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Universidad Andrés BelloFacultad de Ciencias Biológicas
Escuela de Ingeniería en Biotecnología
EFECTO DEL ESTRÉS CRÓNICO SOBRE LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMAAUTOFAGIA/LISOSOMA EN EL RIÑÓN CEFÁLICO DEL LENGUADO FINO
(Paralichthys adspersus).
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al
Grado de Magíster en Biotecnología.
Director de Tesis: Dr. Alfredo Molina S. Facultad Ciencias Biológicas.
Universidad Nacional Andrés Bello.
Co-Director de Tesis: Dr. Cristián Valenzuela I.Facultad Ciencias Biológicas.
Universidad Nacional Andrés Bello.
Tamara Isabel Vera TobarSantiago, Chile.
Julio, 201
Agradecimientos
Quisiera comenzar agradeciendo al Dr. Alfredo Molina por brindarme la oportunidad de
formar parte del Laboratorio de Biotecnología Molecular, quién junto al Dr. Juan Valdés me
entregaron incalculables consejos durante el desarrollo de mi tesis. En especial, un inmenso y
profundo agradecimiento a mi co-tutor el Dr. Cristián Valenzuela por su apoyo y consejos diarios,
por considerarme y tratarme como a un par…gran parte de lo que he aprendido y soy hoy como
profesional es gracias a él.
Gracias al Dr. Sebastián Escobar, por instruirme en mis primeros pasos en la
investigación.
Gracias a los compañeros y amigos del laboratorio, Rodrigo y Oscar por regalarme un
poco de su tiempo y brindarme valiosos consejos, aportando en el desarrollo de ésta tesis.
Especialmente, me gustaría agradecer a mis amigas Brisa, Pierina y Marcia por apoyarme y
aconsejarme incondicionalmente en todas las situaciones de la vida…en uds. encontré una
amistad verdadera y grande profesionales.
Gracias a mis padrinos, Julio y Norma, por su apoyo e interés, a pesar de no entender
mucho sobre mi trabajo.
Finalmente, pero no menos importante…un especial agradecimiento a las mujeres de mi
vida! A mi abuela, Violeta Flores Meza, sé cuánto te habría gustado poder ver esto pero, también
sé que estés donde estés estas muy orgullosa y feliz. A mi tía, Violeta Tobar Flores, por apoyarme
y ayudarme en todas las decisiones de mi vida. A mi mamá, Isabel Tobar Flores, gracias por haber
sido mamá y papá, por tu amor incondicional y por no haberte rendido nunca y siempre tener una
palabra de aliento que me ayudara a seguir adelante…si no fuera por uds, nada de esto hubiera
sido posible y por eso esta tesis está dedicada a uds.
Índice
1. RESUMEN..................................................................................................................8
2. INTRODUCCIÓN......................................................................................................9
2.1. El estrés afecta negativamente la productividad de la industria acuícola.....................9
2.2. Estrés en peces............................................................................................................10
2.3. Inmunidad en peces....................................................................................................11
2.4. Autofagia y su relación con Inmunidad......................................................................15
2.5. Integración Estrés – Inmunidad – Autofagia..............................................................16
2.5.1. Estrés-Inmunidad................................................................................................16
2.5.2. Inmunidad – Autofagia.......................................................................................17
2.5.3. Autofagia- Estrés................................................................................................18
3. HIPÓTESIS...............................................................................................................19
4. OBJETIVOS..............................................................................................................19
4.1. Objetivo general..........................................................................................................19
4.2. Objetivos específicos..................................................................................................19
5. DISEÑO EXPERIMENTAL....................................................................................20
6. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................22
6.1. Peces y cultivo............................................................................................................22
6.2. Obtención del riñón cefálico.......................................................................................22
6.3. Extracción de ARN y síntesis de ADNc.....................................................................22
6.4. Diseño y evaluación de partidores..............................................................................23
6.5. PCR en tiempo real.....................................................................................................24
6.6. Extracción y cuantificación de proteínas....................................................................24
6.7. Western blot................................................................................................................25
6.8. Análisis estadístico.....................................................................................................26
7. RESULTADOS..........................................................................................................27
7.1. Efecto de la alta densidad poblacional en la respuesta a estrés a través de la vía cortisol/GR/REDD-1/KLF15......................................................................................27
7.2. Efecto de la alta densidad poblacional en los niveles de expresión de diversas moléculas asociadas a la inmunidad en el riñón cefálico............................................................30
7.3. La alta densidad poblacional activa el proceso de autofagia en el riñón cefálico del lenguado fino..............................................................................................................33
8. DISCUSIÓN..............................................................................................................36
9. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES................................................................42
10. BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................43
11. ANEXOS....................................................................................................................65
11.1. Tabla 1. Partidores utilizados en esta tesis................................................................65
11.2. Tabla 2. Anticuerpos utilizados en esta tesis.............................................................66
11.3. Cortisol plasmático...................................................................................................67
11.4. Activación de la autofagia a las 7 semanas de confinamiento en el músculo esquelético68
Índice de figuras y tablas
Figura 1: Esquema representativo del ensayo de alta densidad poblacional.
Figura 2: Expresión de los receptores de corticoesteroides en el riñón cefálico del Lenguado fino
en confinamiento.
Figura 3: Expresión de genes blancos de los receptores de corticoesteroides en el riñón cefálico
del Lenguado fino en confinamiento.
Figura 4: Expresión de genes relacionados a inmunidad en el riñón cefálico del Lenguado fino
en confinamiento.
Figura 5: Contenido proteico de IL-1β en el riñón cefálico del Lenguado fino a las 7 semanas de
confinamiento.
Figura 6: Expresión de genes asociados a la autofagia en el riñón cefálico del Lenguado fino en
confinamiento.
Figura 7: Contenido proteico de moléculas relacionadas con el proceso de activación de la
autofagia en el riñón cefálico del Lenguado fino a las 7 semanas de confinamiento.
Tabla 1: Partidores utilizados para qPCR durante el desarrollo de ésta tesis*.
Tabla 2: Anticuerpos utilizados para Western blot durante el desarrollo de ésta tesis*.
*Las tablas se encuentran en el anexo 1 y 2, respectivamente.
Abreviaciones
ACTH: Hormona Adrenocorticotropa
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AP-1: Factor de transcripción
ARN: Ácido ribonucleico
ATG 14: Autophagy-related protein 14
Beclin: Autophagy-related protein 6
Bnip 3: Bcl2/adenovirus E1B19 kDa protein- interacting protein 3
Caspasa 1/ICE: Interleukin converting enzyme
GC(s): Glucocorticoide(s)
GR(s): Receptor(es) de glucocorticoide(s)
H2B: Histona
FOXOs: Factores de transcripción
HPA: Hipotálamo – Pituitaria – Adrenal
HPI: Hipotálamo – Pituitaria – Interrenal
IFNs: Interferones
IKK: IκB kinase
IL-18: Interleuquina 18
IL-1β: Interleuquina 1 beta
IL-8: Interleuquina 8
ILs: Interleuquinas
KLF-15: Krupel –like factor 15
LC3: Microtubule- associated proteins 1A/1B-light chain 3
Leap 1/Hep 1: Liver- expressed Antimicrobial Protein 1
Leap 2: Liver-expressed Antimicrobial Protein 2
LPS: Lipopolisacárido
MAPKs: Mitogen-activated protein kinase
MC: Mineralocorticoides
MR: Receptor de mineralocorticoide
NCBI: National Center for Biotecnology Information
NFκB: Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de la células B activadas.
NK: Natural killer
PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos
PRRs: receptores de reconocimiento de patrones
RE: Retículo endoplásmico
Redd-1: regulated in development and DNA damage responses-1
Rheb: Ras homolog enriched in brain
SAG: Síndrome de Adaptación General
SOCS: Supresores de la señalización de citoquinas
SQSTM1/p62: Secuestrosoma
TLRs: Toll-like receptors
TNFs: Factores de Necrosis Tumoral
TNF-α: Factor de Necrosis Tumoral alfa
TNF-β: Factor de Necrosis Tumoral beta
TOR: Target of Rapamycin
1. RESUMEN
Diversos factores afectan los cultivos acuícolas, específicamente las altas densidades
poblacionales han sido señaladas como un factor de estrés social. La respuesta al estrés
desencadena un aumento en la producción y liberación de cortisol, seguido de un aumento en los
niveles de expresión génico de los receptores de glucocorticoides. El responsable de la
producción de cortisol en peces, es el tejido interrenal ubicado en la porción anterior del riñón,
denominado riñón cefálico. Además, en éste órgano es posible encontrar entremezclados varios
tipos celulares, destacándose las células del sistema inmune, ya que debido a la proximidad
existen entre estos tipos celulares, se ha hipotetizado una posible comunicación paracrina entre
ellos. Más aún, se ha descrito que el estrés es capaz de modular diferentes procesos biológicos,
entre ellos, la respuesta inmune. Como parte de la respuesta inmune se encuentra la síntesis y
secreción de citoquinas, proceso que puede ser regulado de manera negativa por las moléculas
SOCS, donde resalta la posible retroalimentación negativa existente entre SOCS-3 e IL-1β, ésta
es una molécula que carece de péptido señal, debido a esto no sería secretada por la ruta clásica
de secreción. Es más, algunos autores sostienen que la secreción de IL-1β sería controlada por el
proceso de autofagia. La autofagia es un proceso homeostático altamente conservado, el cual
puede ser activado mediante la vía GR/KLF-15/REDD-1. Hasta ahora, ésta vía sólo ha sido
descrita en el músculo y por primera vez se describe en un órgano como el riñón cefálico de un
pez plano. En base a estos antecedentes se planteó como hipótesis que “El estrés producido por
una alta densidad poblacional genera una expresión diferencial de genes de genes asociados a la
inmunidad y una activación de la autofagia en el riñón cefálico del lenguado fino”. Para poner a
prueba nuestra hipótesis, los lenguados juveniles fueron sometidos a una alta densidad
poblacional y se analizaron moléculas relacionadas a estrés, inmunidad y autofagia en el riñón
cefálico. En la presente tesis se describe como una condición de alta densidad poblacional en el
riñón cefálico del lenguado fino, genera un aumento en los niveles de expresión de los
marcadores de estrés secundario (GR1 y GR2). Además, fue posible observar una sobre-
expresión de moléculas relacionadas al sistema inmune, destacándose la regulación positiva de
IL-1βy SOCS-3. Además, el aumento en la expresión de, marcadores génicos y proteicos
evidenciarían una activación del proceso de autofagia. Donde el proceso autofagico podría estar
regulando de manera negativa la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, con el fin de
mantener la homeostasis mediante la vía GR/KLF-15/REDD-1.
