37

Los osteoclastos, las células multinucleadas que reabsor-ben hueso, se originan a partir del linaje celular de los mo-nocitos/macrófagos. Los osteoblastos (o células del estromade la médula ósea) están implicados en la osteoclastogéne-sis (27, 30). El factor estimulante de las colonias de macró-fagos (MCSF), producido por los osteoblastos, es un factoresencial para la formación de los osteoclastos (39). El RANKL–ligando del receptor activador del factor nuclear kappa-B(NF-κB)– es otra citocina esencial para la osteoclastogéne-sis y es expresado por los osteoblastos como una citocinaasociada a la membrana (3, 12). Los precursores de los os-teoclastos expresan RANK (un receptor de RANKL), recono-cen el RANKL expresado por los osteoblastos a través de lainteracción célula-célula y se diferencian en osteoclastos bajola presencia del MCSF. La osteoprotegerina, producida prin-cipalmente por los osteoblastos, es un receptor soluble queatrae a RANKL (31). La osteoprotegerina bloquea la osteo-clastogénesis mediante la inhibición de la interacciónRANKL-RANK. Las hormonas y citocinas estimulantes de laresorción ósea potencian la expresión de RANKL en los os-teoblastos. Los osteoclastos maduros también expresanRANK, y RANKL sustenta la supervivencia y estimula la ac-tividad de resorción ósea de los osteoclastos (3, 12).

Se ha propuesto al lipopolisacárido (LPS), un constitu-yente fundamental de la pared celular de las bacterias gram-negativas, como un potente estimulador de la resorción óseaen las enfermedades inflamatorias (21). CD14 es una gluco-proteína anclada a la membrana que actúa como miembrodel sistema receptor del LPS. El receptor de tipo Toll 4 (TLR-4) es fundamental para la captura y la transducción de se-ñales inducida por el LPS (2, 38). Las lipoproteínas y lipo-péptidos bacterianos presentan patrones molecularesespecíficos de agentes patógenos (PAMP). El complejo deTLR-6 y TLR-2 reconoce el diacil-lipopéptido (2, 7). Se hadescrito que las lipoproteínas derivadas de Mycoplasma sa-livarium, un miembro de la microflora bucal humana, asícomo un diacil-lipopéptido sintético (FSL-1), activan a losfibroblastos gingivales humanos para inducir la producciónde citocinas inflamatorias a través de señales mediadas porla proteincinasa p38 activada por mitógenos (MAPK) (22).

Los miembros de la familia TLR presentan una región in-tracitoplásmica, denominada dominio de homología Toll/re-ceptor de interleucina 1 (dominio Toll-IL-1R). A través de la

interacción homófila de dichos dominios, el factor 88 de di-ferenciación mieloide (MyD88) se asocia no sólo con los re-ceptores de citocinas para IL-1 e IL-18, sino también con va-rios TLR (1, 2). Los ratones deficientes en MyD88 (MyD88–/–)mostraban resistencia a las respuestas inducidas por LPS,incluida la producción de citocinas por parte de macrófa-gos, la proliferación de linfocitos B y el shock endotóxico (1,17). Los ratones MyD88–/– no respondían ante IL-1, IL-18u otros componentes de la pared celular microbiana, comoel peptidoglucano y los lipopéptidos (29). Sin embargo, losmacrófagos deficientes en MyD88 mostraban un retraso enla activación de las cascadas de NF-κB y de MAPK en res-puesta al LPS (17). Además, dicho LPS inducía la madura-ción funcional de células dendríticas deficientes en MyD88,incluyendo la activación de moléculas coestimuladoras (16).Estos resultados señalan la existencia de una vía indepen-diente de MyD88 a través del TLR-4.

