unidad 5 tecnicas de análisis y manipulacion del adn adn
DESCRIPTION
ÂTRANSCRIPT
5. Técnicas de Análisis y Manipulación
de Ácidos Nucleicos.
OBTENCION Y PREPARACIÓN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS.
La muestra celular se obtiene y prepara a partir de:
Órganos
tejidos
fluidos biológicos
En función del objetivo perseguido:
Clínico
Identificación de individuos
Tipo de célula: Somática
Germinal
Tipo de genoma:
Nuclear
Mitocondrial
Tipo de estudio a realizar:
Secuencia del genoma
Genes
Productos génicos
En cualquiera de los caso, deben emplearse condiciones
que garanticen Ia calidad de Ia muestra frente a las
diversas variables que afectan a Ia fase preanalitica
Recolección
Anticoagulante empleado
Manipulaciones para Ia conservación
Transporte, etc.
En general, la preparación preliminar se hace rápidamente
tras la obtención (dentro de 1 hora, como máximo 24 h), o la
muestra se mantiene congelada hasta que llega al
laboratorio.
Muestras de tejidos sólidos.
Normalmente se obtienen mediante biopsia (método
invasivo de recogida, bajo condiciones quirúrgicas, de
células o porciones de tejido de un organismo vivo, con
fines diagnósticos).
Se liberan de restos de sangre, grasa o tejidos
acompañantes por lavados con disolución salina
fisiológica fría y se envían al laboratorio, según los
casos, refrigeradas o congeladas, protegidas con hielo,
nieve carbónica o nitrógeno líquido.
Muestras de suspensiones celulares.
Células embrionarias (diagnóstico pre-implantación).
EI óvulo fertilizado origina en el útero por sucesivas
mitosis estructuras de 2, 4 y 8 células totipotentes (8
blastómeros, que forman la mérula) y luego de 16, 32 y
64 células pluripotentes; esta última estructura se llama
blastocisto o blastodermo, y a partir de ella se inicia el
desarrollo.
Para observar si el embrión es portador de un trastorno
genético se puede obtener DNA extrayendo 1 ó 2
blastómeros (que no afecta al desarrollo de las otras
células de la mórula).
Líquido o fluido amniótico
A partir de la primera semana de gestación, el embrión
queda protegido al estar inmerso en el líquido amniótico,
contenido dentro de una membrana llamada saco amniótico
o amnios. La composición del líquido amniótico, cuyo
volumen llega hasta 1.100 ml a término, depende de un
equilibrio dinámico de intercambios con el feto y la madre, y
contiene células epiteliales que aportan unos 65 ng DNA/ml.
La obtención de una muestra, mediante punción abdominal
a través de la pared del útero, se denomina amniocentesis.
Células de tejidos o sangre fetales
Como alternativa al líquido amniótico se utilizan
muestras de vellosidades coriónicas, tejido fetal
procedente del corion (membrana más externa
del embrión, que contacta con la placenta). Estas
constituyen la mejor fuente de DNA fetal.
Células de sangre o médula ósea adultas
Las muestras de sangre periférica son las más
empleadas, comúnmente de sangre venosa
(unos 40 ug DNA/ml) recogida sobre
anticoagulante.
Se utilizan también manchas de sangre, que se
obtienen de sangre fisiológica (talón, dedo...)
secada sobre un papel o cartón, o bien de
origen accidental (prendas, vehículos,
utensilios...). La mancha se raspa y extrae por
lavado con disolución salina.
Muestras bucales
Los raspados y enjuagues bucales, obtenidos por
métodos no invasivos, con cepillo suave o algodón y
disolución salina, contienen células epiteliales de
descamación con suficiente DNA genómico para su
detección, previa amplificación por PCR.
La saliva es de uso creciente por su facilidad de obtención
(toma directa o presencia sobre la piel, sellos, colilla de
cigarrillo, etc.)
