a este grupo químico, por lo que estos aislamientos fueron
considerados como “sensibles” y “levemente sensibles”. Adicionalmente, estos
24
resultados fueron comprobados con los registros de EC50 obtenidos en el aislamiento
silvestre (<10 µg/cm³). Según Leroux et al. (2010) en su investigación mencionan que,
de 100 aislamientos 10 de ellos fueron sensibles a las carboxamidas con un EC50 <10
µg/cm³, sugiriendo en su trabajo que el sistema de rotación de fungicidas basado en la
sensibilidad del hongo, ha permitido mantener una estabilidad genética de B. cinerea,
impidiendo de esta forma posibles mutaciones que conlleven perdida de sensibilidad al
mismo.
Los ocho aislamientos restantes (A1, A4, A5, A7, A8, A9, A10 y A12) fueron
considerados como “resistentes” a boscalid, debido a que su EC50 fue >100 mg/L,
exceptuando el aislamiento A3 que registró un EC50 de 54,60 µg/cm³ (Cuadro 5).
Específicamente, los aislamientos A1, A5, A7, A8 y A9, registraron un EC50 >100 mg/L
para las tres carboxamidas probadas, por lo que se puede asumir la presencia de
mutaciones que generen una posible resistencia puntual y cruzada entre los ingredientes
activos de este grupo químico. Por otro lado, se observó una mayor sensibilidad de los
aislamientos de B. cinerea a fluopyram con respecto a fluxapyroxad y boscalid, por lo
que se podría considerar según Veloukas et al. (2011), que estos últimos tienen una
menor capacidad de inhibir la acción de transporte de electrones en la enzima succinato
deshidrogenasa (SDHI), y una menor probabilidad de resistencia cruzada con otros
miembros del mismo grupo químico, probablemente debido a que fluxapyroxad y
boscalid tienen su sitio de acción en la región amina de la proteína SDHI, generando
una menor capacidad de control en comparación con fluopyram que tienen su sitio de
acción en la región hidrofóbica (Julca, 2016).
Según Fernández et al. (2015) mencionan que, en los cultivos cuya frecuencia de uso de
carboxamidas es continua, existen aislamientos de B. cinerea con una sensibilidad baja
para boscalid (56.2 %) y penthiopyrad (20.5 %), sin embargo, existe alta sensibilidad
para fluopyram (5.3 %) pero ya no para fluxapyroxad (13.1 %). Contrastando con esto,
se realizaron estudios en frutilla, ornamentales y uva durante el 2016, llegando a tener
frecuencias de aislamientos similares a los ya mencionados en esta investigación
(Harvey, 1995; Veloukas et al., 2011; Julca, 2016).
Según Alberoni et al. (2011), una mayor probabilidad de resistencia se dará si existe
mayor presión de selección sobre el hongo, por lo que una población resistente de B.
cinerea sobrepasará el 60 % de la población total, e incrementará la posibilidad de
generar resistencia cruzada (RC) entre ingredientes activos del mismo grupo químico.
Por otro lado, es importante considerar que mediante los análisis de EC50 para el grupo
de las carboxamidas, permite predecir una posible resistencia cruzada, considerando que
ya se han reportado riesgos de desarrollo de la misma entre fungicidas del mismo grupo
químico en otros cultivos (Leroux et al., 2010; Satammler et al., 2015). Según Amiri et
al. (2014), mencionan que la pérdida de sensibilidad de los aislados de B. cinerea en
fresa a las carboxamidas (fluopyram, fluxapyroxad, boscalid y penthiopyrad), tiene
relación con la presencia de las mutaciones tales como H272R, H272L, P225F y P225H
detectadas en el gen sdhB.
4.1.1.2. Hydroxyanhilidas
Fenhexamid, es un fungicida de espectro estrecho (Rossenbloich & Stuebler, 2000) que
pertenece a la familia química de las hidroxyanhilidas que inhiben la biosíntesis de
esteroles (SBI) en la formación de membranas (Debieu et al., 2001). La disminución de
25
la sensibilidad de B. cinerea a fenhexamid en el cultivo de rosas se ha ido
incrementando considerablemente durante los últimos años, principalmente debido a su
uso constante del ingrediente activo y por largos periodos de tiempo. En este sentido,
nuestros resultados sugirieron que existieron dos grupos de aislamientos de B. cinerea
con diferente nivel de sensibilidad; por una parte, los moderadamente resistentes con un
EC50 entre 7,81-50 mg/L, que correspondieron a los aislamientos (A2, A5, A7, A8, A9
y A12), y los resistentes con un EC50 >50 µg/cm³, que correspondieron a los
aislamientos (A1, A3, A4, A6, A10, A11 y A13) (Cuadro 5). Según Fillinger et al.
(2008), los fenotipos de resistencia a fenhexamid se clasifican en HydS (sensible),
HydR3+ (altamente resistente) e HydR3− (moderadamente a ligeramente resistente).
Según Fournier et al. (2003) y Fournier et al. (2005), la HydR1 aparentemente tiene una
alta sensibilidad al fungicida en campo, porque la presencia de resistencia a fenhexamid
se encuentra durante el crecimiento micelial, por lo que no se ve afectado la formación
del tubo germinativo; a pesar de esto se evidencia baja sensibilidad en Botrytis
pseudocinerea, el cual posee una resistencia natural al fungicida, formando parte de las
especies de B. cinerea.
Por otro lado, Leroux et al. (2002) mencionan que, los aislamientos HydR3 (+)
presentaron resistencia a la fenhexamid afectando el alargamiento del tubo germinativo,
por lo que, Fillinger et al. (2008) destacan que, al analizar los aislados de B. cinerea se
sugirió la presencia de dos clases de niveles de sensibilidad al fungicida, concluyendo
que, el EC50 entre 5 y 1 µg/cm³ y EC50 entre 2-1 µg/cm³ pertenecen al grupo HydR3+
considerados como resistentes, mientras que, los valores cuyo EC50 <2 µg/cm³
pertenecen al grupo HydR3−, considerados altamente sensibles a fenhexamid.
Correlacionando con los datos obtenidos en este estudio, se determinó que todos los
aislamientos pertenecen al grupo HydR3 + (resistentes) a fenhexamid.
Según Gachotte et al. (1999), el mecanismo de acción del fungicida es el principal
causante de la pérdida de sensibilidad, debido a que el mismo bloquea la des metilación
en C4 de los esteroles, proceso importante que implica tres enzimas diferentes: Erg25
(C4-metiletoxidasa), Erg27 (3-quetoreductasa) y Erg26 (C3-deshidrogenasa, C4-
descarboxilasa). Considerando que, las enzimas del grupo metilo (C4) forman un grupo
Keto (C3) y la enzima (27) reduce la (C3) a hidroxilo, generando un esterol funcional,
lo que le permite ser reconocido por las proteínas mitocondriales, que por su uso
constante cambia de estructura cuaternaria de la proteína, para de esta manera evitar el
paso del fungicida e impedir el crecimiento micelial del hongo. Por otro lado, es
importante mencionar que se han registrado pérdidas de sensibilidad natural
(variabilidad) del hongo B. pseudocinerea y B. cinerea hacia fenhexamid (Fournier et
al., 2005, Walker et al., 2011).
Al evidenciar la pérdida de sensibilidad en aislamientos de B. cinerea, Billard et al.
(2012) sugieren en su investigación que, existen aislamientos resistentes a boscalid,
fenhexamid y pyrimetanil presentes en uva, alcanzando un EC50 de 18,85, 36,5 y 73,14
µg/cm³, respectivamente, por lo tanto, los autores describen la presencia de resistencia a
multidrogas (MDR por sus siglas en inglés) o resistencia a multifungicida (MFR por sus
siglas en inglés) entre los grupos químicos mencionados. Correlacionando con nuestro
estudio en base al EC50 calculado, se considera una posible presencia de mutaciones
para fenhexamid y boscalid, ya que de los 14 aislados 4 de ellos tuvieron baja
sensibilidad para ambos fungicidas. Como lo mencionan Amiri et al. (2014), se han
observado aislamientos de B. cinerea con CCR (resistencia a la clase química por sus
26
siglas en inglés) múltiple en diferentes cultivos, incluidos pepino, uvas y fresas para los
fungicidas mencionados.
