u/hplc masterclass orientado a laboratorios 3.-posibilidades y … · 2016-09-04 · 1220 infinity...

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

3.-Posibilidades y

Optimización

Condiciones de

los Detectores

“Diode Array”

Isidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

U/HPLC MasterClassOrientado a Laboratorios

de Control de Calidad.

Capítulo 3

Objetivo: Mostrar Cómo extraer todo el

rendimiento/potencial a un

detector DAD

3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los

Detectores “Diode Array” (DAD):

3.1.- Introducción a la Tecnología DAD

• Aportaciones de la Tecnología y Optimización

Condiciones Detección.

• Optimización sensibilidad y resolución espectral

con rendija programable.

• Elección de la celda de trabajo.

3.2/3.3.- Consideraciones en la:

• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.

• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.

Página: 2

Capítulo 3

Agenda Detallada Curso U/HPLC

Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)

12:30h

Cap. 3












Página: 3

Capítulo 3



Cap. 3

Diseño de la Óptica Convencional

frente a la de "Diode-Array“ (DAD)

Detector de Barrido Convencional

Fuente

Rendija

de Salida

Detector

Único

Red

Holográfica

Móvil

Rendija

de Entrada

Celda

de

Flujo

Radiación

monocromática

Detector "Diode-Array"

"Diode-Array"

Rendija de

Entrada

Fuente

Celda

de

FlujoRed

Holográfica

Fija

Detector

Múltiple

FijoRadiación

Policromática

•1979 HP-8450: Primer Espectrofotómetro UV/VIS “Diode Array” del mercado.

•1982 HP-1040: Primer Detector “Diode Array” para HPLC del mercado.

Página: 4

Cap. 3

Excelente Resolución

Espectral

Lámpara de

Tungsteno(dependiendo modelo

DAD)

Lámpara de

Deuterio

Lentes Filtro de Óxido

de Holmio

Celda de

Flujo

Rendija

Programable

1 a 8 nm (ó16)

Red

Holográfica

"Diode-Array" de

1024 Elementos

190 nm

950nm*(640 modelos

Con 1 lámpara)

Amplio Rango

de Longitudes

de Onda

Verificación

Automática de

Longitudes de Onda

Optimización Rápida

de la Sensibilidad y

ResoluciónTecnología compartida con

Espectrofotómetro UV/VIS Agilent-8453/8454

Diseño Óptica DAD Agilent Series 1100/1200/1220/1260*

Optimizado para una excelente Sensibilidad y Flexibilidad

*Versiones DAD y MWD. En 1260 sólo modelos G1315C y G1315D.

En modelos de otras series con 1 sola lámpara (deuterio) el rango es 190-640nm

Página: 5

Cap. 3

Lámpara de Deuterio

Celda de flujo “Max-Light cartridge“

Rendija Programable

1024 fotodiodos

“Diode-Array”

MonocromadorEspejo

160 Hz

CELDA Estandard:De 10 mm de camino óptico y tan solo 1 µl de volumen σ

CELDA de Alta Sensibilidad:De 60 mm de camino óptico y tan solo 4 µl de volumen σ

Diseño Óptica Agilent 1290-DADOptimizado para la Máxima Sensibilidad

Página: 6

Cap. 3

100

Programación de la Señal del DAD

Ancho de banda (240/80--> detecta de 200-280nm.).

Al variarlo cambia el nº de diodos que se promedian

Long. onda de REFERENCIA

(400/100-->RESTA promedio 300-400nm.)

Ancho Rendija (define la anchura del

haz de luz incidente)

Es importante ajustar adecuadamente la

FRECUENCIA DE ADQUSICION DE DATOS

Programación de eventos en el tiempo ( long.

onda/ manera almacenar espectros/ threshold/

frecuencia adquisición/ balance).

El Ancho de Banda deber ser igual o

superior al Ancho de Rendija

Ancho Incorrecto

Altura mínima que debe tener el pico para

guardar espectros selectivamente (desactivado si

se guardan todos los espectros)Resolución con la que se guardan

los espectros en el disco

Página: 7

Cap. 3

Análisis Cualitativo:

Explorando el Campo Espectral

Modos de Adquisición Espectral Agilent

1100/1200 (programable en el tiempo)

Todos los Espectros

Cada 2 Espectros

Todos los del Pico

Espectros en la línea de base más 3 en el pico.