El adaptador que induce interferón β y que contiene eldominio Toll/receptor de IL-1 (TRIF) fue identificado comouna molécula adaptadora que participa en las vías de seña-lización independientes de MyD88 (33). TRIF desempeñapapeles esenciales en las rutas mediadas por TLR-4 y TLR-3(11, 34). La molécula adaptadora relacionada con TRIF(TRAM) ha sido identificada como un adaptador que parti-cipa de forma específica en la ruta de señalización mediadapor TLR-4 e independiente de MyD88 (6, 35). Empleando ra-tones deficientes en TRIF (TRIF–/–) y ratones deficientes enTRAM (TRAM–/–), se ha demostrado que se requieren tantolas vías dependientes de MyD88 como las que dependen deTRAM-TRIF para la producción de citocinas proinflamato-rias inducidas por el LPS en los macrófagos, y para la acti-vación de los linfocitos B inducida por LPS (35). Además, seha constatado que las señales mediadas por MAPK p38 yMEK/ERK (MEK: cinasa MAPK-ERK; ERK: cinasa reguladapor señales extracelulares) participan en la producción decitocinas proinflamatorias inducida por LPS en las célulasosteoblásticas humanas (18). Mediante el uso de ratonesMyD88–/– y ratones TRIF–/–-, hemos explorado los papeles deMyD88 y TRIF en la diferenciación de osteoclastos y en lafunción osteoclástica, inducidas por el LPS, la IL-1a y el dia-cil-lipopéptido (24).

El muramil-dipéptido, la estructura esencial responsablede la actividad inmunoadyuvante del peptidoglucano, se en-

Periodontology 2000 (Ed Esp), Vol. 18, 2008, 37-42

Transducción de señalesde la diferenciación de osteoclastosinducida por el lipopolisacáridoNOBUYUKI UDAGAWA, NOBUAKI SATO, SHUHUA YANG, MIDORI NAKAMURA,TERUHITO YAMASHITA, HIROSHI NAKAMURA Y TOSHIHIDE NOGUCHI

Copyright © Blackwell Munksgaard

PERIODONTOLOGY 2000ISSN 0906-6713

Copyright © Grupo Ars XXI de Comunicación, S.L.

PERIODONTOLOGY 2000 (Ed Esp)ISSN 1695-1808

cuentra presente en las paredes celulares de bacterias gram-positivas y gramnegativas. Dicho muramil-dipéptido por sísolo es incapaz de inducir la formación de osteoclastos en co-cultivo, pero si se estimula de forma sinérgica, es inducidopor el LPS y la IL-1a, pero no por la 1α,15-dihidroxi-vitaminaD3 [1α,25(OH)2D3] o la prostaglandina E2 (PGE2). Hemos ex-plorado los papeles del muramil-dipéptido en la osteoclasto-génesis y en la función de los osteoclastos maduros (37).

MyD88 es una señal esencial parala diferenciación de osteoclastos inducidapor LPS e IL-1αα

El LPS, la IL-1α y el diacil-lipopéptido, así como 1α,25(OH)2D3 más PGE2, estimularon la formación de osteo-clastos positivos para la fosfatasa ácida resistente al tartrato(TRAP) en cocultivos de osteoblastos primarios y células he-matopoyéticas derivadas de la médula ósea, obtenidas de ra-tones sin manipulación genética (fig. 1A). Por el contrario, elLPS, la IL-1α y el diacil-lipopéptido no indujeron la forma-ción de osteoclastos en el cocultivo de osteoblastos deriva-dos de MyD88–/– y de células hematopoyéticas (fig. 1A). El nú-

mero de osteoclastos formados en respuesta a 1α,25(OH)2D3

más PGE2 en los cocultivos preparados a partir de ratonesMyD88–/– fue siempre significativamente menor que el obte-nido a partir de ratones no manipulados (fig. 1A). Esto sugiereque MyD88 participa en la función de los osteoblastos, in-cluido el soporte de osteoclastos, en respuesta a 1α,25(OH)2D3

más PGE2. Se ha descrito que la osteoprotegerina inhibe com-pletamente la formación de osteoclastos inducida por LPS,IL-1α, diacil-lipopéptido y 1a,25(OH)2D3 más PGE2 en cocul-tivos sin manipulación genética. El tratamiento con LPS, IL-1α y diacil-lipopéptido de osteoblastos no manipulados esti-muló la expresión de ARNm de RANKL en un plazo de 24horas. Estos resultados sugieren que las señales mediadas porMyD88 son importantes para los osteoblastos, pero no paralos precursores osteoclásticos, en la formación de osteoclas-tos inducida por LPS, IL-1α y diacil-lipopéptido en el sistemade cocultivo (24) (fig. 4B).

Tanto las vías dependientes de MyD88 como de TRIF sonesenciales para la producción de citocinas proinflamatoriasinducidas por LPS en macrófagos peritoneales (11, 34). Em-pleando ratones TRIF–/–, hemos examinado la importanciade señales mediadas por TRIF en la formación de osteoclas-tos inducida por el LPS. Éste estimuló la formación de oste-oclastos en cocultivos preparados a partir de ratones TRIF–/–,

Udagawa et al.

