UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL PRESENTADO PARA

OBTENER EL TITULO DE LA LICENCIATURA EN "=."-

INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL. . . ~* ;"-

MARTHA ALICIA AVIÑA CRUZ

MATRICULA: 85239405

EN EL LABORATORIO DE ANALISIS CLINICO. /

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL

UNIDAD DE MEDICINA FAMILIAR NO.11 ASESOR: DR. CARLOS ORTIZ MEDINA.

Cnsa abierta al tiempo

LIC. JIJLIO DE LARR ISASSI Coord, Sistemas Escolares P r e s e n ~ e .

Por medio de l a presente se hace constar que el alumno, cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servicio Social.

MATRICU1,A: 85239405

LIC13NC.IATURA: Ingenieda Riqurrnica lntlust ria1

Sc estientic 13 prescntc para los fincs que al intcresncio convcngam ;I los vcintitrcs dias del mes de julio d e m i l novecicntos noventa y uno.

Nc;;ibre :

Pta t r ícu la :

Te lefono partícular:

I i c e n c i a t u r a :

Tutor ex te rno:

Lugar de r e a l i z a c i ó n :

Fecha de i n i c i o :

Fecha de terminación:

Clave:

Firma dc l t u t o r :

Plartha Alicia Aviña 'Cruz.

85239.105.

5 69 43 7 8

I n g e n i e r í a B i g u í m i c a I n d u s t r i a l (12), Divis ión

d e C .B .S . , U n i v e r s i d a d A u t o n m b k t r o p l i t a n a -

Uni.dad I z t a p a l a p a .

91 - P

20 horas .

i',pl.i cac ión T&xicds Bi-o?uíini.czS en el. r-,cdmra-

torio de AnZil is is Cl ínico.

D r . Carlos Ortíz Pledina, Director de l a Unidad -

de bleclicina F z n i l i a r N0.11 del I n s t i t u r o Mexica-

no d e l S e g u r o Social.

Labratorio de A n á l i s i s C l í n i c o s de la Unidad d e

Medicina Famil iar N0.11 d e l I.M.S.S.

5 de Noviembre de 1990.

24 de ¡Yayo d e 1991.

23 3 052/90

Las actividades correspndien tes a l trabajo de Servicio Social se desarrolla rc3n en e l Ukora tor io dc Aniilisis C l í n i c o s de la Unidad de Medi.cina FaTiliar No.

lI d e l I n s t i t u t o &lexicano del Seguro Snc ia l (Caruso y Leon Cavalo, Col. Vallejo).

-

3 2 2 2 4 0 8

Rccurscs ccn los que cuen'ia. el Lzkxxatcrio de Análisis Clínicos de la Unidad (?e Pledicim Farri l i a r Xo. 21 d e ac:uerdo a lo que el Instituto Flexicano del Seguro -

Social tiene nor.mado reqxcto a 1.0s recperimicn-tos f ls icos , tecnolGgicos, materia - les y hurik3nos.

0

De acuerdo a los Gbjetivos señaldos se establece un programa de trabajo por

horas, día y semana y por área de trabajo:

Se tomrán mues-tras de sar,yre venosa de 20 a 30 minutos diariamente durante dos - sacanas, muestras de exudados farinqcos durante 20 a 30 minutos p r d í a las dos - siguientes senanas y as: sucesivaente durante los sei.s meses de trabajo.

Se realizará un reconocimiento, revisi¿% y manejo de material, equipo y reac

tivos que se utilizan en el. ldmratorio de análisis clínicos de primer n i v e l de -. 2 a 3 dícis 3.1 inicio d e l t r a ! i j o en cada k e a (Química-Clínica, Im.unoloyía, Hem

tolocjia y I'~icro5lolcgla rcspec:ki.vm?.cn-tc_) , CQJIO se irCiic:cl en e l crotlqraxa de ac t i

vidades.

-

.-

-

S e t r a b j a r á un mes 211 el &ea d c Qukica-Cllnica, realizando Ziferentes técnicas

por e l nétdo colori i@trico para determinar: glucosa, urea, á.cic?o úrico y crea-ti-

nina durante dos scmnas; y coiesterol, transzminasas, fosfatasas, bilirrubinas,

zdbwina y trig]-iceridos las d o s senmas siguientes.

A continuc.ci6n se t r a h jar2 en el 5rea de irmmología durante dos semnas, deter-

nunando en suero: protcina-C reactiva, antiestreptol-isin~s, reaccicnes febriles y

l a pr-eh para l a detección de S í f i l i s .

Pcsterio;riient.e cn e l Srea de fie,mtoloqis, ( 3 semanas) se redizarán b5ometríz.s k- m5tic5s ccrpletas y l a determinacion de los grups sanyuineos y factor Rh. POI- ú i t b o se realizar5n en e l área d e P-licrobicdoc;.ía. duracte 4 sen-zms tincicnes

& G;z-ti, - m ~ d ~ x . m y C J l t i 1 . a f ~ ~ = 11 \ q i ! y L s ps k, i&.tjf i L z i & 62 T~F-T-

ni"cs: p-.

.Wesor responsable:

Dr. Carlos Ortíz Mcdina, Director de l a Unidad de Mledicina Faniliar No.11 del I n s -

t.itu.to !.lexicano del Seguro Social.

"-

!

r ri

APLICACION DE TECNICAS BIWIMICAS EN EL LAEDRA3DRIO DE ANALISIS CLINIC0

I N D I C E

Introducción.

Objetivo General y Objetivos Especif icos.

Material, Métodos y Tdcnicas de las Actividades desarrolladas:

(A ) Química-Clínica

Prueba de embarazo en portaobjetos. Cuantif icaciÓn de glucosa en suero sanguíneo.

CuantificaciÓn de urea en suero sanguíneo. Cuantif icación de &ido Úrico en suero sanguíneo.

Cuantif icaciÓn de creatinina en suero sanguíneo.

Cuantificación de colesterol en suero sanguíneo.

: m . . Cuantif icación de bilirrubinas en suero sanguíneo.

Cuantif icación de transaminasa glutámica oxalacética. Cuantif icación de transaminasa glutámica pirúvica.

CuantificaciÓn de fosfatasa &ida en suero sanguíneo. CuantificaciÓn de fosfatasa alcalina en suero sanguíneo.

Cuantif icaciÓn de triglicéridos en suero sanguíneo.

( B ) Imnunología Prueba de latex para factor rewnatoide en scero sanguheo.

Reacciones febriles en suero sanguíneo.

Determinación de proteína C-reactiva en suero sanguíneo.

Prueba del VD& en suero sanguíneo (deteccion de Sífilis). Determinacidn de antiestreptolisinas en 5i12ro sanguíneo.

(C ) Hematologia

Biometria Hemática completa. Sedimentación globular. Cuantificación de reticulocitos. Determinación de grupos sanguíneos (A,E3,0) y factor Rh (0).

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Microbiología 2 2 2 4 0 8

Urocultivo: Cuenta de leucocitos y de bacterias. Cultivo de exudados faringeos: siembra directa y vaciado en placa. Cultivo de exudados vaginales: frotis para la tincion de Gram,

pseparacion en fresco y cultivos.

Lista de medios de cultivo más utilizados m el área de Microbiologia.

Objetivos y metas alcanzadas.

Resultados de las Actividades desarrolladas,

Cronoyrama de Actividades.

Tabla de resultados.

Conclusiones.

Recomendaciones.

Bibliografía.

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APLICACION DE TKNICAS BIoQUIMICAS EN EL W R A I D R I O DE ANALISIS CLINIC0

Introducción.

Existe una gran y variada población de microorganismos, los cuales estan -- presentes practicamente en toda la naturaleza, se encuentran en la tierra, en la flora y fauna, en el agua, en la atmósfera y en el ser humano. Se sabe que los microorganismos son los causantes de muchas enfermedades; en el presente trabajo, se describen, en forma practica las técnicas fundamentales más frecuentes en Microbiología y Química-Clínica principalmente, así como la impor- tancia de 1.a inte.rpretaci6n de los resultados de ].as pruebas de laboratorio, co

1110 apoyo en la prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades.

-

-

Los microorganisrnos que se pueden encontrar en la sangre son virus, levadu-

ras ,- bacterias, hongos, protozoarios y metazoarios. Sin embargo, aunque se con- sidera que la sangre es un medio aséptico, se pueden encontrar en el torrente

circulatorio del organismo humano tanto microorganismos patógenos como no patóge nos. Entre las bacterias pat6genas por ejemplo, presentes en hemocultivos se en cuentran Clostridium sp., Escherichia coli, Hemophilus influenzae, Salmonella T.,

Diplococcus pneumoniae, Staphilococcus aureus, Pseudomonas sp., Streptococcus de

los grupos A, B, D y anaerobios, Neisseria meningitidis, Grupo paracolon y Here-

llea sp., Brucella sp., Candida albicans, Corynebacterium diphteriae, Leptospira

sp., Listeria monocytcqenes, Pasteurella sp., Streptobacillus moniliformis, Spi- rillum minus, Vibrio fetus, Neisseria gonorrheae y Serratia marcescens.

. .

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- " .

De la misma forma podrían mencionarse la gran cantidad de microorganismos -

tanto patógenos corn no patkenos clue se encuentran presentes en la piel, en que

maduras, heridas, en oídos, nariz, garganta, en infecciones gastrointestinales,

del peritoneo, de las vías urinarias, de los huesos y articulaciones, de las rne- ninges , etc.

-

Así, uno de los objetivos principales del trabajo de Servicio Social, ha si do encontrar y conccer las características de los procesos metab6licos de los mi croorganismos y su comportamiento frente a factores fisicquírnicos, además de técnicas de aislamiento para su identificación con fines diagnósticos.

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Objetivo General.

Aprendizaje y realización de métodos y técnicas bicquímicas útiles en el diagnósti -

co clínico, apoyando así a la atención médica mediante estudios inmunol6qicos, he -

matológicos, microbiológicos y químico-clínicos. Asimisnlo, conocer y aplicar las medidas generales de seguridad y control en el La- boratorio de Análisis Clínicos de primer nivel.

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Objetivos Espec.íficos. .... -."- ..-.-. - .""

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6.

Dentro de los procedimientos técnicos generales aprender a tomar nuestras de

sangre venosa y exudados faringeos.

En el área de Química-clínica aprender y realizar técnicas para la determind¿% y cuantificación en plasma y suero sanguíneo de: glucosa, urea, creatinina, áci do úrico, bilirrubinas, fosfatasa ácida y alcalina, colesterol, transaminasas - glutámicas oxalacética y pirúvica y triglicéridos por espectrofotometría (colo- rimetría) . Dentro del área de Química-clínica, determinación de la hormona gonadotropj-na -

coriónica humana -1ICG-. Técnica inmunológica: prueba de embarazo.

En el área de Inmunología realizar en suero sanguíneo procedi~rnientos técnicos -

para la cuantificación y determinación de antiestreptolisinas, proteína C-reac- tiva, reacciones febriles y prueba del \'DIU (detección de Sífilis).

En el área de Hernatología realizar biometrías henGticas, determinación de gru- p s sanguíneos (A,B,O) y factor Rh ( U ) .

En el área de Microbiolqía realizar técnicas de cultivo bacteriológicas y de - urocultivo para la identificación de micrmrganismos patkenos presentes en -

rnuestras de orina, exudados faringeos y vaginales.

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Material, Métodos y Técnicas de las Actividades desarrolladas.

Se realizaron los Análisis Clínicos a pacientes Derecho-habientes de la Unidad de

Medicina Familiar N0.11 del I.M.S.S., solicitados por el Médico tratante.

* Material Biológico: Sangre venosa, orina y muestras de exudados faringeos y va- ginales.

