Universidad Autónoma de Ciudad JuárezInstituto de Ciencias BiomédicasDepartamento de Ciencias Básica

Uso de ciclodextrinas como antioxidantes

Ciudad Juárez

CiclodextrinasOligosacáridos cíclicos naturales constituidos por 6, 7 u 8 unidades de glucopiranosa unidas por enlaces glucosídicos α(1,4)

O

H

H

HO

H

O

OHH

H

OH

O

H

H

HO

H

HO

H

H

OH

O

O

H

H OH

HO

HO

H

H

OHO

H

H

OH

H

O

HOH

H

HO

O

H

H

OH

H

OH

H

H

HO

O

O

H

HHO

HO

OH

H

H

HO

O

H

H

HOH

O

OH

H

H

OH

O

HH

OH

H

O

HO

H

H

OH

O

H

H

OH

H

O

HOH

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

OH

H

HO

H

OOHH

H

HO

O

H

H OH

H

OHO

H

H

OH

O

H

HHO

H

O

OH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OHH

H

OH

O

H

H

HO

H

O

HO

H

H

OH

O

HH

OH

HHO

H

H

OH

O

OH

HOH

H

OHO

H

H OHO

H

H

OH

H

O

HOH

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

O

H H

HO

HOH

H

H

HO

O

OH

HHO

H

OOH

H

HHO

4,7 - 5,3 Å 6,0 - 6,5 Å 7,5 -8,3 Å

α β γ

Almidón

Ciclodextrinas

Ciclodextrina GlucosilTransferasa

E.C. 2.4.1.19

Reacción

intramolecular

Obtención de Ciclodextrinas

Cinturón de hidroxilosprimarios

Cinturón de oxígenos

glucosídicos

H(3) H(3)H(3)

H(5) H(5)H(5)

H(6)H(6

Cinturón de hidroxilos

secundarios

Propiedades fisicoquímicas de las Ciclodextrinas

Complejos de inclusión

Supermolécula formada por una molécula huésped (sustrato) que es incluída o encapsulada en el interior de una molécula hospedadora (receptor)

• Equilibrio Químico

• Constante de equilibrio

La formación de agregados supramoleculares está regida por un Proceso de Reconocimiento Molecular

a) Compatibilidad geométrica:

Tamaño

Forma

b) Compatibilidad en la polaridad.

A mayor polaridad del huésped, menor capacidad de formar complejos

Complejos de inclusión

(b) (c)(a)

(d) (e)

Completo Axial

Parcial

De estequiometría superior

Tipos:

(b) (c)(a)

(d) (e)

Completo Axial

Parcial

De estequiometría superior

(b) (c)(a)

(d) (e)

Completo Axial

Parcial

De estequiometría superior

Tipos:

Estequiometría y Fortaleza.

Complejos de inclusión

Modificación de las propiedades fisicoquímicas de la molécula huésped

Solubilidad: Aumento o disminuciónBiodisponibilidad

Estabilidad: TérmicaOxidaciónDegradación fotoinducida

Otros procesos: Enmascarar saborReducir volatilidad

Complejos de inclusión

● β y γ ciclodextrinas son “generalmente reconocidas como seguras” (GRAS de Generally Recognized As Safe) por la FDA.

● El reconocimiento GRAS fue otorgado en el año 2000 para la γ-CD y 2001 para la β-CD, aunque esta última ha sido utilizada desde 1996.

● La Organización Mundial de la Salud aprobó el uso de la β-CD como aditivo alimentario desde 1993.

● Para estas aprobaciones tuvieron que realizarse estudios de: toxicidad aguda y crónica, teratogenicidad y embrio-toxicidad, estimaciones de la máxima dosis consumible (9-12 mg/día.Kg), etc.

Usos de las ciclodextrinas en alimentos: Normativa

80-90%Vehículo de vitaminas y ácidos grasos como suplemento2%Leche de soya (modificación del sabor)

1 %Bebidas e polvo, sopas instantáneas, polvo para salsas, café y té instantáneos, especias, botanas, chicles y dulces

γ-CD0.2%Sopas deshidratadas

1%Gelatinas y pudines, café y té de sabores, productos de queso, polvo para bebidas

2 %Cereales, chicles, dulces

β-CD

Máximo permitido

Tipo de alimento y uso

80-90%Vehículo de vitaminas y ácidos grasos como suplemento2%Leche de soya (modificación del sabor)