Solamente en el máximo

Absorb

ancia

Los DAD de Agilent Tech. además de poder extraer “a posteriori” cualquier cromatograma a cualquier long. onda, permiten directamente guardar varios cromatogramas (señal 2D) programables en el tiempo e independientes del fichero espectral-3D

Página: 8

Cap. 3

Evaluación Longuitud Onda Óptima:

Extracción de Cualquier Cromatograma del 3D

min5 10 15 20 25

mAU

0

10

20

30

40

50

1.9

29

2.4

17

2.7

43

3.4

70

3.9

02

4.7

47

6.3

43

7.5

51

8.3

64

12.8

35

14.0

40

16.3

68

18.5

28

19.0

58

21.4

29

22.5

71 23.5

09

.Si previamente no se ha adquirido una determinada señal, “a posteriori” se podrá

extraer del 3D cualquier cromatograma a cualquier long. Onda (en el rango espectral

almacenado).

1.- Adquirir todos los espectros

2.- Seleccionar fichero

3.- Abrir “Isoabsorbance Plot”

4.- Seleccionar “Cursor: Signal”

*DAD1, Sig=257.00, 32.00 Ref=376.00, 34.00

, EXT of DEMODADN.D

5.- Seleccionar “Long. Onda”

6.- Pulsar “COPY”

7.- Evaluar Cromatograma desde

pantalla de “Data Analysis”

Para poder disponer de toda

la información en “Set up

DAD parameters / Spectrum”

seleccionar: “Store: All”

Página: 9

Cap. 3












Página: 10

Capítulo 3



11-49minCap. 3

Aportaciones Tecnología "Diode-Array“

Ventajas Sistema Óptica Reversa

Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad

Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas

Múltiples longitudes de onda simultáneas

Ancho de banda y rendija variables para optimizar: Sensibilidad/Linealidad/Selectividad/Resolución Espectral

Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):

Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”

Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos

cromatográficamente solapados

Óptica sin partes móviles

Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta

Gran fiabilidad

Bajo coste de mantenimiento

Página: 11

Cap. 3

Sensibilidad Detectores Agilent 1100/1200

DAD "versus" VWD

Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN

Bifenilo o-Terfenilo

min2 3 4 5 6

mAU

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

min2 3 4 5 6

mAU

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

Agilent 1100 DAD

Agilent 1100 VWD

Equipo: Agilent 1100

Columna: Lichrospher RP-18 125x4mm 5um

Flujo: 1.5mL/min.

Eluyente: Acetonitrilo/Agua (75/25)

Temperatura: 25º C

Detección: peak width (adquis.: >0.2min)

DAD: 254 nm/30nm Ref: 360nm/100nm

slit ópico: 8nm

VWD: 254 nm.

Volumen Inyección: 0.1µL.

Muestra: A: 1ppm Bifenilo

B: 3ppm o-Terfenilo

(10µl solución => 10-30 ppb - 100-300pg. iny.)

Página: 12

Cap. 3

Agilent - DAD: Espectros de Alta Calidad a

Nivel de Trazas


Espectro Pico 1

Bifenilo

nm220 240 260 280 300 320 340 360

mAU

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Espectro Pico 2

o-Terfenilo

nm220 240 260 280 300 320 340 360

mAU

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16 ¡¡Sólo 0.07mUA !!

min2 3 4 5 6

mAU

0

0.02

0.04

0.06

0.08

DAD1 B, Sig=254,30 Ref=360,100 (TESB110B\001-0501.D)

Area: 0.442383 2.1

29

Area: 0.894019 3.3

46

1

2

¡¡Sólo 0.06-0.08 mUA !!

Columna: Lichrospher RP-18 125mmx4mm 5um

Flujo: 1.5mL/min.

Eluyente: Acetonitrilo/Agua (75/25) isocrático

Detección: peak width (adquis.: >0.2min) / slit óptico: 8nm

DAD 1100: 254 nm/30nm Ref: 360nm/100nm

Temperatura: 25º C

Volumen Inyección: 0.1µL.

Muestra: A: 1ppm Bifenilo

B: 3ppm o-Terfenilo(10µl solución => 10-30 ppb - 100-300pg. iny.)

Página: 13

Cap. 3













Gran fiabilidad


Página: 14

Cap. 3

Análisis Cuantitativo: Detección a Múltiples

Longitudes de Onda.1. Metronidazol

2. Meticlorpindol

3. Sulfapiridina

4. Furazolidina

5. Pyrazona

6. Ipronidazol

7. Cloramfenicol

8. N-Acetilsulfapiridina

9. Etopabat

10. Benzotiazuron

11. Nicarbazina

Muestra Antibióticos

Columna 250 x 4.6 mm ODS Spherisorb

Fase Móvil 0.02 mM NaAc/ACN

Gradiente 8 a 90% B

Meticlorpindol Metronidazol Nicarbazina

0240

100

280 320 360 400

Norm

aliz

ad

o

100

120

80

60

40

20

0

2010 30

1

2

3

4

5

11

8

9,10

6,7

275 nm

315 nm

360 nm

Longitud de Onda (nm) Tiempo (min)A

bso

rba

ncia

(m

AU

)

La adquisición simultanea de múltiples cromatogramas permite no tener que programar en el

tiempo cambios de longitud de onda en zonas críticas (picos próximos) del cromatograma.