4.1.1.3. Estrobilurinas (QoI)
Las estrobilurinas (QoI) como pyraclostrobin, son utilizadas para el control de varios
hongos fitopatógenos principalmente del orden Erysiphales, sin embargo, ha resultado
ser muy efectivo para el control de B. cinerea en el sector ornamental (Jiang et al.,
2009). Su modo de acción radica en la inhibición de la cadena transportadora de
electrones en el sitio Qo del complejo mitocondrial III (Brent Hollomon, 2007),
afectando el crecimiento mitocondrial y germinación de esporas; por lo tanto, su acción
es de forma preventiva, curativa y en ciertos casos erradicantes (Markoglou et al.,
2006).
En este estudio, los resultados sugieren que, 12 aislamientos de B. cinerea resultaron ser
resistentes a pyraclostrobin ya que registraron un EC50 >100 µg/cm³, y dos de ellos
moderadamente resistentes con un EC50 10-100 µg/cm³ (incluyendo el aislado silvestre)
(Cuadro 5). Este comportamiento pudo deberse a la presión de selección direccional
(evolutiva) ejercida en el patógeno durante muchos años, originando individuos poco
sensibles con una posible mutación hacia el fungicida. Según Leroux et al. (2010)
mencionan que, la concentración efectiva para la pérdida de sensibilidad a estrobilurinas
es de 10 µg/cm³; por lo que, nuestros resultados sugirieron que, todos los 14 aislados de
B. cinerea fueron considerados poco sensibles (resistentes) a estrobilurinas (Cuadro 5).
Según Grossmann & Reztlaff (1997) mencionan que, durante muchos años se ha
generado una presión de selección natural sobre B. cinerea, a través de un proceso de
adaptabilidad al hongo de suelo Estrobilorus tenacelus del cual se sintetizó inicialmente
las estrobilurinas, por lo que es probable que en la naturaleza existan aislamientos
silvestres con la capacidad de resistir a este grupo químico. Por otro lado, pyraclostrobin
ejerce una presión de selección adicional a la natural, bloqueando la respiración
mitocondrial, inhibiendo la formación de ATP, reduciendo la penetración de esporas en
la planta, por lo que existe una doble presión de selección, permitiendo que el hongo
pueda adaptarse al mecanismo de acción del fungicida.
Al igual que en estos resultados, Ishii (2008) menciona que la resistencia a las
estrobilurinas (QoI) ha sido determinada en varios hongos fitopatógenos de importancia
agrícola en diferentes partes del mundo, por lo que la pérdida de sensibilidad ocasionada
de manera natural e inducida, ha generado diferentes tipos de aislamientos del mismo
hongo dentro de un mismo entorno, que se pueden expresar en diferentes épocas,
considerando que puede ser mayor la resistente o la silvestre, por lo que es necesario
implementar un plan de manejo químico para cada uno de los entornos, considerando la
variabilidad que el hongo en un mismo entorno.
4.1.1.4. Benzimidazoles
Los benzimidazoles son fungicidas de amplio espectro que actúan de manera sistémica
en la planta, provocando distorsiones de tubos germinativos, inhibiendo el crecimiento
micelial, además de impedir la división celular del fitopatógeno al interferir en la
polimerización de la proteína β tubulin (Davidse & Ishii, 1995; Leroux, 2007). Los
27
hallazgos en este estudio sugieren que, los 13 aislamientos tuvieron una baja
sensibilidad al fungicida ya que registraron un EC50 >100 µg/cm³, aludiendo este
comportamiento a un mal manejo de los fungicidas al nivel de campo o invernadero,
originando diferentes aislados de B. cinerea, especialmente si el fungicida se usa
recurrentemente en el cultivo, generando algún tipo de resistencia en el fitopatógeno. En
la mayoría de los casos, la resistencia a benzimidazoles se adquiere mediante una
mutación en las posiciones 198 y 200 de los aminoácidos en el gen de la β-tubulina
(Banno et al., 2008).
Particularmente, el aislamiento silvestre mantuvo un nivel de sensibilidad bajo al
fungicida ya que su EC50 fue de 2,17 µg/cm³, sugiriendo que la resistencia se presenta
por una presión de selección disruptiva (recurrente aplicación del fungicida), y cuyos
aislamientos silvestres no se ven afectados por esta presión de selección. Según
Yourman & Jeffersen (1999), los aislamientos de B. cinerea resistentes a
benzimidazoles también presentaron resistencia a dicarboxamidas (iprodione), esto se
dio en aislamientos testigos y en aquellos donde se utilizó benzimidazoles por muchos
años. Los aislamientos mutados BenA-E198A, han sido detectados en todo el mundo en
diferentes cultivos, principalmente en frutilla, uva y un poco menos en ornamentales,
generando diferentes niveles poblacionales que se expresan cada año con resistencia a
benzimidazoles (Cui et al., 2004).
Según Álvarez et al. (2016), al analizar los EC50 para metil thiophanato en campos de
fresa en Oxnard-California, se basaron en estudios que influyeran en la elongación del
tubo germinativo en conidios de B. cinerea, por lo que Weber & Hahn (2011)
consideraron que, los aislados moderadamente resistentes presentan un EC50 entre 4.67 y
16.1 µg/cm³ y resistentes con un EC50 >28 µg/cm³. Corroborando estos datos, Fernández
et al. (2012) mencionan que, al aplicar una dosis de 100 µg/cm³, se pudo identificar que
el 85 % de aislados de fresa de Carolina Sur fueron resistentes a metil thiophanato,
similar a los resultados alcanzados del presente estudio. Todos los aislados
caracterizados por Fernández et al. (2012) como resistentes, expresaron la mutación
puntual de E198A (cambio de alanina a glutamato en la posición 198) anteriormente ya
mencionada.
28
Cuadro 5. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea para 6 fungicidas monogénicos.
Ais
lam
ien
to EC50 (µg/cm³)
Carboxamidas Hidroxy-
anhilidas Estro-bilurinas Benzimi-dazoles
Boscalid Fluxapyroxad Fluopyram Fenhexamid Pyraclostrobin Metil thiophanato
A1 >100 >100 >100 >100 >100 >100
A2 >100 8,47 1,18 13,14 20,09 >100
A3 54,60 6,02 2,13 >100 >100 >100
A4 >100 >100 21,52 >100 >100 >100
A5 >100 >100 92,30 7,81 >100 >100
A6 3,98 6,94 2,66 >100 >100 >100
A7 >100 >100 >100 49,64 >100 >100
A8 >100 >100 51,57 20,10 >100 >100
A9 >100 >100 83,45 22,60 >100 >100
A10 73,70 >100 16,75 >100 >100 >100
A11 2,18 7,64 2,49 >100 >100 >100
A12 >100 >100 22,38 44,44 >100 >100
A13 >100 23,62 0,69 >100 49,85 >100
A14
(Silvestre) 2,36 0,64 1,91 5,23 10,49 2,17
* Fuente: Amiri et al. (2014)
4.1.2. Resistencia a multifungicida mono génico (MFRm)
El porcentaje de frecuencia de aislamientos resistentes de Botrytis cinerea fue mayor
para pyraclostrobin y metil thiophanato que para el resto de fungicidas monogénicos,
principalmente debido al alto número de aislamientos poco sensibles (resistentes)
analizados en esta investigación. Estos resultados sugieren que, existe una mayor
frecuencia de aislados resistentes a estos dos grupos químicos (estrobilurinas y
benzimidazoles), debido a que su modo de acción es muy específico; por ejemplo, metil
thiophanato afecta la formación de la tubulina (diferenciación celular), y pyraclostrobin
que afecta el transporte de electrones en la enzima citocromo-c, inhibiendo la
formación de esporas del patógeno; generando una estrecha relación entre los dos
grupos químicos ya que, no existirá formación de tubulina para la diferenciación celular
del hongo, debido a que, necesita energía para su síntesis, por lo que el patógeno va a
tratar de potenciar la mitosis, generando nuevas esporas, para asegurar su supervivencia
(Faretra et al., 1989; Faretra & Pollastro, 1991, 1993a; Pollastro & Faretra, 1992; De
Guido et al., 2007).