38

Fig.1. El MyD88 es esencial para la osteoclastogénesis inducida porLPS,IL-1αα y diacil-lipopéptido.A) Efectos de 1αα,25(OH)2D3 (1,25D3)más PGE2, IL-1αα y diacil-lipopéptido sobre la formación de osteo-clastos en cocultivos de osteoblastos y células hematopoyéticas pre-paradas a partir de ratones macho no manipulados (WT) y MyD88–/–.Se cocultivaron osteoblastos craneales y células hematopoyéticasderivadas de la médula ósea procedentes de ratones no manipula-dos y MyD88–/– durante 7 días en una placa de 48 pocillos, en pre-sencia o en ausencia de LPS (1 mg/ml), IL-1αα (10 ng/ml), diacil-li-popéptido (10-8 m) y 1αα,25(OH)2D3 (10-8 m) más PGE2 (10-6 m).Las células se fijaron y tiñeron posteriormente para TRAP. Las cé-lulas multinucleadas TRAP+ que contenían tres o más núcleos seconsideraron osteoclastos. Se expresaron los valores como media ±desviación estándar (DE) de tres cultivos. B) Efectos del LPS sobrela producción de IL-6 en osteoblastos preparados de ratones no ma-nipulados (WT), TRIF–/– y MyD88–/–. Los osteoblastos se incubaron

durante 24 horas en presencia o en ausencia de LPS (100 ng/ml). Serecogió el medio de acondicionamiento, y se midió la concentra-ción de IL-6 en el mismo mediante un enzimoinmunoanálisis deadsorción (ELISA). Los valores se expresan como media ± DE de loscultivos por cuadruplicado. C) Efectos del LPS sobre la producciónde IL-6 en los macrófagos de médula ósea tratados con factor esti-mulante de colonias de macrófagos, preparados a partir de ratonesno manipulados (WT), TRIF–/– y MyD88–/–. Se incubaron los macró-fagos derivados de la médula ósea durante 24 horas en presencia oen ausencia de LPS (100 ng/ml). Se recogió el medio de acondicio-namiento, y se midió la IL-6 en éste mediante ELISA. Se expresanlos valores como media ± DE de los cultivos por cuadruplicado. IL:interleucina; LPS: lipopolisacárido; MyD88: factor 88 de diferencia-ción mieloide; PGE2: prostaglandina E2; TRAP: fosfatasa ácida re-sistente al tartrato; TRIF: adaptador que induce interferón ββ y quecontiene el dominio Toll/receptor de IL-1.

A

B C

Ost

eocl

asto

s/p

oci

llo

IL-6

(n

g/m

l)

IL-6

(n

g/m

l)

1000

800

600

400

200

0

6

5

4

3

2

1

0

6

5

4

3

2

1

0

Control

Control

Control LPSWT

Control LPSTRIF-/-

Control LPSMyD88-/-

Control LPSWT

Control LPSTRIF-/-

Control LPSMyD88-/-

Control 1,25D3

+PGE2

LPS IL-1α Diacil-lipopéptido

LPS IL-1α Diacil-lipopéptido

Osteoblastos Macrófagos de médula ósea

WT MyD88-/-

así como en ratones no manipulados. Del mismo modo, laIL-1α y el diacil-lipopéptido estimularon la formación de os-teoclastos en los cocultivos preparados a partir de ratonesTRIF–/–. Estos resultados sugieren que la vía mediada por TRIFno participa en la formación de osteoclastos inducida por IL-1α y ligandos de los receptores TLR (24) (fig. 4B).

Papel de MyD88 en la producciónde citocinas proinflamatorias inducidapor el lipopolisacárido