Página: 15

Cap. 3






Ancho de banda y rendija variables para optimizar:

Sensibilidad/ Linealidad/ Selectividad/ Resolución Espectral







Gran fiabilidad


Página: 16 18-42minCap. 3

Optimización de Sensibilidad / Resolución

Espectral con Rendija Programable

Ruído < 1x10-5AU

rendija 1 nm

"promediando" 2nm de

longitud de onda

nm230 240 250 260 270 280

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7 mAU

1 nm

8 nm

2 nm

4 nm

Rendijas más gruesas proporcionan mayor intensidad de luz, y en consecuencia mejor

sensibilidad, pero una menor resolución espectral. No obstante la anchura típica de las bandas

espectrales en disolución (30-60nm) se ve poco afectada por la utilización de p.e. rendijas de 8 nm.

Rendija

“slit”slit

DAD-1100

DAD’s-1050 /1090

4nm 8nm

1nm

benceno

Página: 17

Rendija

programable:1100/1200/1220

/1260/1290

Cap. 3

DAD’s Antiguos: Influencia del Ancho de

Banda en la Relación S/N.

• En DAD’s antiguos Anchos de Banda de 10/30 nm suele

mejorar la sensibilidad. • El óptimo está alrededor del ancho de la banda

espectroscópica al 50% de su altura.

• En DAD’s modernos el ruido electrónico es casi

despreciable NO mejora la sensibilidad

Ancho de Banda

32 nm

12 nm

4 nm

S/N= 2.1

S/N=1.0

S/N= 0.7

0.1 maU

1

n

n = número de puntos

promediadosRuido α

ANCHO BANDA

Página: 18

Ejemplo con datos DAD-1090

Cap. 3

12904nm

30nm

80nm

DAD’s Modernos: Influencia del Ancho de Banda

en la Relación S/N.

Página: 19

Cap. 3

ANCHO BANDA

4nm

250nm

30nm

80nm

• En DAD’s MODERNOS Anchos de Banda de 4-8 nm CENTRADOS en el máximo de absorbancia

suelen mejorar la sensibilidad. (Al aumentar la señal sin que aumente el ruido).

4nm

30nm

80nm

1290

Detección UV "Universal“

Detección con Banda Ancha

WL 260 nm, BW 80 nm

WL 250 nm, BW 4 nm

WL 280 nm, BW 4 nm

4 5 6Tiempo (min)

Anchos de banda de 80-100 nm permiten disponer de un detector "Universal”

- Muy útil en optimización composición del eluyente

- Detección de compuestos no esperados

(Debe ser > ó = anchura de la rendija seleccionada)

BANDA ANCHA

80nm.

BANDA ESTRECHA 4nm

Página: 20

Ejemplo con datos DAD-1090

Cap. 3


min3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1 A, Sig=525,250 Ref=800,100, TT (COLO0219\001-2801.D) 3

.057

4.2

89

5.5

27

5.9

03

8.4

12

9.0

81

min3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1 C, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)

3.0

57

5.5

27

min3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1 D, Sig=512,50 Ref=650,100, TT (COLO0219\001-2801.D)

5.9

03

8.4

12

min3 4 5 6 7 8 9

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1 E, Sig=620,60 Ref=750,100, TT (COLO0219\001-2801.D)

4.2

89 9.0

81

430/50 nm

512/50 nm

620/60 nm

Universalidad Agilent DAD’s:

Detección con Banda Ancha

nm400 500 600 700 800 900

Norm.

0

1

2

3

4

*DAD1, 9.059 (4.7 mAU,Apx) Ref=8.926 & 9.232 of 001-3001.D

*DAD1, 8.406 (2.9 mAU, - ) Ref=8.345 & 8.505 of 001-3001.D

*DAD1, 5.912 (1.2 mAU, - ) Ref=5.806 & 6.066 of 001-3001.D

*DAD1, 5.532 (1.4 mAU, - ) Ref=5.445 & 5.659 of 001-3001.D

*DAD1, 4.299 (1.1 mAU, - ) Ref=4.219 & 4.412 of 001-3001.D

*DAD1, 3.065 (1.5 mAU, - ) Ref=2.959 & 3.212 of 001-3001.D

E-132E-104/102 E-124/129 E-133

400nm 650nm

E-102:Tartrazina

E-104: Amarillo Quinolina

E-124: Ponceau 4R

E-132: Carmín Índigo

DAD-1100

525/250 nm: detecta todo lo que absorba entre 400 y 650 nm.