1 %Bebidas e polvo, sopas instantáneas, polvo para salsas, café y té instantáneos, especias, botanas, chicles y dulces

γ-CD0.2%Sopas deshidratadas

1%Gelatinas y pudines, café y té de sabores, productos de queso, polvo para bebidas

2 %Cereales, chicles, dulces

β-CD

Máximo permitido

Tipo de alimento y uso

Usos de las ciclodextrinas en alimentos

• Protección frente a la degradación• Eliminación productos indeseables (olores, sabores)• Control de la maduración de frutas (Metileno)

ColesterolHO

C8H17

Complejo con β-CD insoluble

Ejemplos de aplicaciones

Productos lácteos libresde colesterol

Complejación de Vainillina

Prolongar sensación de frescura y liberación controlada del aroma en:

• Shampoo

• Enjuague de boca

• Chicles

Ejemplos de aplicaciones

Ejemplos de aplicaciones

Complejación de ácidos orgánicos usualmente líquidos para formar granulados:

Producción de bebidas en polvo ricas en proteína de soya y de un color rojo brillante

Ejemplos de aplicacionesComplejación de β caroteno:

Producción de sustitutos de grasas (no digeribles) , enriquecidos en vitaminas liposolubles

CH3 CH3

CH3CH3

CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

Ejemplos de aplicacionesComplejación de aceite de ajo: Capacidad antifúngica

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro

•• ¿¿El complejo ciclodextrina: El complejo ciclodextrina: polifenolpolifenoltiene mayor capacidad antioxidante tiene mayor capacidad antioxidante que el compuesto libre?que el compuesto libre?

•• ¿¿El complejo ciclodextrina: El complejo ciclodextrina: polifenolpolifenolse degrada menos que el antioxidante se degrada menos que el antioxidante libre?libre?

•• FormulaciFormulacióón de suplementos n de suplementos alimenticios alimenticios

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante

Los compuestos fenólicos “neutralizan” el exceso de radicales libres que pueden desarrollar enfermedades crónicas de tipo degenerativo tales como el cáncer y cardiovasculares.

Estos radicales libres pueden dañar el ADN y ser potencialmente cancerígenos

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante

Otro efecto protector de estos antioxidantes es a nivel cardiovascular.La LDL-colesterol al ser oxidada por radicales libres es reconocida por los macrófagos muy rápidamente.

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante

Esta respuesta tan agresiva puede crear daños en el endotelio vascular, solución de continuidad en vasos y finalmente trombos.

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante

Un buen aporte de frutas a la dieta puede tener excelentes efectos en nuestra salud

Es importante mantener la capacidad antioxidante de los alimentos

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante

Determinación de la Capacidad Antioxidante

Dos métodos principales:

- Transferencia de átomos de hidrógeno (HAT)

X· + AH → XH + A·

Método ORAC

ROO. + proteína → oxidación

ROO. + AH → ROOH + A.

ROO. + A. → ROOA

Reacción Rápida

Independiente del disolvente

tiempo (min)

0 20 40 60 80 100

Fluo

resc

enci

a (u

a)

0

10

20

30

40

50

60

Dos métodos principales:

- Transferencia individual de electrón (SET)

M(III) + AH → M(II) + AH+

Método FRAP

Determinación de la Capacidad Antioxidante

Fe(TPTZ)2(III) + AntiOH → Fe(TPTZ)2(II) + AntiOH+·

Ambos mecanismos (HAT y SET) ocurren paralelamente

Capacidad Reductora

Reacción Lenta

Dependiente del disolvente y pH

Sensible a la presencia de vit. C

Determinación de la Capacidad Antioxidante

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 500 1000 1500 2000

Tiempo / s

Abs

595

Qc

Rt

CA

CDQC

CDRt

CDCA

y = 0.0005x + 0.1594R2 = 0.9988

00.2

0.40.6

0.81

1.21.4

1.61.8

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Fe2+ / mM

Abs

Cuantificar la concentración de

Fe2+ reducido

•• ¿¿Forman las ciclodextrinas Forman las ciclodextrinas complejos de inclusicomplejos de inclusióón con los n con los

polifenolespolifenoles??

•• ¿¿Los Los complejoscomplejos mmodificanodifican la la capacidad antioxidante de los capacidad antioxidante de los

polifenolespolifenoles??

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles

Quercetina

0

5

10

15

20

450 500 550

l / nm

u. a

. f.

Espectro de fluorescencia

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles

Análisis no lineal: ajuste por mínimos cuadrados

[β-CD] / nm

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

Fluo

resc

ence

Inte

nsity

/ a.

u.