Categoría EC50
Sensible <0,05-1,37
Levemente sensible 1,38-7,80
Moderadamente resistente 7,81-50
Resistente >50
29
Por otro lado, para boscalid y pyraclostrobin el 69,23 % de los aislamientos resultaron
ser poco sensibles, tal como se muestran en el Gráfico 1, porque como en el caso
anterior ambos ingredientes ejercen una fuerte presión sobre los complejos proteínicos
en la respiración mitocondrial, es decir, afectan al mismo sector de la célula, ejerciendo
mayor presión de selección (Baroffio et al., 2003).
Si se combina el presente plan de manejo con boscalid + pyraclostrobin + fenhexamid,
se tendrá que, de los 14 aislamientos el 46,15 % serán poco sensibles (Gráfico 1),
principalmente debido a que fenhexamid afecta a la proteína de la aldo-Keto-reductasa
cuya principal función es ayudar a la síntesis de ergosterol que sirve para la formación
de membranas en la célula del hongo. Estos tres ingredientes activos tienen una estrecha
relación con respecto a la resistencia entre grupos químicos, particularmente la síntesis
de la aldo-Keto-reductasa que permite la respiración mitocondrial y por ende generación
de ATP (energía), condescendiendo que los complejos proteínicos se inserten en las
membranas internas de la mitocondria, donde además las hidroxianhilidas y las
carboxamidas actúan (Rosslenbroich & Stuebler, 2000). Por otro lado, Snježana
Topolovec-Pintarić (2011), en su estudio “La resistencia a botricidas”, demostró la
estrecha relación de cada uno de los fungicidas antes mencionado y su efecto de cada
uno de ellos con el porcentaje de resistencia a multidrogas (resistencia a
multifungicidas) como ya se mencionó antes y como se observa en el Gráfico 1.
Gráfico 1. Resistencia a multifungicidas monogénicos de Botrytis cinerea para
boscalid, pyraclostrobin, fenhexamid y metil thiophanato.
Por otro lado, al analizar los aislamientos resistentes para el grupo químico de las
carboxamidas, se determinó que el mayor porcentaje con 84,62 % pertenece a boscalid,
debido a que es un producto que ya no se usa ampliamente en el campo floricultor por
su baja efectividad para el control de B. cinerea según lo menciona la FRAC (2019);
además es importante señalar que nuestros resultados sugirieron que la relación entre
boscalid y fluxapyroxad genera un 61,54 % de probabilidad de generar resistencia
cruzada, debido principalmente a que ambos fungicidas ejercen un mismo mecanismo
de acción sobre la región amina de la succinato deshidrogenasa, lo que no ocurre con
fluopyram porque su sitio de acción está en la región hidrofóbica de la misma proteína,
tal como se lo había mencionado anteriormente (Rupp et al., 2017).
[VALOR] %
[VALOR] %
[VALOR] %
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
Boscalid + Pyraclostrobin(MRF2)
Boscalid + Pyraclostrobin+ Fenhexamid (MRF3)
Pyraclostrobin + MethilTiofanato (MRF2)
Frec
uen
cia
de
aisl
amie
nto
s re
sist
ente
s
Bo
tryt
is c
iner
ea
Multifungicide resistance (MFR)
30
Además, es importante señalar que en los seis análisis con resistencia a multifungicidas,
el principal ingrediente activo que promueve este comportamiento es boscalid, frente a
fluxapyroxad y fluopyram (Gráfico 2), manteniendo el mismo porcentaje de frecuencia
de aislamientos resistentes que fluxapyroxad solo, e igual fluopyram respectivamente,
tal como lo menciona Baroffio et al. (2003). Según Rupp et al. (2017), las frecuencias
de aislamientos resistentes se basan en el uso del fungicida principalmente aquellos que
comparen el mismo ingrediente activo; en este sentido el autor menciona también que
sus resultados sugirieron que la presencia de MDR1 entre boscalid y fluxapyroxad es
del 67 % en aislados de B. cinerea, por lo que los conidios recuperados de los tejidos de
manzana porosa fueron probados para sensibilidad o resistencia al fungicida de
diagnóstico antes ya mencionado.
Gráfico 2. Resistencia a multifungicidas monogénicos de Botrytis cinerea para
boscalid, fluxapyroxad y fluopyram.
4.1.3. Mutaciones contra fungicidas monogénicos
Se determinó la presencia de las mutaciones en los fungicidas monogénicos mediante el
análisis de cada uno de los grupos químicos detallados en este estudio, tomando en
consideración la presencia de mutaciones aberrantes (mutación con mayor eficacia y
rango de acción), y medianamente aberrantes (mutaciones con menor espectro de
eficacia de acción) presentes en los aislamientos para el hongo B. cinerea (Amiri et al.,
2014).
Fernández et al. (2017) mencionan que, las principales mutaciones aberrantes en B.
cinerea que confieren resistencia a las cuatro carboxamidas usadas (boscalid, fluopiram,
carboxin y bixafen), son P225 y N230. Contrastando con los resultados de este estudio,
se determinó la presencia de dos mutaciones conocidas como P225H y P225F
respectivamente, causales de resistencia cruzada entre ingredientes activos del grupo
químico de las carboxamidas excepto para fluopyram, es decir, aislamientos con
resistencia a boscalid, también presentarán para fluxapyroxad y viceversa (Cuadro 6 y
7).
[VALOR] %
[VALOR] %
[VALOR] %
[VALOR] %
[VALOR] % [VALOR] %
0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,0090,00
Fre
cue
nci
a d
e a
isla
mie
nto
s re
sist
en
tes
B
otr
ytis
cin
erea
Multifungicide resistance (MFR)
31
Por otro lado, los aislamientos A1, A4, A5, A9 y A12 presentaron la mutación P225H, y
registraron un EC50>100 µg/cm³ para ambos ingredientes activos (boscalid y
fluxapyroxad), existiendo una alta relación en la mutación; por lo tanto, se alude una
posible resistencia puntual y cruzada completa entre los ingredientes activos
mencionados en los 5 aislamientos. Por otro lado, la mutación P225F se presentó en el
aislamiento A7, sugiriendo posible resistencia puntual y cruzada incompleta entre los
ingredientes activos.
Adicionalmente, el grupo de carboxamidas presentó dos mutaciones poco aberrantes en
los aislamientos A2 y A13 (mutación H272R), mientras que, el aislamiento A8
(mutación H272L), cuya resistencia es de tipo puntual incompleta. Según, Leroux et al.
(2010), Veloukas et al. (2011), De Miccolis Angelini et al. (2014a) y Esterio et al.
(2015), nos mencionan que, aislamientos analizados con baja sensibilidad presentaron
en la región SDH (succinato deshidrogenasa) resistencia a fungicidas SDHI (grupo de
moléculas que inhiben el succinato deshidrogenasa), cuyo modo de acción generó
mutación en dos sitios activos del gen sdh, cuyas subunidades conocidas como SdHD y
SdHB, es decir, la mutación en SdHB (H272L) afecta la susceptibilidad a todos los
fungicidas SDHI, mientras que la mutación en SdHB (H272R), confiriere resistencia a
todos los fungicidas SDHI probados, excepto fluopyram. Según Bardas et al. (2010),
Kim & Xiao (2010), Leroux et al. (2010), Leroch et al. (2011), Veloukas et al. (2011);
Fernández-Ortuno et al. (2012), Chatzidimopoulos et al. (2013), Amiri et al. (2014), De
Miccolis Angelini et al. (2014b), Hahn (2014) y Konstantinou et al. (2015) mencionan
que, el grupo SDHI por su modo de acción ha generado baja sensibilidad en B. cinerea
provenientes de manzana, tomate, uva, lechuga, fresa, kiwi y ornamentales en varios
países donde su cultivo es permanente.
A pesar de eso, en esta investigación se encontraron un total de nueve mutaciones
presentes en los 14 aislamientos de B. cinerea para un total de cuatro grupos químicos.
