transfecciones ii biología molecular 2009 viernes 22 mayo
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TRANSFECCIONES II
Biología Molecular 2009
Viernes 22 mayo
Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de levaduras
pAD
pBD
Plásmidos reporteros
Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero
pBIND
pACT
pG5/luc
Ejemplo de resultados
Enriquecimiento de transfectantes
• Cell sorting
Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes
Transfección estable
• Por integración• Por recombinación homóloga• Como episoma
• Requiere de un marcador de selección en el vector
• Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
Marcadores de selección eucariontes
• Agent Action Marker Gene
• Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase• Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin• G-418 Neomycin phosphotransferase• Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
Marcadores de selección
• G418 (Geneticina)– Bloquea la traducción– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )– Para células de mamífero, plantas y levaduras
• Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
Sistema reprimible por tetraciclina
Sistema inducible por tetraciclina
Vector de expresión del regulador
Vector de expresión del regulador
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión para dos genes regulados por tet
Vector episomal
Sistema de recombinación homóloga
• Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae
• Sitio FRT (Flp recombination target)• Recombinasa Flp
Vector que contiene el sitio FRT
Pasos de recombinación homóloga
1- Generar línea que posea el sitio FRT
Vector de clonado del gen de interés
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión de la recombinasa
2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa
Resultado
Disminuir expresión de un gen
-Ribozimas
aaaaa--------auucg--------ccguuua--------uaagc-- ggcaaau----
cDNA
ribozima
Clivado del mRNA blanco
-Antisentido
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----gttagccggggaagcaaat
1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases)
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA
Disminuir expresión de un gen
cDNA
aaaaaa5’ 3’a b c
2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco.
a’ b’ c’
mRNA
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA
Disminuir expresión de un gen
Síntesis in vitro
• Síntesis química
• Transcripción in vitro
• Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER
Expression in vivo
• Plásmidos
• Templados para PCR (cassette de expresión siRNA)
• Vectores virales
-RNAi (siRNA)
Clivado del mRNA blanco
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----
guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaacRNAi(30 a 50 nucleotidos)
mRNA
a) Síntesis
b) cDNA
Degradación por RNAsa
Procesados por la maquinaria celular (dicer…)
Estrategias siRNA
Expresión de siRNA in vivo
Promotor/Enhancer
• • Pol III (U6, H1)
• • Pol II (CMV)
Secuencia de terminación• Pol III: string of 3-5T’s)Señal de poly(A) SV40
siRNA TempladoTemplado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA
Vector siRNA
Vectores Plasmídicos
Expresión transiente
• No se trabaja con RNA
• Produce gran cantidad de vector
• Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección
Expresión Estable (marcadores de selección)
• Produce líneas estables
• Animales transgénicos
Vectores múltiples siRNA
Vectores múltiples siRNA
Control siRNA
Bibliotecas siRNA
Diseño del experimento
Diseño del experimento
Bibliotecas siRNA: ejemplo
Bibliotecas siRNA: ejemplo
Bibliotecas siRNA: ejemplo