Química-Clínica.

c 1 . Prueba de Fmbarazo en Portaobjetos: detección de la hormona gonadotropina corió -

nica humana -HCG- en orina. La prueba se basa en el principio de inhibición de

aglutinación; la orina humana a probar es mezclada con el suero Anti-HCG y con

las partículas de latex recubiertas con Antigeno HCG. En el caso de una mujer - no embarazada, la orina normalmente no contiene HCG, de tal forma que el anti-

cuerpo queda libre para reaccionar con el Antígeno HCG de las partículas de la-

tex; el punto final es una aglutinación, que indica un resultado negativo (nom -

barazada). En el caso de una mujer embarazada, la orina contiene HCG la cual reacciona con el anticuerpo Anti-IICG y éste ya no aglutina las partículas de la -

tex, indicando un resultado positivo (embarazada).

REACTIVOS

- Suero Anti-HCG (producido en conejos), el cual contiene Anti-HCG diluido para pro

porcionar sensibilidad a 3.5 UI/ml. - Antigeno que contiene partículas de 1atex.en suspensión, recubiertas con HCG.

-

PROCEDIMIENTO

a) Colocar una gota de orina en una placa de vidrio (portaobjeto con fondo negro),

y mezclar con una gota de suero Anti-HCG y dos gotas de partículas de latex re-

cubiertas con Antígeno-HCG.

b) Mover suave y lentmente el portaobjetos durante no más de 90 segundos. Resultado negativo: Aglutinación al cabo de 90 segundos.

Resultado positivo: No aglutinación al cabo de 90 segundos.

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- 2. Técnica de Hultman con ortotoluidina para la cuantificación de Glucosa en suero sanguíneo por colorimetría. La ortotoluidina reacciona especificamente con las aldohexosas en solución acética caliente; el color verde formado es proporcid a la concentración de glucosa presente.

REACTIVOS - Solución de ortotoluidina: tiourea 1.5 g, ortotoluidina 60 ml, ácido acético gla cia1 940 ml.

- Solución de glucosa (dextrosa) de 10 mg en 1 m1 de agua destilada.

PROCEDIMIENTO

a) En un tukm de ensaye colocar O. 1 m l de sucro s.-mguíneo.

b) Agregar 5 ml del reactivo de ortotoluidina y mezclar. c) Tapar los tubos y colocar en baño de agua en ebullición durante 10 minutos.

d) Enfriar los tubos con agua corriente y mezclar bien. e) Leer en espectrofotómetro en longitud de onda de 630 m.

Calibración (curva estandar): De la solución de glucosa poner O, 0.5, 0.75, 1.0, - 1..5 y 2.0 m1 en tubs de ensaye y adicionar agua destilada c.b.p. 10 nil. De cada dilución tornar 0.1 ml y proseguir cam se indica en la técnica a partir del paso b.

* Valores normales: De 70 a 100 mg en 100 m1 de suero.

3 . TGcnica de Berthelot-Chaney-Marbach para la cuantifica6iÓn de Urea en suero san_

guíneo por colorimetría. La ureasa hidroliza la urea en amoniaco y anhídrido carbónico, el amoniaco l i e

rad0 reacciona con el fenol y el hipocl.orito para fonnar la paraquinona clora

na; kta, con una segunda molGcula de fenol, produce un compuesto indofenólico de color azul, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de urea presente.

REACrIVOS - Solución de urea al 1 %. - Solución de hidróxido de sodio 5N. - Solución de hipclorito de scdio 0.14N.

- Solución de fenol al 85 %

- Ni-troprusiato de scdio: Nitroprusiato 20 mcj, solución del fenol al.858 = 5 d, - aforar con agua destilada a 150 ml.

- Solución de ureasa: ureasa 20 mg, EiYTA a pH 6.5 = 25 ml y agua destilada c.b.p.- 50 ml.

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PROCEDIMIENTO

a) Colocar en un tubo de ensaye 0.1 ml de suero sanguíneo. b) Añadir O. 5 ml de la solución de ureasa, mezclar y de jar reposar 30 minutos. c) Agregar 3.5 ml de solución fenolada de nitroprusiato de sodio y agitar.

d) Adicionar 0.25 ml de hipoclorito de sodio 0.14N y 0.25 ml de NaOH 5N. e) Dejar reposar durante 10 minutos. f) Leer en longitud de onda de 550 nm en espectrofotdmetro.

Calibración: Colocar O, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml de la solución de urea en tu- bos y añadir agua destilada c.b.p. 10 ml. De cada dilución tomar 0.1 m1 y prose- gui-r como se indica a partjr del paso b.

* Valores normales: De 1G a 35 mg en 100 ml.

4. Técnica de Caraway: determinación de Ácido Úrico en suero sanguíneo por colori-

metria. El ácido úrico, al reducir el fosfotungstato en medio alcalino, produce un com-

puesto de color azul de intensidad proporcional a la cantidad de ácido úrico -

presente en la muestra.

REACTIVOS

- Solución de ácido túngstico: tungstato de sodio al 10 %. - Acido sulfúrico 0.66 N. - Solución de carbonato de sodio al 10 %. - Solución de ácido úrico, 100 mg en 100 ml de agua. - Reactivo de ácido fosfotúngstico Folin y Denis: tungstato de sodio 50 g , ácido -

ortofosf6rico 40 ml y agua destilada aforando a 500 ml.

- Acido fosfotúngstico diluido: 10 ml del reactivo Folin y Denis, aforar a 100 ml

con agua destilada.

PROCEDIM1Eh"rO

a) Colocar en un tubo de ensaye 1 m1 de suero sanguíneo. b) Agregar 9 m l de solución.de ácido túngstico, mezclar y filtrar.

c ) En un tubo (P) pner 5 ml del filtrado, en otro tubo (B) 5 m1 de agua destila%, ( blanco ).

d) Afiadir a cada tubo 1 m l de solución de carbonato de sodio al 10 % y mezclar. e) Dejar reposar durante 10 minutos.

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f) Agregar a cada tubo 1 m l de ácido fosfotúngstico diluido y mezclar.

g) Dejar reposar durante 30 minutos. h) Leer en el espectrofotómetro a 700 m.

Calibración: De la solución de ácido Úrico medir 0.3 m1 en un t u b o adicionando 17 m1 de agua destilada. Se obtiene una concentración de 1.5 mg en 100 ml.

Colocar en tubos 1, 2, 3, 4 y 5 m1 de la solución diluida anterior y adicionar a-

gua destilada c.b.p. 5 ml. Proseguir como se indica a partir del paso d. * Valores normales: Hombres: 3 a 7 mg/lOO ml. Mujeres: 2 a 6 mg/lOO ml.

REACTIVOS

- Soluci6n de ácid0 pícrico 0.04 M.

- Hidróxido de scdio 0.75 N.

- Solución de creatinina 1 my/nll.

- Sol.ución diluida de creatinina 0.10 mg/ml.

- Solución de ácido clorhídrico 0.1 N.

Calibración: Colocar en tubos O. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 ml de solución diluida - de creatinina y adicionar agua destilada c.b.p. 10 ml. De cada dilución se t m n

3 ml y se prosigue como se indica a partir del paso b. * Valores normales: De 0.5 a 1.5 mg/lOO m l de sangre.

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6. d Técnica de Pearson, Stern y McGavack: Cuantificación de colesterol en suero san - guíneo por colorimetría. El á&do paratoluensulfónico en medio acético reacciona con el colesterol para formar un complejo que con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado, se vuelve de color verde, cuya intensidad es proporcional a la concentración de co - lesterol presente.

REACTIVOS

- Solución acética de ácido paratoluensulfónico al 12 %: ácido p-toluensulfónico - 12 g y ácido acético glacial c.b.p. 100 ml.

- Solución de colesterol de 40 rncj en 10 ml.

- Acido sulfúrico concentrado.

- Anhídrido acético.

PROCEDIMIENTO a) Poner 0.1 ml de suero en un tubo (P), 0.1 ml de agua en otro tubo (B) y 0.1 ml

de la solución de colesterol en otro tub (E). b) A los tubs P y B agregar 0.1 ml de ácido acético glacial; al tubo E añadir 0.1

m1 de agua destilada. c) Agregar a todos los tubos 0.5 n;l de solución acética de ácido p-toluensulfóni.co

al 12 8.

d) Agregar 1.5 m l de anhídrido acético; no agitar.

e) Dejar la mezcla a temperaruta ambiente hasta que se enfríe. f) Añadir 0.2 m1 de ácido sulfúrico concentrado y agitar. g) Dejar 20 minutos a temperatura ambiente. h) Leer en espectrofot6netro a 550 nm.

Con el tubo B, ajustar el cero de densidad óptica y leer el tu!m P y E.

Calibración: De la solución de colesterol de 40 mg en 10 m1 tomar 1, 2, 3, 4 y 5ml y aforar a 5 ml con &ido acético glacial para obtener las siguientes concentracig nes: 8, 16, 24, 32 y 40 rng en 10 ml. De cada dilución se toma 0.1 ml y se continm c m o se indica a partir del paso b.

* Valores normales: Colesterol total de 170 a 240 mg en 100 ml.

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7. Técnica de Sepúlveda-Osterberg para la determinación de bilirrubinas en suero -

sanguíneo por colorimetría. El ácido sulfanílico diazotado se une a la bilirrubina para formar la azobilinu

bina de color rosa, proporcional a la cantidad de bilirrubina presente. -

REACTIVOS - Diazo-blanck: ácido clorhídrico 15 m1 y agua destilada c.b.p. 1000 ml. - Diazo A de Ehrlich: ácido sulfanílico 1 g, ácido clorhídrico 15 ml y agua desti-

lada c.b.p. 1000 ml. - Soluci6n B de nitrito de s d i o al 50 %. - Sulfato de sdio al 12 %. - Versatol pediátrico con concentración de bilirrubina de 20 mg/lOO ml.

- Solución diluida de bilirrubina de 0.004 mg/ml.

PROCEDIMIENTO -(A) Bilirrubina directa:

a) Marcar dos tubos (1 y 2) y colocar en cada tubo 1 m 1 de suero y 7 ml de agua. b) En el tubo 1 agregar 2 ml de diazo-reactivo. En el t u b 2 agregar 2 m1 de diam-

blanck. Mezclar.

c) Dejar reposar durante 5 ninutos y leer a longitud de onda de 550 m.

.. (B) Bilirrubina indirecta: Poner en un tubo 1 m1 de suero. Agregar 1 ml de sulfato de sodio y 10 r n l de cloroformo.

Agitar y centrifugar a 3,000 rpm durante 5 minutos y separar-el clorofom con

pipeta Pasteur. Repetir esta operación hasta que el cloroformo sea incoloro. E v a p r a r los extractos clorofórmicos en bafio de agua caliente. Arladir 0. 5 m1 de

cloroforno y agitar. Añadir 2 m l de alcohol etílico absoluto y 0.5 ml de diazo-reactivo. Agitar y de

jar reposar durante 15 minutos. Añadir 7 ni de alcohol etílico absoluto; leer a una longitud de onda de 550 m.

Calibración: Tomar 1 m1 del Versatol pediátrico y llevar a 50 ml con agua destiladh. Concentración 0.004 my/&.

Al&l etíl~a solucisn dituick de bi 1 i rn3x.m ng/lOO ml __ ~ ~~ "" ~ . . "" ~ " "" -

9 O 0.0 8 1 7

0.4 2 0.8

6 3 5

1.2 4 1.6

8

Desarrollar color adicionando 1 m1 de diazo-reactivo de Ehrlich y dejar a tempera- tura ambiente durante 15 minutos. Leer a longitud de onda de 550 m.

* Valores Normales: Bilirrubina directa de O mg por ciento. Bilirrubina indirecta de O a 0.8 mg por ciento.

8. Técnica de Reitman y Frankel para la cuantificación de Transaminasa Glutámica -

oxalacética por colorimetría.