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2. INTRODUCCIÓN
2.1. El estrés afecta negativamente la productividad de la industria acuícola
En general, durante la rutina de la industria acuícola, se utilizan procesos que influyen
directamente en el crecimiento de los peces: la densidad de cultivo, la calidad del agua, las dietas
y los métodos de alimentación. Asimismo, la rutina de explotación introduce otros factores,
como: clasificación de los individuos, medida de talla y peso, transporte y traslado de tanques,
desinfección periódica, entre otros. Todos estos efectos generan en la producción: i) reducción de
la supervivencia, ii) reducción del proceso reproductor y iii) reducción del crecimiento (Castelló,
1993).
Para mejorar la productividad de la industria acuícola, es necesario considerar factores
ambientales, tales como el estrés social generado por las altas densidades poblacionales que se
manejan en la acuicultura intensiva. Dado que la acuicultura maneja grandes poblaciones de
organismos en espacios limitados, nace la necesidad de investigar y comprender el efecto que las
altas densidades provocan en los peces (De Ocampo y Cambreros, 1999).
Al transcurrir los años se ha hecho evidente la necesidad de diversificar la acuicultura
chilena, con el fin de disminuir la dependencia a la salmonicultura y consolidar la industria a
nivel mundial. Por ello se ha invertido en el desarrollo de nuevas tecnologías para el cultivo de
especies nativas, una de las especies con mayor potencial es el lenguado chileno (Paralichthys
adspersus) perteneciente al orden de los pleuronectiformes (pez plano), distribuido desde la
localidad de Paita (norte de Perú) hasta el golfo de Arauco (Chile), incluyendo el archipiélago de
Juan Fernández (Alvial y Manríquez, 1999). Ésta especie ha sido considerada para diversificar
la acuicultura, ya que presenta un alto valor comercial en el mercado, producto de la calidad de su
carne, la cual se distingue por ser un filete blanco con bajos contenidos de ácidos grasos y textura
firme (Alvial y Manríquez, 1999; Fuentes et al., 2008). Sin embargo, este pez presenta una baja
tasa de crecimiento (Fuentes et al., 2013), lo que ha dificultado su introducción y
posicionamiento en la industria acuícola chilena.
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2.2. Estrés en peces
El concepto de estrés es definido como “la suma de todas las respuestas fisiológicas por
las cuales un animal intenta mantener o establecer de nuevo un metabolismo normal frente a una
fuerza física o química” (Selye, 1950).
Los peces fueron los primeros vertebrados en desarrollar una respuesta al estrés, capaz de
interrelacionar órganos asociados a diferentes sistemas como el sistema nervioso-endocrino-
inmune (Engelsma et al., 2002; Flik et al., 2006), o el eje Hipotálamo- Pituitario-Interrenal
(HPI), que se diferencia del conocido en mamíferos (eje Hipotálamo-Pituitario-Adrenal (HPA))
por presentar un conjunto difuso de células interrenales (Weyts et al., 1999). Este eje es activado
por los estímulos estresores desencadenando el síndrome de adaptación general (SAG), el cual
consta de 3 etapas: la fase de alarma inicial en donde son sintetizadas las catecolaminas desde
tejidos cromafines (Randall y Ferry, 1992; Reid et al., 1998). Si el estímulo estresor continúa,
se activa la fase de resistencia, en donde el organismo reduce a niveles basales las catecolaminas
y se activa el eje HPI para la liberación de corticoesteroides (Janey et al., 1992). Finalmente, si el
estrés persiste, comienza la fase de agotamiento, donde se afecta el crecimiento, resistencia
general a enfermedades, comportamiento, y en última instancia la supervivencia; donde además,
se afecta la activación del eje HPI y la recuperación de la homeostasis (Wedemeyer y McLeay,
1981; Wedemeyer et al., 1990; Barandica y Tort, 2008).
En condiciones de estrés, la principal respuesta se encuentra dada por la liberación de
corticoesteroides, hormonas esteroidales, que son liberadas por la corteza suprarrenal y su
concentración plasmática es controlada por el eje hipotálamo- hipófisis- glándula suprarrenal, los
cuales se pueden clasificar en glucocorticoides (GC) y mineralocorticoides (MC) (Rhen y
Cidlowski, 2005). El GC activo más abundante es el cortisol, el cual afecta a casi todos los
sistemas fisiológicos en el organismo (Charmandari et al., 2005). Su respuesta es mediada por
los receptores de glucocorticoides (GRs), que se localizan predominantemente en el citoplasma
en forma inactiva. Este receptor se disocia del complejo uniéndose a su ligando y se transloca al
núcleo de forma activa, induciendo o reprimiendo la transcripción de genes (Kumar y Calhoun,
2008). Por ejemplo klf-15 (krüpel-like factor15) y redd-1 (DNA damage responses-1) activan su
expresión por la acción de GR (De Young et al. 2008; Xiao et al. 2013). Además, el principal
mineralocorticoide es la aldosterona, que se une al receptor de mineralocorticoide (MR), que en
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ausencia de su ligando se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma (Whalter et al.,
2005).
En peces, la respuesta al estrés es sensada por el hipotálamo, desencadenando la secreción
del factor liberador de corticoesteroides, este factor se unirá a su receptor en la adenohipófisis,
provocando la liberación de la hormona adrenocorticotropina (ACTH), la cual estimula la
secreción de corticoesteroides por el riñón cefálico (Alsop y Vijayan, 2009). En teleósteos, la
principal hormona es el cortisol (Mommsen et al., 1999), ya que actúa como glucocorticoide y
mineralocorticoide, debido a que los peces carecen de aldosterona sintetasa, enzima clave en la
síntesis de aldosterona (Bury y Sturm, 2007; Jiang et al., 1998; Mommsen et al., 1999). En
peces, existen dos genes que codifican para GR (gr1 y gr2), lo que se puede explicar por un
evento de duplicación completo del genoma ocurrido durante su evolución (Bury y Sturm, 2007;
Kim et al., 2011). La conservación de estos genes, sugiere que no son redundantes, adquiriendo
distintas funciones y sometiéndose a una neofuncionalización. Como ya se mencionó, los peces
no producen aldosterona. Sin embargo, pueden expresar GR y MR, donde el cortisol actúa como
ligando para ambos receptores (Greenwood et al., 2003). En cuanto a la función del cortisol, se
han descrito variadas funciones fisiológicas como en el metabolismo de los carbohidratos, los
intercambios osmóticos, y cambios en el sistema inmunológico (Mommsen et al., 1999).
No obstante, desde el punto de vista de la acuicultura, el proceso biológico más
importante que se ve afectado por el estrés es la respuesta inmune (Einarsdoattir et al., 2000).
En peces, el sistema inmune se ve afectado en relación al tipo de estrés. Así, un estrés agudo
provoca un aumento en el número y tráfico de células fagocíticas fomentando la respuesta
inmune innata (Barandica y Tort, 2008). Por otra parte, un estrés crónico, puede originar un
aumento de la susceptibilidad a enfermedades y patógenos, originando pérdidas importantes en el
sector acuícola (Olabuenaga, 2000).
2.3. Inmunidad en peces
Los peces son un grupo diverso y, desde un punto de vista evolutivo, son los primeros
vertebrados en presentar un sistema inmune completo (desde hace 450-500 millones de años)
(Marchalonis y Schluter, 1998; Hoar et al., 1997). Su respuesta inmune, tanto innata como
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adaptativa tiene muchas similitudes con el sistema inmune de los mamíferos (Ellis, 1988;
Olabuenaga, 2000).
La respuesta inmune inespecífica se divide en barreras físicas, componentes celulares y
humorales (Toche, 2012). La primera línea defensiva contra patógenos en peces y la más extensa,
corresponde a la piel, la cual se encuentra recubierta por un mucus, que posee compuestos
antimicrobianos, lisozimas, inhibidores de proteasas, factores del complemento, lectinas,
interferones y transferrina, entre otros (Manning, 1998; Buchmann et al., 2001) . También se
consideran como barreras físicas, las escamas, las mucosas que recubren las branquias y el tracto
grastointestinal (Magnadóttir, 2006; Buchmann et al., 2004; Tomoki, 1996; Ellis, 1989; Woo,
2007). Dentro de los componentes celulares, existen células capaces de identificar patrones
moleculares distintivos de los microogranismos (fagocitos, macrófagos, neutrófilos, entre otros)
(Magnadóttir, 2006), mediante un variado sistema de proteínas receptoras, como los receptores
tipo-toll (Toll-like receptors (TLR)), iniciando así la respuesta inmune (Garfias y Gualito, 2005).