Como ya fue mencionado, el grupo de las carboxamidas generaron el mayor número de
mutaciones aberrantes dentro de este estudio; sin embargo, adicionalmente se identificó
la presencia de la mutación F412S en los aislamientos A1, A3, A4, A6, A7, A10, A11,
A12 y A13; cuyo mecanismo de acción impide el reconocimiento de fenhexamid con la
enzima Keto reductasa afectando la formación del ergosterol, cuya presencia denota una
estrecha relación con el grupo de carboxamidas y con todos los fungicidas que afecten a
los complejos proteínicos mitocondriales (Gachotte et al. 1999), tal como se explica en
el Gráfico 8.
Según Billard et al. (2011) mencionan que, la acción de fenhexamid está direccionado a
las membranas celulares y membranas de la matriz del mitocondrio, cuyo modo de
acción está en las crestas mitocondriales que sobreponen los complejos proteínicos, es
decir que, fenhexamid actúa dañando la membrana hasta llegar al mitocondrio por la
presencia de los poros mitocondriales; posteriormente, daña la formación de ergosterol
y a su vez bloquea la formación de la enzima keto-reductasa. Teniendo en cuenta que,
las membranas de la cresta presentan ergosterol al ser una membrana fosfolipídica, se
considera que, el modo de acción de fenhexamid no permite sobreponer los complejos
proteínicos, ejerciendo una relación entre carboxamidas, hidroxianhilidas y
estrobilurinas, considerándose como resistencia bilateral según lo mencionado por
Leroux (2004); además mencionan que, si se identifica la presencia de la mutación
F412, Botrytis presentará un dominio transmembranal diferente en la cadena proteínica
32
del mitocondrio, es decir, la región de enlace con fenhexamid se ve afectada, por lo
tanto fenhexamid no va a poder atravesar la membrana mitocondrial y actuar en dentro
de ella.
Además, es importante señalar también que las demás mutaciones identificadas en este
estudio para las hydroxianhilidas (L195F y V309M), de acuerdo a Fillinger et al.
(2008), se encuentran en la región NAGI motif de la proteína III del mitocondrio, es
decir que no presentan una función asignada definida, por eso no son consideradas
como mutaciones aberrantes, por lo que su acción no presenta cambios significativos en
la estructura cuaternaria de la proteína, es decir que, aun teniendo esta mutación
fenhexamid sigue teniendo efectividad en aislamientos de B. cinerea. En ese sentido, en
los aislamientos A2, A8 y A9 se encontró la mutación V309M, y el aislamiento A5 la
mutación L195F. Baumler et al. (2003) mencionan que, de los cinco complejos
proteínicos que son afectados por ciertos grupos químicos, las estrobilurinas afectan al
complejo 3 del mitocondrio, y que cuando estos ingredientes disminuyen su acción es
debido a la presencia de la mutación aberrante G143A. Por su lado Ishii (2008)
menciona que, uno de los principales mecanismo de evolución direccional en Botrytis,
se debe a la presencia de un by-pass energético que permite el transporte alternativo de
electrones para la consecuente generación de ATP, es decir, que si el transporte se
genera antes del complejo 3 y este se ve afectado por botricidas, generará un mecanismo
que le permite tener sensibilidad al fungicida, esto se debe a la adaptación generada a
través del tiempo por los diferentes mecanismos de control hacia Botrytis. En este
estudio, se determinó la presencia de la mutación G143A en los 14 aislamientos,
incluido el silvestre.
Por su lado, la resistencia genética al grupo de los benzimidazoles se da por una
sustitución del ácido glutámico (GAG) a alanina (GCG) en la posición 198 (E198A). En
este sentido, esta mutación se encontró en los 13 de los 14 aislamientos analizados en
esta investigación, por lo que se supone que la misma está ampliamente distribuida en
varias poblaciones del hongo en el cultivo de rosas. Normalmente, este tipo de mutación
se genera por el mal manejo del grupo químico y el aumento de dosificación para
mejorar su efectividad, sin tomar en cuenta que esta selección disruptiva ha ido
transformado un mayor número de aislamientos silvestres en resistentes con respecto al
tiempo; sin embargo, es necesario mencionar que aquellos aislamientos que presentan
una fumigación al año del producto son aquellos que aún mantienen la sensibilidad del
hongo es estable, (Yourman & Jeffers, 1999), principalmente en fincas de rosas
pequeñas. Corroborando con nuestros datos, según Liu et al. (2019) mencionan que, los
aislamientos analizados como Ben-HR presentaron la mutación E198A, mostrando baja
sensibilidad a benzimidazoles, mientras que, los aislamientos sensibles a
benzimidazoles (Ben-S) silvestres, no tuvieron la presencia de la mutación, tal como
ocurrió en nuestra investigación con el aislamiento silvestre.
Adicionalmente, según Mernke et al. (2011), la baja sensibilidad hacia un determinado
fungicida dejará de ser efectiva por lo menos de 2 a 4 años dependiendo del tipo de
mutación generada y la presencia de aislamientos silvestres (sin mutación), que
desplacen a los resistentes, si solo si, no se utiliza compuestos químicos con el mismo
modo de acción, permitiéndole al patógeno desarrollar una descendencia libre de la
mutación en el tiempo transcurrido desde la última aplicación del fungicida. En este
sentido, si en ambiente hay un alto porcentaje de aislamientos mutados, pero también la
presencia de aislamientos silvestres sin mutación, en la segunda generación existirán un
33
menor porcentaje de aislamientos mutados, ya sea por desplazamiento o por
anastomosis, hasta lograr erradicar por completo en el tiempo la resistencia detectada
inicialmente. Si esto sucede, es posible volver a usar el ingrediente activo como una
herramienta de control del hongo. Además, es importante señalar que los aislamientos
resistentes representarán una menor proporción con respecto a los silvestres, siempre y
cuando no se ejerza una constante presión de selección tal como las ya mencionadas
anteriormente.
Cuadro 6. Mutaciones identificadas para 14 aislamientos de B. cinerea en cuatro
grupos químicos de fungicidas monogénicos.
AIS
LA
MIE
NT
O MUTACIÓN
CARBOXAMIDAS HIDROXYANHILIDAS ESTROBI-
LURINAS
BENZIM
I-
DAZOL
ES
P225H
***
P225F
***
H272R
*
H272L
*
L195F
*
V309M
*
F412S
***
G143A
**
E198A
**
A1 X X X X
A2 X X X X
A3 X X X
A4 X X X X
A5 X X X X
A6 X X X
A7 X X X X
A8 X X X X
A9 X X X X
A10 X X X
A11 X X X
A12 X X X X
A13 X X X X
A14
Silvestre
X
Fuente: Amiri et al. (2014)
Mutación Efecto
Altamente aberrante (***) Resistencia puntual y cruzada completa
Medianamente aberrante (**) Resistencia puntual y cruzada
incompleta
Poco aberrante (*) Resistencia puntual
34
4.1.4. Efecto de la resistencia de B. cinerea a carboxamidas
Según Villani et al. (2016), la mayoría de carboxamidas como carboxin, fluxapyroxad,
y boscalid, actúan sobre el extremo amida (parte de la proteína dirigida hacia el
citoplasma de la mitocondria), donde dos de ellos, boscalid y fluxapyroxad comparten
el mismo sitio de acción, en cambio fluopyram tiene su sitio de acción en el extremo
hidrofóbico hacia la membrana, por lo tanto la capacidad de resistencia cruzada entre
boscalid y fluxapyroxad es muy alta, pero media para fluopyram, tal como se muestra
en el Gráfico 3.
Gráfico 3. Sitios de acción de las carboxamidas en la proteína succinato deshidrogenasa
(SdHB) de B. cinerea.
Como ya se mencionó anteriormente, la modificación P225 le confiere resistencia a
todas las carboxamidas: carboxin, boscalid, fluxapyroxad y fluropyram, por lo que es
considerada como una mutación aberrante de acuerdo a lo indica Alberoni et al. (2011),
es decir que, si se presenta esta mutación para 1 ingrediente activo, existirá para los
demás, debido a que la proteína cambia de forma cuaternaria y el fungicida no
reconocerá el sitio de acción, por lo tanto, perderá su efectividad de control tal como se
muestra en el Gráfico 4. Adicionalmente, Laleve et al. (2014) y Veloukas et al. (2014),
mencionan que la mutación P225 presentó aislados de B. cinerea con niveles bajos de
sensibilidad al grupo de fungicidas SDHI, además sugieren que la presencia de
mutaciones las proteínas del mitocondrio, específicamente en el complejo III genera
efectos adversos unos con otros por la presencia de resistencia cruzada entre ellos.