La transaminasa glutámica oxalacética cataliza la transferencia del grupo amino del ácido asp;lirt;ico al Sicido alf~-cetocj~utárico, formando como uno de los pro-

ductos ácido oxalacético que reacciona con la 2,4-dinitrofenil-hidracina, dando origen a la cetohidrazona, que en presencia del hidróxido de sodio produce una coloración café intensa, proporcional a la cantidad de cetoácido presente en la muestra.

REACTIVOS

- Sustrato para transaminasa glutárnica oxalacética: ácido alfa-cetqlutárico 0.292

g, ácido DL-asgrtico 26.6 g, hidróxido de scdio 1N: 200 m1 y buffer fosfato 0.1 M

pH 7.4 c.b.p. 1000 ml. Sustrato: E O .

- Solución de 2,4-dinitrofenil-hidracina: 2,4-dinitrofenil-hidracina 0.198 g y áti. do clorhídrico c.b.p. 1000 Inl. Reactivo: B. (IIC1 = 1 N) . - Hidróxido de scdio 0.4 N.

PROCEDIMIENTO

a) A 1 ml de sustrato E O precalentado 5 minutos a 37OC, añadir 0.2 mi de suero y mezclar.

b) Incub,ar a 37°C durante 60 minutos. c) Añadir 1 ml del reactivo B, mezclar y dejar a temperatura ambiente 20 minutos. d) Agregar 10 ml de hidróxido de scdio 0.4 N, mezclar y dejar a tempratura dien_

te durante 5 minutos. e) Leer a longitud de onda de 505 m.

Calibración: Reconstituir un suero de referencia multienzimático con concentración de 65 unida6es Reitn-m-Frankel.

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sustrato m SEm pbfn pr3ua- 1.0 nil O n i l 0.2 nil O m l 0.8 0.2 0.2 65 0.7 0.3 0.2 97.5 0.6 0.4 0.2 1.30 0.5 0.5 0.2 162.5

Ckntinuar como se indica a partir del paso b.

Reconstituir un Versatol E con concentración de 331 unidades de acuerdo a las ins- trucciones del vial, tomar 2 m1 y llevarlos a 10 m l con aqua destilada.

1 ml O. O ml. O. 2 ml. o 0 .8 0.2 0.2 66.2 0.7 0.3 0.2 99.3 0.6 0.4 0.2 132.4 0.5 0.5 0.2 165.1

Continuar como se indica a partir del paso b.

* Valores normales: De 8 a 40 unidades.

- 9. Técnica de Reitman y Frankel para la cuantificación de Transaminasa Glut%ca Pirúvica por colorimetría.

La transaminasa glutámica pirúvica cataliza la transferencia de un grupo amino

de la DL-alanina, al ácido alfa-cetqlutárico, formando como uno de los prduc- tos de la reacción ácido pirúvico que reacciona con la 2,4-dinitrofenil-hidaci na y da origen a la cetohidrazona, que en presencia de hidróxido de scdio prod: cen una coloracién café intensa, que es proporcional a la cantidad de ácido pi.- rúvico presente en la muestra.

-

REACTIVOS

- Sustrato para transminasa glutámica pirúvica: ácido alfa-cetoglut5rico 0.292 g, DL-alanina 17.8 9 , a y a destilada 200 ml y solució; amztiguadora fosfato pii 7.4 -

c.b.p 1000 ml. Sustrato: TGP.

- Solución de 2,4-dinitrofenil-hidacina: 2,4-dinitrofenil-hidracina 0.193 g y ács do clorhídrico 1N c.b.p. 1000 ml. Reactivo C. - Hidróxido de s d i o 0.4 N.

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PROCEDIMIENTO a) A 1 m l de sustrato TGP precalentado a 37OC añadir 0.2 ml de suero y mezclar.

b) Incubar a 37°C durante 30 minutos.

c) Añadir 1 ml de reactivo C. Mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 20 m i - nutos .

d) Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 N, mezclar y dejar a temperatura ambien - te durante 5 minutos.

e) Leer a una longitud de onda de 505 m. 2 2 2 4 8 8 Calibración: Reconstituir un suero de referencia multienzimático con concentración de G5 unidades Reitmn-F’rankel.

SJStK-ab TGP SEm pt& 1.0 nil on i l 0.2 nil O 0.8 0.2 0.2 G5 0.7 0.3 0.2 97.5 0.G 0.4 0.2 L30 0.5 0.5 0.2 162.5

1

Gmtinuar como se indica a partir del paso b.

* Valores normales: De 8 a 40 unidades.

10. Técnica de Bassey Lowry-Brock para l a cuantificación de Fosfatasa Acida en sue_

ro sanguíneo por colorimetría.

Las fosfatasas rompen el grupo fosfato del p-nitrofenil fosfato, con formación del p-nitrofenol libre, que en solución ácida diluida es incoloro. En medio al- calino se transforma en ión nitrofenolato con coloraci-ón amarilla intensa, pro-

porcional a la cantidad de enzima presente. La reacción se efectúa durante 30 -

minutos exactamente y se detiene por la adición de hidróxido de scdio que inac- tiva la enzima y a l mismo tiemp diluye el color del nitrofenolato.

REACTIVOS

- Hidróxido de scdio 0.2 N, y 0.1 N. - Stock sustrato en tabletas; p-nitrofenil fosfato disE&.;.o.

- Solución estandar concentrada 10 mM/1 y diluida 0.05 mf.l/l, de p-nitrofenol. - Buffer &ido a pH 4.8: Disolver una tableta de stock sustrato en 6 ml de agua k4

tilada y afiadir l a misma cantidad de buffer ácido.

11

PROCEDIMIENTO

a) Marcar 3 tubos (1,2,3). Agregar 1 ml de sustrato buffer ácido precalentado a - 37°C a los tubos 1 y 2.

b) Añadir 0.2 ml de suero al tubo 2 y 0.2 m l de agua al tubo 1. c) Incubar a 37°C durante 30 minutos exactamente. d) En el tubo 3 mezclar 5 m1 de hidróxido de sodio 0.1 N y 0.2 ml de suero.

e) Agregar 4 ml de hidróxido de scdio 0.1 N a los tubos 1 y 2. Mezclar. f)*Leer a 415 nm. Ajustar a 100% de T con el tubo 1 y leer en el t u b 2. 9) Ajustar a 100% de T con hidróxido de sodio 0.1 N y leer en el tubo 3.

Unidades de fosfatasa ácida = unidades del tubo 2 - unidades del tubo 3.

“Calibración:

w- . C . r

HLdrmucb de 60 0.2 N SluAb estambr dilui& Lklik%s* 0.05 rrM4

10 m1 1.1 m1 O 8 1.1 2 6 1.1 4 4 1.1 6 2 1.1 8 O 1.1 10 2.34

O 0.47 (3.94 1.40 1.87

* Valores normales: Hanbres de 0.13 a 0.63 unidades. Mujeres de 0.01 a 0.56 unidades.

11. Técnica de Bassey Lowry-Brock para la cuantificación de Fosfatasa Alcalina en - suero sanguíneo por colorimetría.

La fosfatasa libera al grupo fosfato del p-nitrofenil fosfato, con formación de

p-nitrofenol, que en medio alcalino se transforma en ión nitrofenol-ato con cols,

ración amarilla intensa, proporcional a la cantidad de enzima presente. La reac

ción se efectúa en 30 minutos y se detiene por la adición de hidróxido de scdio que inactiva la enzima. La unidad enzimática se define como el número de mili

-

60 minutos p r litro de suero. moles de p-nitrofenol formdo en

K~crIVOS

- Hidróxido de scdio 0.2 N y 0.02 N - Stock sustrato en tabletas: p-nitrofenil fosfato disódico. - Buffer alcalino: Disolver una tableta de stock sustrato en 6 m1 de agua destila- da y añadir 13 misma cantidad de buffer alcalino (pH 10.3). - Acido clorhIdrico concentrado.

12

- Solución estandar diluida de p-nitrofenol 0.05 mM/1.

PROCEDIMIENTO a) Marcar dos tubos (1 y 21, añadir a cada uno 1 ml de sustrato buffer alcalino p-

calentado a 37°C.

b) Añadir 0.1 ml de suero al tubo 2 y 0.1 ml de agua al t u b 1. c) Incubar a 37OC durante 30 minutos.

d) Añadir a los dos tubos 10 m l de hidróxido de sdio 0.02 N y mezclar. e) Ceer a 415 nm en espctrofotbnetro. Llevar a 100% de T con el tubo 1 y leer en

el tubo 2.

f) Añadir dos gotas de &ido clorhidrico concentrado en cada tuho y mezclar. g ) Volver a leer a justando a 100% de T con el tubo 1.

Unidades de fosfatasa alcalina = unidades de la primera lectura - unidades de la la segunda lectura.

Talibración: I

%m - . C .

Hu3naib de &o 0.2 N S 1 ~ á - I esta* dLlui.& uni- ala 0.05 nf.Vl

10 ml 1.1 ml O O 8 1.1. 2 2 6 1.1 4 4 4 1.1 6 6 2 1.1 8 8

valor^^ normales: Adultos de 0.8 a 2.3 unidades. Niños de 2.8 a 6.7 unidades.

L 12. Cuantificación de triglicéridos mediante el ensayo d ~ ? Gilford p r rnbc-irrekía. El glicerol producido por hidrólisis enzimática de triglic6ridos es fosforiiado por adenosinatrifosfatasa (ATP) para producir l-glicerofosfato y ADP en la reas ción catalizada por glicercquinasa (GK). El glicerofosfato-deshidrcgerLasa (G-1- PDH) catalizu la oxidación del l-glicerofosfato en presencia de nicotinamida a-

denina dinucleótido (NAD') para prducir NADH que es usado para reducir la ani-

lina de cloruro de 2-tetrazolio (iodofenil-p)-3-(nitrofenil-p)--5"enil (IN11 a formazan en la reacción catalizada por diaforasa. El fomazan absorbe la luz a 500 MI. La intensidad del glicerol y por tanto a la

color f G m d o concentración

es proporcional a la concentración de -.

de triglicéridos .

13

REACTIVOS

- Reactivo para triglicéridos (color): Cuando reconstituido, las concentraciones c k

los ingredientes son las siguientes: ATP 1 rrunol/l; NAD 1.2 mol/l; IhT 1 ml/l, -

GK (microbiana) 120 U/].; G-1-PDH (conejo) 3500 U/1; Diafora 450 U / l ; bpasa (micro -

Liana) 1 x lo5 U/1; Amat iguador pH 7 -7 .

PROCEDIMIENTO

Longitud de onda: 500 m. Tiempo de reacción: 18 a 30 minutos. Temperatura de reacción: ambiente. a) Llevar el espectrofothetro a cero de absorkncia con agua destilada.

b) Colocar 1 m1 de reactivo de triglicéridos a tubos de ensaye. d) Añadir 0.01 m1 de agua, suero a cada tubo; nezclar y esperar c?;? 18 a 30 minuts.

Blanco suero Agua 0.01 m1 "

Suero " 0.01 m1 Re3ct. Triglicéridos 1.0 m1 1.0 ml

e) Despugs de 18, pero dentro de 30 minutos, leer las absorbancias.

* Val-ores normales: 44 a 166 mg/dl (0.5-1.9 ml/l).

Inmunoloqía -

" 1. Prueba d e l a t e x para Factor Reumatoide en suero sancjuheo p r precipita- ción, utilizada en la identificación de artritis reumatoide.

Las partículas de latex están cubiertas con la fracción I1 de Conn (gammaglobu- lina humana), y se precipitan en contactos con el suero de pacientes con artri- tis reumatoide, que contiene una sustancia parecida a un anticuerpo de alto p-

so molecular, llmado factor reumatoide.

Rrn-CTIVOS

- Equipo para investigar factor reurmtoide (RaTest).