Página: 21

Cap. 3


Aportaciones Tecnología "Diode-Array"











Gran fiabilidad


Página: 22 24-36minCap. 3

Longitud de Onda de Referencia Interna

Longitud de onda de Referencia

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

220 230 250 260 280 290 300 310 320270240

Longitud de ondaAnalítica

A 1a

A 2a

=

A 1a

A 2a

A 1r

A 2r

=

A 1r

A 2r

Ab

sorb

an

cia

(A

U)

Longitud Onda

(nm)

1.- REDUCCIÓN DEL RUIDO DE MUESTRA por

Partículas en suspensión.

Cambios de índice de refracción trabajando con

gradientes de concentración.

Turbulencias en corrientes de flujo.

2.- REDUCCIÓN DE LA DERIVA INSTRUMENTAL

Envejecimiento de la lámpara.

MEJORA LA PRECISIÓN Y EXACTITUD

Longitudes Onda

Analítica Referencia

Posibilidad de restar la

absorbancia de una zona en la

que el compuesto de interés

deja de absorber

Página: 23

Cap. 3

Longitud de Onda de Referencia Interna: reducción

interferencias por presencia de partículas en suspensión


Tampón: 20mM Borato pH= 9.2, sin microfiltrar, preparado 3 meses antes

Capilar: 56 cm de longitud efectiva y 50 µm de diámetro interno. BF3

"SPIKES"

(partículas)

EOF

PICOS

MUESTRA

PICOS MUESTRAProductos de degradación

de un fármaco irradiado con

luz UV

CON ReferenciaDAD1 B. Sig: 275/,20 Ref: 350,80

Sin ReferenciaDAD1 A. Sig: 275,20 Ref: off

Ejemplo con Electroforesis Capilar(capilar de separación sin relleno)

En las condiciones empleadas la Long. Onda de Referencia permite eliminar los “spikes”

producidos por el paso de las partículas del tampón por la celda de detección.

Página: 24

Cap. 3

Empleo de Referencia Interna con DAD

Página: 25

Con Referencia Interna: 360/100(más próxima a la long. de trabajo)

Con Referencia Interna: 550/100(más alejada a la long. de trabajo)

Sin Referencia Interna

min2 3 4 5 6

mAU

0

0.0250.05

0.0750.1

0.125

mAU

00.0250.050.0750.10.125

min2 3 4 5 6

0.075

mAU

0.025

0.1

0

0.05

0.125

min2 3 4 5 6

DAD-1100

Cap. 3

SIN referencia interna

DAD-1290

CON referencia interna

Ref.: 350/100nm

• En DAD’s más antiguos (p.e.

1090-1050-1100), una

referencia interna próxima a la

analítica reduce el nivel de

ruido.

• En DAD’s modernos (p.e.

1290), la referencia interna NO

reduce el nivel de ruido

“electrónico”, pero sí el de

“muestra”. 1ª inyección con Gradiente a 5mL/min

Resolución Espectral de

Picos Cromatográficamente Solapados

A

BA

SUPRESIÓN ESPECTRAL

DEL PICO B

285 nm sin Ref.

285 nm con Ref. 325Abs

Abs

tR

tR

285 325Longitud de Onda

Analítica

Longitud de Onda

Referencia

Longitud de Onda (nm)

Absorb

ancia A

BB

260)(Referencia

alternativa

Página: 26

Cap. 3


nm450 500 550 600 650 700

Norm.

0

200

400

600

800

1000

*DAD1, 4.292 (203 mAU,Apx) Ref=4.152 & 4.592 of 001-2801.D

*DAD1, 9.079 (1162 mAU, - ) Ref=8.706 & 10.952 of 001-2801.D

min4 6 8 10

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

DAD1 B, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)

E-1

32

E-1

04

E-1

24

E-1

29

E-1

33

min4 6 8 10

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

*DAD1, Sig=630.00, 30.00 Ref=590.00, 38.00 , EXT of 001-2801.D

min4 6 8 10

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175

*DAD1, Sig=612.00, 30.00 Ref=645.00, 20.00 , EXT of 001-2801.D

Selectividad Agilent DAD’s: Supresión Espectral de

Picos Utilizando Longitud de Onda de Referencia

Esta opción permite Resolver

Espectroscópicamente Picos

Cromatográficamente Solapados.