Semen
Contiene millones de espermatozoides (5-7% del
volumen total, con 1,3 pg DNA por célula)
formados en los testículos, en suspensión en una
fracción liquida de secreciones de las vesículas
seminales (50% en volumen), la próstata (20% en
volumen), las glándulas bulborrectales y el
epidídimo.
Se recoge de varias maneras:
a) En preservativo, para estudios de funcionamiento del
tracto genital masculino, marcadores de fertilidad, etc.
b) Por aspiración directa de la vagina, para investigación
criminal por agresión sexual
c) Por lavado salino de manchas secas en ropa, piel,
pelo, etc.
Las muestras frescas se deben analizar antes de 1h de
su recogida, manteniéndolas a temperatura corporal
durante su transporte.
Los espermatozoides se pueden separar del resto de
células (que incluyen las de la víctima, en casos de
asalto sexual) mediante lisis diferencial de éstas con
SDS (dodecilsulfato sódico) y proteinasa K.
Células en cultivo
Las células aisladas o procedentes de tejidos u
órganos disgregados se pueden cultivar en
medios especiales.
El cultivo celular constituye per se un área de
estudio independiente, con requerimientos
especializados en cuanto a equipo,
procedimientos, sustratos, nutrientes y factores
de crecimiento, etc.
Muestras celulares de líquidos biológicos
extravasculares.
Líquido cefalorraquídeo
Es un fluido resultante de Ia ultrafiltración del
plasma (de ahí su analogía en composición) y
que recoge los productos de desecho del
metabolismo cerebral. Se encuentra en dos
compartimentos que recubren el cerebro y la
medula espinal, comunicados entre sí: el
sistema ventricular (30 ml) y el espacio
subaracnoideo.
Líquidos o derrames serosos
Se localizan en las cavidades del cuerpo que
rodean los órganos, delimitadas por dos
membranas, la parietal (externa) y Ia visceral
(interna, superficie del órgano).
Liquido articular o sinovial
Es un ultrafiltrado del plasma, viscoso, con un
alto contenido en proteínas y ácido hialurónico,
localizado en la cavidad articular para conferir un
carácter lubricante frente a la fricción propia de
las articulaciones durante el movimiento.
Muestras biológicas menos habituales
Pueden contener células y, por tanto, DNA, una serie de
muestras de interés en casos concretos:
Humor acuoso (cámara anterior del ojo)
Humor vítreo (detrás del iris)
Lagrimas
Endolinfa (tubo espiral del oído interno)
Perilinfa (canales del equilibrio)
Moco cervical
Líquidos folicular, oviductal y vaginal
Heces
Secreciones nasales
Uñas, etc.
DISOCIACION DE LA MUESTRA TISULAR
En los tejidos, las células se encuentran
atrapadas en una organización tridimensional,
con interacciones o adhesiones tanto entre ellas
como con la matriz extracelular (gel hidratado
formado por fibras proteicas, como colágeno, y
cadenas glucídicas complejas).
El mejor rendimiento en cuanto a disociación de
células pueden señalarse tres estrategias:
Fragmentación mecánica: Mediante corte, troceado o triturado de la
muestra.
Disgregación química: La rotura de la matriz extracelular y de las uniones
intercelulares se suele realizar por homogeneización isotónica o por
sonicación (exposición a ultrasonidos, ondas sonoras o acústicas no
percibidas por el oído humano por poseer una frecuencia superior a 20
kHz), generalmente en presencia de detergentes (iónicos, como el
dodecilsulfato sódico o SDS, o no iónicos, como Tween-20 y Triton X-100).
La eliminación de cationes divalentes, en especial el Ca2+ (con agentes
quelantes como EDTA).
Digestión enzimática: Las proteínas de la matriz se digieren con proteasas
como colagenasa, proteinasa K, pepsina o tripsina. Dependiendo del tipo de
muestra, esta digestión puede requerir largos tiempos de incubación (por
ejemplo, células en cultivo o raíces de pelo).