Como la mayoría de los animales no mamíferos, los teleósteos carecen de médula ósea,
por lo que, la hematopoyesis se da principalmente en el riñón (Zapata et al., 2006). Así, en este
órgano, las principales células encontradas son, macrófagos y células linfoides en todos sus
estadios del desarrollo (Press et al., 1994). Esto hace del riñón un análogo de la medula ósea, de
los ganglios y en parte de la glándula adrenal de los vertebrados superiores (Fánge, 1992).
Dentro de los componentes humorales, se encuentran las citoquinas, que en peces existe
una gran variedad siendo similares a las de mamíferos (Plouffe et al., 2006). Entre ellas se
encuentran: el factor de necrosis tumoral, el interferón, las quimioquinas y las interleuquinas
(Savan y Sakai, 2004; Savan et al., 2005; Zou et al., 2004; Fujiki et al., 2000; Zou et al.,
1999).
Los factores de necrosis tumoral (TNFs) se encuentran involucrados en procesos
inflamatorios, apoptóticos, proliferación celular y estimulación del sistema inmune (Poisa, 2008).
En mamíferos, los TNFs se han encontrado en dos formas (TNF-α y TNF-β), mientras que en
peces parece que sólo existe una forma, similar en estructura y organización genómica al TNF-α
de mamíferos (Camussi et al., 1991). Ésta proteína puede ser sintetizada por varios tipos
celulares (monocitos-macrófagos, linfocitos, células NK (del inglés Natural Killer), entre otros)
bajo estimulación con endotoxinas, mediadores de la inflamación o citoquinas como la IL-1, y
también de manera autocrina, bajo estimulación con el propio TNF-α (Camussi et al., 1991).
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Los interferones (IFNs) constituyen una familia de glicoproteínas, producidas por
macrófagos, linfocitos, fibroblastos y células NK, otorgando protección contra infecciones virales
(Secombes, 1996) y que poseen propiedades inmunomodulatorias, al incrementar la expresión de
otras citoquinas (Farber, 1997). Se ha descrito que los interferones en peces (IFN-α, IFN- β e
IFN-γ), son muy similares a las de mamíferos en cuanto a estructura génica, proteica y
propiedades funcionales (Robertsen, 2006).
Por otra parte, las quimioquinas son una superfamilia de citoquinas, producida por
múltiples tipos celulares, como macrófagos (Reyes-Cerpa et al., 2013). Poseen propiedades
quimioatractantes, concentrando a las células efectoras en el sitio de la infección o lesión (Proost
et al., 1996). Éstas pueden activar a células del sistema inmune y comenzar el proceso de
reparación de heridas (Laing y Secombes, 2004). Un ejemplo es la interleuquina 8 (IL-8)
(Kerry, 2004), funcionalmente, es conocida como un agente de reclutamiento de neutrófilos y
otros leucocitos importantes en el sitio de las reacciones inflamatorias (Li y Yao, 2013).
Las interleuquinas (ILs) abarcan un grupo de citoquinas (proteínas inmunomoduladoras),
que provocan una amplia variedad de respuestas en células y tejidos (Brocker et al., 2010). Estas
proteínas gatillan o aumentan la expresión de una gran cantidad de genes no estructurales,
particularmente otras citoquinas, que se expresan de forma característica durante la inflamación
(Dinarello, 1994; Bird et al., 2002). En peces, la función de las interlequinas ha sido descrita
como moléculas pro-inflamatorias o antagonistas, pues inhiben la expresión de los miembros de
su propia familia (Secombes et al., 2011).
Interleuquina 1β, es una de las citoquinas proinflamatorias más potentes, induciendo la
respuesta inflamatoria en tejidos y órganos, además se ha demostrado que posee múltiples y
diversas propiedades en la respuesta a la infección, injuria o desafío inmune (Dinarello, 1984).
Es producida, principalmente por macrófagos y monocitos, afectando a casi todos los tipos
celulares (neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, basófilos, entre otros) (Sims y Smith,
2010). La actividad de IL-1β es mediada por su unión al receptor de IL-1 tipo I (IL-1RI), éste
recluta a una proteína accesoria (IL-1RAP) formando un complejo que desencadena una serie de
eventos de fosforilación, los que conducen a la activación de la quinasa IκB (IKK) y las vías de
las MAPKs (Dinarello, 2009; O’Neill, 2008; Wang et al., 2010). Estas vías de señalización
activan los factores de transcripción NF-κB y AP-1, lo que resulta en la inducción de genes que
codifican quimioquinas, citoquinas, proteínas de fase aguda, moléculas de adhesión celular, y las
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enzimas que participan en la producción de sustancias pro-inflamatorias (Burns et al., 2003). En
mamíferos, IL-1β es sintetizada como una molécula precursora inactiva sin péptido señal (pro-IL-
1β) de 31 kDa (March et al., 1985; Auron et al., 1984). Luego, la pro-IL-1β es activada por la
Caspasa 1 o ICE (del inglés Interleukin Converting Enzyme), que la procesa proteolíticamente
generando la citoquina activa IL-1β (Black et al., 1988). Una vez que la IL-1β es secretada,
participa en la generación de la respuesta inmune local y sistémica contra diversas clases de
patógenos y está implicada en la fisiopatología de enfermedades inflamatorias, resaltando su
papel en la evolución del proceso inflamatorio (Huang et al., 2013). Sin embargo, tanto en
mamíferos como en peces, se desconoce de qué manera IL-1β es secretada, ya que ésta ha sido
denominada como una proteína sin péptido señal, debido a que carece de la secuencia que le
permite a las proteínas secretoras llegar al retículo endoplásmico para translocar al lumen del
mismo (Schatz y Dobberristein, 1996). Sin embargo, se ha demostrado que la IL-1β es secretada
de manera activa por monocitos humanos activados por LPS (lipopolisácaridos), a través de una
vía secretoria que evadiría el RE y el aparato de Golgi (Rubartelli et al., 1990; Muesch et al.,
1990). Interesantemente, se ha observado que la secreción de IL-1β es inducida por el estrés
(Rubartelli et al., 1990) y en vertebrados superiores se ha hipotetizado que el proceso de la
secreción de la IL-1β podría ser regulado por el fenómeno de autofagia (Harris et al., 2011).
La IL-1β es una de las citoquinas más estudiadas en teleósteos, debido a la comunicación
entre el sistema neuroendocrino y el sistema inmunológico (Engelsma et al., 2002). Así, en
peces, la estructura primaria de la pro-IL-1β es similar a la de mamíferos (Seppola et al., 2008;
Wang et al., 2006; Corripio-Miyar et al., 2007; Jiang et al., 2008). Sin embargo, no ha sido
posible identificar el sitio de corte proteolítico en vertebrados inferiores (Bird et al., 2002;
Sakamaki y Satou, 2009; Secombes et al., 2011). Aun así, es posible identificar otras
similitudes con respecto a los mamíferos : i) muchos de los roles efectores de IL-1β son mediados
a través de un aumento o disminución de la regulación de la expresión de otras citoquinas y
quimioquinas (Dinarello, 1996), ii) La IL-1β en teleósteos es regulada en respuesta a varios
estímulos, como LPS o poly I:C (Pelegrín et al., 2001; Reyes-Cerpa et al., 2012), iii) Las IL-1β
de teleósteos poseen entre un 25-30% de similitud de secuencia con respecto a la proteína
encontrada en mamíferos (Engelsma et al., 2002).
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2.4. Autofagia y su relación con Inmunidad
La autofagia es definida como un proceso homeostático altamente conservado, para la
degradación de macromoléculas citosólica, organelos dañados o en exceso y algunos patógenos,
con el fin de garantizar el suministro de energía y nutrientes, y la eliminación de los organelos
viejos (Levine y Kroemer, 2008). En condiciones basales, la autofagia se produce a niveles bajos
en casi todas las células (Mizushima et al., 2008; Belghit et al., 2013), pero está fuertemente
inducida bajo condiciones tales como cambios de pH (Xu et al., 2011), cambios metabólicos
(Boya et al., 2005) o estrés térmico (Apel et al., 2008), constituyendo una respuesta universal al
estrés. Más aún, se ha afirmado que los PAMPs (Patrones moleculares asociados a patógenos),
PRRs (receptores de reconocimiento de patrones) y algunas citoquinas (TNF-α, IFN-γ) serían
capaces de activar el proceso de autofagia (Levine et al., 2011).
Mediante el proceso de autofagia, las células eucariotas sometidas a condiciones de estrés,
optimizan el uso de los suministros energéticos, sin embargo, un exceso de autofagia puede llevar
a la muerte celular (Jung et al., 2010). Una molécula clave en la regulación de la inducción de
autofagia es TOR (del inglés Target of Rapamicin), cuando TOR se encuentra activado
(fosforilado) se suprime la autofagia, en cambio, la regulación negativa de TOR promueve la
autofagia (Alers et al., 2012). La autofagia se induce por la activación de un complejo regulador
(que contiene a beclin-1 y ATG14 entre otras proteínas), el cual induce el reclutamiento de la
proteína de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 (LC3) al autofagosoma naciente
(fagoforo) (He y Klionsky, 2009), este es expandido como consecuencia a la acción de LC3,
producto de dos sistemas de conjugación de proteínas. El primer sistema facilita la
transformación de LC3-I a su forma activa LC3-II, mediante la conjugación a
fosfatidiletanolamina (PE), lo que permite la transformación de la membrana en un sistema
cerrado de doble membrana (He y Klionsky, 2009). Finalmente, el autofagosoma se une al
compartimento endosomal o lisosomal, formando el autolisosoma, donde ocurre la degradación
total de los organelos y macromoléculas por parte de un pool de enzimas proteolíticas (Puleston
y Simon, 2014; Kuballa et al., 2012). Otra molécula fundamental en el proceso de autofagia es
Bnip3 (BCL2/adenovirus E1a 19-kDa protein-interacting protein 3), la cual está directamente
relacionada con la activación de la autofagia dirigida, en donde ciertos organelos en particular
son degradados. Un ejemplo de ello es la mitofagia, proceso por el cual mitocondrias dañadas son
15
marcadas para su degradación, lo que resulta en el reclutamiento de proteínas adaptadoras de
autofagia como SQSTM1/p62, y donde Bnip3 compite con Beclin 1 para unirse a Bcl-2 y así
liberar a Beclin 1 para participar en la mitofagia (Tracy et al., 2007).