Examinaremos a continuación la producción de citoci-nas proinflamatorias en osteoblastos y macrófagos prepa-rados a partir de ratones TRIF–/– y MyD88–/–. El tratamientocon LPS durante 24 horas estimuló la producción de IL-6en osteoblastos TRIF–/– y no manipulados, pero no en lososteoblastos MyD88–/– (fig. 1B). El LPS estimuló la produc-ción de IL-6 en macrófagos no manipulados de la médulaósea, pero no en aquellos TRIF–/– o MyD88–/– (fig. 1C). Es-

tos resultados sugieren que la vía dependiente de TRIF par-ticipa en la producción de IL-6 inducida por LPS en los ma-crófagos, pero no en los osteoblastos (24) (fig. 4A). En estemomento, no se sabe por qué las células inmunitarias, comolos macrófagos y los linfocitos B, necesitaban la señaliza-ción tanto de MyD88 como de TRIF en respuesta al LPS.Previamente hemos descrito que el LPS estimulaba la pro-ducción de citocinas proinflamatorias, como IL-1β, TNF-αe IL-6, en los macrófagos de médula ósea, pero no en lososteoclastos (14). De este modo, los osteoclastos respondenal LPS a través de TLR-4, pero las características de estas cé-lulas son bastante diferentes de las de sus precursores, losmacrófagos de la médula ósea. Estos resultados sugierenque TRIF es importante para la función de las células in-munitarias, pero no para las células no inmunitarias, comolos osteoblastos y osteoclastos. La pérdida de la capacidadde respuesta al LPS en los osteoclastos debe ser un requi-sito para poder llevar a cabo papeles esenciales en el re-cambio óseo fisiológico. En el futuro, los estudios segura-mente aclararán el significado de la necesidad de señales através de TRAM-TRIF en las células inmunitarias.

Transducción de señales de la diferenciación de osteoclastos inducida por el lipopolisacárido

39

Fig. 2. Efectos de RANKL, LPS, IL-1αα y diacil-lipopéptido sobre lasupervivencia de los osteoclastos preparados a partir de ratones nomanipulados (WT), MyD88–/– y TRIF–/–. A) Se prepararon osteo-clastos purificados en cocultivos de osteoblastos y células de mé-dula ósea obtenidos de ratones WT, MyD88–/– y TRIF–/–. Los osteo-clastos, WT, MyD88–/– y TRIF–/– se trataron con RANKL o sin éste(100 ng/ml), LPS (1 mg/ml), IL-1αα (10 ng/ml) y diacil-lipopéptido(10-8 m). Tras un cultivo de 24 horas, las células se fijaron y tiñeronpara TRAP. Aquellas células multinucleadas TRAP+ con tres o másnúcleos se consideraron osteoclastos viables. Se expresaron los va-lores como media ± desviación estándar (DE) de tres cultivos. B)Expresión de MyD88, TRIF y TRAM en osteoblastos, macrófagos y

osteoclastos preparados a partir de ratones WT, TRIF–/– y MyD88–/–.Se extrajo el ARN celular total de los osteoblastos, los macrófagosde médula ósea inducidos con factor estimulante de colonias demacrófagos, y los osteoclastos; se retrotranscribió y amplificó me-diante reacción en cadena de la polimerasa para MyD88–/–, TRIF,TRAM o la glicerol-fosfato-deshidrogenasa de ratón (GAPDH). IL:interleucina; LPS: lipopolisacárido; MyD88: factor 88 de diferen-ciación mieloide; PGE2: prostaglandina E2; RANKL: ligando del re-ceptor activador del factor nuclear kappa-B (NF-κκB); TRAM: molé-cula adaptadora relacionada con TRIF; TRAP: fosfatasa ácidaresistente al tartrato; TRIF: adaptador que induce interferón ββ yque contiene el dominio Toll/receptor de IL-1.

A

B

Control

WT

TRIF-/-

MyD

88-/-

WT

TRIF-/-

MyD

88-/-

WT

TRIF-/-

MyD

88-/-

RANKL

Lipopolis

acárido

Il-1α

Diacil-

lipopétid

o

Control

RANKL

Lipopolis

acárido

Il-1α

Diacil-

lipopétid

o

Control

RANKL

Lipopolis

acárido

Il-1α

Diacil-

lipopétid

o

Sup

ervi

ven

cia

de

ost

eocl

asto

s (%

)

70

60

50

40

30

20

10

0

MyD88

TRIF

TRAM

GAPDH

OsteblastosMacrófagos de

médula ósea Osteoclastos

WT MyD88-/- TRIF-/-

MyD88 participa en la supervivenciade osteoclastos mantenida porel lipopolisacárido y la interleucina 1αα