Konstantinou et al. (2014) indican que, el tipo de mutaciones aberrantes generalmente
suelen presentarse rara vez en aislados de B. cinerea, sin embargo, en los últimos años
se ha reportado casos con mayor cantidad de aislados mutados en diferentes cultivos
que usan intensivamente el grupo de fungicidas SDHI. Contrastando con estos datos,
Esterios et al. (2015), confirman que, la mutación P225H se encuentra presente en
aislados provenientes de uva de mesa y porta injertos de frutas que han sido expuestos a
un control químico con el grupo de fungicidas SDHI.
35
Gráfico 4. Efecto de una mutación aberrante P225H y P225F en B. cinerea.
Por otro lado, Mallik et al. (2013) mencionan que, la modificación de la H272 tiene
efectos diferenciales sobre la sensibilidad de B. cinerea a fungicidas SDHI, debido a
que confieren resistencia a todas las carboxamidas excepto para fluopyram, es decir que,
si se presentan las 2 mutaciones (H272R y H272L), estas generarán resistencia
únicamente a boscalid y carboxin, tal como se muestra en el Gráfico 5. Es importante
señalar que, los aislamientos que no tuvieron estas mutaciones para este grupo químico,
se recomienda mantener un adecuado sistema de rotación en función del código FRAC,
en el que menciona que se puede aplicar hasta dos veces el producto por año, y en
temporadas donde no exista una presión de inóculo alta en el ambiente.
De la misma manera, Leroux et al. (2010), Veloukas et al. (2011) Fernandez-Ortuno et
al. (2012) y De Miccolis Angelini et al. (2014a), mencionan que, al analizar los aislados
de B. cinerea con mutación H272, estos fueron considerados como poco aberrantes al
ser la mutación más común en la región de SDH para el grupo de fungicidas SDHI,
comparando con otros estudios sugirieron que, “actualmente es la mutación que
prevalece en la mayoría de cepas no silvestres del patógeno” (Leroux et al., 2010).
Por otro lado, Laleve et al. (2014) mencionan que, varios estudios han señalado que los
monitoreos anuales registrados en las fincas de los diferentes cultivos han permitido
desarrollar un programa de protección para evitar aislados resistentes, y en el caso de
existir, potenciar a la disminución de los productos SDHI buscando nuevas alternativas
funcionales en la actualidad. La presencia de las mutaciones provenientes de los
fungicidas del grupo SDHI generalmente es rara, en el caso de ser aberrantes y
frecuentes o muy comunes en aquellas cuya resistencia es enfocada a un solo
ingrediente activo, como es la mutación H272R, con lo que según Laleve et al. (2014) y
Veloukas et al. (2014), la correlación entre las mutaciones aberrantes y poco aberrantes
de los fungicidas del grupo SDHI se presenta mediante una aptitud de costo en cepas
isogénicas tanto en cultivos de campo abierto y bajo invernadero.
36
Gráfico 5. Efecto de una mutación medianamente aberrante H272R y H272L.
Según Amiri et al. (2014), la modificación de la estructura cuaternaria de la proteína se
da en el sitio de reconocimiento de fluopyram, contrastando la resistencia puntual de la
mutación H272R y H272L, considerada hasta el momento como una mutación poco
aberrante, sin embargo, la presencia de la mutación aberrante P225 se da para los sitios
de reconocimiento para boscalid y fluxapyroxad.
Adicionalmente, Kim & Xiao (2011), Walker et al. (2013) y Fernández-Ortuño et al.
(2014), mencionan que, los datos obtenidos de la resistencia al grupo de las
carboxamidas, incentivó a la creación de nuevos grupos químicos para el control de
hongos fitopatógenos que presenten baja sensibilidad, cuyos hechos se observaron en el
uso no continuo de la mezcla (pyraclostrobin + boscalid) para el control de B. cinerea
en diferentes cultivos frutales y ornamentales, a pesar de esto Walker et al. (2013), nos
mencionan que, el preámbulo para el fungicida (fluopyram + tryfloxistrobin), ha
generado controversias por la contribución en la reducción de aislamientos resistentes
dentro de una finca a el ingrediente activo boscalid.
Gráfico 6. Efecto de una mutación medianamente aberrante H272R y H272L en B.
cinerea.
37
4.1.5. Probabilidad de resistencia cruzada entre carboxamidas
Al realizar el análisis de correlación de Pearson entre los valores de EC50 para
determinar una posible resistencia cruzada entre ingredientes activo, nos indicó que, la
probabilidad de resistencia cruzada entre fluxapyroxad y fluopyram es del 74 %, del 70
% entre boscalid y fluxapyroxad y del 62 % entre boscalid y fluopyram. Este análisis se
realizó tomando en cuenta el número de aislamientos resistentes para los fungicidas
monogénicos, por lo tanto, existe mayor porcentaje de resistencia cruzada entre los
aislamientos debido al sitio de acción del complejo proteínico en el cual se desarrolla la
acción del fungicida para el control del hongo como ya se explicó anteriormente
(Snježana, 2011).
Además, la presencia de una correlación significativa para los tres grupos químicos, nos
permite sugerir una correcta toma de rotación de químicos durante el ciclo del cultivo
para el patógeno B. cinerea, lo cual según Fraaije et al. (2012), gracias a los estudios
realizados en los diferentes cultivos se ha determinado que un tiempo de reposo entre
dos y tres años dependiendo del tipo de mutación presente para aquellos fungicidas
monogénicos, evitará generar frecuencias de aislados altos con baja sensibilidad a
carboxamidas. Adicionalmente, según Avenot & Michailides (2010), las frecuencias de
aislados presentes en cada finca o entorno varía de acuerdo a la frecuencia de uso del
fungicida o grupos químicos dentro de un programa de control del hongo B. cinerea.
Cuadro 7. Correlación de Pearson para la determinación de la probabilidad de
resistencia cruzada entre boscalid, fluxapyroxad y fluopyram.
Ingrediente activo Boscalid Fluxapyroxad Fluopyram
Boscalid
Fluxapyroxad 0,701
Fluopyram 0,62 0,74
1 > 0,6 correlación significativa; <0,5 correlación no significativa.
4.2. FUNGICIDAS DE ACCIÓN POLIGÉNICA
4.2.1. Determinación de la eficiencia de concentración 50 (EC50)
Al analizar los 14 aislamientos de Botrytis con los fungicidas cyprodinil y pyrimetanil
(anilinopirimidinas), fludioxinil (fenilpirroles), se determinó que existen asilamientos
altamente sensibles con un EC50 que oscila entre 0,05 y 1,37 μg/cm³, sugiriendo que la
acción de los fungicidas no ha afectado a la estructura cuaternaria de la proteínas
membranales donde tienen su sitio de acción, por lo que la pérdida de sensibilidad a
estos grupos químicos no es una realidad de acuerdo a lo que se observó en esta
investigación. Según Petsikos et al. (2003), la pérdida de sensibilidad de B. cinerea a
fungicidas poligénicos se presenta en un periodo de tiempo de menos de 10 años,
cuando el grupo químico es usado más de dos veces al año generando aislamientos
resistentes permanentes. Particularmente, los fungicidas poligénicos ejercen su modo de
acción en varias proteínas del hongo, por lo que los usos recurrentes de estos fungicidas
pueden generar resistencia poligénica puntual, cruzada y multidrogas (Petsikos et al.,
2003).