Recientemente, en levaduras se demostró la participación de la autofagia en el proceso de
secreción de proteínas sin péptido señal, dando lugar a la hipótesis de la existencia de una
“autofagia secretora” (Zhang y Schekman, 2013; Jiang et al., 2013). Éste mecanismo consistiría
en una fusión del autofagosoma con endosomas para formar un anfisoma, el que es exocitado, lo
que conlleva a la liberación extracelular de su contenido (Jiang et al., 2013; Giuliani et al.,
2011). Por otro lado, y continuando con la secreción de proteínas sin péptido señal en mamíferos,
se ha descrito la participación de la autofagia en la regulación de la producción de IL-1β (Harris
et al., 2011). La hipótesis de estos investigadores plantea que, sería la activación de los TLRs, la
que induciría el proceso de autofagia (Delgado et al., 2008; Xu et al., 2007) y durante la
formación del autofagosoma, pro-IL-1β sería secuestrado dentro de éste, siendo necesario para la
secreción de IL-1β (Piccioli y Rubartelli, 2013).
2.5. Integración Estrés – Inmunidad – Autofagia
2.5.1. Estrés-Inmunidad
Durante la respuesta al estrés la función del cortisol es movilizar y reasignar los sustratos
disponibles para energía y de esta forma hacer frente a las demandas energéticas asociadas con la
adaptación al estrés. En consecuencia, la exposición prolongada a factores de estrés aumentará la
movilización de energía a expensas de otras vías, incluyendo la función inmune y la resistencia a
enfermedades (Philip y Vijayan, 2015).
Además, la interconexión entre los sistemas endocrino e inmune está bien estudiada en los
vertebrados, incluyendo a los peces. Tal relación está basada en la actividad de moléculas del
sistema inmune, llamadas citoquinas, las cuales tienen la capacidad de regular la acción
endocrina (Tort, 2011). También, ha sido demostrado que la expresión de múltiples proteínas
SOCS (del inglés Suppressor of Cytokine Signalling) puede ser inducida por una gran cantidad
de citoquinas, incluyendo muchas que regulan el sistema inmune, y a menudo, esta expresión se
correlaciona con la inhibición de la acción de citoquinas (Alexander, 2002). Por ejemplo, se ha
16
reportado que IL-1β induce la expresión de SOCS3 (Boisclair et al., 2000), y que a su vez, IL-1β
es sensible a la inhibición por parte de SOCS3 (Karlsen et al., 2001). Más aún, recientemente se
ha demostrado que el cortisol sería capaz de modular la expresión de genes SOCS, suprimiendo
la respuesta inmune a estrés en Trucha arcoíris (O. mykiss) (Philip y Vijayan, 2015).
Castillo y colaboradores (2009), presentan evidencia que sugiere que la expresión de
citoquinas pro y antiinflamatorias en el riñón cefálico de la Dorada (Sparus aurata), se
encontraría influenciada por las hormonas relacionadas al estrés, destacando un papel importante
para el sistema endocrino en la modulación de la respuesta inmune en teleósteos. Es importante
señalar que los peces no poseen glándula adrenal, y su tejido equivalente se encuentra en el riñón
cefálico, donde el tejido interrenal, las células cromafines, las células hematopoyéticas y el tejido
inmune se encuentra entremezclado, por lo que la proximidad de las células lleva a cuestionarse
si existe una posible interacción paracrina (Castillo et al., 2009). Más aun, hay autores que
señalan particularmente a la familia de IL-1 como moléculas claves en la relación del sistema
endocrino e inmune (Korneva et al., 2001). Finalmente, hay reportes que señalan a IL-1β, como
la molécula responsable de la activación del eje HPI en Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
(Holland et al., 2002).
2.5.2. Inmunidad – Autofagia
La autofagia juega un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa, tanto en la
eliminación directa de bacterias, como en el procesamiento y presentación de antígenos (Levine
et al., 2011; Deretic, 2011). Además, en vertebrados superiores se ha descrito que las proteínas
de la autofagia funcionan tanto en la activación como en la inactivación de la señalización
inmune inespecífica (Saitoh y Akira, 2010), cuando la infección celular (u otro tipo de estresor)
es capaz de promover la maduración de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β e IL-18 (Saitoh
y Akira, 2010). Otras relaciones entre moléculas de señalización inmune y regulación de la
autofagia fueron sugeridas utilizando ARN de interferencia en el genoma humano,
identificándose varias citoquinas (CLCF1, LIF, IGF1, entre otras) (Lipinski et al., 2010) que
suprimen la actividad basal de la autofagia. Estos resultados plantean la posibilidad de que las
citoquinas puedan tener un papel más amplio en el control de la autofagia. Sin embargo, en el
caso particular de IL-1β (como se discutió en el punto 4 de ésta introducción), no ha sido posible
17
determinar cuál es su relación con el proceso de autofagia debido a la divergencia existente entre
los datos obtenidos.
En peces, particularmente, en Salmón del Atlántico (Salmo Salar), se ha sostenido que
existe una correlación entre los altos niveles de expresión de IL-1β y los altos niveles de
activación de autofagia en granulocitos de riñón cefálico, sugiriendo que estas células se habrían
especializado en la producción y secreción de IL-1β (Iliev et al.,2013).
2.5.3. Autofagia- Estrés
La relación entre el estrés y la autofagia ha sido ampliamente estudiada en mamíferos, y
se ha determinado que la autofagia puede ser inducida por una gran variedad de estímulos
estresores. Como se describió, anteriormente, un estímulo estresor es capaz de elevar los niveles
de cortisol, esta hormona se une a los receptores de glucocorticoides (GR) y/o
mineralocorticoides (MR), formando un complejo activo que transloca al núcleo y se une a sitios
de ADN específicos, activando la transcripción de genes blanco. Shimizu et al. (2011) describe la
activación de dos genes blancos, KLF-15 y REDD-1, como consecuencia del estrés. KLF-15
activa a los factores de transcripción Foxo’s, que a su vez activan la transcripción de lc3 y bnip3
(moléculas descritas anteriormente). Por otro lado, REDD-1 inhibe la actividad de Rheb, el cual
impide la fosforilación de TOR, activando el proceso de autofagia (Shimizu et al., 2011). Esta
vía de señalización ha sido descrita en músculo de mamíferos (Shimizu et al., 2011) y
recientemente en músculo de peces (Fuentes et al., 2012; Valenzuela et al., 2015), pero hasta
ahora no ha sido descrito en el riñón cefálico de un pez plano.
En resumen, según lo anteriormente descrito, sumado a la alta complejidad de la
interconexión entre los sistemas, esta tesis propone la siguiente hipótesis de trabajo: “El estrés
producido por una alta densidad poblacional genera una expresión diferencial de genes asociados
a la inmunidad y una activación de la autofagia en el riñón cefálico del lenguado fino”.
Para evaluar esta hipótesis se utilizó un modelo de estudio in vivo de estrés gatillado por
una alta densidad poblacional. En este modelo se evaluarán los niveles de transcritos de genes
relacionados con estrés, inmunidad y autofagia en el riñón cefálico del lenguado fino. También,
se evaluarán los niveles proteicos de IL-1β y moléculas asociadas a la activación del proceso de
autofagia.
18
3. HIPÓTESIS
“El estrés producido por una alta densidad poblacional genera una expresión diferencial de genes
asociados a la inmunidad y una activación de la autofagia en el riñón cefálico del lenguado fino”.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Estudiar el efecto del estrés gatillado por una alta densidad poblacional sobre el proceso
autofágico en el riñón cefálico.
4.2. Objetivos específicos
4.2.1. Demostrar que una alta densidad poblacional genera una respuesta secundaria al estrés, a
través de la medición de los niveles de transcrito de genes relacionados con la respuesta a
estrés en riñón cefálico.
4.2.2. Caracterizar el efecto del estrés por una alta densidad poblacional sobre la expresión de
genes relacionados a la respuesta inmune en riñón cefálico.
4.2.3. Analizar el efecto del estrés sobre la activación del sistema autofagia/lisosoma en el riñón
cefálico.
19
5. DISEÑO EXPERIMENTAL
En este ensayo se evaluó la respuesta temporal al estrés crónico ocasionado por una condición
de alta densidad poblacional, los individuos fueron divididos de manera aleatoria en 2 grupos,
control y experimental por períodos de 4 (grupo control 4w y experimental 4w) y 7 semanas
(grupo control 7w y experimental 7w) (Douxfils et al., 2011). Los peces fueron expuestos a una
densidad de 30 individuos por estanque en el caso de los grupos controles (6,7 Kg/m3),
correspondiente a las condiciones de cultivo utilizadas en CIMARQ, mientras que los peces
correspondientes a los grupos experimentales fueron sometidos a una densidad poblacional de 90
individuos por estanque (17,3 Kg/m3) según se ha informado para peces planos (Jia et al., 2016).
Un número de individuos, n=6 fue utilizado para muestrear los grupos controles y experimentales
(Figura 1).
20
Figura 1.- Esquema representativo del ensayo de alta densidad poblacional. Para las 4 y 7
semanas, se consideró un grupo control (4w-ctrl) y un grupo experimental (4w-exp), con una
densidad poblacional 2.5 (aprox) veces mayor al control, considerando un números de individuos
n=6 en cada grupo.