Previamente, hemos descrito que los osteoclastos purifi-cados morían de forma espontánea en un plazo de 36 ho-ras, como resultado de la apoptosis, y que el LPS y la IL-1αfavorecían la supervivencia de estos osteoclastos (15). Se pre-pararon osteoclastos a partir de cocultivos de osteoblastosy células de la médula ósea obtenidos de ratones no mani-pulados, así como de ratones MyD88–/–, TLR-4–/– y TRIF–/–.La mayor parte de los osteoclastos moría de forma espon-tánea y desaparecía en 24 horas. RANKL estimuló la super-vivencia de los osteoclastos derivados de ratones MyD88–/–,TLR-4–/– y TRIF–/–. El LPS y la IL-1α sostuvieron la supervi-vencia de osteoclastos no manipulados y de osteoclastosTRIF–/–, pero no de osteoclastos MyD88–/– (fig. 2A). La IL-1αy el RANKL, pero no LPS, favorecieron la supervivencia deosteoclastos derivados de ratones TLR-4–/–. El diacil-lipo-péptido (un ligando del complejo entre TLR-2 y TLR-6) nomantuvo la supervivencia de los osteoclastos derivados deninguno de los ratones (fig. 2A). Takami et al. (28) han des-crito que los osteoclastos maduros expresaban el ARNm deTLR-2 y TLR-4, pero no de TLR-6. Estos resultados sugierenque el diacil-lipopéptido no mantuvo la supervivencia de lososteoclastos debido a la ausencia de TLR-6 en dichos oste-oclastos. De este modo, las señales mediadas por MyD88,pero no por TRIF, fueron esenciales para la supervivencia deosteoclastos mantenida por LPS e IL-1α (24) (fig. 4C).

TRAM no se expresa en osteoblastosni en osteoclastos

Se ha demostrado que TRAM participa en la ruta de se-ñalización mediada por TRIF e inducida por LPS (6, 35). He-mos examinado la expresión de ARNm de TRIF y TRAM enlos osteoblastos, macrófagos de médula ósea y osteoclastospreparados a partir de ratones MyD88–/–, TRIF–/– y no mani-pulados. El ARNm de TRIF se expresó en los osteoblastos,macrófagos y osteoclastos derivados de los ratones no ma-nipulados y MyD88–/– (fig. 2B). Resulta interesante que TRAMse expresa en los macrófagos, pero no en los osteoblastos nien los osteoclastos maduros (fig. 2B). Los osteoblastos y lososteoclastos expresaban TRIF pero no TRAM, lo que sugiereque la expresión de esta última es necesaria para la acciónmediada por TRIF en estas células (fig. 4). Nuestros resulta-dos también sugieren que TRAM puede ser un adaptadorclave importante en la ruta mediada por TLR-4 para fun-ciones en células concretas.

Los ratones MyD88–/– mostrabanuna profunda osteopenia con reducciónen la resorción y formación de hueso

Las mediciones histomorfométricas de las vértebras hanpuesto de manifiesto que los ratones MyD88–/– mostrabanuna osteopenia con reducción en la resorción y la formaciónóseas. Los parámetros funcionales relacionados con la re-sorción ósea, como el cociente superficie con osteoclas-tos/superficie ósea, así como el cociente número de osteo-

clastos/superficie ósea, fueron un 37,4% y un 46,8% inferio-res en los ratones MyD88–/– que en los no manipulados, res-pectivamente (fig. 3). Los parámetros funcionales relaciona-dos con la formación de hueso, como el cociente volumende osteoide/volumen tisular y el cociente superficie con os-teoblastos/superficie ósea, también se encontraban reduci-dos de forma significativa en los ratones MyD88–/– (fig. 3).Tanto el volumen óseo trabecular (volumen óseo por volu-men tisular como el número de trabéculas se hallaban re-ducidos de forma significativa en ratones MyD88–/– de 14 se-manas, en comparación con los no manipulados (fig. 3). Nose observaron diferencias significativas en el tamaño y laforma corporal entre ambos tipos de ratones. El análisis his-tológico puso de manifiesto que era evidente una pérdida de

Udagawa et al.

40

Fig. 3. Análisis histomorfométrico de las vértebras en ratones no ma-nipulados (WT) y MyD88–/–. Se sacrificaron los siete ratones machoMyD88–/– y WT (de 14 semanas) para su análisis histomorfométrico.Se extrajeron las vértebras de los ratones, se fijaron en etanol al 70%,y se incluyeron en glicol-metacrilato sin descalcificación. Se prepara-ron y tiñeron los cortes con Villanueva Goldner, con el fin de discri-minar entre el hueso mineralizado y desmineralizado, e identificar loscomponentes celulares. Se llevó a cabo un análisis histomorfométricocuantitativo con doble enmascaramiento. Se expresaron los valorescomo media ± desviación estándar (DE) de los siete ratones. Se llevóa cabo el análisis estadístico mediante una prueba de la t de Student.Diferencias significativas entre los ratones WT y MyD88–/– (*p < 0,005,**p < 0,05, ***p < 0,01). MyD88: factor 88 de diferenciación mieloide.