38
4.2.1.1. Anilinopirimidinas y fenilpirroles
Cyprodinil y pyrimetanil son fungicidas absorbidos por los tejidos de la planta con
translocación acrópeta (sistema ascendente) vía xilema, inhibiendo la penetración y el
crecimiento micelial del hongo tanto dentro del tejido como en la superficie foliar;
además, intervienen en la inhibición de la síntesis de aminoácidos y proteínas
(Syngenta, 2019). Según FRAC (2019), existe resistencia al hongo B. cinerea para el
fungicida cyprodinil, mientras que, fludioxonil inhibe el crecimiento micelial del hongo
y posee una translocación limitada cuya principal actividad es por contacto,
interviniendo en la transducción de señales osmóticas (os-2, HOG1). De la misma
manera este autor menciona que, existen pocos aislamientos de Botrytis con presencia
de resistencia a los fenilpirroles. Por su lado, pyrimetanil inhibe la biosíntesis de la
metionina y la secreción de enzimas hidrolíticas del hongo (necesarias para la infección)
y, en consecuencia, impide el crecimiento y elongación de los tubos germinativos de las
ascosporas (Bayer, 2019). Según la Frac (2019) existe resistencia en B. cinerea para el
fungicida pyrimetanil.
Los resultados de este estudio sugieren que, los 14 aislamientos fueron sensibles a los
grupos químicos (anilinopirimidinas y fenilpirroles) con un EC50 <1,37 μg/cm³,
sugiriendo que el mecanismo de acción de los dos fungicidas no ha generado pérdida de
sensibilidad. Por otro lado, Moyano et al. (2004) mencionan que, el uso recurrente de
estos ingredientes activos genera varias mutaciones en las proteínas membranales de
Botrytis en un relativo periodo corto de tiempo. Al igual que nuestros hallazgos,
Petsikos et al. (2003) mencionan que los fungicidas cyprodinil y pyrimetanil tienen la
capacidad de inhibir el crecimiento micelial de aislamientos sensibles y resistentes de B.
cinerea en bajas concentraciones, permitiéndole un correcto control micelial para evitar
la propagación de la enfermedad en los diferentes cultivos.
A pesar de que en este estudio no se determinaron mutaciones para fungicidas
poligénicos, es importante tomar en cuenta el estudio realizado en Uruguay, donde
mencionan que las dos anilinopirimidinas (cyprodinil y pyrimetanil) poseen el mismo
modo de acción, donde si se detecta alguna mutación, esta afectará a la eficacia de los
dos ingredientes activos perteneciente a este grupo químico, por lo que es necesario
tomar en cuenta esta información al momento de realizar los planes de rotación de
fungicidas, principalmente en el cultivo de rosa, donde se genera una mayor presión de
selección por aplicación de fungicidas sobre el hongo (Gepp et al., 2012).
Para las anilinopirimidinas se considera una característica de resistencia estable, ya que
los aislamientos poseen la habilidad competitiva similar a la de los sensibles por lo que
su sensibilidad es medianamente aberrante al fungicida (Moyano et al., 2004; Bardas et
al., 2008; Zhang et al., 2009). Sin embargo, Baroffio et al. (2003) encontraron que, los
aislamientos resistentes de B. cinerea sobrevivían en menor medida el invierno en
viñedos suizos, por lo que se resalta la falta de presencia de la mutación en el país, sin
embargo, es importante señalar que se debe evitar las aplicaciones repetidas de
anilinopirimidinas para evitar la selección de cepas resistentes el resto del año.
Por otro lado, a pesar de existir alta sensibilidad de B. cinerea al compuesto cyprodinil
+ fludioxinil, se debe tomar en cuenta lo que menciona Segmuller et al. (2007), que se
han registrado altos niveles de resistencia a fludioxinil en varios aislados de Carolina
del Norte y Sur, vinculándose al tipo de modo de acción del fungicida en el patógeno
39
sobre las enzimas involucradas en la osmo regulación del grupo MAPAK (proteína
quinasa activada por mitógeno tipo Hog1), por lo tanto, la resistencia adquirida al
fungicida se adquiere mediante la mutación de los genes bos1 (Fillinger et al., 2012),
bcsak1 (Segmuller et al., 2007), BcOS4 (Yang et al., 2012), bos5 (Yan et al., 2010) y
BRRG-1 (Yan et al., 2011), identificados por la reducción de sales en el patógeno para
impedir el ataque del fungicida dentro de este (Li et al., 2014). Por lo tanto, es
indispensable tomar en cuenta esta información para evitar posibles mutaciones en los
aislados de B. cinerea en rosas en el Ecuador.
Por otro lado, según Vanderplank (1984), la resistencia poligénica o no específica ha
sido analizada en diferentes enfermedades fúngicas para diferentes cultivos en el
mundo, existiendo pocos caso de presencia de esta; sin embargo, según Renfro, (1985),
el tipo de resistencia adquirida para cada uno de los fungicidas poligénicos es estable,
debido a que al afectar la estructura de membranas del patógeno esta prevalecerá de
generación en generación, generando una población con resistencia irreversible, por
ejemplo, el tizón de la hoja del norte, la mancha negra y el virus del estriado del Maíz.
Además, según Vermeulen et al. (2001) y Hayashi et al. (2001), varios estudios
analizados han demostrado la presencia en B. cinerea sobre fenotipos MDR y cepas de
campo de Penicillium digitatum y Mycosphaerella graminicola (Nakaune et al., 1998);
posteriormente, Roohparvar et al. (2008) mencionan que, al analizar los aislados no se
ha podido describir la importancia ejercida por fenotipos MDR en la agricultura.
Por otro lado, Morschhäuser et al. (2007) mencionan que, la resistencia irreversible
proveniente aislados con resistencia poligénica y multidrogas ha generado hongos con
sobreexpresión continua de transportadores ABC CDR1 y CDR2, o el transportador
MFS MDR1, observados en varios asilados de Candida spp. con resistencia a fenotipos
MDR. Un estudio realizado por Leroux & Descotes (1996) demuestra que, el
crecimiento de aislados con el fenotipo MDR I, II y III, considerándose que, los
asilamientos MDR1 tenían niveles de resistencia hacia fludioxonil, cyprodinil y
tolnaftato, los aislamientos del fenotipo MDR2 poseían mayor resistencia a fenhexamid,
tolnaftato, cicloheximida y cyprodinil, en cambio, los aislamientos del fenotipo MDR3
mantuvieron altos niveles de resistencia contra la mayoría de los fungicidas poligénicos,
por lo que, Kretschmer et al. (2009), en el Anexo 17 muestra un aumento considerable
de aislados con la presencia de la mutación después de 10 años usando fungicidas
poligénicos.
40
Cuadro 8. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea para dos fungicidas poligénicos.
Ais
lam
ien
to
EC50 µg/cm³
Anilinopirimidinas + Fenilpirroles
Cyprodinil + Fludioxinil Pirimetanil
A1 0,04 <0,01
A2 0,11 <0,01
A3 0,05 <0,01
A4 0,07 <0,01
A5 0,26 <0,01
A6 0,01 <0,01
A7 <0,01 <0,01
A8 <0,01 <0,01
A9 0,01 <0,01
A10 <0,01 <0,01
A11 0,01 <0,01
A12 0,07 <0,01
A13 0,02 <0,01
A14
Silvestre <0,01 <0,01
*Categoría del EC50 para determinar el grado de sensibilidad
del fungicida.
Categoría EC50
Sensible <0,05-1,37
Levemente sensible 1,38-7,80
Moderadamente resistente 7,81-50
Resistente >50
Fuente: Petsikos et al. (2003)
4.2.2. Análisis del EC50 de B. cinerea para fungicidas disruptores de
membrana y ATP
Al analizar los 14 aislamientos con los fungicidas disruptores de membrana como
meflentrifluconazole y prochloraz, se determinó que tres de los asilamientos estudiados
(A3, A12 y A13) fueron levemente sensibles para ambos fungicidas, es decir que el
EC50 se encuentra entre 1,38 y 7,80 μg/cm³, mientras que, los 11 aislamientos restantes
presentaron un EC50 < 1,37 μg/cm³, aludiendo que no existe resistencia a los
ingredientes activos. Este resultado sugiere que se ha realizado un correcto manejo de
estas moléculas con respecto al tiempo de uso; sin embargo, es necesario tomar en
cuenta que, si alguna finca o aislamiento sobrepasa el umbral de sensibilidad (>30
μg/cm³) del fungicida para cada uno de los aislamientos, sugiere Gutiérrez et al. (2002)
41
que se puede tener la presencia de una resistencia a multidrogas tipo I, II y III. A pesar
de esto, en este estudio no se analizó la presencia de mutaciones, debido a que los EC50
sugirieron alta sensibilidad de los aislados de B. cinerea a los fungicidas antes
mencionados. Pese a tener estos resultados, es necesario tomar en cuenta las
recomendaciones de sistemas de rotación basadas en lo que menciona FRAC (2019),
para triazoles usar de 2 hasta 3 veces al año, y de esta forma evitar futuros problemas de
resistencia.