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR
SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES
En general, dada su complejidad macromolecular, los ácidos
nucleicos son difíciles de separar de los componentes de
membrana, proteína residual o añadida (tales como las
enzimas de restricción) y otras moléculas solubles (por
ejemplo, polisacáridos),
Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus
características. De ahí que sean muchos los métodos
suaves elaborados para eliminar la impureza de las
preparaciones, todos ellos basados en las propiedades
físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de
proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como
la proteinasa K.
Los métodos drásticos alteran sus estructuras y sus
características. De ahí que sean muchos los métodos
suaves elaborados para eliminar la impureza de las
preparaciones, todos ellos basados en las propiedades
físico-químicas del ácido nucleico. Para la eliminación de
proteínas asociadas se utilizan enzimas proteolíticas, como
la proteinasa K.
Extracción del DNA
El protocolo básico consiste en el tratamiento del
homogenado con disolventes orgánicos (fenol,
cloroformo o ambos).
ANALISIS DIRECTOS DEL DNA
Electroforesis
Esta técnica se basa en la capacidad de las
macromoléculas cargadas para desplazarse en un
campo eléctrico, con velocidad proporcional a su
carga e inversamente proporcional a su tamaño.
Las moléculas de DNA poseen, al pH alcalino
habitual, una carga negativa uniforme por unidad de
masa, lo que hace que su movilidad hacia el ánodo
(+) solo venga determinada por el tamaño de la
molécula (número de pares de bases, si es lineal).
Detección del DNA tras su separación (“revelado”)
Una vez separadas, las moléculas de DNA se
visualizan normalmente por la fluorescencia de
distintos compuestos que se unen a ellas.
Aunque el más utilizado es el bromuro de etidio,
va siendo sustituido por otros fluorocromos con
mayor poder de detección o menor toxicidad.
Tecnología del DNA recombinante
(Clonación celular)
El método clásico de clonación de ácidos nucleicos es
el que aprovecha la capacidad de las células para
replicar el DNA.
Surge gracias a la aparición de una serie de técnicas
que permiten el aislamiento del DNA y al
descubrimiento en los años 70 de las enzimas de
restricción, que hace posible en el laboratorio clonar el
DNA e incorporar los fragmentos a vectores, que a su
vez se introducen en células anfitrionas, donde tiene
lugar su replicación.
ENZIMAS DE RESTRICCION
Aunque estas enzimas desempeñan una función
propia en las células procariotas en las que se
descubrieron, son particularmente importantes por su
empleo experimental en varias áreas de la Biología
Molecular, de interés tanto básico como aplicado al
diagnóstico clínico.
En especial, se utilizan en el proceso de la clonación
molecular del DNA, Además, tienen aplicación en otras
técnicas, como la secuenciación del genoma y el
estudio de los polimorfismos.
Se inicia el estudio de estas enzimas con un breve
recordatorio de las nucleasas en general.
Nucleasas
Se denomina de forma genérica nucleasa a cualquier
enzima con capacidad de escindir los enlaces
fosfodiéster de Ia cadena polinucleotidica de los ácidos
nucleicos; son, por tanto, fosfodiesterasas. Su
especificidad puede analizarse con respecto a tres
criterios:
1. Escisión en posiciones internas o terminales en la
estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas,
respectivamente):
1. Escisión en posiciones internas o terminales en la
estructura primaria (endonucleasas y exonucleasas,
respectivamente):
2. Actuación sobre uno de los dos tipos de enlace
fosfoéster:
3. Reconocimiento de nucleósidos, bien por Ia pentosa o
bien por Ia base nitrogenada (solo en algunas nucleasas)
desoxirribonucleasas o DNasas, que actúan solo sobre
DNA; ribonucleasas o RNasas, que hidrolizan RNA
finalmente, algunas nucleasas distinguen entre
nucleósidos purinicos y pirimidinicos:
Enzimas de restricción.
Las enzimas de restricción se Ilaman también nucleasas
de restricción, endonucleasas de restricción y, en
ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas.