2,5

2

1,5

1

0,5

0

1,6

1,2

0,8

0,4

0

25

20

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10

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0

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30

20

10

0

16

12

8

4

0WT MyD88-/- WT MyD88-/-

WT MyD88-/- WT MyD88-/-

WT MyD88-/- WT MyD88-/-

******

** **

***

Número de osteoblastos/superficie ósea

Volumen de osteoide/volumen tisular

Superficie con osteoblastos/superficie ósea

Volumen ósea/Volumen tisular Número de trabéculas

Superficie con osteoclastos/superficie ósea

(%)

(%)

(%)

(%)

(nú

mer

o/m

m)

(nú

mer

o/m

m)

hueso trabecular en las tibias de los ratones MyD88–/–. Estosresultados sugieren que MyD88 participa en la regulación fi-siológica de la resorción y la formación óseas (24) (fig. 4).

No sólo los parámetros relacionados con la resorción óseasino también los relativos a su formación disminuyeron deforma significativa en ratones MyD88–/– en comparación conlos no manipulados (fig. 3). Los ratones deficientes en proteí-nas de la matriz ósea, como la osteonectina y el biglicano, de-sarrollaron asimismo una profunda osteopenia, con un des-censo en la formación y la resorción óseas (5, 8, 32). La deficienciade la osteoprotegerina en los ratones indujo una osteoporosisgrave originada por la mayor resorción ósea, pero también seobservó la aceleración en la formación de hueso en estos ra-tones (4, 19). Estos hallazgos sugieren que la formación y la re-sorción óseas se encuentran estrechamente relacionadas.

El muramil-dipéptido favorecela formación de osteoclastos inducidapor LPS, IL-1αα y TNF-αα a travésde la señalización mediada por el dominio2 de oligomerización que se unea nucleótidos en los osteoblastos

El muramil-dipéptido, la unidad estructural mínima esen-cial responsable de la actividad inmunoadyuvante de lospeptidoglucanos, se distribuye de forma ubicua en las pa-

redes celulares de las bacterias gramnegativas y gramposi-tivas (23) (fig. 5). Se ha demostrado que ejerce diversos efec-tos biológicos sobre las células inmunocompetentes (20).Hemos demostrado que la inyección de muramil-dipéptidoen ratones daba lugar a una hipersensibilidad a la endoto-xina: aumento en la producción de TNF-α (26) y del shockletal (25) tras la exposición a una inyección de LPS. Tambiénhemos constatado que el muramil-dipéptido potencia deforma sinérgica la producción de citocinas proinflamatoriasinducida por LPS en células monociticas humanas (36). Re-cientemente, se ha propuesto al dominio 2 de oligomeriza-ción que se une a nucleótidos (Nod2), un miembro de la fa-milia de proteínas Apaf1/Nod, como sensor intracelular delmuramil-dipéptido (9, 10, 13). Nod2 consta de un dominioN-terminal para atracción de caspasa, un dominio centralpara unión a nucleótidos, y repeticiones ricas en leucina enel extremo C-terminal. Actúa como un adaptador en la trans-ducción de señales. La expresión de Nod2 es potenciada porcitocinas proinflamatorias y LPS (10). Estudios recientes hanestablecido que una mutación con variación en la franja delectura en Nod2, la cual da lugar a una deficiencia en la ac-tivación de NF-κB mediada por el muramil-dipéptido, par-ticipa en la susceptibilidad a la enfermedad de Crohn, untrastorno inflamatorio crónico del tracto intestinal (13). Deeste modo, el muramil-dipéptido desempeña un papel enmuchos aspectos de las respuestas inflamatorias.