14

PROCEDIMIENTO a) Se pone 1 m1 de solución salina amortiguadora de glicina en solución salina y -

se añade 1 gota de suero sanguíneo del paciente,, éste queda así diluido 1:20 a- proximadmente.

b) Se deposita una gota de suero diluido en una placa de vidrio que trae el equip. c) Se .deposita una gota de suero control positivo y una gota del suero control ne-

gativo en la misma placa de vidrio donde está el problema (la placa esta dividi

da en rectángulos). d) Añadir a cada suero una gota de reactivo globulina latex y mezclar -con aplica-

dores- , extendiendo las mezclas en áreas de 20 por 25 m. Se mueve la placa am

las manos j.npxi:rGndok movi.miento de rotacj ón durante 1 min~1t.o.

- Lectura: se examina si hay aglutinación macroscópica en los sueros problema y - control positivo; si l a hay, la prueba es positiva y la magnitud de la aglutinacih se informa de una a cuatro cruces.

* Valores normales: Negativo.

- 2. Reacciones Febriles en suero sanguíneo por aglutinación de anticuer-pos en placa y en tubo. Las reacciones febriles son de valor en el diagnóstico de muchas enfermedades:

fiebre tifoidea, paratifoidea, tifo y enfermedades producidas por otras rickett sias. Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido p r agentes infecciosos, responde produciendo anticuerpos aglutinantes contra ellos, los cuales se pnen de manifiesto al entrar en contacto el anti-

cueryp con el antigen0 específico.

Para la detección de los anticuerpos se usa el suero del paciente y antígenos - purificados. El título de anticuerpos depende del tipo y curso de la enfermedd.

Para que los resultados tengan valor diagnóstico el título de ellos debe zumrtar.

-(A) Aglutinación en placa (comoprueba'tamiz cuando se tienen que examinar numero-

sas muestras). Sirve como prueba de aglutinación completa; sin embargo, se su$% re que debe ser t m d a como complemento de la aglutinación macroscópica en tubo. Las reacciones francamente negativas se reprtan como tales. Las dudosas deben repetirse con la aglutinación en tubo.

. .

15

REACTIVOS - Antígenos febriles (equipo con placa de vidrio de 2C; por 30 cm y pipetas de Kahn de 0.2 m l , graduadas en 0.01 ml).

PROCEDIMIENTO

a) En la placa de vidrio poner 0.04 ml del suero del paciente para cada uno de los antígenos a utilizar.

b) A cada gota de suero, añadir una gota de cada antígeno. c) Mezclar con un aplicador.

d) Cuando hay reacción positiva se repite la técnica descrita con diluciones, las cuales SEI obtienen con el uso de ].as siguientes cantidades del suero: __ ." Plili.li tros de suero Dilución Mililitros de suero

"

0.08 1: 20 0.01 1: 160 0.04 1: 40 O. 005 1 : 3.2 O 0.02 1:80 i.1

- Equip de antígenos = proveniente de la S.S.A o del Instituto Nacional de ~ g i m -

- Solución salina al 85 8. (Clorum de SALO)

- F o ~ o ~ , al 0.3 %. - Fenol, al 0.5 %.

PROCEDIMIENTO

a) Preparación de los antígenos: el antígeno que se adquiere es concentrado y es -

necesario diluirlo. Se toma 1 m1 del concentrado y se le añaden 99 ml de solu-

ción de cloruro de s d i s al 85 % con fornil al 0.3 9 a tdos los antzgenos excq

to el de brucela, al que se le pone como preservativo fenol al 0.5 %. -

b) Agitar e incubar 24 horas a 37OC.

c) Leer la aglutinación y anotar la dilución máxima de suero en la cual se observó

ésta.

16

- 3. Determinación de proteína C-reactiva en suero mediante la aglutinación de partí - culas latex en prtaobjetos.

~a proteína C-reactiva es una proteína plasmática, que aparece en concentracio--

nes muy bajas en las personas sanas. El nivel superior del margen de normalidad en adultos puede situarse en aprox. 5 mgCPR/l. El significado diagnóstico de

la determinación de proteína C-reactiva (CPR) consiste en que la concentración

de CPR sigue muy de cerca tanto en los aumentos como en los descensos el curso de procesos inflamatorios de origen infeccioso y no infeccioso. La aparición de un nivel s&.:-ico de CPR medible es un fendrneno no específico que acompaña a todas las enfermedades inflamatorias agudas y tumores malignos. El principal valor - diagn6stico de la rmcci.ón CPR rzside en la detección de procesos i.nflamatorios

como la fiebre reumáticz y en la fase aguda de la artritis reumatoide.

REACTIVOS - Rapi Tex-CPR (reactivo-latex-CPR) , se compone de una suspensión acuosa de parti culas de poliestireno-latex, recubiertas con la fracción gammaglobulina de un sue-

ro específico anti-CPR. E l reactivo-latex-CPR analizado frente a una serie de di15

ción d e l suero estandar CPR posee una sensibilidad de aprox. 1 mgCPR/l. Analizando los sueros de pacientes según de describe (dilución 1 + 5) el margen de medición - es de 6 a 500 mgCPR/l. - Suero control-CPR positivo para Rapi Tex-CPR, es un suero humano estabilizado 1í quido, con un contenido míniro de CPR de 10 mg/l.

- Suero control negativo para Rapi Tex-CPR, es un suero humano estabili-zado líqui- do con un contenido máximo de CPR de 0.1 mg/l

PROCEDIMIENTO (Screening)

a) Poner los reactivos y las muestras a temFeratura ambiente. b) Diluir los sueros de paciente 1 + 5 con solución salina isotónica 0.9 %. c) Depositar una gota de la dilución y también una gota de suero control positivo

y suero control negativo listos para el uso, en cada una de las áreas de reac-

ción de la placa de reacción.

d) Añadir 1 gota de reactivo-latex-CPR (agitar previamente) a cada muestra de sue- ro y controles; después de mezclar bien con un palillo agitador, balancear la -

placa de reacción. e) Transcurridos 2 minutos valorar la aglutinación comparando con la reacción de -

los sueros control.

17

* Valoración: Una aglutinación clara indica una concentración sérica de CPR supe- rior a 6 mg/l; las muestras que no reaccionan con reactivo-latex-CPR, contienen u- na concentración menor de 6 mg/l.

- 4 . Prueba del VDRL: detección de Sífilis en suero sanguíneo. Las reaginas presentes en el suero de pacientes con sífilis causan la flocula-

ción del antígeno VDRL estabilizado en suspensión. La reagina es un sustancia - que aparece en la sangre y líquido cefalorraquídeo de personas que padecen sífi ].is y otras enfermedades corno e1 mal de pinto, lepra y paludismo. Est-a sustancia flocula las ernulsiones de una solución alcohólica de cardiolipina, colesterol y lecitina suficiente para estandarizar su reactividad. Dicha solución se usa como

antígeno.

REACTIVOS

- Antígeno de floculación de cardiolipina VDRL, contiene en solución alcohólica:

cardiolipina 0.3 g/l, lecitina 2.1 q/1 y colesterol 9.0 g/l. - Líquido diluente (pH 6.0) que contiene: formaldehído neutro (35 % ) , &$Kl4-.LB2O :

93 nlg/l, KH2POq 170 v/l, NaCl 10 g/1. - Suero de control positivo para l a sífilis.

PROCEDIMIENTO a) Preparación de la suspensión de antígeno: colocar 0.4 m l de líquido diluente en

un frasco con tapón y agregar 0.5 m1 de antígeno, gota a gota, mientras se agi- ta el frasco. Agregar 4.1 ml. de líquido diluente y cerrar el frascc; agitar.

b) Colocar 0.05 m1 de suero sobre un prtaobjetos con excavaciones (14 m). c) Agregar 1 gota de suspensión antAy6nica con jeringa de vidrio.

d) Hacer rotar durante 4 minutos en un aparato de rotación (aprox. 180 rp).

* Evaluación: con microscopio (aumento de 100 veces) inmediatamente después de ter

minada la rotación, observación:

Sin grms: Negativo. Grumos de reconocimiento inseguro: Reacción dudosa.

Grumos pequeños pero nítidos: Cébilmente positivo. Grumos grandes: Positivo.

18

- 5. Determinación de Antiestreptolisinas en suero sanguíneo. Las antiestreptolisinas son anticuerpos que aparecen en las personas que pfkm

una infección producida por estreptococos de los grupos A, C y G. Un título al- to es un signo menor en el diagnóstico de la fiebre reumática, es decir, por sí solo no permite hacer el diagnóstico, pero si es un dato útil en el estudio y - control de la enfermedad. Una sola determinación no es de valor, la prueba debe repetirse con lapsos de 2 semanas. El incremento de los títulos de una determi- nación a otra, indica actividad en la infección.

- E:streptolisina ' '0'' BELI, se presenta en forma oxida&establ.e pero no activa.

Plod0 de activarla: Se 1-econstituye con agua dest-ilada con el volurnen indicado en -

la etiqueta del frasco.

- Solución mortiguadora: 7.4 g de NaC1, 3.7 g de KH2P04 y 1.81 g de Na2HP04 en - 1000 ml de agua destilada ajustando el pH a 6.5-6.7 con NaOH 0.1 N.

- Suspensión de globulos rojos. Una cantidad apropiada de sangre h m n a o de cone- jo (desfibrinada o con anticoagulante) se centrifuga a 2000 r p durante 5 minutos,

el sobrenadante se desecha y el paquete de globulos se lava con solución salina al 0.85 %, centrifugándose de nuevo. Los globulos rojos se suspenden en solución amor

tiguadora a una concentración final del 5 %. -

PROCEDIMIENTO

a) Diluciones del suero en tubos de ensaye usando solución anortiguadora como di12

yente: 1:lOO-1.0 ml de la dilución 1:lO + 9 m1 de solución amortiguadora. 1: 10-0.5 m1 de suero + 4.5 m1 de solución amortiguadora. 1:500-2.0 ml de la dilución 1:lOO + 8 ml.de solución amortiguadora.

. . b) LZI prueba se monta de acuerdo con el siguiente protocolo: ggina siguiente.

* Interpretación: el título de antiestreptolisina "O" se expresa en unidades Todd. Estas unidades son la recíproca de la dilución más alta del suero que neutraliza - completamente la Estreptolisina "O"; así, un suero que no presenta henolisis de lcs tubs 1 a 4, huellas de hernolisis en el tubo 5 y hmlisis en todos los demás, es reprtado caro 125 unidades Todd. Una sola titulación de antiestreptolisina "O" de 125 unidades no proparciona por - si sola gran información; sin embargo, si el título representa una elevación a par tir de un título de 50 unidades, éste indicará una infección estrepto&cica, o que hubo infección recientenente. Una caída de un título de 250 unidades a 125 indica- rá curación o remisión de la infección.

19

Diluciones del suero,problema:

Tubs

Título en lJni&&s Todd.

M O O 1: 500 4 5 6 7 8 9 1 O l L 3 2 L 3 1 4

0.8 0.6 0.4 0.3

0.0 0.2 0.4. 0.6 0.8 1.5 1.0 0.2 0.4 0.6 0.7

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 O O

Agitar los tubos

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 I 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5 I Agitar e incubar a 37°C durante 15 minutos

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agitar e incubar a 37OC durante 45 minutos. Agitar cada 15 minutos. Centrifugar los tubos durante 1 mi nuto a 1500 rpm. I -

12 50 1 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500

El patrón de antiestreptolisina es suero o ganunaglobulina estandarizada para ser sada como control. Después de reconstituirse con 10 m1 de agua destilada d e k ser usado como la dilución 1:lOO del suero, en el rango de 100 a 333 en los tubos 3 a 7 como se muestra en el cuadro. Se debe obtener un punto final equivalente a 166 u nidadcs Todd por ml, osea, ausencia de hemolisis en los tubos 3, 4 y 5 y lmnolisis en los tubos 6 y 7.

20

Hematología

2 2 2 4 0 8 - 1 . Biometria Kemdtica completa en sangre venosa (con anticoagulante seco).

La Hemoglobina reacciona con el ferrocianuro y forma metahemoglobina, la cual con el cianuro de potasio forma cianometaherwglobina, las soluciones de &te - compuesto son relativamente estables.