E-132

E-133

630612Ref: 590 Ref: 645

: 612/30 nm ref: 645/20 nm

: 630/30 nm ref: 590/38 nm

E-133

Suprimido

Espectralmente

E-132

Suprimido

Espectralmente

Página: 27

Cap. 3


Aportaciones Tecnología "Diode-Array"










Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta permite para

cuantificar seleccionar cualquier long. onda de la banda espectral (no

necesariamente la del máximo); es útil para poder cuantificar espectros saturados,

cuantificando a longitudes de onda en la base de la banda espectral (en una zona no

saturada).

Gran fiabilidad


Página: 28

Cap. 3






• Optimización sensibilidad y resolución

espectral con rendija programable.





Página: 29

Capítulo 3



33-27minCap. 3

Optimización Sensibilidad en DAD’s Agilent

Longitud de

Onda

Seleccionar la longitud de onda del máximo de absorbancia.

Programar cambios de long. de onda en el tiempo.

Incrementar el ancho de rendija.

Más luz

Mejor sensibilidad

Menor linealidad

Menor resolución espectral

Los espectros en fase líquida suelen dar bandas con anchos de más de 30 nm.

4-8 nm buen compromiso resolución espectral/ sensibilidad

DAD’s Antiguos: Usar un promedio de longitudes de onda

(típico 20-40 nm). DAD’s Modernos usar 4-8nm.

DAD’s Antiguos: Reduce el ruido./Mejora sensibilidad.

proporcionalmente a la raíz cuadrada del número de datos.

No afecta a la linealidad o a la resolución espectral.

los espectros son independientes del cromatograma.

Emplear referencia interna.

Reduce ruido de muestra mejora robustez.

partículas en suspensión / cambios índice refracción.λ analítica

λ referencia

Página: 30

Cap. 3

Resumen Optimización de Sensibilidad

con DAD’s Agilent Antiguos

Ácido Anisídico

Ancho de Banda

al 50% de la altura

(DAD’s antiguos)

30 nm

Longitud de onda (nm)

mA

U

Longitud de Onda

Analítica

Ancho de Banda de Referencia

340 nm

100 nm

Longitud de Onda de Referencia(lo más próxima posible a la analítica)

OPTIMO: - Rendija: 8nm (16)

- Señal: 255/30 Ref. 340/100

Página: 31

Cap. 3

DAD’s Modernos usar 4-8nm

Válido para cualquier tipo de detector HPLC / GC / CE

Influencia de la Frecuencia de Adquisición

de Datos

Ruido estadístico Detector α1

n

n = número de puntos

promediados

Ventajas optimización: - Mejora sensibilidad sin pérdida resolución

- Ahorro de espacio de disco duro

- Reprocesado más rápido de los datos.

Tiempo de

Respuesta

2.3 sec

1.0 sec

0.3 sec

0.1 sec

PeakWidth

(min) *S/N

0.1

0.05

0.01

0.005

6.1

3.7

1.8

1

Tiempo (min)

2.3

seg

1.0

seg

0.3

seg

0.1

seg

0.1 mAU

* Utilizar un PK WD de adquisición

del orden del WIDTH (integración)

del pico más fino de interés

-Valores Típicos en HPLC (“convencional”: 10-25cm long. 5μm )

“Peak Width: >0.1min ó >0.2min

Página: 32

Nº puntos/pico:

• Máx. resolución: ≥30-40

• Resol.+sensibil.: 15-25

• Máx. sensibilid.: 8-12

Cap. 3

Ejemplo Influencia Frecuencia Adquisición en la

Resolución en Cromatografía Ultra-Rápìda

20Hz es suficiente para picos con PW > 0.01min (0.6seg)

(peakwidth al 50% de su altura)

min0.1 0.2 0.3 0.4 0.50

80Hz

PW=0.30sec

40Hz

PW=0.33sec

20Hz

PW=0.42sec

10Hz

PW=0.67sec

5HzPW=1.24sec

DAD standard 20Hz

Agilent SL Fast DAD

20Hz “versus” 80Hz

+ 40% Ancho pico

– 40% Capacidad de separación de picos

– 30% Resolución

– 70% Eficiencia aparente de la columna

10Hz “versus” 80Hz

+ 120% Ancho pico

– 120% Capacidad de separación de picos

– 90% Resolución

– 260% Eficiencia aparente de la columna

Muestra: Mezcla de Fenonas

Columna: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8umGradiente: 50-100% ACN in 0.3min

Celda det.: 5ul

Página: 33

Cap. 3

3.- Posibilidades Detectores “Diode Array” (DAD) de Agilent:

Introducción a la Tecnología DAD



• Optimización sensibilidad y resolución espectral con

rendija programable.