21
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Peces y cultivo
Lenguados finos sexualmente inmaduros (P. adspersus) con un peso corporal de 105 ±10
grs. y un tamaño de 19±2 cm fueron obtenidos del centro de investigación Marina de Quintay
(CIMARQ) (Valparaíso, Chile). Los individuos se mantuvieron bajo condiciones de temperatura
y fotoperíodo correspondiente a la ubicación geográfica de CIMARQ (33_130S; 71_380W). Los
peces se mantuvieron en tanques circulares (75 cm) de fibra de vidrio con una columna de agua
de 30 cm, y una renovación del agua de 15.4 L min-1 (un aclaramiento de agua por hora),
asegurando un concentración de oxígeno de 6.5±0.5 mg L-1 (monitoreado dos veces al día). Los
peces fueron alimentados a saciedad, una vez al día con pellets comercial (Skretting, Puerto
Montt, Chile), de acuerdo a los estándares de procedimientos utilizados normalmente en
condiciones de cultivo en CIMARQ.
Los peces fueron divididos aleatoriamente en 4 estanques. Dos estanques contenían 30
individuos, correspondientes a los grupos controles y dos estanques, contenían 90 individuos,
correspondientes a los grupos experimentales. Los peces de los estanques controles y
experimentales fueron muestreados a las 4 y 7 semanas (4w y 7w).
6.2. Obtención del riñón cefálico
Aleatoriamente se escogieron seis individuos por estanque (n=6) , los cuales fueron
anestesiados por baño y luego eutanasiados, utilizando un exceso de benzocaína (a una
concentración de 30 mg/ml) en tanques de 5 litros de agua salada. Posteriormente se procedió a la
extracción del riñón cefálico de todos los especímenes con bisturí estéril, almacenándolos a
-80˚C.
22
6.3. Extracción de ARN y síntesis de ADNc
Con el propósito de obtener ARN y posteriormente ADNc para evaluar mediante qPCR
las distintas moléculas involucradas en esta investigación, se realizaron extracciones de ARN
utilizando el kit comercial RNeasy Mini Kit (Qiagen, Austin, TX, EE.UU.) El ARN se cuantificó
mediante la tecnología NanoDrop con el sistema espectrofotómetro Epoch multi-volumen
(BioTek, Winooski, VT, EE.UU.). Sólo los ARNs altamente puros con una relación A260/280
entre 1,9 y 2,1, se utilizaron para la síntesis de ADNc.
La evaluación de la integridad del ARN se verifico mediante geles de
formaldehido/agarosa al 1,2%, migrado por 30 min a 70V. De manera breve, para la transcripción
reversa, el ARN se trató con el buffer DNA-wipeout con el propósito de eliminar el ADN.
Posteriormente, la síntesis de ADNc se realizó con 500 μg de ARN siguiendo las
recomendaciones del fabricante, utilizando el kit QuantiTect® Reverse Transcription (Qiagen,
Austin, TX, EE.UU.)
6.4. Diseño y evaluación de partidores
El transcriptoma del Lenguado fino fue obtenido por nuestro grupo de investigación y se
encuentra disponible en la base de datos SRA de NCBI (SRX 612429), este fue utilizado para el
diseño de partidores de las moléculas consideradas para evaluar en esta investigación.
Para realizar el qPCR de los genes de interés, se diseñaron partidores específicos para
cada gen, mediante el uso de los software Amplifx (http://ifrjr.nord.univmrs.fr/AmplifX-Home-
page) y Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Una vez generados, se validaron mediante el
software NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/com/netprimer/) para descartar estructuras
secundarias.
Con el propósito de evaluar la especificidad de los partidores, se realizó una curva de
disociación, utilizando un pool de cDNA, el cual contiene 2 μl de cada una de las muestras
extraídas que se amplificarán en una reacción única. La mezcla de la reacción correspondió a 7,5
μl de Brilliant® SYBR® Green qPCR Master Mix (Stratagene, USA), 1,5 μl de mix de partidores
(5 μM), 0,2 μl de ROX y 6 μl de pool de cDNA (dilución 1/40). La reacción se realizó en un
23
equipo Mx3000p® qPCR System (Stratagene, USA) usando el siguiente programa de
amplificación: denaturación inicial de 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de denaturación
30 s a 95°C, alineamiento 30 s a temperatura según el gen y 30 s a 72°C de extensión (la
secuencia y Tm de cada partidor se detallada en la tabla de partidores del anexo 11.1).
Luego, se realizaron curvas estándar para cada partidor, con el objetivo de determinar las
eficiencias de PCR. Para ello, se realizarón 8 diluciones seriadas utilizando un pool de cDNA. La
reacción y el programa de qPCR se ejecutaron como se mencionó anteriormente. Por último, se
determinaron los valores de Ct para cada gen estudiado, los cuales fueron procesados en el
software Q-Gene (Muller et al., 2002), utilizando como gen de referencia la proteína ribosomal
18S.
6.5. PCR en tiempo real
Los análisis de expresión se realizaron mediante qPCR, utilizando los partidores
específicos diseñados. El análisis se realizó con el equipo Mx3000p® qPCR System (Stratagene,
USA).
La expresión génica fue cuantificada en una reacción que contuvo 7,5 μL de Brilliant®
SYBR® Green qPCR Master Mix (Stratagene, USA), 1,5 μL de mix de partidores (5 μM), 0,2 μL
de ROX y 6 μL de cDNA (dilución 1/40) para cada muestra. Las reacciones se realizaron por
triplicado técnico para cada una de las muestras en trabajo. El programa de amplificación consta
de las siguientes etapas: 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a
temperatura variable según cada gen (Tabla 1) y 30 s a 72°C.
Adicionalmente, se incluyeron dos controles negativos: el primero correspondió a un
control sin templado (NTC), el cual permitió descartar la amplificación de cualquier
contaminante en las muestras, y el segundo fue un control sin transcriptasa reversa (-RT),
correspondiente a cDNA que fue sintetizado en ausencia de la enzima, lo que permitió descartar
la amplificación de DNA genómico contaminante.
6.6. Extracción y cuantificación de proteínas
24
Para evaluar los niveles proteicos en el riñón cefálico se utilizó un protocolo de Western
blot. Brevemente el tejido (0,1 g) se homogenizo a 4°C en 1 ml de tampón de lisis (100 mM Tris
HCl pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2% Nonidet P-40, 50 mM Na3VO4, 200 mM NaF,
100 mM pirofosfato de sodio y 20 μL del cóctel de inhibidor de proteasas (Calbiochem-
Novabiochem, San Diego, CA)). El sobrenadante fue recolectado y sometido a centrifugación por
30 min a 12000 x g (4°C). Las proteínas totales extraídas fueron cuantificadas usando el Pierce®
Protein Assay Kit bajo las condiciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL).
6.7. Western blot
Se separaron 50 μg de proteínas totales mediante geles de poliacrilamida al 12% en condiciones
denaturantes (SDS/PAGE), las que luego fueron electro-transferidas durante 35 minutos a 100
volt a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedoford, MA),
previamente activadas en metanol. Posteriormente, la membrana fue bloqueada utilizando una
solución 2% de agente bloqueante ECL Blocking agent (GE Healthcare, Amersham, UK) disuelto
en TBS 1X (200 mM Tris-HCl, pH 7,6 y 1,5 M NaCl), incubándola por una hora a temperatura
ambiente en agitación. A continuación, se incubó con el anticuerpo primario diluido en agente
bloqueante ECL Blocking agent (según se indica en tabla 2 del anexo 11.2) durante toda la noche
a 4ºC con agitación. Al día siguiente, se lavó tres veces con TBS 1X por 10 minutos y luego se
incubo con el anticuerpo secundario diluido en agente bloqueante ECL Blocking agent (según se
indica en la tabla 2 del anexo 11.2) conjugado a peroxidasa durante una hora a temperatura
ambiente en agitación. Después de otros tres lavados, las membranas fueron reveladas en
películas HyperfilmTM ECL (Amersham Biosciences, Amersham, UK), utilizando el kit de
quimioluminiscencia de alta sensibilidad ECL Prime Western Blotting Detection Kit (GE
Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de los resultados, las películas fueron digitalizadas y sometidas a un análisis
densitométrico mediante el software Image J (NIH, USA). Como control de carga, las
membranas utilizadas fueron sometidas a un protocolo de stripping con el fin de desplazar los
25
anticuerpos adheridos a las proteínas, para ello se incubo la membrana con una solución de
stripping (10% SDS, 0.8% Tris, pH 6.7, 0.08% β-mercaptoetanol) durante 10 min a 50 ºC con
agitación constante. Luego, se lavó tres veces con TBS 1X por 10 min y se bloqueó con una
solución 2% de agente bloqueante ECL Blocking agent disuelto en TBS1X, por 1 hora.
Posteriormente se incubó con el anticuerpo primario contra la histona H2B, diluido en el agente
bloqueante ECL Blocking agent durante toda la noche, para al siguiente día continuar con el
protocolo de western blot descrito anteriormente.
6.8. Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el software Sigmaplot versión 12.0
(Systat Software, Inc., San Jose, CA, U.S.A). Los datos fueron expresado en veces de cambio y
analizados utilizando un ANOVA de dos vías (Two-way ANOVA), post Test de Tukey.
26
7. RESULTADOS
7.1. Efecto de la alta densidad poblacional en la respuesta a estrés a través de la vía
cortisol/GR/REDD-1/KLF15.