En los cocultivos de osteoblastos primarios y células he-matopoyéticas derivados de ratón, 1α,25(OH)2D3, PGE2, LPS

Transducción de señales de la diferenciación de osteoclastos inducida por el lipopolisacárido

41

Fig. 4. Papel de las vías de señalización de MyD88 y TRAM-TRIF enlos macrófagos, osteoblastos y osteoclastos expuestos a LPS, IL-1,diacil-lipopéptido y RANKL. A) Papel de la señalización mediadapor MyD88 y TRAM-TRIF en la producción de IL-6 en macrófagos.Estos expresan CD14y TLR-4.Tanto las vías dependientes de MyD88como de TRAM-TRIF mediadas por TLR-4 son esenciales para laproducción de IL-6 en macrófagos. B) Papel de las señales media-das por MyD88 en la producción de IL-6 y en la formación de os-teoclastos en los osteoblastos.Los osteoblastos expresan CD14,TLR-2, TLR-4, TLR-6 y IL-1R. LPS estimula la producción de IL-6 a travésde la señalización de MyD88. El LPS, la IL-1 y el diacil-lipopéptidoestimulan la expresión de RANKL en los osteoblastos a través delos respectivos sistemas de receptores. La expresión de ARNm deRANKL inducida por TLR y IL-1R en los osteoblastos está mediada

por la señalización de MyD88, seguida de la proteincinasa C (PKC)y MEK/ERK. C) Papel de las señales mediadas por MyD88 en la fun-ción de los osteoclastos. Los osteoclastos maduros expresan CD14,TLR-4 y IL-1R, así como RANK. LPS, IL-1 y RANKL estimulan la su-pervivencia de los osteoclastos a través de TLR-4, IL-1R y RANK,respectivamente. MyD88 participa en la supervivencia de los oste-oclastos mantenida por LPS y IL-1, pero no por RANKL. ERK: ci-nasa regulada por señales extracelulares; IL: interleucina; LPS: li-popolisacárido; MEK: cinasa MAPK-ERK; MyD88: factor 88 dediferenciación mieloide; RANK: receptor activador del factor nu-clear kappa-B (NF-κκB); RANKL: ligando de RANK; TLR: receptor tipoToll;TRAM: molécula adaptadora relacionada con TRIF;TRIF: adap-tador que induce interferón ββ y que contiene el dominio Toll/re-ceptor de IL-1.

A Macrófagos B Osteoblastos C Osteoclastos

LPS LPS LPSIL-1 IL-1 RANKLDiacil-lipopéptido

TLR4

TRAM TRAM TRAM

TRIF TRIF TRIFPKC

MEK/ER K

RANKL

Producciónde IL-6 Producción

de IL-6Formación deosteoclastos

Supervivenciade osteoclastos

maduros

MyD88 MyD88MyD88

MyD88

TLR4 TLR4IL-1RIL-1R RANK

TLR2 TLR6

e IL-1α estimulan la formación de osteoclastos. El muramil-dipéptido por sí solo no pudo inducir la formación de osteo-clastos en el cocultivo, pero potenció dicha formación trasla inducción con LPS, IL-1α o TNF-α, pero no con 1α,25(OH)2D3 o PGE2 (37). El muramil-dipéptido no pudo au-mentar la formación de osteoclastos a partir de progenito-res de osteoclastos ante la inducción de RANKL o del TNF-α, pero activó la expresión de RANKL en osteoblastos tratadoscon LPS o TNF-α, aunque no con 1α,25(OH)2D3. Los osteo-blastos expresaban ARNm de Nod2, un sensor intracelulardel muramil-dipéptido, en respuesta al LPS, IL-1α o TNF-α,pero no con 1α,25(OH)2D3. La inducción de la expresión deARNm de Nod2 por LPS, pero no por TNF-α, en los osteo-blastos, dependía de TLR-4 y MyD88. El muramil-dipéptidotambién aumentó la formación de osteoclastos inducida porTNF-α en cocultivos preparados a partir de ratones defi-cientes en la proteína adaptadora que contiene el dominioToll-IL-1R, a través de la activación de la expresión de ARNmde RANKL en osteoblastos, lo que sugiere que TLR-2 no par-ticipa en la formación de osteoclastos inducida por mura-mil-dipéptido (37). La depleción de Nod2 intracelular porparte de pequeñas moléculas de ARN de interferencia blo-queó la activación inducida por el muramil-dipéptido delARNm de RANKL en los osteoblastos. LPS y RANKL estimu-laron la supervivencia de los osteoclastos, y este efecto nose vio potenciado por el muramil-dipéptido. Estos resulta-dos sugieren que este último potencia de forma sinérgica laformación de osteoclastos inducida por LPS, IL-1α y TNF-αa través de la expresión de RANKL en los osteoblastos, y que

en dicha expresión inducida por muramil-dipéptido parti-cipan señales mediadas por Nod2 (37) (fig. 6).