• Consideraciones en la:

– Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.

– Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.

Página: 34


(4/4)

38-22minCap. 3

Optimización de las Dimensiones de la Celda

¿Cómo lograr celdas de menor volumen?

10 mm camino óptico13 µL volumen

4.6 mm id column

+ =

Columna corta

d.i. 2.1 mm

?Dispersión pico• Pérdida de resolución• Menor señal (S/N)

Camino óptico Corto (3 mm, 2 µL) menor señal

Alta transmisión de luz => bajo ruido Baja S/N Baja transm. de luz elevado ruido Baja S/N

Camino óptico Largo (10 mm, 0.5 µL)

Absorbancia = € x b x C (b= camino óptico)

Página: 35

Celda Flujo

Convencional

Guía de ondas optofluídica

Reflexión interna total de la luz

Diseño de Celda:

“Max-Light High Sensitivity cell“

Cap. 3

La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)

1290 Infinity Diode-Array Detector Mejora Sensibilidad x10 “versus” Detectores 1200-VWD/DAD- Comparación celdas “Max-Light High Sensitivity vs 1200-VWD“

1200-VWD (10 mm x σ Vol.: 14 µL)

S/N: 253

Muestra: Antraceno, 835 pg/µL

Col.:: 4.6x150mm ZORBAX SB C18, 5 µm

Fase móvil: Agua/Acetonitrilo = 20/80

Flujo: 1.5ml/min

Detección 251nm, PW >0.1min,

Volumen inyección : 5µl

Temp. columna: 40°C

Celda “Max-Light High Sensitivity“ (60 mm x σ Vol.: 4 µL)

S/N: 2944

Technical Note: 5990-5326EN

mD

LFr

24

42

V2

V

Mayor Sensibilidad: hasta x10 veces*. Sin aumento de la dispersión del pico

*Celda 6cm picos intensos/eluyentes que absorban mucho saturarán el detector más fácilmente, al incrementar la señal .

Cap. 3

Página: 36

Elección de la Celda de Trabajo en DAD.

• Una celda con mayor camino óptico mejorará la sensibilidad pero su mayor

volumen puede hacer perder resolución.

• Las dimensiones (/flujo) de la columna definirán la celda a utilizar.

• En UHPLC y especialmente si se reduce el diámetro de la columna a 2.1 (3)

mm convendrá reducir el volumen de la celda utilizada.

• Max-Light High Sensitivity cells:

• Máx. resolución: 10mm y 1 µL vol. σ

• Máx. sensibilidad: 60mm y 4 µL vol. σ

hasta 60 bars

MWD & DAD STANDARD FLOW CELLS

Column length Typical peak width Recommended flow cell

<= 5 cm 0.025 min Nano

10 cm 0.05 min flow cell Semimicro flow cell

20 cm 0.1 min Standard flow cell

>= 40 cm 0.2 min

Typical flow rate 1-2 ml/min

Internal column diameter 2.1mm 4.6 mm

0.2- 0.4 ml/min 0.4- 0.8 ml/min

3.0 mm

0.01-0.2 ml/min

0.5- 1.0 mm

CELDAS

ESTANDARDMicro SemiMicro Standard

MWD/DAD MWD/DAD MWD/DAD

Max pressure (bar) 400 120 120

Path Length (mm) 6 6 10

Volume (µl) 1.7 5 13

Página: 37

Cap. 3

Dispersión Max-Light Flow cell 10 mm vs 60 mm

Columna UHPLC: 2.1 mm x 50mm x 1.8µm

10 mm Max-Light cell

Fenonas

Celda 60mm mejora x4 la sensibilidad, pero

pierde resolución con columnas/picos de muy

pequeño volumen1µL4µL Vol. σ 50 % pérdida de la capacidad de

separar picos de muy pequeño volumen

60 mm Max-Light High Sensitivity cell

mAU/cm

1.5min

TS

TS

Cap. 3

Página: 38












Página: 39

Capítulo 3



45-15minCap. 3

Biblioteca de Espectros- Confirmación

Identificación por Comparación Espectral

Atrazina

Biblioteca de Espectros

ClortoluronClortoluron

?