Con el fin de evaluar el efecto de las altas densidades poblacionales sobre la
expresión de genes relacionados a la respuesta al estrés, se evaluaron los niveles de
transcritode los receptores de corticosteroides en el riñón cefálico del lenguado fino, los
cuales al unirse a su ligando, translocan al núcleo promoviendo la expresión de genes
blancos. Durante las 4 semanas del ensayo, no se observaron diferencias significativas en
los niveles de expresión de ninguno de los genes analizados. Sin embargo, se determinó
que mediante un tratamiento de alta densidad poblacional existe un aumento significativo
a las 7 semanas de la expresión de los receptores de glucocorticoides (gr1 y gr2), pero no
del receptor de mineralocorticoide (mr) (Figura 2). Específicamente, el receptor de
glucocorticoides 1 (gr1) presenta un aumento de 2 veces en los niveles de transcrito del
grupo experimental versus el grupo control (Figura 2A). Los niveles de transcrito del
receptor de glucocorticoides 2 (gr2) se observaron aumentados en 13 veces con respecto
al grupo control (Figura 2B). Por otro lado, como se mencionó anteriormente, existen
variaciones en los niveles de expresión del receptor de mineralocorticoides (mr) a las 7
semanas, pero ésta variación no resulta ser estadísticamente significativa (Figura 2C). En
cuanto a los niveles de expresión de los genes blancos de los receptores de
corticoesteroides, klf-15 y redd-1, estos se observaron aumentados a las 7 semanas de
27
manera significativa (Figura 3). Concretamente, los niveles de transcrito de klf-15 se
encuentran aumentados 3.5 veces en comparación al grupo control (Figura 3A). Los
niveles de ARN mensajero de redd-1 se observaron aumentados 5 veces en comparación
al grupo control (Figura 3B).
28
Figura 2. Expresión de los receptores de
corticoesteroides en el riñón cefálico del
Lenguado fino en confinamiento. (A, B y C)
Niveles de transcrito de gr1, gr2 y mr,
respectivamente, en el riñón cefálico del Lenguado
fino durante 4 y 7 semanas (4w y 7w). Las barras
negras representan los grupos controles y las barras
blancas corresponden a los grupos experimentales.
Gen de referencia utilizado: 18S. Análisis
estadístico ANOVA de dos vías (two-way ANOVA),
post Test de Tukey, para indicar diferencias
significativas se utilizó un nivel de probabilidad (*
P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P <
0.0001).
A B
C
** ****
gr1 gr2
mr
29
A
*
Figura 3. Expresión de genes blancos de los receptores de corticoesteroides en el riñón
cefálico del Lenguado fino en confinamiento. (A) y (B) Niveles de transcrito de klf-15 y
redd-1, respectivamente, durante 4 y 7 semanas (4w y 7w). Las barras negras representan los
grupos controles y las barras blancas corresponden a los grupos experimentales. Gen de
referencia utilizado: 18S. Análisis estadístico ANOVA de dos vías (two-way ANOVA), post
Test de Tukey, para indicar diferencias significativas se utilizó un nivel de probabilidad (* P <
0.05 , ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001).
B***
klf-15redd-1
.2. Efecto de la alta densidad poblacional en los niveles de expresión de diversas
moléculas asociadas a la inmunidad en el riñón cefálico.
Como se mencionó anteriormente el estrés puede activar o suprimir ciertas vías del
sistema inmune en peces, dependiendo de la intensidad y duración el estímulo. Por ello
se evaluaron los niveles de transcrito, mediante qPCR, de citoquinas pro-inflamatorias
(IL-1β, TNF-α e IL-8), péptidos antimicrobianos y un regulador de la expresión de las
citoquinas, como SOCS-3 en el riñón cefálico del lenguado fino.
Durante las 4 semanas, los niveles de transcrito de las citoquinas TNF-α e IL-8
presentan variaciones pero no resultan ser significativas. No obstante, existen citoquinas
que no presentan variaciones en sus niveles de expresión a las 4 semanas de tratamiento,
como IL-1β (Figura 4). De manera generalizada, las variaciones significativas en los
niveles de expresión de las citoquinas se producen a las 7 semanas de confinamiento.
Específicamente, IL-1β es el gen que presenta un mayor aumento, es decir, se expresa 6
veces más que el control a las 7 semanas (Figura 4A). En el caso de TNF-α e IL-8 se
observa un aumento significativo en sus niveles de transcrito de 5 y 4 veces,
respectivamente, en el grupo experimental (Figura 4B y 4C). En cuanto a los niveles de
expresión de SOCS-3, se determinó que no existen variaciones significativas a las 4
semanas de tratamiento. Sin embargo, durante las 7 semanas se observó un aumento
significativo en los niveles de transcrito, dado por un aumento de 60 veces en
comparación al control (Figura 4F).
Por otro lado, en la expresión de los péptidos antimicrobianos (leap-1 y leap-2) se
observaron variaciones en sus niveles de expresión a las 4 y 7 semanas del ensayo, pero
ninguna de ellas resultó ser significativas (Figura 4D y 4E).
30
En cuanto a los niveles proteicos de IL-1β en el riñón cefálico, mediante el análisis
densitométrico, fue posible determinar que existe un aumento significativo en el
contenido proteico de 2.3 veces, en comparación al grupo control (Figura 5B).
31
Figura 4. Expresión de genes relacionados a inmunidad en el riñón cefálico del Lenguado
fino en confinamiento. (A, B, C, D, E y F) Niveles de transcrito de il-1β, tnf-α, il-8, hep-1
(leap-1), leap-2 y socs-3 respectivamente, durante 4 y 7 semanas (4w y 7w). Las barras negras
representan los grupos controles y las barras blancas corresponden a los grupos experimentales.
Gen de referencia utilizado: 18S. Análisis estadístico ANOVA de dos vías (two-way ANOVA),
post Test de Tukey, para indicar diferencias significativas se utilizó un nivel de probabilidad (*
P < 0.05 , ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001).
A B
C D
E F
** **
*
**
il-1β tnf-α
il-8 hep-1
leap-2 socs-3
32
Figura 5. Contenido proteico de IL-1β en el riñón cefálico del Lenguado fino a las
7 semanas de confinamiento. (A) Imagen representativa del contenido proteico de IL-
1β, donde se utilizó como control de carga H2B. (B) Análisis densitométrico del
contenido proteico de IL-1β a las 7 semanas de tratamiento. La barra negra corresponde
al grupo control y la barra blanca corresponde al grupo experimental. Análisis
estadístico: t de Student.
A B
*
17 kDa
14 kDa
.3. La alta densidad poblacional activa el proceso de autofagia en el riñón cefálico del
lenguado fino.
Para abordar éste objetivo se evaluaron, mediante qPCR, los genes relacionados al
complejo activador del proceso de autofagia, beclin-1, atg14, bnip3 y el marcador
clásico de autofagia, lc3, en el riñón cefálico del lenguado fino. Durante las 4 semanas
se observaron variaciones en los niveles de transcrito, de los genes anteriormente
mencionados, pero éstas no fueron significativas (Figura 8). A las 7 semanas del ensayo,
los niveles de transcrito de beclin-1, bnip-3 y lc3 se encontraban aumentados
significativamente (Figura 6). Más específicamente, los niveles de expresión se
observaron aumentados 4.5 veces para beclin-1 (Figura 6A), 20 veces para bnip-3
(Figura 6B) y 8 veces para lc3 (Figura 6D), todas en comparación al grupo control.
Por otro lado, los niveles de transcrito de atg14 se observaron aumentados a las 7
semanas del ensayo, pero no de manera significativa (Figura 6C).
Se determinó que los niveles proteicos de LC3-II se encontraban aumentados, de
manera significativa, a las 7 semanas de confinamiento (Figura 7A, 7C). En cuanto a
p62 (STQTM1), no se observaron variaciones en los niveles proteicos (Figura 7B, 7D).
33
34
Figura 6. Expresión de genes asociados a la autofagia en el riñón cefálico del Lenguado
fino en confinamiento. (A, B, C y D) Niveles de transcrito de beclin-1, bnip3, atg14 y lc3,
respectivamente, en el durante 4 y 7 semanas (4w y 7w). Las barras negras representan los
grupos controles y las barras blancas corresponden a los grupos experimentales. Gen de
referencia utilizado: 18S. Análisis estadístico ANOVA de dos vías (two-way ANOVA), post
Test de Tukey ,para indicar diferencias significativas se utilizó un nivel de probabilidad (* P <
0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001).
A B
C D
********
***
beclin15
bnip3
atg-14 lc3
35
CTRL EXP
p62
H2B
CTRL EXP
LC3-I
LC3-II
H2B
A B
C
Figura 7. Contenido proteico de moléculas relacionadas con el proceso de activación de la
autofagia en el riñón cefálico del Lenguado fino a las 7 semanas de confinamiento. (A)
Imagen representativa del contenido proteico de LC3 I y LC3 II, donde se utilizó como control de
carga H2B. (B) Imagen representativa del contenido proteico de p62 (SQSTM1), donde se utilizó
como control de carga H2B. (C) Análisis densitométrico del contenido proteico de LC3 II/ LC3 I
a las 7 semanas de tratamiento. La barra negra corresponde al grupo control y la barra blanca
corresponde al grupo experimental. (D) Análisis densitométrico del contenido proteico de p62 a
las 7 semanas de tratamiento. La barra negra corresponde al grupo control y la barra blanca
corresponde al grupo experimental. Análisis estadístico: t de Student.