En conclusión, el muramil-dipéptido potenció la forma-ción de osteoclastos inducida por LPS, IL-1α o TNF-α en co-cultivos, a través de la estimulación de la expresión de RANKLen osteoblastos. LPS e IL-1α estimularon la expresión deARNm de Nod2 en los osteoblastos a través de la señaliza-ción mediada por MyD88, mientras que TNF-α indujo la ex-presión de ARNm de Nod2 en los osteoblastos a través deuna señalización independiente de MyD88 (fig. 6). La re-ducción de la expresión de Nod2 por pequeñas moléculasde ARN de interferencia bloqueó la activación inducida porel muramil-dipéptido del ARNm de RANKL en los osteo-blastos. Estos resultados sugieren que Nod2 actúa como re-ceptor intracelular del muramil-dipéptido para inducir la ex-presión de RANKL en los osteoblastos (fig. 6). Se hademostrado que dicha sustancia aumenta la producción decitocinas proinflamatorias en las células monocíticas en pre-sencia de LPS. Dichos resultados sugieren que el muramil-dipéptido puede desempeñar un papel clave en la resorciónosteoclástica del hueso en las enfermedades inflamatorias,como la periodontitis.

Periodontology 2000, Vol. 43, 2007, 56-64

Bibliografía disponible en la versión electrónicade la revista: www.ArsXXI.com/PERIO

Udagawa et al.

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Fig. 5. Transducción de señales por Nod2 en la producción de ci-tocinas inflamatorias. El muramil-dipéptido, la unidad estructuralmínima esencial, responsable de la actividad inmunoadyuvante delos peptidoglucanos, se distribuye de forma ubicua en las paredescelulares de las bacterias gramnegativas y grampositivas. Nod2, unmiembro de la familia de proteínas Apaf1/Nod, es un sensor intra-celular del muralmil-dipéptido. Nod2 consta de dos dominios N-terminales de atracción de caspasa, un dominio central de unióna nucleótidos, y repeticiones ricas en leucina en el extremo C-ter-minal, y funciona como un adaptador en la transducción de seña-les. MDP: muralmil-dipéptido; NF-κκB: factor nuclear kappa-B;Nod2: dominio 2 de oligomerización que se une a nucleótidos

Fig. 6. Posible papel del MDP en la osteoclastogénesis inducida porLPS, IL-1αα y TNF-αα. LPS y IL-1a inducen a los osteoblastos a ex-presar Nod2, un receptor celular de MDP, a través de TLR-4 y IL-1R, respectivamente. MyD88 participa en la señalización mediadapor TLR-4 e IL-1R. TNF-αα se une a su receptor TNFR e induce la ex-presión de Nod2 a través de una vía independiente de MyD88. MDPse une a Nod2 y potencia de forma sinérgica la expresión de RANKLinducida por LPS, IL-1αα y TNF-αα. Por otro lado, 1a,25(OH)2D3 in-duce directamente la expresión de RANKL a través del receptor devitamina D (VDR) de forma independiente de Nod2. IL: interleu-cina; LPS: lipopolisacárido; MDP: muramil-dipéptido; Nod2: do-minio 2 de oligomerización que se une a nucleótidos; MyD88: fac-tor 88 de diferenciación mieloide; RANKL: ligando del receptoractivador del factor nuclear kappa-B (NF-κκB); TLR: receptor tipoToll; TNF-αα: factor de necrosis tumoral αα; TRIF: adaptador que in-duce interferón b y que contiene el dominio Toll/receptor de IL-1.

Bacteria LPS IL-1α TNF-α

TRL4 IL-1R TNFR 1α,25(OH)2D3

MDP

Osteoblastos RANKL

VDR

MyD88TRIF

NOD2

Formación de osteoclastos

NOD2

RIP2MDP

Citoplasma

Activación de NF-κB

Componentebacteriano

Invasión de bacterias

Expresión génica decitocinas inflamatorias

Núcleo

Transducción de señalesde la diferenciación de osteoclastosinducida por el lipopolisacárido

Nobuyuki Udagawa, Nobuaki Sato,Shuhua Yang, Midori Nakamura,Teruhito Yamashita, Hiroshi Nakamura yToshihide Noguchi

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