Se nombran con tres letras tomadas del género
y especie de la bacteria de la que se aislaron
originalmente, seguidas a veces por una letra
más, que identifica el serotipo (variante
antigénica de la bacteria), y finalmente por un
número romano que las identifican en el caso de
que en una misma variante se hayan encontrado
varias enzimas con distinta especificidad:
La importancia de las enzimas de restricción
radica en su gran especificidad de
reconocimiento de una secuencia corta de DNA
dúplex y la consiguiente hidrólisis de un enlace
fosfodiéster en cada hebra, justamente en
secuencias concretas del DNA llamadas sitios
de reconocimiento o de restricción.
Los fragmentos de DNA originados son útiles
para iniciar la clonación celular o acelular, para
el análisis de DNA, para elaborar mapas físicos
de restricción, para la detección de
polimorfismos, etc.
Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres
familias, de acuerdo con sus propiedades:
Acción de las enzimas de restricción de tipo II
Las enzimas de tipo II, son las mas usadas
pues, al clonar en secuencias muy definidas,
son las utilizadas como herramientas en
ingeniería genética.
Son éstas las restrictasas estructuralmente más
simples y las mejor estudiadas por su utilidad
en Ingeniería Genética, a modo de “tijeras” para
el corte del DNA.
EI sitio de restricción es a Ia vez Iugar de
reconocimiento y de hidrolisis.
Se hidrolizan de forma muy específica enlaces
fosfoéster del DNA, uno en cada hebra, generándose
dos fragmentos de restricción.
EI enlace hidrolizado es siempre el 3'-P, por lo que el
fosfato queda unido a 5’, dejando en ambos
fragmentos extremes 3'-OH y 5’-P.
La reacción no necesita ATP, lo que la diferencia de la
catalizada por las enzimas de tipo I y III.
CLONACION CELULAR DE MOLECULAS
DE DNA
EI objetivo central de esta clonación es la
producción de un gran número de copias de una
región de DNA.
Se trata, por tanto, de un proceso de clonación de
tipo celular (pues se consigue gracias al empleo
de células) que, por contraposición a la clonación
acelular por PCR, in vitro, se puede considerar que
se realiza in vivo (estrictamente hablando, en
cultivo).
Se basa esta clonación, al igual que Ia PCR, en Ia
realización de múltiples rondas de replicación,
pero en este caso catalizadas por la DNA
polimerasa propia de la célula en la que se lleva a
cabo el proceso, célula “anfitriona”.
Para ello, el fragmento de DNA a clonar (llamado
inserto) se une a otro DNA (vector de clonación), y
la molécula de DNA recombinante formada se
incorpora a Ia célula anfitriona donde tiene lugar la
amplificación por replicación.
Una vez detectada la presencia del DNA de
interés y seleccionados los clones que lo
han amplificado, se aísla el gen o
fragmento de DNA, que se emplea con
distintos fines, esencialmente el estudio de
características físicas, secuencia,
estructura, propiedades funcionales,
expresión génica a proteínas, etc. (muchos
de estos objetivos pueden ser aplicables
también a la PCR o clonación acelular).
Tipos de vectores.
Plásmidos.
Son moléculas de DNA de doble hebra, de
pequeño tamaño (2-5 kb) y forma circular,
presentes en forma libre en el citosol de
muchas bacterias (de 1 a 3.000
plásmidos/célula) y de algunos eucariotas
unicelulares.
Bacteriófagos.
Los bacteriófagos (también llamados fagos) son virus que infectan
exclusivamente a bacterias.
Los virus en general se replican mediante la introducción de su
genoma en células procariotas o eucariotas (infección).
Esta propiedad resulta útil para conseguir una alta eficiencia de
clonación, empleando como vectores virus mordicados.
Cada tipo de virus infecta a células específicas y, dependiendo del
tamaño del genoma vírico, admite insertos más o menos grandes,
pero en general mayores que los que se pueden insertar en
plásmidos.