*
D
16 kDa
14 kDa
47 kDa
14 kDa
14 kDa
8. DISCUSIÓN
Para enfrentar las altas densidades poblacionales, la respuesta a estrés se caracteriza por
una serie de cambios endocrinos y metabólicos. Evidencia de estos cambios son el aumento de
varias veces en el cortisol plasmático (respuesta primaria), relacionado con la demanda energética
(glucosa) producida por el estrés (Hanson y Reshef, 1997). En teleósteos, el cortisol es el
principal glucocorticoide circulante liberado del tejido interrenal en el riñón cefálico, y se
encuentra elevado, luego de la activación del eje HPI durante períodos de estrés (Aluru y
Vijayan, 2009). Previamente nuestro grupo de investigación evaluó los niveles de cortisol
plasmático, donde se determinó que solamente a las 4 semanas de tratamiento existía un aumento
significativo en sus niveles (Anexo 11.3), demostrando que la alta densidad poblacional actúa
como un factor de estrés en el lenguado fino. Sin embargo, a las 7 semanas, los niveles de cortisol
en el grupo experimental no variaron significativamente con respecto al control. Lo descrito
anteriormente, podría justificarse por el fenómeno de desensibilización o habituación,
desarrollado en organismos sometidos a períodos de estrés crónico (Cyr y Romero, 2009).
Además, para evaluar los efectos de las condiciones de estrés ambiental en los peces, se
ha sugerido el análisis de una serie de biomarcadores moleculares (respuesta secundaria), ya que
en teleósteos, se sabe que los glucocorticoides como el cortisol, son liberados al sistema
circulatorio, ingresan a la célula y se unen a los receptores citosólicos de glucocorticoides, los
cuales actúan como factores de transcripción, controlando y regulando su expresión génica
(Terova et al., 2005). Es por ello, que para evaluar la respuesta secundaria al estrés, generada por
la alta densidad poblacional, se midieron los niveles de transcrito de los receptores de
glucocorticoides (GR1 y GR2) y receptor de mineralocorticoides (MR), los cuales no presentaron
36
variaciones significativas a las 4 semanas, mientras que a las 7 semanas se observan aumentados,
sólo GR1 y GR2 de manera significativa. En carpa se ha demostrado que GR2 es
significativamente más sensible a la unión de cortisol que GR1 y MR (Stolte et al., 2008a). Más
aún se ha reportado, en carpa que los niveles de expresión de MR son bajos en tejidos inmunes,
como el riñón cefálico (Stolte et al., 2008b). Por lo que se podría sugerir que los efectos
observados durante este ensayo, se generan principalmente por la actividad de la vía cortisol/GR.
En músculo de mamíferos se han identificado dos genes blanco directos de GR, REDD-1
y KLF-15, capaces de inducir el proceso de autofagia (Shimizu et al., 2011). Hasta ahora, la
expresión de estos genes no ha sido descrita en un órgano inmunológico como el riñón cefálico,
donde se observaron variaciones en los niveles de expresión significativos a las 7 semanas del
ensayo para ambos genes, lo que sugiere la activación de la autofagia en este modelo. Este
proceso ha sido asociado a diversos procesos biológicos, como la degradación de proteínas, sin
embargo, en nuestro modelo la acción de la autofagia podría estar relacionada con la secreción de
moléculas inmunes como las citoquinas.
En peces, uno de los procesos más afectados por el estrés es la inmunidad,
particularmente en Dorada, se ha concluido que el aumento en la expresión de GR podría deberse
al aumento de la liberación de cortisol como resultado de la expresión de citoquinas pro-
inflamatorias, capaces de estimular el eje HPI (Acerete et al., 2007). Además, la relación entre
estrés e inmunosupresión ha sido sugerida en peces (Bonga, 1997;Saeji et al., 2003), ya que
muchos estudios han demostrado que un estrés crónico resulta en una inmunosupresión
significativa, asociada con altos niveles de cortisol plasmático (Tort, 2011; Sunyer y Tort, 1995;
Tort et al., 1998; Montero et al., 1999; MacKenzie et al., 2006). Asimismo, la alta densidad de
población como factor de estrés, resulta en la alteración de moléculas relacionadas con
inmunidad como proteínas, enzimas o el gen (Salas-Leiton et al., 2010; Vargas-Chacoff et al.,
2014; Ni et al., 2014), todo lo anterior sugiere que existe una compleja relación entre el estrés y
la inmunidad.
IL-1β y TNF-α son importantes citoquinas pro-inflamatorias involucradas en la respuesta
inmune en peces, ya que se encuentran involucradas en procesos inflamatorios luego de alguna
lesión o infección (Sigh et al., 2004). Los resultados de los efectos de las altas densidades
poblacionales por largos períodos de tiempo, son diversos en cuanto a la expresión de estas
citoquinas en peces. Durante el presente ensayo, no se observaron variaciones significativas en la
37
expresión de citoquinas pro-inflamatorias a las 4 semanas de ensayo. Sin embargo, a las 7
semanas de confinamiento se observó una sobre-expresión, significativa, de las citoquinas pro-
inflamatorias (il-1β y tnf-α). Más aún, los niveles proteicos de IL-1β, también, se observaron
aumentados de manera significativa a las 7 semanas del ensayo. Contrario a lo observado en esta
investigación, en Trucha arcoíris (O.mykiss) se demostró que el estrés gatillado por una condición
de sobrepoblación a largo plazo suprime la expresión de IL-1β y TNF-α (Yarahmadi et al.,
2015), más aún se ha sugerido que la reducción en la expresión de estas citoquinas podría estar
relacionada con un elevado nivel de cortisol, después de un estrés crónico en altas densidades
poblacionales (Castillo et al., 2009). En Rodoballo (S. maximus), también perteneciente al orden
de los pleuronectiformes, se demostró que la expresión de IL-1β y TNF-α disminuyen, en
ensayos de altas densidades durante 120 días (Jia et al., 2016). Sin embargo, resultados similares
a los nuestros en riñón cefálico, han sido descritos en la sangre del bacalao del Atlántico
(G.morhua), donde la sobrepoblación aumenta la expresión del gen de IL-1β luego de 72 horas
(Caipang et al., 2008). En humanos, por otro lado, se ha descrito que el estrés puede suprimir las
funciones inmunes bajo algunas condiciones mientras que pueden mejorarlas en otras (Dhabar,
2009). Más aún, sostienen que el estrés crónico puede desregular la respuesta inmune, induciendo
un aumento en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias (Glaser y Kiecolt-Glaser, 2005;
Chrousos y Kino, 2007) y desarrollando enfermedades autoinmunes (Dhabar, 2009).
Otro grupo importante de moléculas inmunes que son afectadas por el estrés son las
quimioquinas, estas moléculas pertenecen a una superfamilia, donde podemos encontrar a IL-8,
sus niveles de expresión pueden ser influenciados por infecciones, inmunoestimulantes y
secreción de otras citoquinas como IL-1 y TNF-α (Secombes et al., 2001; Nootash et al., 2013).
En el presente trabajo, los niveles de transcrito de IL-8 se observaron aumentados de manera
significativa a las 7 semanas del ensayo. Contrariamente, en trucha arcoíris (O.mykiss) se
demostró que las altas densidades poblacionales disminuyen los niveles de expresión de IL-8, IL-
1β y TNF-α a los 30 días de ensayo (Yarahmadi et al., 2016). Más aún, se ha descrito que la
estimulación de la expresión de IL-8 depende, en la mayoría de las células, de IL-1β y TNF-α
(Roebuck, 1999), por lo que en nuestro modelo la sobre-expresión observada de IL-8 podría
estar asociada con altos niveles de expresión de IL-1β y TNF-α.
Debido a la sobre-expresión de las citoquinas descrita en ésta investigación, se podría
suponer que existe una activación de la respuesta inmune por parte de algún patógeno, por lo que
38
se evaluó la expresión de los péptidos antimicrobianos, como parte de las respuesta efectora del
sistema inmune innato (Krause et al., 2000). Sin embargo, los niveles de expresión de Hepcidina
(también denominada Leap-1) y Leap-2 no presentaron variaciones significativas durante las 4 y
7 semanas del ensayo, siendo concordante con los resultados demostrados en Medaka, donde un
desafío bacteriano es capaz de aumentar la expresión de péptidos antimicrobianos, como LEAP-1
y LEAP-2, en varios tejidos (Bo et al., 2011). Es por lo anterior, que es posible sugerir que los
resultados obtenidos son efecto del estrés provocado por la alta densidad poblacional y no de
algún proceso infeccioso.
En vertebrados, la expresión de las citoquinas se encuentra mediada por proteínas,
llamadas supresores de la señalización de las citoquinas, SOCS (del inglés: Suppressors of
cytokine signaling) (Alexander y Hilton, 2004). Estudios previos, en mamíferos, han
demostrado que la expresión de SOCS-3 se mantiene en niveles bajos en células sin estimular,
pero aumenta rápidamente después de la estimulación de las citoquinas o desafío bacteriano
(Bode et al., 1999; Dalpke et al., 2003; Mostecki et al., 2005). En nuestro ensayo, a las 7
semanas, fue posible observar un aumento de 60 veces en la expresión de SOCS-3 en el grupo
experimental con respecto al grupo control. Además, se sabe que SOCS-3 es regulado por IL-1β
y TNF-α, entre otros (Palmer y Restifo, 2009) y, SOCS-3 es conocido por regular negativamente
la expresión de citoquinas pro-inflamatorias (Yasukawa et al., 2003), generando un sistema de
retroalimentación negativa entre ellas. En trucha, se determinó que IL-1β aumenta la expresión
de SOCS-3, en una línea celular fibroide (RTG-2), además, se sugiere que la expresión de los
genes SOCS y su modulación serían célula-citoquina específico en peces y en mamíferos (Wang
y Secombes, 2008).
En resumen, se podría sugerir que la activación del eje HPI y la disminución de los
niveles de cortisol plasmático, luego de largos períodos de estrés por sobrepoblación, generan un
aumento en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1β, y otros componentes del
sistema inmune, como SOCS-3, debido a su relación de retroalimentación.