El hematócrito: se basa en la separación de los glóbulos rojos y el plasma m ”

do se centrifuga la sangre durante 30 minutos, el paquete de erit-rocitos a1 1.00

m . . es el resultado que se informa.

Las cuentas de leucocitos y de eritrocitos: las muestras se diluyen con liqui-

dos adecuados (Turk y Gowers) y se cuentan en la celda de una c k r a (hemathe_

tro) cuya capacidad se conoce.

Cuenta diferencial: una extensión delgada de sangre en un portaob jeto se tiñe, después se observa con el microscopio y se cuentan las distintas variedads-

hay en 100 leucocitos.

mmwos - Anticoagulante de biometría: EDTA al 10 9 ; usar O. 2 ml de anticoagulante seco -

para 4.5 a 5 ml de sangre. - Diluyente de Drabkin: ferrocianuro de potasio 200 mg, cianuro de potasio 50 mg,

bicarbonato de sodio 1 g; aforar a 1 litro con agua destilada. - Solución salina (NaC1) al O. 85 %. - Diluyente de Turk: Colocar de 1 a 3 m1 de acido acetic0 glacial en un matraz a- forado de 100 m1 y aforar con agua destilada agregando unas gotas de azul de met-

leno.

- Colorante de Wrigth: colorante de Wrigth 2 g, glicerina 30 m1 y netanol c.b.p.- 1000 ml. Este colorante debe dejarse madurar For lo menos un mes y filtrarse an- tes de usarse.

- Soluciofi amortiguadora para colorante de Wrigth: disolver fosfato disddico 4.5g,

fosfato monoptásico 5.9 g y agua destilada 100 ml. Ce esta solucidn se t c m 9.5 m1.y aforar a 2 litros con agua destilada, esta solucion debe quedar a pH 6.4-6.5.

21

PROCEDIMIENTO

- (A) Hemoglobina (T6cnica macro): a) Mezclar por inversión la sangre y esperar 10 minutos. b) Leer en celdilla a una longitud de onda de 540 m. Ajustar el 100 % de Transmi

tancia con el diluyente de Drabkin. C) Convertir el % de T en gramos de hemoglobina en 100 m l de sangre con la tabla

de calibracion

T u b

5 2.5 0.0

0.0

2.5 5.0

15.0

7.5 0

- (B) Hemat&rito *(Técnica macro): a) Mezclar Lperfectamente y con suavidad la sangre con anticoagulante. b) Llenar de sangre un tubo Wintrok de henatdcrito, hasta la marca 0-10 con una

pipeta Pasteur. (No deben quedar burbujas de aire dentro de la colurnna de san-

gre o en el fondo del tubo).

c) Centrifugar el tubo a 2200 rpm durante 30 minutos.

d) Leer el limite superior de la columna de glóbulos rojos en la escala ascenden-

te de La derecha. El resultado se informa en mililitros por ciento,

Thcnica micro: a) Llenar con sangre venosa las dos terceras partes de dos tubos heparinizados -

(microhemat&ritos) y cerrar el extra &S distante de la sangre csn la flama de un mechero haciendo un movimiento de rotación.

b) Csntrifugar el tubo 5 minutos a 12 000 q m .

c) Lectura de hematócritos: poner el tub capilar en el surco de un indicador de plástico; el microhematócrito en mililitros por ciento se lee en el punto de -

la escala que queda abajo del indicador de plástico.

22

Leucoc

Aspirar

ca 0.5.

Aspirar

itos. Cuenta total ;

sangre bien mezclada con una pipeta para glóbulos blancos hasta la E

líquido de Turk con la misma pipeta hasta la marca 11 (debe rotarse la pipeta mientras se aspira el diluyente).

c) Agitar la pipeta 90 segundos para conseguir una suspensión uniforme. d) Tirar 3 o 4 gotas del contenido de la pipeta, limpiar la punta de ésta con ga-

sa o papel absorbente y llenar la cámara para contar globulos en una forma tal que la introducción del líquido sea uniforme.

e) Esperar dos minutos y contar con objetivo seco débil los cuadros grandes de - las esquinas de 1.a cuadrícula, el resultado se multiplica por 50 y a s í se ob-

tiene el número de leucocitos en un milimetro cúbico.

Si el número de leucocitos es menor a 2000, aspirar sangre con la pipeta de leuco_

citos hasta la marca 1 y diluyente hasta la marca 11 y contar los 9 cuadros de la cámara y el resultado se multiplica por 11.1. Si la cuenta es de 2000 a 4000 se llena la pipeta con sangre hasta la marca 0.5 y

se cuentan los 9 cuadros de la cámara y el resultado se multiplica por 22 -2. Para cuentas entre 4000 y 25000 leucocitos, se llena la pipeta hasta la marca 0.5 y se cuentan los 4 cuadros grandes de la cámara y multiplicar el resultado por 50. Para cuentas de 25000 y 50000 leucocitos debe llenarse la pipeta para eritrocitos

hasta la marca 1 y dil-uyente hasta la marca 101; se cuentan los 4 cuadros grandes de la cámara y el resultado se multiplica por 250.

*Cuenta diferencial:

a) Se hace una extensión de sangre bien mezclada y se deja secar.

b) Se cubre con el colorante de Wrigth de 1.5 a 2 minutos.

c) Se akde el doble de solución amortiguadora pH 6.4 y de jar actuar 6 minutos.

d) Lavar con el chorro de agua de la llave y de jar secar la extensión. e) Observar con objetivo de inmersión para hacer la diferenciación de las células

y anotar las anonzlidades de cada uno de los elementos, de la serie blanca: -

roja y las plaquetas. Los blastos de la serie blanca y las celulas plasmáticas

deben entrar en la cuenta de 100 celulas; los normoblastos deben contarse fue- ra de las 100 c6lulas.

23

c 3. Cuantificación de Reticulocitos en sangre venosa por tinciÓn de frotis por el

metodo de Wrigth.

Los reticulocitos son las celulas precursoras de los eritrocitos maduros: p- seen un retículo que se tiñe con el colorante nuevo azul de metileno, este re- ticulo disminuye a medida que la célula madura; en éSta no se encuentra.

REACTIVOS

- Reactivo para teñir reticulocitos: nuevo azul de metileno 0.5 g, oxalato de po- tasio 1.4 9, cloruro de sodio 0.8 g y agua destilada c.b.p.100 ml.

PROCEDIMIENTO Poner G gotas del. colorante para reticulocitos en un tubo y añadir 6 gotas de

sangre venosa y nlezclar. Esperar 10 minutos y decantar el sobrenadante, con el sedimento se hace un fro_ tis y se deja secar.

Teñir el frotis con el método de Wrigth y contar el número de reticulocitos -

que se encuentren por cada 100 eritrocitos.

* Valores normales: De 0.5 a 1.5 reticulocitos por cada 100 eritrocitos.

I 4. Determinación de Grupos Sanguíneos (A,B,O) y factor Rh (D). Para identificar los antigenos de los grupos A, B, y O se usan antisueros con- tra ellos y su presencia se pone de mnifiesto por la aglutinación de los eri- trocitos.

Para identificar el aglutin%eno Rh se usa un antisuero específico, y su pre- sencia se p n e de manifiesto por la aglutinación de los eritrocitos.

R W C T I V O S

- Sueros Anti- A, Anti-B, Anti- O y Anti- Rh.

PROCEDIMIENTO

a) Colocar aprox. 5 gotas de sangre venosa en una placa de porcelana (separadas u, na de otra aproximadamente 2 cm).

b) Adicionar los sueros Anti- A, Anti-B, Anti-O y Anti-Rh y mezclar bien con un a- plicador y observar si hay o no aglutinación.

Aglutinación con los sueros Anti- A, *B u .O indica tipo de sangre A, B u O respectj vamente. Aglutinación con el suero Anti- Rh indica factor negativo.

25

Microbiología

- 1 , Urocultivo. La orina de pacientes con pielonefritis tiene mayor número de leucocitos que - el nomlal, y el número de bacterias viables de la porción media de la micción

excede de 100 O00 en un mililitro. El diagnóstico de las infecciones de las vías urinarias se hace demostrando bacteriuria por medio del cultivo. El uro- cultivo cuantitativo permite distinguir la bacteriuria significativa de la si2 ple contaminaci.Cn de la muestra.

REACTIVOS

- Medios de cultivo: Gelosa sangre y E M B , Tripticasa, Soya, Agar o B . H . I . , Es- taf il.ococo no. 110. - Solución salina al 85 %.

PROCEDIMIENTO

-(A) Cuenta de leucocitos.

a ) El número de leucocitos se determina en el sedimento urinario; para ello se de

positan 10 m1 de orina, habiéndose tomado previanente la muestra para el culti vo, en un tubo de centrifuga; se centrifuga a 2000 rpm durante 5 minutos, se desecha el sobrenadante y se resuspende en l a gota de orina residual el sedi-

mento. De &te se toma una gota, la cual se deposita en un portaobjeto limpio y se cubre con un cubreobjeto.

b) Se observa con el microscopio con el objetivo seco fuerte y se cuenta el nhe-

ro de leucocitos por campo. Se observan 10 campos y se saca un promedio.

- (B) Cuenta de bacterias. Mdtdo con asa calibrada. a) El metodo cuantitativo que se utiliza de rutina es el de la asa calibrada para

inocular. Se toma una asada de la orina sin centrifugar y se hace una siembra

por estrias en toda la superficie de la placa. Como en las infecciones del e- to urinario pueden encontrarse bacterias grm psitivas (estreptococos y esta-

filococos) y bacilos gram negativos (E. Coli, Paracolobactrum y Proteus), es - conveniente sembrar l a orina en una placa de agar sangre y en uno de los r r d i c ~

selectivos para las bacterias Gram negativas, tales como el medio EN3 o el de Mac-Conkey. P h s placas se inccban a 37°C y se examinan después de 24 a 48 ho ras. Se multiplica por 100 el número de colonias que aparecen en la placa, pa- ra determinar el número de bacterias que existen en l m1 de orina,

26

b) Si no hay desarrollo en las primeras 24 hrs, se reincuba otras 24 y si tampoco

esta vez hubo desarrollo se informa que "no hubo desarrollo después de 45 hrs de incubación". De ordinario se hace antibiograma a las bacterias encontra-

das en el urocultivo. c) Además de la siembra se hace un frotis con orina bien mezclada sin centrifugar

para estudio microscópico directo. La orina se deposita en una lámina con la -

misma asa calibrada y se usa la tinción de Gram para el frotis; éste será posh tivo cuando contenga por lo menos unas cuantas bacterias por canqm. Si en el -

frotis directo se encuentran cocos gram positivos, se sembrará la orina en una caja con medio S-110.

El rc:;ultado del frotis esta en relación con la contan1inación o la infeccj.ón. 1,a

correlacidn entre los resultados del frotis y cultivo es de 75 por 35 por ciento.

Método de diluciones. a) Con solución salina al 85 9; se hacen diluciones l:lO, 1:100, 1:lOOO y 1:lOOOO

de la orina. En tubos que contienen 13 O 15 ml de BHI, tripticasa soya-agar o cualquier otro medio nutritivo, el cual se fundirá y cuando se encuentre de 45 a 47°C de temperatura, poner 1 ml de cada una de las diluciones de orina; agi-

tar por rotacidn y practicar la técnica de vaciado en placa. b) Incubar a 37OC durante 24 horas y hacer la cuenta de la colonias que se desa-

rrollaron al cabo de este tiempo, se multiplica por la dilución, y asi se c i k q drá e l número de hcteri-as por mililitro de orina.

* Valores normales: Adultos- hasta 100 en un m3. Niños- hasta, 50 en un md.