Por otro lado, según Leroch et al. (2011), el modo de acción de los triazoles afecta
principalmente a los ácidos grasos por lo que los niveles de resistencia son bajos,
comparados con aquellos de tipo monogénico o poligénico cuyo modo de acción se
encuentra en las proteínas, donde para monogénicos si fueron determinadas mutaciones
de diferente tipo en esta investigación.
Por otro lado, fluazinam (2,6-dinitro-anilines) actúa como disruptor del ATP, cuyo modo
de acción se da a través de la inhibición de la fosforilación oxidativa (proceso mediante
el cual los seres vivos produce ATP, mediante el transporte de electrones gracias a una
reacción de óxido reducción). Según la FRAC (2019), la fluazinam incrementa la
permeabilidad de la membrana interna de la mitocondria hacia los protones, generando
según Chen et al. (2018), que se disminuya la producción de protones e impide la
formación de ATP; y la energía demandante es liberada como calor generando un flujo
de electrones, por lo tanto, impide la formación de micelio y crecimiento del hongo.
Nuestros resultados sugieren que, los 14 aislamientos de B. cinerea fueron sensibles al
grupo químico de las 2,6-dinitro-anilines con un EC50 <1,37 μg/cm³, aludiendo que la
alta sensibilidad al fungicida, se debe gracias al mecanismo de acción del mismo
generando niveles bajos de resistencia en el hongo.
Shengming et al. (2019) mencionan que, aislamientos de Botrytis controlados con
fluazinam presentan bajo crecimiento micelial del hongo, sin embargo, existen pocos
aislamientos registrados en Japón que presenta una resistencia media al grupo químico
en mención, generando una resistencia en el patógeno no reversible a fluazinam.
Adicionalmente, Shengming et al. (2019), también menciona que, la forma de adquirir
una resistencia no reversible es, mediante un plan preventivo de manejo químico en el
cultivo, además Vitoratos, (2014), nos sugiere que, si alguna finca o aislamiento
sobrepasa el umbral de sensibilidad (>22 μg/cm³) del fungicida en el patógeno, se puede
generar la presencia de una resistencia a multidrogas de tipo I, II y III, por lo que, se
generarán aislamientos resistentes, no solo al grupo químico sino a una familia completa
de ingredientes activos con el mismo modo de acción de los fungicidas ya mencionados.
Cuadro 9. Matriz de relación del EC50 de B. cinerea y tres fungicidas disruptores de
membrana y ATP.
42
Fin
ca EC50 µg/cm³
Disruptores de membrana ATP
Meflentrifluconazole Prochloraz Fluazinam
A1 0,27 0,05 <0,01
A2 0,65 0,24 <0,01
A3 2,31 1,41 <0,01
A4 0,14 0,13 <0,01
A5 0,28 0,05 <0,01
A6 0,24 0,04 <0,01
A7 0,25 0,15 <0,01
A8 0,2 <0,01 <0,01
A9 0,26 <0,01 <0,01
A10 0,35 0,2 <0,01
A11 0,22 0,05 <0,01
A12 3,67 1,41 <0,01
A13 2,66 1,56 <0,01
A14
Silvestre 0,95 0,18 <0,01
*Categoría del EC50 para determinar el grado de sensibilidad del fungicida.
Categoría EC50
Sensible <0,05-1,37
Levemente sensible 1,38-7,80
Moderadamente resistente 7,81-50
Resistente >50 Fuente: Veloukas et al. (2011)
43
5. CONCLUSIONES
Los niveles de sensibilidad de los 14 aislamientos de Botytis cinerea variaron
entre monogénicos y poligénicos, siendo los monogénicos los de mayor
resistencia, especialmente para estrobilurinas y benzimidazoles, en casi todos los
aislamientos, además existieron 6 aislamientos sensibles al grupo de
carboxamidas; esto probablemente se deba al manejo de rotación de fungicidas
para cada uno de los aislamientos, sin embargo, se evidenció bajos niveles de
sensibilidad para los demás aislados de carboxamidas y hidroxianhilidas,
mientras que, los fungicidas de acción poligénica y disruptores de ATP
presentaron alta sensibilidad a los fungicidas probados, debido al mecanismo de
acción en el hongo para los 14 aislamientos.
Los niveles de resistencia para Botrytis cinerea en los 14 aislamientos,
presentaron nueve tipos de mutaciones en los fungicidas monogénicos, de los
cuales las mutaciones P225H y P225F resultaron ser aberrantes para el grupo
químico de las carboxamidas, confiriendo resistencia a boscalid, fluopyram y
fluxapyroxad; por otro lado, las mutaciones H272R y H272L resultaron ser
medianamente aberrantes para el grupo químico de las carboxamidas,
confiriendo resistencia a boscalid y fluxapyroxad. Mientras que, para el grupo
químico de las hidroxyanhilidas, se presentó tres diferentes tipos de mutaciones,
de las cuales la mutación F412S resultó ser aberrante, confiriendo resistencia a
fenhexamid; por otro lado, las mutaciones L195F y V309M resultaron ser poco
aberrantes, confiriéndoles una baja resistencia a fenhexamid, mientras que, para
el grupo de los benzimidazoles, la mutación E198A resultó ser medianamente
aberrante, confiriéndole resistencia a metil thiophanato, finalmente en el grupo
de las estrobilurinas la mutación G143A resultó ser aberrante confiriéndole
resistencia a pyraclostrobin.
En los 14 aislamientos del hongo Botrytis cinerea, la resistencia adquirida por
cada uno de ellos se clasificó en resistencia monogénica y poligénica
principalmente, de los cuales se evidenció aislados con presencia de resistencia
específica o monogénica, dentro de los cuales se detectó alta probabilidad de
resistencia cruzada entre boscalid y fluxapyroxad, en 5 aislamientos analizados
en este estudio, debido al modo de acción de los fungicidas, cuya correlación de
Pearson es de 0,70; adicionalmente, no se evidenció la presencia de resistencia
poligénica, ni multidrogas en esta investigación.
44
6. RECOMENDACIONES
La frecuencia de aplicación de botricidas por ciclo de producción en rosas, debe
ser de dos aplicaciones si los niveles de sensibilidad están entre 0,05 y 1,37 ppm.
Si los niveles de sensibilidad están entre 7,81 y 50,00 ppm, suspender las
aplicaciones de botricidas en rosas por lo menos por un año.
En el cultivo de rosas no hacer mezclas entre grupos químicos pertenecientes al
grupo de SDHI/QoI (inhibidores de la suncinato deshidrogenasa e inhibidores de
la quinasa), debido a la posible presencia de MFR (resistencia multidrogas) con
benzimidazoles e hidroxianhilidas.
Donde se observe pérdida de sensibilidad a boscalid, evitar aplicar otra
carboxamida que tenga el mismo sitio de acción en la SDHI.
Se pueden hacer mezclas entre ingredientes SDHI con ingredientes que afectan
membranas o pared, tales como DMI (inhibidores disruptores de membranas),
Aminas y Polyoxinas. La frecuencia de aplicación en mezcla dependiendo de la
sensibilidad (0,05-1,37 ppm) puede ser de tres veces por año.
Mezclar el ingrediente activo con ingredientes multisitio como guanidinas.
45
7. RESUMEN
Botrytis cinerea conocido comúnmente como “moho gris”, se aprecia por la presencia
de pequeñas manchas circulares de color marrón/violeta, seguido de la formación de un
micelio de color grisáceo que ocasiona podredumbre en los botones florales, divisadas
fácilmente por los técnicos de las fincas (Williamson et al., 2007). Este fitopatógeno es
la causa de la mayor pérdida económica para la industria de rosa al nivel mundial y en
el Ecuador, afectando a más de 200 distintas especies vegetales, siendo un problema
antes y después de la recolección (Benito et al., 2000). Por otro lado, durante los
últimos años en el Ecuador se ha visto una considerable pérdida de sensibilidad del
hongo a ciertos ingredientes activos (fungicidas mono y poligénicos), por lo que es
necesario dilucidar en específico la pérdida de sensibilidad y la consecuente resistencia.