Por otra parte, se ha descrito que en la inmunidad, específicamente en la eliminación de
bacterias, procesamiento y presentación antigénica jugaría un rol importante el proceso de
autofagia (Levine et al., 2011; Deretic, 2011). Adicionalmente, se ha descrito en mamíferos, que
el estrés es capaz de activar el proceso de autofagia, ya que éste proceso permitiría optimizar los
suministros energéticos (Jung et al., 2010). En miotubos de rata tratadas con corticoesteorides
39
sintéticos, la estimulación de la autofagia depende del procesamiento de LC3 y la actividad de
GR (Troncoso et al., 2014). En nuestro ensayo, para monitorear el proceso de autofagia, se
evaluaron los niveles de expresión de moléculas relacionadas al proceso, en donde se determinó
que existía un aumento significativo, en los niveles de expresión de lc3, bnip3 y beclin-1.
Algunos autores sostienen que el único marcador confiable de la activación del proceso de
autofagia son los niveles proteicos de la conversión de LC3-I a LC3-II y p62, ya que cuando sus
niveles proteicos disminuyen se puede afirmar que la autofagia se encuentra activada (en
conjunto con un aumento en los niveles proteicos de LC3-II) (Klionsky et al., 2016).En nuestro
caso, los niveles proteicos de la conversión de LC3-I a LC3-II se observó aumentado de manera
significativa a las 7 semanas. En cambio, p62 no presentó variaciones a las 7 semanas, sin
embargo, esto no es sorprendente, ya que se ha descrito que la variación de p62 depende del tipo
celular (Klionsky et al., 2016). Previamente, nuestro grupo de investigación, demostró que en el
músculo esquelético las altas densidades poblacionales a las 7 semanas generan la activación de
la autofagia con resultados similares a los descritos anteriormente (Anexo 3).
En base, a los antecedentes mencionados anteriormente, es que posible sugerir que a las 7
semanas del ensayo, existe una activación del proceso de autofagia.
Además, en vertebrados superiores se ha descrito que la autofagia sería capaz de
promover la maduración de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β (Saitoh y Akira, 2010).
Más aún, hay autores que sostienen que la autofagia podría desempeñar un papel inhibitorio, de
acuerdo con esto, la activación de la autofagia reduciría la producción de IL-1β, probablemente a
través de la limitación de la activación del inflammasoma, tal como ocurre en mamíferos (Shi et
al., 2012; Nakahira et al., 2011). Por lo que, en este ensayo podría estar funcionando como un
mecanismo homeostático, para disminuir los altos niveles de expresión de las citoquinas,
específicamente IL-1β.
En peces, particularmente, en el salmón del atlántico (Salmo Salar), se ha sostenido que
existe una correlación entre los altos niveles de expresión de IL-1β y los altos niveles de
activación de autofagia en granulocitos de riñón cefálico, sugiriendo que estas células se habrían
especializado en la producción y secreción de IL-1β (Iliev et al., 2013).
En mamíferos, hay autores que sostienen que al someter macrófagos a períodos de
inanición, se activaría la autofagia y aumentaría la producción de IL-1β (Dupont et al., 2011).
Por otro lado, hay publicaciones que señalan que cuando las células son estimuladas con LPS, se
40
induce la autofagia, pero disminuye la secreción de IL-1β (Harris et al., 2011). También, hay
autores que afirman que sería IL-1β la que induciría el proceso de autofagia mediante un
desequilibrio en el calcio homeostático (Xu et al., 2014). Debido a lo descrito, anteriormente, no
ha sido posible determinar con certeza si la autofagia promueve o inhibe la secreción de IL-1β.
Más aún, debido a que IL-1β es una molécula sin péptido señal, se ha hipotetizado que el proceso
de autofagia, sería el encargado de su producción en mamíferos (Harris et al., 2011). En base a
estos antecedentes y los resultados obtenidos en esta investigación, se puede sugerir que en el
lenguado fino sometido a altas densidades poblacionales, el proceso autofágico podría estar
regulando de manera negativa la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, con el fin de
mantener la homeostasis y así evitar una inflamación perjudicial para el organismo.
41
9. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
La respuesta al estrés gatillado por una condición de alta densidad poblacional, se
promueve mediante la vía de cortisol/GR en el riñón cefálico del lenguado fino.
El estrés generado por altas densidades poblacionales modula positivamente la expresión
de citoquinas pro-inflamatorias en el riñón cefálico del lenguado fino. Este aumento
exacerbado en la inmunidad, puede ser nocivo para el organismo. Por lo anterior, sería
trascendental en otros trabajos, determinar cuál es el factor intrínseco del lenguado fino
capaz de generar éste tipo de respuestas en el riñón cefálico.
La alta densidad poblacional promueve la expresión de SOCS-3, sugiriendo una
inhibición de la acción biológica de las citoquinas sobre-expresadas en nuestro modelo.
Se describe por primera vez en el riñón cefálico que el estrés generado por la alta
densidad poblacional, activa el proceso de autofagia a través de la vía de KLF-15/REDD-
1 en el lenguado fino.
La autofagia estaría asociada a la regulación negativa de la secreción de citoquinas pro-
inflamatorias, con el fin de mantener la homeostasis en el riñón cefálico del lenguado
fino. Además, se sugieren ensayos funcionales posteriores, para determinar cuál es la
relación entre IL-1β y la autofagia en el lenguado fino, ya que esta información sería
42
fundamental a niveles comerciales, para asegurar condiciones de replicabilidad durante la
acuicultura intensiva.
Se demostró que durante una condición de alta densidad poblacional, se desarrolla una
interacción entre el estrés, sistema inmune y autofagia en el riñón cefálico del lenguado
fino, por lo que las moléculas evaluadas en este trabajo, podrían ser utilizados como
marcadores moleculares, de manera de optimizar las condiciones de cultivo y disminuir
los factores de estrés social, como la alta densidad poblacional.
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11. ANEXOS
11.1. Tabla 1. Partidores utilizados para qPCR durante el desarrollo de esta tesis.
Gen Partidor
Secuencia (5’-3’) Tamaño(bp)
Tm(˚C)
Eficiencia(%)
N˚ deacceso
gr1 Forward ACCTGCCTTTGCCCAACCTT 130 64 97.4 SRX612429
Reverse CGACCGCTGTTCCCATCCA
gr2 Forward CCAGAGTTACTGCCAAATGA 162 59 99.5 SRX612429
Reverse GACACTGACTTCGGTTCCTT
mr Forward TACAGAACGACACCAACAGCC 96 60 100.4 SRX612429
Reverse CCCCGTCAACCATCTCTACTT
klf-15 Forward GGCGAAAGGTTCAAGGACA 246 60 100.2 SRX612429
Reverse ACACTGGAGGCACTGGTATC
redd-1
Forward GACTCAGGCTCCGACATCTCC 126 63 99.8 SR612429
Reverse TTTGGCTTCTCGCAGGCTT
il-1β Forward AGGGAGGCAGCAACAA 215 58 103.6 KJ605419.1
Reverse AATCGCACCATCTCACTTTC
il-8 Forward CGAGGGTTCAGACAGACCTT 194 60 103.1 SRX612429
Reverse TTTGCTCTCAGTGACGGGAT
hep-1 Forward TGATGTCAATGGAATCGTGGA 151 60 102.4 SRX612429
65
Reverse TGAGGTTGTTGCGGGAAT
leap-2
Forward GTACTTCGCAGGCTCGG 177 60 100.6 SRX612429
Reverse TCAGACTCAAGCGTCCACA
socs-3
Forward GTGGGGAGCAGACTGAATG 156 60 100.2 SRX612429
Reverse CATCACCACAATCCAGC
atg14 Forward CTGTGTGGGGAAGATGTGTG 235 60 101.4 SRX612429
Reverse CGAGGAGGTGAAGAGCGA
lc3 Forward CAGAGAGTAGAAGATGTCCG 198 60 102 SRX612429
Reverse GAAGAAAGCCTGGTTTGAGT
beclin-1 Forward TCTGGCATTCGTTCTCTGTG 174 60 104.6 SRX612429
Reverse ATCTGATGGAGGCACAATGG
bnip-3
Forward ACCTGATGAAGAAAAATGCTGAT 130 57 101 SRX612429
Reverse ATGACGCTGGTGTTCCTGA
18S Forward GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT 191 60 99.2 SRX612429
Reverse ATCCCGAGGTCCAACTACG
11.2. Tabla 2. Anticu 1ºq1erpos utilizados para Western blot durante el desarrollo de esta tesis.
Anticuerpo Dilución Marca N˚ decatálogo
IL-1β 1:1000 Producción local
66
LC3 A/B 1:1000 Cell Signaling 12741
SQSTM1(p62) 1:1000 Abcam 1790
H2B 1:3000 Abcam 91526
Anti-rabbit IgG,HRP-linked
1:20001:5000
Cell Signaling 7074
11.3. Cortisol plasmático
67
11.4.Activación de la autofagia a las 7 semanas de confinamiento en el músculo esquelético
68
Niveles plasmáticos de cortisol durante una condición de alta densidad poblacional en el lenguado
fino. Las barra blancas representan los grupos control. Las barras negras representan a los grupos
experimentales. Para indicar diferencias significativas se utilizó un nivel de probabilidad (*P < 0.05,
**P < 0.01,***P < 0.001). 4W=4 semanas; 7W= 7 semanas
69
BA
Activación del proceso autofágico bajo condiciones de confinamiento en el músculo esquelético
del lenguado fino. A) Imagen representativa de los niveles proteicos de LC3-I/II y SQSMT1. Se
utilizó como control de carga H2B. B) Contenido proteico de LC3 y SQSTM1. Las barras blancas y
negras representan los grupos control y experimental, respectivamente. Para indicar diferencias
significativas se utilizó un nivel de probabilidad (*P < 0.05). 4W= 4 semanas; 7W= 7 semanas.