Factor de

Similitud

999

100

80

60

40

20

0

300250200


Tiempo (min)

20

15

10

5

0

25 30 35 40 45

Absorb

ancia

(m

AU

)N

orm

ali

za

da

Los espectros de UV/VIS pueden variar con cambios en el pH y composición

de la fase móvil. Se recomienda asociar las bibliotecas con los métodos de trabajo

Página: 40

Cap. 3

Comparación Espectros: Fiabilidad Espectral

La absorbancia máxima de los espectros de UV/VIS comparados debe estar

dentro del rango de linealidad de la ley de Lambert y Beer en todo el rango

de longitudes comparadas.

Benzo(g,h,i)perileno

Muestra: 1.1 mAU FS

Archivo de biblioteca: 680 mAU FS

Absorbancia en el máximo del espectro

240 260 280 300 320 340 360 380

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

*DAD1, 21.801 (1.1 mAU, - ) Ref=22.374 de PNA5.D

*Benzo(g,h,i)perileno


Ab

so

rba

ncia

(m

AU

)

-En espectros a nivel de trazas es útil la función

“Smooth ” (con p.e. factores 5-15).

- Para disponer de mayor precisión espectral

puede recurrirse a la función “Spline” (con factor 5 y

adquisición 1nm se obtiene una precisión 1nm/5= 0.2nm.)

- Para superponer espectros basta pulsar tecla

“CTRL” al solicitarlos.

Página: 41

TS

Cap. 3

Supresión Influencia Cambio Composición Eluyente

Si se trabaja con gradientes de concentración, y los eluyentes utilizados absorben dentro del rango

de longitudes de onda empleado, se debería restar el espectro promedio de inicio y final del pico

(especialmente en el análisis de trazas)

min0 5 10 15 20 25

mAU

0

10

20

30

40

50

DAD1 A, Sig=254,20 Ref=500,100 (DEMO\DEMODADN.D)

2.4

26

2.7

43

3.4

69

3.9

01

4.7

48

6.3

44

7.5

51

8.3

64

12.8

35

14.0

41

16.3

69

18.5

29

19.0

60

21.4

33

22.5

70

23.5

10

Automáticamente

resta espectros de

referencia

1.- Espectro Referencia Inicio pico

SELECCIÓN MANUAL Espectros Referencia

2.- EspectroReferencia Final pico3.- Esp.

Máximo

Automáticamente toma el espectro en el máximo del pico

SELECCIÓN AUTOMATICA

Página: 42

Cap. 3

Cálculo del Factor de SimilitudN

orm

ali

za

do


100

80

60

40

20

0

300250

Patrón

Desconocido

220 280

83

Ajuste de regresión lineal

Coeficiente de correlación = 0.92399

Factor de Similitud = 923.99

Desconocido

0 10080604020

210

230

240

250260

270

330

320

310

280nm

Pa

tró

n

100

80

60

40

20

0

+220nm

+

300+

++

++

+

++

+

+83

Página: 43

Cap. 3

Ejemplos Comparación Espectral:

El Factor de Similitud

Coef. Correlación = 0.999963


Pa

tró

n (

mA

U)

300

200

100

0

0 10050 150

Desconocido (mAU)

300

200

100

0

0 10 20 30

Desconocido (mAU)

Coef. Correlación = 0.056

Factor de Similitud = 56

Pa

tró

n (

ma

U)

0

20

40

60

80

100

No

rma

liza

do

300250


Desconocido

Patrón

0

20

40

60

80

100

No

rma

lizad

o

250 300 350 400


Desconocido

Patrón

Página: 44

Cap. 3


Cuantificación por Identificación Espectral(no por Tiempos de Tabla Calibración)

Los Nombres en la Biblioteca y en

la Tabla de Calibración deben de

coincidir exactamente(los tiempos de retención no hace falta que

coincidan)

Página: 45

Muy útil cuando la identificación por

tiempos de retención resulta poco fiable.

Cap. 3












Página: 46

Capítulo 3



52-8minCap. 3

Pureza Espectral de Picos

Pico

puro Pico

impuro7.6 7.8 8.0 8.2 8.4

Tiempo (min)

200 400Longitud de Onda (nm)200 400Longitud de Onda (nm)

Factor similitud o

pureza 999

Ab

so

rban

ci

aA

bso

rban

cia

NO

RM

AL

IZA

DA

Factor similitud o

pureza 764

Los espectros comparados deben estar dentro del rango de linealidad y no

incluir espectros de línea de base. Convendrá ajustar correctamente el umbral de

absorbancia mínima, la integración o la zona del pico a evaluar (mediante arrastre icono pureza).

Icono Pureza Pico

“Spectral Options”

Múltiples Espectros del Pico

(según “Spectra per Peak” y

“Threshold”)

Página: 47

Cap. 3

curva definida por sistema(calculado a partir relación s/n)

Definir uno o más espectros de

referencia dentro de un pico.