En época lluviosa cuando el microclima es apropiado para el crecimiento del hongo,
incrementan las infecciones y la probabilidad de aparecimiento de razas mutantes. En
este sentido, durante los últimos años este hongo ha ido perdiendo sensibilidad a varios
fungicidas, principalmente debido al constante uso de ingredientes activos específicos
para proteínas fúngicas. Cabe mencionar que Botrytis tiene un amplio rango de
hospederos secundarios en el Ecuador, como la frutilla, la uva, entre otros. Gracias a las
cualidades de adaptación del hongo a su medio, se han manifestado diferentes tipos de
resistencia adquirida a fungicidas (Agrios, 2005). El grupo del fungicida determina si la
sensibilidad y la resistencia puede ser monogénica o poligénica; dentro de la resistencia
monogénica está la resistencia cruzada, y dentro de la resistencia poligénica está la
resistencia a multidrogas. La resistencia a los fungicidas puede estar gobernada por
genes mayores únicos (resistencia monogénica u oligogénica), así como la gobernada
por genes menores (resistencia poligénica, mutaciones alélicas secuenciales). Por lo
expuesto la presente investigación tuvo como objetivo principal estudiar la sensibilidad
y la resistencia mono y poligénica de aislamientos de Botrytis sp., a 11 fungicidas,
específicamente se buscó determinar el EC50 en los 14 aislados; para esto se realizaron
ensayos en laboratorio bajo condiciones de temperatura y humedad en donde se midió el
crecimiento micelial de Botrytis cinerea. Se utilizó un diseño completamente al azar con
cinco tratamientos (dosis) de 0; 0,1; 1; 10 y 100 ppm, y dos observaciones para cada
fungicida; además se realizó identificación de mutaciones mediante una extracción de
ADN y secuenciación de la misma. Con los datos obtenidos de los parámetros
evaluados se calculó el EC50 mediante modelos PROBIT para conocer la inhibición del
crecimiento micelial para cada fungicida, utilizando el programa estadístico Infostat
2019 Versión Estudiantil. Los resultados obtenidos mostraron que existe pérdida de
sensibilidad para los fungicidas que pertenecen al grupo de los monogénicos hacia el
hongo Botrytis cinerea. en los 13 aislados y solo para estrobilurinas la resistencia en el
testigo. Mientras que, para los fungicidas poligénicos, disruptores de membrana y ATP,
el EC50 se mantuvo en un rango bajo promedio para los 14 aislamientos, cuyos estudios
posteriores mencionan que por su mecanismo de acción no suelen presentar con
frecuencia mutaciones; aunque, una vez adquirido para uno se adquiere para el resto;
por otro lado, de las mutaciones presentes en los fungicidas monogénicos cinco de ellas
son aberrantes y representan una complejidad cuando se refiere a resistencia cruzada
entre carboxamidas e hidroxianhilidas, porque su mecanismo de acción se presenta en el
complejo proteínico de la membrana mitocondrial del hongo, cuyas mutaciones
cambian la estructura y no permiten el reconocimiento del fungicida para enlazar
puentes de hidrógeno e impedir el control del patógeno, verificando los aislados, la
sensibilidad de Botrytis cinerea al fungicida se está perdiendo casi en su totalidad,
46
excepto para alguno de ellos en los cuales es necesario mantener un sistema riguroso de
plan químico para evitar posibles mutaciones a futuro.
SUMMARY
Botrytis cinerea commonly known as "gray mold", is seen by the presence of small
circular spots of brown / violet, followed by the formation of a grayish mycelium that
causes rot on the flower buds, easily spotted by the technicians of the farms
(Williamson et al., 2007). This phytopathogen is the cause of the greatest economic loss
for the rose industry worldwide and in Ecuador, affecting more than 200 different plant
species, being a problem before and after harvesting (Benito et al., 2000). On the other
hand, during the last years in Ecuador there has been a considerable loss of sensitivity
of the fungus to certain active ingredients (mono and polygenic fungicides), so it is
necessary to clarify specifically the loss of sensitivity and the consequent resistance. In
the rainy season when the microclimate is appropriate for the growth of the fungus,
infections and the probability of appearance of mutant races increase. In this sense,
during the last years this fungus has been losing sensitivity to several fungicides, mainly
due to the constant use of specific active ingredients for fungal proteins. It should be
mentioned that Botrytis has a wide range of secondary hosts in Ecuador, such as
strawberries, grapes, among others. Thanks to the adaptation qualities of the fungus to
its environment, different types of resistance to fungicides have been manifested
(Agrios, 2005). The fungicide group determines whether the sensitivity and resistance
can be monogenic or polygenic; Within the monogenic resistance is the cross resistance,
and within the polygenic resistance is the multi-drug resistance. Fungicide resistance
may be governed by single major genes (monogenic or oligogenic resistance), as well as
governed by minor genes (polygenic resistance, sequential allelic mutations). Therefore,
this research aimed to study the sensitivity and mono and polygenic resistance of
Botrytis sp. At 11 fungicides, it was specifically sought to determine the EC50 in the 14
isolates; For this, laboratory tests were carried out under conditions of temperature and
humidity where the mycelial growth of Botrytis cinerea was measured. A completely
randomized design was used with five treatments (doses) of 0; 0.1; one; 10 and 100
ppm, and two observations for each fungicide; In addition, mutations were identified by
DNA extraction and sequencing. With the data obtained from the parameters evaluated,
the EC50 was calculated using PROBIT models to determine the inhibition of mycelial
growth for each fungicide, using the statistical program Infostat 2019 Student Version.
The results obtained showed that there is a loss of sensitivity for fungicides belonging to
the group of monogenic to the fungus Botrytis cinerea. in the 13 isolated and only for
strobilurines the resistance in the control. While, for polygenic fungicides, membrane
disruptors and ATP, the EC50 remained in a low average range for the 14 isolates,
whose subsequent studies mention that due to their mechanism of action they do not
usually present mutations frequently; although, once acquired for one, it is acquired for
the rest; on the other hand, of the mutations present in monogenic fungicides, five of
them are aberrant and represent a complexity when it comes to cross resistance between
carboxamides and hydroxyanhilides, because their mechanism of action occurs in the
protein complex of the mitochondrial membrane of the fungus, whose mutations change
the structure and do not allow the recognition of the fungicide to bind hydrogen bonds
and prevent the control of the pathogen, verifying the isolates, the sensitivity of Botrytis
cinerea to the fungicide is being lost almost entirely, except for some of them in the
which is necessary to maintain a rigorous chemical plan system to avoid possible future
mutations.
47
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56
9. ANEXOS Anexo 1. Control del hongo Botrytis cinerea por fenhexamid.
Anexo 2. Presencia de la mutación aberrante F412S.
Anexo 3. Presencia de la mutación F412I, que inhibe el proceso de control de
fenhexamid.
57
Anexo 4. Presencia de la mutación E198 del grupo de los benzimidazoles
Anexo 5. Proceso de transportación de electrones para generar ATP sin la
influencia de fluazinam
58
Anexo 6. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluxapyroxad.
Anexo 7. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluazinam.
59
Anexo 8. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo cyprodinil + fludioxonil.
Anexo 9. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo boscalid.
60
Anexo 10. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fenhexamid.
Anexo 11. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo prochloraz.
61
Anexo 12. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo mefentri-fluconazole.
Anexo 13. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo metil thiophanato.
62
Anexo 14. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo pyrimetanil.
Anexo 15. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo fluopyram + pyrimethanil.
63
Anexo 16. Crecimiento micelial de Botrytis sp. en los cinco tratamientos (de arriba a
abajo) de la observación 1– fincas 4, 6, 11, 8, 10, 7 y 14 6 al día 15 de evaluación del
ensayo con el ingrediente activo pyraclostrobin.
Anexo 17. Frecuencias de aislamiento de cepas de B. cinerea MDR de regiones
vitivinícolas francesas y alemanas de 1994 a 2008 (Kretschmer et al., 2009).