Así, para clonar en bacterias se usan bacteriófagos.
Cósmidos
Son vectores sintéticos, quimeras que combinan
características de plásmidos y fagos para combinar las
ventajas de ambos tipos de vectores.
EI fragmento plasmídico proporciona las características
de tamaño pequeño (5-7 kb).
Del fago se toman las secuencias “cos” (del inglés
cohesive sites), que proporcionan al cósmido la
capacidad, propia del DNA del fago, de ser
empaquetado en cápsidas víricas in vitro.
Cromosomas artificiales
Este tipo de vectores se han diseñado en especial para
adaptarse al gran tamaño de insertos requeridos en el
caso del genoma humano y de otros mamíferos, y para la
clonación en células eucariotas.
a) Cromosomas artificiales bacterianos:
Se les llama comúnmente BACS (bacteriaI artificial
chromosomes). Se trata de vectores sintéticos derivados
del plásmido F o el fago P1. Se caracterizan, en primer
lugar, por aceptar grandes insertos de DNA, entre 100 y
300 kb.
b) Cromosomas artificiales de levadura:
Los YACs (yeast artificial chromosomes) son vectores
sintéticos que contienen las tres regiones relacionadas
con la funcionalidad de un cromosoma; secuencias
constituyentes de un centrómero, de dos telómeros y
de un origen de replicación.
GENOTECAS Se llama genéricamente genoteca o biblioteca de DNA a una colección de clones formados a partir de todos los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisión del genoma de una especie o de un tejido.
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)
• KARY MULLIS,1985.
• ESTA TÉCNICA PERMITE AMPLIFICAR, A GRAN ESCALA,
REGIONES ESPECIFICAS DEL ADN.
• SE BASA EN EL USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS QUE
SON COMPLEMENTARIOS A SECUENCIAS QUE FLANQUEAN
UNA REGIÓN ESPECIFICA DEL ADN MOLDE
• POR MEDIO DE CICLOS DE AMPLIFICACIÓN REPETIDOS, ES
POSIBLE OBTENER REGIONES DISCRETAS DEL ADN.
PASOS FUNDAMENTALES DE LA
PCR
• DESNATURALIZACIÓN: 94° C.
• APAREAMIENTO: INICIADOR O PRIMER Y ES UN
OLIGONUCLEÓTIDO DE 15 A 30 BASES NUCLEOTÍDICAS. 45-
65°C.
• EXTENSIÓN: POLIMERIZACIÓN, EN DIRECCIÓN 5’ A 3’ POR
MEDIO DE UNA ADN POLIMERASA Y
DESOXIRRIBONUCLEÓSIDOS TRIFOSFATADOS (dNTPs). 72° C.
COMPONENTES DE LA PCR
• ADN BLANCO (MOLDE, OBJETIVO O PLANTILLA).
• INICIADORES (PRIMERS): SON FRAGMENTOS DE ADN
SINTÉTICOS (OLIGONUCLEÓTIDOS) QUE SON HOMÓLOGOS
COMPLEMENTARIOS A UNA REGIÓN DEL ADN MOLDE.
• ENZIMAS POLIMERASAS TERMOESTABLES: THERMUS
AQUATICUS (TAQ) Y T. TERMOPHYLLUS (TTH).
COMPONENTES DE LA PCR
• DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS DE TRIFOSFATO (dNTPs): LA ADN POLIMERASA INCORPORA DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS AL FORMAR UN ENLACE FOSFODIÉSTER ENTRE EL GRUPO –OH LIBRE EN EL EXTREMO 3’ DE LA CADENA NACIENTE Y EL
GRUPO FOSFATO 5’ DEL dNTP.
• EL AMORTIGUADOR: LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA ESTÁNDAR PARA LA PCR CONTIENE KCl 50 mM, TRIS-HCL 10 mM, PH 8.4, MgCl2 1.5 mM Y GELATINA EN CONCENTRACIÓN DE 100 g/ml.