La flora bacteriana de las orinas normales difiere de la de las orinas con m i m g

ganisinos pat&Jenos. En el^ prher caso, los micrmrcjanknlos encontrados con m6s frecuencia son;

Flora Microbiana en la Orina:

Gram positiva Patdgena No patógena

Estreptococo heta Difteroides hemolitico Bacillus subtilis

Estafilococo coagulasa + Estafilococo coagulasa - Candida albicans Levaduras saprofitas

Gram negativa Escherichia coli Aerobacter Proteus Salmonelas y Shigelas Paracolon Neisseria gonorrhoeae

27

- 2, Exudado faringeo. Los cultivos de faringe son importantes en el diagnóstico de ciertas enferma&

des, tales como las inflamaciones de la garganta de t i p estreptocóccico, dif- térico, etc., en el descubrimiento de focos de infección en algunas enfermeda- des como la escarlatina, fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y también - en la detección de portadores de organismos como el Estreptococo beta hemolíti;

co, 'Estafilococo aureus, bacilo diftérico y Hemophilus.

REACTIVOS

- Medios de cultivo: Caldo de tripticasa soya o de cerebro y corazon (BHI), gelo-

sa sangre de carnero al. 5 o 10 %, mdio mani.to1 sal a g a r 17 medio eosins azul de -

metileno (FJB). Otros medios segun necesidades (LOeffler o Tinsdalc, Bordet y Sa- lmuraud ).

- Sangre desfibrinada de carnero.

PROCEDIMIENTO a) Siembra directa: Inmediatamente después de que la muestra fué tomada con un hi

s o p , este se hace rodar y se frota en el borde de una placa de agar sangre c~

briendo solo un sexto de la superficie, con un asa se extiende la muestra en - la mitad de la superficie mediante 10 a 20 movimientos de un lado a otro de la placa. Después, sin volver a estrar en el sitio donde se inóculo el hisopo, el

asa extiende el inóculo que con ella hizo, en el resto de la superficie de la placa; al final el asa se hunde varias veces en el medio para investigar hemó-

lisis bajo la superficie. Se incuban las placas a 35-37OC durante 18-24 horas. Se recomienda incubar en un medio con tensión reducida de oxígeno, de preferen - cia en una mezcla de 10 8 de CO2 y 90 9 de nitr6geno.

b) Vaciado en placa: Es otro procedimiento que permite estudiar la morfología de las colonias y la hemólisis en la superficie y profundidad en una placa de ge-

losa sangre: Se funden 15 a 20 ml de agar base y se ajusta su temperatura a 4 5 O

C. antes de Isarlo. El hisopo que so Lpsne en 1 ml de caldo de tripticas2 soya

se exprime contra la superficie interior de un tubo, se saca y se coloca en un

tubo esteril. Luego, se añaden O. 7 m1 de sangre de carnero desfibrinada esté- ril al agar base fundido.

28

Se toma una asada del caldo que contiene el hisopo, se toca 1a.superficie in-

terna del tubo para eliminar el exceso y se transfiere el asa al agar con la -

sangre y se mezcla por rotación; se flamean los labios del tubo y se vacía su contenido en una caja petri. Asi, cuando el agar haya solidificado, se toma el hisopo que se dejó en el tubo estéril y se siembra en un sexto de la Superficie y con el asa se extiende este inóculo como en la siembra directa. Se incuba a

35-37OC durante 18-24 horas.

* Lectura de los cultivos: i) Estreptccoco beta hemolítico. Las colonias de la superficie del agar sangre -

son pequeñas, de menos de 1 mm de diámetro, convexas, traslucidas , grisaceas, o p ~ cas, duras y secas, rodeadits por una zona de hen6lisis de 2 mm de dicimetro (se o)?

serva transparente e incolora), sin eritrocitos o muy escasos; las colonias abajo de la superficie son de fcmna lenticular y están rodeadas también por una zona de hemólisis sin eritrocitos.

Clasificación del Estreptococo grupo A: se toman colonias del estreptococo hemoli

tic0 descritas en el parrafo anterior, se siembra en una placa de gelosa sangre,

en su superficie se coloca un disco de papel impregnado con 0.04 unidades de baci

tracina; se observa una zona de inhibición del desarrollo de 15 a 20 mm de diáme-

tro cuadrado: el estreptococo es del grupo A.

iii) Estreptccoco no hmlitico. Las colonias no producen ningun cambio demostra- ble en la sangre que las rcdea, es decir, no producen ningun tipo de hemólisis.

29

vi) Bacilo diftérico. Su busqueda generalmente se hace de urgencia, por lo que

es importante conocer su morfología. El informe preliminar es presubtivo y se ha- ce tincidn de Gram. Son bacilos gram positivos, rectos o ligeramente encorvados, se presentan en empalizada o semejantes a las letras chinas; no se tiñen uniforme_ mente, sino que presentan granulos metacromáticos . El cultivo se hace en placas .de gelosa sangre, Tinsdale o.lijeffler.

vii) Haemophilus. Debido a la dificult.ad de crecimiento de estos en los medios - comunes, es recomendable usar medios enriquecidos como el medio de gelosa chocolg

te con hemina y extracto de levadura o el de Bordet Gengou con sangre de conejo,e incuhr hasta 72 horas o mas, con objeto de obtener un mejor desarrollo; son gram nqativos ¿:- form cocobxi~lar en cultivos recientes y formas hcilares grandes, fommndo madejas, en cultivos viejos. Sus colonias son pequeñas, mucosas y de un rmn de diáme-tro. Para la obtencidn de cultivo de Haemophilus, se recomienda usar -

gelosa sangre preparada con sangre de conejo, pues la sangre de carnero no ES Úti¡

para este progsito. v i i i ) Candida albicans. Solo es importante cuando se observan numerosas esporas y micelios en el frotis, en este caso se cultiva la muestra para investigar si es - Candida albicans (vease exudado cervicovaginal).

iu) &?cilcsadif~. La ~ & s u d e s a r r o l l o s e ~ v a l o r a r t a n t o a e l E M 3 m € n la yelaSam; l o ~ ~ ~ ~ l a s l a s l & & ~ s t c s m i ~ ~ ~ w ”

tcdhskotras.

*Valores normales:

Microorganismos encontrados en la

Neisseria catarrha1i.s y otras Es treptococo gama hemolítico. Estreptococo alfa hemolítico.

ocasionalmente grupos B, C y G. ( no del Grupo A). Estreptococo beta hemolitico del yrup A, Estreptococo ];eta hcmolitico

de personas con proceso inflnatcniodeella. faringe de personas sanas. Microorganismos encontrados en la faringe

Neisserias.

Estafilococo coagulasa (-).

Estafilococo dorado coagulasa (+). Estafilococo dorado coagulasa (+). &

Haemophilus haemolyticus. Bordetella pertussis. Haemophilus influenzae. Haemophilus influenzae. & &

Bacilos coliformes (después de Bacilos coliformes. & & tratamiento con penicilina),

-____ -

30

& La importancia de estos microorganismos como responsables de la infección fa- ringea está relacionada con la abundancia de ellos en el exudado que se estudia. && La importancia de estos microorganismos como agentes responsables de la infec- ción feringea es dudosa pero, en caso de ser así, también está en relación con la abundancia de ellos en cultivo de la muestra que se estudia.

+ 3 o Exudado cervicovaginal. 2 2 2 4 0 8 La flora bacteriana del tracto genital femenino esta constituida por lxcilos -

gram positivos (lactobacilos) y Staphilococcus epidermidis. El pH vaginal va&

considerablemente de acuerdo can 1.a flora kci-eriana y la can-tidi d de glucoge-

no presente en el epitelio; este factor, a su vez, depende de la función ovdri

ca; en la mayoría de los casos predomina el lactobacilo (bacilo de Dijderlein )

junto con bacilos intestinales aerobios, especies de Bacteroides y Haemophilus,

Enterococcus y Staphilococcus epidermidis. El cérvix normal generalmente es estéril o contiene algunas bacterias; los mi-

croorganisms presentes son idénticos a los encontrados en la porción alta de la vagina. La flora bacteriana de la vulva es una mezcla de los microorganis

n:as presentes en la piel de esa área y las bacterias de la vagina. Los microor ganismos mas cmunes del tracto genital, son los siguientes:

Flora patkena o poten_ Microorgnnismos cialmente patbena. Flora no patógena.

Gram negativos Neisseria gonorrhoeae Neisseria catarrhalis Haemophilus vaginalis Neisseria f 3.ava Haanophilus ducreyi Bacilos colifornes

Streptococcus beta hemolitico

Lxt&x¡lur; x.irh>hy 1 us Bacillus subtilis Difteroides Strepkaxms m hemolitico Streptococcus faecalis Staphylococcus epidemidis

Hongos Candida albicans Levaduras saprofitas Protozoarios Trichomona vaginalis Yycobacteria Mycobacterium Tuberculosis Mycobacterium cnegmatis

REACI'IVOS

- PIedios de cultivo: Thayer Martin o agar chocolate con antimicrobiano, Casman (de

preferencia con sangre de conejo), gelosa sangre, EMB, BHI infusión y Nickerson.

- Solucion salina al 85 L: o dehidroxido de sodio o de potasio al 10 %.

31

PROCEDIMIENTO (Muestras de cérvix, fondo de saco vaginal y meato urinario).

Con las muestras de exudados cervicovaginales se hacen frotis para la tinciÓn de Gram. Con las muestras del meato urinario y las del fondo del saco vaginal

posterior, se hacen frotis separados en un solo portaobjeto rotando y presim- do suavemente el hisopo con el que se tanó la muestra sobre su superficie de -

manera que no se destruyan las células y asi la observación de germenes intra- celulares pueda realizarse con certeza.

En el frotis se buscan diplococos gram negativos intracelulares en los leucoci tos plimorfonucleares, levaduras, bacilos gram positivos con morfología del

bacilo de D&lerlein, bacilos gram negativos, cocos gram positivos y c6lulas in dicadoras (epitelia1.e~ recubiertas de 1laerr.ophylus vaginal.is).

Preparación en fresco: El hisopo con la muestra de secrecion o exudado del fog do de saco vaginal posterior se introduce e n un tubo con solucion salina al 85

por ciento, se observa entre cubre y prtaobjeto. En esta preparación se bLlscan

tricilomonas, levaduras, celulas indicadoras y leucocitos.

Cultivos: La muestra del cérvix se siembra en los medios de Thayer Martin, ge- losa sangre, EMB y el medio Casman; se extienden los inóculos con el asa, para

las placas con el medio de Thayer Martin: incubación a 35°C durante 48 hrs. en

una atmósfera de COZ al 10 % (esta se logra poniendo en un recipiente una vela

encendida y cerrando10 luego herméticamente). Las placas con el medio de Cas- man se incuban tambien en atmósfera de C02 a 37°C durante 48 hrs. Si se obser- van levaduras, en el frotis teñido con el metcdo de Gram o en el examen de la preparación en fresco, se siembra en el medio Nickerson el cual se incuba a tm

pratura ambiente. -

* Resultados: -Neisseria gonorrhoeae. Practicamente las Neisserias se desarrollan en el medio de Thayer Martin -son gonocccos. Son colonias transparentes y traslucidas. Dan psi- tiva ia pruekx de la oxidasa.

Prueba de la oxidasa: Se coloca un pedacito de papel filtro en una caja petri, se

satura con una solución de clorhidrato de tetrametilparafenilendiamina; se toma - con asa de platino una prcio'n de la colonia que se va a probar y se talla contra el papel filtro; cuando el microorganismo prduce oxidasa se obtiene un color p& pura oscuro en io segundos.

32

De la misma colonia oxidasa positiva, se hace un frotis y se tiñe por el método -

de Gram para confirmar que los microorganisms de la colonia oxidasa son diploco- cos gram negativos.

-Candida albicans. Esto hongo esta normalmente presente en la vagina; solo cuando se observan numerosas esporas y pseudomicelios de levaduras, en el frotis o en la preparación en fresco, se debe investigar su especie.