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

1/[β-CD]

0 1000 2000 3000 4000

1/Δ

F

0 .050 .100.150.200.250.300.350.400.45

[ ][ ]01

011

1 CDKCDKFFF CH

++

=λλ

λ

Datos iniciales:Valores de ajuste lineal:

K1

K1

Guest K1/ M-1

(linear fit)

K1/ M-1

(non-linear fit)

CA 420 ± 50a 465 ± 26

Rt 250 ± 48 224 ± 14

Qc 1284 ± 106 1138 ± 52

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 500 1000 1500 2000

Tiempo / s

Abs

595

Qc

Rt

CA

CDQC

CDRt

CDCA

Transformar a concentración de Fe2+ con la curva de calibración

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro

Fe2+ 4 min Fe2+ 30 min

Qc 1424 ± 73 2073 ± 130

Rt 660 ± 58 1454 ± 73

CA 569 ± 23 1063 ± 65

Qc:CD 1515 ± 107 2225 ± 227

Rt:CD 770 ± 23 1608 ± 70 *

CA:CD 673 ± 11 * 1215 ± 27 *

Valores FRAP 4 min

Valores FRAP 4 min y 30 min

0200400600800

10001200140016001800

Qc Qc/CD Rt Rt/CD CA CA/CD

Tratamiento

Fe2+

*

4 grupos: a) control (agua)b) β-CD ( 6 mM)c) Ácido Caféico (6 mM)d) Mezcla (6 mM CD + 6

mM AC)

Duración del experimento: 28 días

Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina

Extracción de sangre (2 mL), centrifugar para separar el plasma y medir capacidad antioxidante por la técnica FRAP

Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina

0.0

100.0

200.0

300.0

400.0

500.0

600.0

700.0

CD Caf com agua

[Fe2+

] / m

M

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

CD Caf com agua

mg

Col

este

rol

Capacidad antioxidante:

Diferencia significativa entre tratamiento con ciclodextrina

Colesterol:

No se presentaron diferencias entre tratamientos

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO

Sustrato + Ciclodextrina Complejo

o-Quinonas

Pardeamiento

PPO

Aminoácidos

K11

Efecto de la β-ciclodextrina sobre la actividad de la PPO

Forma de acción de la PPO

R

OH

R

OH

OH

R

O

O

O2Actividad cresolasa

O2Actividad

catecolasa

R

OH

R

OH

OH

R

O

O

O2Actividad cresolasa

O2Actividad

catecolasa

R

OH

R

OH

OH

R

O

O

O2Actividad cresolasa

O2Actividad cresolasa

O2Actividad

catecolasa

O2Actividad

catecolasa

Enzima responsable del pardeamiento de frutasEnzima responsable del pardeamiento de frutas

[AC] / mM

0 2 4 6 8 10

V o/Uabs

1

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025control 4-HR / 0.5 mM β-CD / 5.0 mMMezcla (CD+ 4-HR)

Vo

/ U

abss

-1

***

§§

Efecto de la β-CD, 4HR y Mezcla sobre la oxidación del AC por PPO de Manzana

Todos los tratamientos produjeron una inhibición de la

actividad de la PPO, siendo esta mayor para el caso de la

mezcla.

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO

Control 4-HR ΜJ* β-CD

Vmax1 2.9 2.8 2.2 2.5

K´M1 3.39 9.86 4.20 8.35

Vmax2 3.0 2.8 2.9 2.1

K´M2 3.68 10.84 6.62 6.4

Ki 0.26 8.38 3.42

Parámetros cinéticos de la PPO de manzana Red Delicious en presencia de los inhibidores.

1Ajuste no-lineal a la ecuación de Michaelis-Menten; 2ajuste lineal a la ecuación Lineweaver-Burk.

Competitivo MixtoMixto

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO

Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada

Manzana cortada lavada y Manzana cortada lavada y tratada con CD, extracto de la tratada con CD, extracto de la piel, extracto mas CD y aguapiel, extracto mas CD y agua

Tomar muestras liofilizar y Tomar muestras liofilizar y determinar capacidad determinar capacidad antioxidanteantioxidante

Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada

1500

2000

2500

3000

0 3 5 7

Días

[Fe2+

] / m

M ControlAguaCD

Capacidad antioxidante de manzana fresca cortadaCapacidad antioxidante de manzana fresca cortada

¡¡Gracias!Gracias!