Compara todos los demás

espectros con el espectro (o

espectros) de referencia y calcula el

factor de similitud.

Dibuja los resultados del factor de

similitud frente al tiempo de

retención para obtener la curva de

similitud (curva negra).

Calcular e imprimir el % de puntos

por debajo del umbral de pureza

(curva roja) definidos por el sistema

o el usuario.

Curva de Similitud:

Umbrales de pureza

global definido por usuario

global definido por sistema

Señales

Máximo (Espectro tomado

como referencia)

Menor similitud (990)

Similitud ideal (1000)

Curva Similitud

Curva Umbral de Pureza

impuropuro Icono Pureza Pico

“arrastrando con el botón

izquierdo apretado” en el

cromatograma calcula la

pureza de todos los picos

(o de 1 sólo) en el rango

de tiempo escogido.

Página: 48

Pureza de Pico - Curva de Similitud:Pureza Espectral a lo largo del pico

Cap. 3

Pureza de Pico: ejemplo pico Impuro

Página: 49

Cap. 3

Pureza de Pico: ejemplo pico Puro

Página: 50

TS

Cap. 3

Ajuste Umbral para Pureza de Pico: ejemplo

pico Puro Incorrectamente Analizado

• En un pico mal integrado y

con un “Threshold” espectral

excesivamente bajo es

habitual obtener “falsos picos

impuros”

0 10080604020

2

1

0

2

3

0

2

4

02

5

0

2

6

0

2

7

0

3

3

0

3

2

0

3

1

0

280nm100

80

60

40

20

0300250

Patr

ón

100

80

60

40

20

0

+220n

m

+3

0

0

+

++

+++

++

+

Patrón

Desconocido

Ajuste de regresión

linealCoeficiente de correlación = 0.92399


+

220 280

83

83

Página: 51

TS

TS

Cap. 3

Opciones Espectrales

Selección del espectro/s de

referencia para el cálculo de la

pureza de pico

Selección de presentación de

multiples espectros en pantalla

Página: 52

Cap. 3

Opciones de Control de la Pureza de Pico

Página: 53

Cap. 3

• Absorbancia excesiva a bajas long. onda: en “Spectral Options/Spectra”

subir la long. onda mínima para estar en rango lineal de absorbancia.

• Picos mal integrados, se pueden corregir mediante 3 opciones:

• Arrastrar el icono de pureza para definir la franja de tiempo del pico para calcular su pureza.

• En “Spectral Options/Spectra/Spectra per peak” subir “threshold (mUA)”.

• Reintegrar para no tomar demasiada base del pico.

• Excesiva “sensibilidad” en la detección de impurezas espectrales, se puede

corregir mediante múltiples opciones:

• Arrastrar el icono de pureza para definir la franja de tiempo del pico para calcular su pureza.

• En “Spectral Options/Spectra/Spectra per peak” subir “threshold (mUA)”.

• Reintegrar para no tomar demasiada base del pico.

• En “Spectral Options/Purity” definir el “Threshold o Fixed Threshold” que interese (p.e. 990 o 995),

en lugar de que lo calcule automáticamente el propio software.

• Cambiar donde o cómo el software calcula el ruido espectral en “Spectral

Options/Advanced/Noise Calculations”:

– Definir en “Calcúlate standard deviation….” el tiempo donde calcular el ruido de línea

de base, una zona libre de picos próxima a la zona de interés que interese.

– Definir en “Take default standard….” el valor de ruido que nos interese. Si se pulsa sobre

el icono con la “i” (“Information on the LC peak purity”), en al lado derecho de “Calculations”

se podrá ver el “Noise Threshold” calculado por el software, y pulsando sobre “advanced”

cambiarlo al valor definido por usuario que interese en “Take default standard….”.

Agilent Serie 1200 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atención

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem

Estamos a su disposición en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem

¿Preguntas?

Logística Comida: Restaurante: “Take East Easy” (a la izquierda de la Farmacia)

• Grupo de mesas reservadas

56

ZONA 1:

3.- Fruta natural

2.- Nevera con

Bebidas. +…

1.-Bandejas +

Vasos +PanENTRADA

ZONA 3:

Postres Fríos

Vistas Maremagnum/ mar

CAJA (dan los

cubiertos)

ZONA 2A:

Plancha

WOK

Pasta/Pizzas

Ensaladas

ZONA 2B:

1ºs y 2ºs

CALIENTES

u/hplc masterclass orientado a laboratorios 3.-posibilidades y … · 2016-09-04 · 1220 infinity...

Documents