-Haemophilus vaginalis (Corynebacterium vaginale). Este microorganism desarrolla

en el medio de Casman colonias diminutas corno puntos, incoloras, transparentes, -

rodeadas p r una zona clara de hemdlisis, (se observa con lupa e iluminacion obli- cua la superfi.cri.e d d medio).

-Coliformes (particularmente E. coli) y Streptococcus faecalis (enterococo). La - presencia de estos microorganisms indica reducción o supresión de la flora rrwnal que se puede deber a la acción de los antimicrobianos, la disminución de los estq

genos o la falta de respuesta del epitelio vaginal a ellos, las alteraciones ana- tómicas o las lesiones q u e ayuden y sostengan el desarrollo de estos microorganis

mos ( f ístulas ),

,

* Valores normales o flora bacteriana normal. Poco después del nacimiento, la f 12 ra normal de la vagina esta constituida por lactobacilos, los que persisten mien-

tras el pIl de la vagina está &ido, lo que sucede los primeros 8 días de vida, - mientras dura el efecto de los estr6genos que pasivamente pasaron de la sangre dc

la madre a la niña. En las niñas antes de la pubertad la flora vaginal esta COL

puesta por cocos y bacilos, en la pukrtad aparecen los lactobacilos que son 1 :,

que mantienen el pH vaginal Scido (por fermentación de carbohidratos) e impiden --.

el establecimiento de otros r ~ l i . c ~ ~ ~ r ~ a r l i . ~ l r , o ~ en la vagina.

Mediante el uso de drogas antimicrobianas y otros medicamentos, la flora bacteria na se modifica y el pH de 1.a vagina cambia; los lactobacilos desaparecen y son

sustituidos p r estreptococos y bacilos colifomes.

33

* TINCION DE GRAM

Se hace un frotis de la muestra sobre un portaobjeto y se fija calentando (se acerca una mechero con flama baja -por debajo del portaobjeto). Se cubre el portaobjeto con Cristal violeta teniendo cuidado que el liquido ba_

ñe todo el frotis; dejar reaccionar durante 1 minuto. Luego, descartar el exes so de colorante y lavar en la llave brevemente, Aplicar yodo de Gram y dejar reaccionar 1 minuto. Lavar en la llave. Agregar solución decolorante (acetona-alcohol o alcohol -95 % ) gota a gota en - el fr0ti.s con el portaobjeto incli.nado. Cuando las gotas de sol.uciÓn ya no -

arrastren color, lavar a la llave.

Finalmente se cubre el porta con solución de safranina de Gram, dejar reaccio- nar aprox. 20 segundos y lavar el exceso de colorante. Secar al aire y obsewar con el microscopio.

Identificacion de microorganismos: Gram positivas - color violeta.

Gram negativas - color rojo,

* MEDIOS DE CULTIVO MAS UTILIZADOS EN EL FiREA DE MICROBIOLCGIA -

. AGAR " " MacCONKEY: " . - - - ""

Peptona Pro teosa Lactosa Mezcla de sales biliares Cloruro de scdio TKja r Rojo neu'iro Cristal violeta Acjua destil-ada

-__ CRLEC EN MANITOL: Extracto de carne de res Peptona Cloruro de sodio Rojo de fenol Nanitol

17 9 3 g 10 Y medio pi1 7.1 . Esterilizar en autoclave

Disolver por ebullición. Reacción del -

1.5 g 5 q

a 15 libras (121°C) durante 15 minutos. 13.5 g Es-te medio puede obtenerse comercialmen 0.03 g 0.001 g te en forma deshidratada y se preparará 1000 m 1 de acuerdo con su instructivo.

Agua destilada 1000 .&

Disolver por ebullición. Reacción por -

medio pH 7.4, Esterilizar en autoclave a 15 libras (121OC) durante 15 minutos. Este medio puede obtenerse comercialme; te en forma deshidratada y se preparará de acuerdo con su instructivo.

. .

* CALDO NUTRITIVO : Extracto de carne de res 3 g Disolver por ebullición. Reacción del medio - Extracto de levadura 2 9 pH 7.4. Repartir en matraces o tubos de ensa-- Peptona 5 9 ye. Esterilizar en autoclave a 15 libras ( l 2 l . C ) Cloruro de scdio 5 9 durante 15 minutos. Agua destilada 1000 ml El medio se obtiene comercialmente en forma -

deshidratada y se preparar: de acuerdo con su instructivo.

* GELOSA CHOCOLATE: i)Proteosa peptona 15 g i)Disolver por ebullición. l&xxi& del medio pH Almidon de maiz 1 9 7.4. Esterilizar en autoclave a 15 libras du- Fosf ato dipot&sico 4!3 rante 15 minutos (121OC). Fosfato monopt&ico 1 9 Cloruro de sodio 5 g ii) Di.solver por ebull.ici&. Repartir en matra- Agar 10 Y ces o tubos de ensaye.Esterilizar en autoclg Agua destilada 1000 ml ve a 15 libras (121OC) durante 15 minutos.

ii)Bacto hemoglobina 20 53 Mezclar asépticamente volumen a volumen las Agua destil; da 1000 ml dos soluciones y repartir en cajas petri.

Estos medi.os pueden obtenerse comercialmente en forma deshidratada y se preparan de acuerdo con su instructivo.

* INFUSION CEREBRO Y CORAZON (BNI ):

Infusion de cerebro de ternera 200 g Disolver por ebullición. Reacción del Infusion de corazón de res 250 g medio pH 7 -4. Repartir en matraces o Proteosa peptona 10 9 tubos de ensaye. Esterilizar en auto- Dextrosa 2 g clave a 15 libras (121°C) durante 15 Cloruro de scdio 5 9 minutos.

__" -

Fosfato disdico Agua destilada

2.5 g El medio se puede obtener comerciahen 'Oo0 *" te en forma deshidratada y se prepara

de acuerdo con su instructivo.

* - MEDIO DE EORDET GENGZIU:

Infusion de papas 125 g Disolver por ebullición. Reacción del medio Peptona 10 9 pH 6.7. Repartir en Eatraces o tubos de en- Cloruro de scdio 5.5 g saye. Esterilizar en autoclave a 15 libras, A g a 20 9 (121" C) durante 15 minutos. Agua destilada 1000 ml Dejar enfriar hasta 45 o 5OoC y añadir asép

ticanente sangre de carnero, conejo o hum; na, en proporcion de 15 a 20 %.

Este medio puede obtenerse comerciahente en forma deshidratada y se preparará de acuerdo con su instructivo.

35

* CALDO DE TRIPTICASA SOYA: Tripticasa peptona 17 4 Fitona peptona 3 4 Cloruro de scdio 5 9 Fosfato dipot&ico 2 - 5 g Dextrosa 2.5 g Agua destilada 1000 m1 Por cada i000 ml de caldo se agregan :

Sacarosa 150 g Citrato de scdio 20 4 mliawd sulfato de &o 0.5 g

Disolver por ebullición, envasar en frascos - de vidrio poniendo en cada uno 50 ml del me- dio, tapar con tap% de hule y después con ta, p6n de rosca de metal; esterilizar en autocla ve a 15 libras (12l0 C ) durante 15 minutos; a- ñadir mezcla estéril de aire con C02 al 10 % .

* PEDIO DE GELQSA SANGRE: Extracto de carne de res 10 g Disolver por ebullición. Reacción del medio - Peptona 10 g pH 7.5. Repartir en matraces o tubos de ensa- Cloruro de scdio 5 g ye. Esterilizar en autoclave a 15 libras (Uo Agar 15 g C ) durante 15 minutos. Agua destilada 1000 ml Dejar enfriar hasta 45 o 50" y añadir ase'p

ticamente sangre estéril desfibrinada en pro1 porcion del 5 8.

Este medi.0 se puede obtener comercialmente en forma deshidratada y se preparará - de acuerdo con su instructivo.

* MEDIO DE LOEFFLER: Suero estéril de caballo 750 m1 Disolver por ebullición. Reacción del me_ Extracto de carne de res 2.5 y dio pH 7.6. Repartir en tubos de ensaye Peptona 2.5 g y colocarlos inclinados en el autoclave Dextrosa 2.5 g a 10 I.ibras de presión durante 20 min. Cloruro de scdio 1.25 g Al final de este tiempo se abre la llave Agua destilada 1000 m1 de vapor para expulsar el aire; cuancbd

aire ha sido expulsado se aumenta la prg si& a 15 libras durante 15 minutos.

Este medio puede obtenerse comercialmente en forma deshidratada y se preparará de acuerdo con su instructivo.

____""".""_."_I

* "- MEDIO EMB- AGAR: Agar eosina azul de metileno Peptona 10 g Disolver por ebullición. Reacción del me

Sacarosa 5 9 de ensaye. Esterilizar a 15 libras en a; Fosfato dipotásico 2 9 toclave (121°C) durante 15 xinutos. Agar 13.5 g Eosina Y 0.4 y Azul de metileno 0.065 g Agua destilada 1000 m1

Lactosa 5. g dio pH 7.2. Repartir en matraces o tubos

El medio puede obtenerse comercialmente en forma deshidratada y se preparará de acuerdo con su instructivo.

36

Extracto de levadura Triptosa Gelatina Lactosa d-Manitol Cloruro de scdio Fosfato diptásico Agar Agua destilada

2.5 g Disolver por ebullición. Reacción del me- 10 dio pH 7.9. Repartir en matraces o tubos

de ensal-?.. Esterilizar en autoclave a 15 libras (121' C ) durante 15 minutos.

30 9 2 g

1 0 g 75 g 5 9 15 g

El medio puede obtenerse comercialmente - en forma deshidratada y se preparará de a cuerdo con su instructivo.

1000 ml

~. - "" """-_I

* MEDIO THAYER MARTIN

CG agar base Bacto hemoglcbina al 2 % Isovitaler (mtuiib) 10 m1 solviendo 10 g d.e hemoglobina en 500 ml - VCN inhibidor 10 ml de agua destilada, agitar hasta obtener 2

na solucion homdqenea, esterilizar a 15 1 libras (121'C) durante 15 minutos.

36 9 - solución I. 10 9 Preparar una solución de hemoglobina, di-

- Solución 11. Preparar el GC agar base disolviendo 36 g del medio deshidratado en 500 m1 de ;"-~u;l agua destilada, mezclar fuertemente y calentar agitando frecuentemente, hervirp 1 minuto, esterilizar en autoclave a 15 libras (121°C) 15 minutos. Dejar enfriar a 50°C y agregar solución I antes ya preparada, hemoglobina (500 ml ) , el isovita- lex (10 m1 reconstituidos) y el VCN inhibidor (10 m1 reconstituidos), mezdando suavernente. Envasar en cajas petri.

- Solución 1. Proteasa peptona Agar Cl.oruro de sodi~o Fosfato de scdio Glucosa

- Solución 2. no. 3 10 9 Bacto hemoglobina 10 9

7.5 g Agua destilada 500 m1

dibjs

Extracto de levadura Agua destilada

2.5 CJ ico 2.5 g

0.25 g

Disolver p r ebullicidn . Esterilizar en a.utoclave a 15 libras, 15 minutos. Mez- clar asépticamente las dos soluciones (1 y 2 ) . Envasar en cajas petri y refri-. 5 9

500 ml

Disolver p r ebullición. Esterilizar en autoclave a 15 libras, 15 minutos. _ ,

37

* NICKERSON AGAR: Extracto de levadura 1 9 Disolver 43 g en un litro de agua desti- Glicina 10 4 lada y desmineralizada. Calentar para di D (+ ) glucosa 10 4 solver el medio durante 15 minutos.No 6e Indicador &itode bismuto 7 g debe sobrecalentar. No se esteriliza. En Agar 15 9 vasar en tubo con tapo'n de algodón y -

Obaservación: el medio preparado presenta una ligera opalescencia. guardar en refrigerador.

* AGAR DE SAL - ~" Y MANITOL: . -"

Extracto de carne 1 9 blczc1.a de pptona 10 53 Cl.oruro de sodio 75 9 D-"anitol 10 9 Agar 15 (3 Rojo de fen01 0.025 g Agua. destilada 1000 m1 pH 7.4

Suspender el medio deshidratado en 1 li- tro de agua de~tilad~! y rexojar unos I.5 minutos, Mezclar bien y calentar a &u-- IliciÓn 1 minuto. Esterilizar en autocla ve a 15 libras de presión (121-C) duran- te 15 minutos y vaciar en cajas petri.

-

* AGAR BICGY: Citrato de amonio y bismuto Sulf ito de scdio Dextrosa Glicina Extracto de levadura Agar Agua des tilada

" " . ~ ~.

PH 6.8

5 9 Suspender el medio deshidratado en 1 li- 3 Y tro de agua destilada. Remojar de 10 a - 10 9 15 minutos; calentar agitando y hervir - 10 9 durante no más de 1 minuto y dejar ulfriar

1.6 g Agitar circularmente y vaciar en cajas - 1 9 a 45-50°C

1000 I n l petri. No esterilizar en autoclave.

Este medio es Útil para aislar Candida albicans y C. tropicalis y para la diferq ciacion de especies.

* AGAR TERGITOL:

I-ieptadecil sulfato de sodio Mezcla de peptonas Extracto &e :e7;s6h-a Lactosa Agar Azul de brorriotimol Acjua destilada pH 6.9

" " "_ 0.1 g SusFnder e1 medio deshi&-atado en 1 li- 5 9 tro de agua destilada o desmineralizada 3 9 y dejar remojar 15 minutos. Calentar y - 10 9 hervir 1 minuto. Esterilizar a 15 libras 1 5 9 durante 15 minutos. Distribuir en cajas

0.025 g petri. 1-000 ml Este es un medio selectivo para detectar

bacterias colifomes en heces y orha.

* SABOURAUD DEXT'OSA AGAR:

Proteosa peptona 10 g Disolver 65 g del medio en 1 litro de agua destilada Dextrosa 40 9 y agitar hasta disolver bien, calentar con agitacio- Agar 15 4 nes frecuentes durante 1 minuto para obtener una sus

pensión homogenea, esterilizar en autoclave 15 lkms 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar asépticamentel m1 de estreptmicina y 1 m1 de penicilina.Envasar en tubo con tapón de rosca previcmente esterilizado, ig clinar y cuando esté frío guardar en el refrigerador.

*.._AGAR ENEQ'

Lactosa Pentosa Fosfato dipotAsico Agar Sulfito de scdio Eucsina básica Agua destilada

1.0 y Disolve]: por ebullición flcaccj.dn del m&io PH a 10 7.5, Esterilizar en autcclave a 15 li-bras (121" C)

15 g

0.4 g

3.5 g durante 15 minutos.

2.5 9

1000 ml

Este medio puede obtenerse comercialmente en fog na deshidratada y se preparará de acuerdo con su instructivo.

* BASE DE AGAR DE CASMAN: Nicotinamida Mezcla de peptonas Peptona biotriptasa Extracto de carfie Acido p-amino benzoic0 Dextrosa Almidón de maíz Cloruro de spdio Agar

. .

PH 7.3

Se suspenden 43 g de polvo en 1 litro de a_ qua destilada, Dejar que se remojen entre 10-15 minutos para que se hidraten correc- tm,ente las particulas de agar. Calentar 2 gitando continuamente y hervir mAs o menos 1 min. o hasta disolución total del medio. Esterilizar en autoclavc a 15 libras duras te 15 minutos.

39

Objetivos y Metas alcanzadas.

Evaluación

(A) Se cumplió con el 100 % de las actividades programadas en cada

una de las dreas de trabajo (Química'-Clínica, Inmunología, He-

matología y Microbiología), por etapas y mensualmente, (B) Cumplimiento de asistencia a l 100 % de las actividades corres-

pondientes al trabajo de Servicio Social. (C) Aprobaci6n de un examen premedición: 60% y un examen postmedi-

cio'n: 95%, con un avance del 35% teórico-práctico. (D) Elaboración de un informe final,

Resultados de la Actividades desarrolladas

El resultado de los análi-sis clínicos realizados f u e dependiente del niínero

de pacientes que por día solicitaron los servicios de laboratorio, p r lo que se hizo anotación de los mismos por día y samna y finalmente un promedio. Se tomaron en total 700 muestras de sangre venosa durante 14 semanas (10/dia), y en total 650 muestras de exudados faringeos durante 13 senlanas (10/dia),

En la tabla no.1 se muestra el número de estudios realizados en total por -

semana y por área de trabajo. En tot.al , se realizaron 5011 esturi-os en las cua- tro áreas durante l a s 27 semanas de trabajo, de los cuales el 48.15 % correspon-

de al área de Quihica-Clínica, el 26.14 % al área de Microbiología, el 13.92 % -

al área de Hernatolcqía y el 11.77 % corresponde al área de Inmunologia.

40

Cronograrna de Actividades

e:

I

41

-+- I

-,1T

- - i " t t t

Tabla no-1

I J

Estudios No.de e s t u d i o s por sema

Semanas : p r ám3. dics. por área. .ssbYhcs - prm&o/día. de n a s de trabajo e n tota i % total de Nxde e 3 d i c ~ I%. tutal

1 2 3 4 5 6 7 8 *

( A ) Química-Cl íni -ca

Glucosa 8.41 % 5 / día 203 32 30 19 23 32 20 20 27 Urea

23.33 8 J.4 / día 563 62 75 67 59 70 86 68 76

Creatillina 22 2% 23 24 23 20 29 25 192 5 / clía

5.51 % 3 / & 133 E 18 16 16 17 15 18 18 T r i g l i c e r i d o s 3.43 8 2 / d í a 83 U L l 1 3 9 9 8 1 0 1 2 Fosfatasas 6.63 % 4 / & 160 ¡S 22 23 29 18 18 23 19 Transaminasas 4.72 % 2-3 / dla u 4 15 15 13 18 15 12 13 U B i l i r r u b i n a s

15.58 % 9 / & 376 48 53 45 47 55 3 43 47 Colesterol 7.95 %

Total

o Acic!o úri-co 5.76 2 3-11 / cilis. 1 39 1 3 18 :1.8 15 19 19 22 1.5

P n E b de arkEEa¿E 18.64 % U / & 450 52 58 53 G2 53 47 55 60 1 I " , ' i. ('

24U ' . 100.00 % GO / día

(B) Tnmunología , .

Prueba ck latex pra factor rSsrubi& 18 18 Ll 12 18

16.64 5; 4 / d-id 97 19 19 22 18 19 At~tist.rqkolisirUs 3 . 2 3 S 8 / día 202 38 41 42 33 42 V m - sífihs 14.57 2 3-4 / día 8G E 16 16 20 19 I i a a 5 - f&riLm 13.G5 'h 7-7

P r o t e í n a C-mx~.va 22 24 30 25 27 128 5 / did

, .

- Total 1oo.m ~; 21-69 6 73 23-24,' 3/di7 dk 5 9

( C ) Ilematología

Uio~netríss 1 ~ ~ 6 t i . a ~ iktexnni~m5ik c k c g - q x ~

23.78 % 5-6 / &a IC6 25 27 27 29 30 28

Eal-qlím y f m Rh 2_5./'8 p 6 / d í a 1.89 30 30 32 28 27 33 ~ ~ c i ~ glchllar 30.6. % 7 / & 214 35 28 38 34 37 42

Qmta dc ~tiaiLa5.t~~ l"FJ 9 23/& 695 T o t a l 1 9 . 7 % 4-5 / día 19 1.8 24 23 27 27 1 U8

(D) Microbiología

Tirx=icnes&Gran

oLLtiK6 li2 €lxKkks 18-09 8 G / & 237 27 28 31 32 31 29 33 35 Umult ivos 28.85 % 4-10 / &-a 378 4% 45 46 46 51 47 43 52 mclrim

amtd Ck ldtcs 20.15' 8 6-7 / día 264 30 28 32 39 29 33 35 38

fv 27 28 32 29 32 25 33 29 235 6 / & 17.93 '% ailtiLcs & eQfk&E q" 23 23 2 3 2 5 27 24 29 22

103.00 '% 33 / dla I310 T o t a l 14.96 % S / & 1%

i J I

42

Conclusiones. .-

En el trabajo de Servicio Social se realizaron en forma práctica y sistemá-

tica las técnicas fundamentales más empleadas en las áreas de Quínuca-Clínica, - Inmunología, Hematologia y Microbiología de laboratorio de análisis clinicos , -

con el fin de apoyar a la atención nédica en el diagnóstico.

Este trabajo ha permitido aplicar los conocimientos y habilidades adquiridos du- rante la carrera en un área especifica cow0 lo es Medicina, debido a que como es

sabido el organismo humano esta es contacto continuo con millones de microorga- nismos, por lo que se dmostró la gran irnyrtancia de la Riquimica en el área de la salud, y el &ea tan cunpl.ia en la que pcx3c~111os incidir, pues actualmente se

realizan grandes esfuerzos de investigación para esclarecer las bases (principal mente a nivel bicquhico y molecular) de la patogenicidad de muchos microorganiz mos, por lo que se considera que la Ingeniería BicquinÚca juega un papel funda- mental en el avance de la Medicina, por lo que es necesario contar con los recuz sos humanos y econÓmicos para lograr un avance más rápido.

Reconendaciones.

1 . Sería deseable que existiera un convenio oficial por,parte de la Universidad Autoncma Metroplitana con Instituciones del Sector Salud para m e r realizar el Servicio Social dentro de estas instituciones.

2. Q m se incluyerá en el programa acadhico de la carrera de Ingenieria Eioquí- mica una U.E.A. en la que se apxten ccnccimientos teórico-prácticos de técni cas especificas de laboratorio clínico p r a el aislamiento y cultivo de mi-

croorganimos ptjyenos.

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Biblioqrafía

1. Bailey, W.R. and Scott, E.G. Diagnostic Microbiology, 4a.ed. Saint Louis, The C.V., Mosby Company.

2. Bennington, James; Fouty, Robert; Hougie, Cecil. El Laboratorio en el Diag- nóstico Clínico, 1986. Edit. Fournier, S.A., México, D.F.

3. Berger, L. and Rudolph, G.N. Alkaline and acid phospatase. In Standard Me- thods of Clinical Chemistry, 1963, vo1.5. Ed. New York, Academic Press.

4. Bradshaw, Jack. Microbiolqía de Laboratorio, 1976. Edit. El Manml Ncderno, S.A., bi6xico, D.l?.

5. Freeman, Bob. Tratado de Microbiología de Burrows , 21a. ed. Nueva Editorial Interamericana, S.A., Pléxico, D.F.

6. Goodale, R.H. and Widmann, F.K. Clinical interpretation of laboratory test,

6a.ed., Philadelphia, F.A. Davis.

7. Henry, R.J. Clinical chemistry. Principles and techniks, 1964.

Hoeber Medical Division, Harper and Row Publishers, New York.

8. Jagannathan, S.N. The determination of plasma triglicerides, 1964, vo1.42.

Canadian Journal of Biochemistry.

9. Kaplan, A. Urea nitrogen and urinary ammonia. In Standard Methcds of Clinicdl Chemistry, 1963, vo1.5. Ed. New York, Academic Press.

10. Pelczar Michael; Chan E.C.S. Elementos de Microbiología, 1984. Edit. Mc Graw Hill, S . A . , México, D.F.

11. Race, R.R. and Sanyer, R. Blood Groups in Man, 3a.ed. Charles C. Thomas, Springfield, Illions.

12. Sonnenwi.rth, A. C. y colabradores. Bacteremia, aspectos clínicos y de labra torio, 1975. Edit . Mgdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.

13. Sonnenwirth, A.C. Collection and culture of specimens and guides for bacte- rial identification, 7a.ed. vol.11. Saint Louis, The C.V. Mosby Company.

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