traduccion de articulo rig-1 y el vhb

8/17/2019 Traduccion de articulo RIG-1 y el VHB

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EL RIG-I SENSOR DE ARN CON FUNCION DOBLE COMO SENSOR INATO

Y FACTOR ANTIVIRAL DIRECTO PARA EL VIRUS DE LA HEPATITIS B

En breve

El mecanismo de detección de virus de la hepatitis B (HBV) y los eventos de

señalización posteriores quedan por totalmente aclarado. Sato y coleasdemuestran que la !"#$" sensor %!& no sólo detecta %!& de HBV preenómicopara inducir pre'erentemente la producción de inter'erón tipo """ sino quetambin contrarresta la interacción de la polimerasa viral con el %!&preenómico para la de'ensa antiviral contra el VHB.

%spectos m*s destacados

• "+& tipo """ se induce predominantemente en hepatocitos humanosdurante la in'ección HBV

• !"#$" detecta el enotipo del VHB % B y , para la inducción de "+& tipo

"""• -a reión /$0 del VHB p%!& es un elemento clave para el

reconocimiento inmediato de !"#$l• !"#$" contrarresta la interacción de VHB 1 con p%!& para suprimir la

replicación viral


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!ES23E&

El reconocimiento innato del husped desencadena la respuesta inmune clavepara la eliminación viral. El mecanismo de detección de virus de la hepatitis B

(HBV) un virus de %4& y la 'orma de señalización a5n no se han aclaradocompletamente. %qu6 se encontró que el tipo """ pero no el tipo " deinter'erón se inducen predominantemente en hepatocitos primarios humanosen respuesta a la in'ección por VHB mediante el *cido retinoico se induce elen $" (!"#$") (-os receptores tipo !"# (en inducible por *cido retinoico)detección mediada por la reión 7 $0 de %!& preenómico del HBV. %dem*s!"#$" podr6a tambin contrarrestar la interacción de la polimerasa del VHB(prote6na 1) con la reión 7 $0 de una manera dependiente de unión al %!&que suprimiendo consistentemente la replicación viral. -a liberación mediadapor lisosomas y la e8presión basada en el vector de esta reión derivada 0 !&%

en el h6ado abolieron la replicación del VHB en hepatocitos humanos$quimricos de ratón. Estos hallazos identi9can un mecanismo dereconocimiento innato por el cual !"#$" tiene 'unción doble como un sensor deHBV en la activación de la señalización innata y para contrarrestar lapolimerasa viral en hepatocitos humanos.

"&:!;42,,"F y "-$>G) e8hibepotente actividad antiviral similar a la de "+&$a y "+&$b. -a producción de "+&stipo " y de tipo """ es inducida masivamente en muchos tipos de clulas despusde la in'ección con diversos virus se sabe que es mediada por la activación de


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los receptores de reconocimiento de patrones (1!!). 4urante la in'ección porvirus *cidos nucleicos derivados de un virus (%!& y %4&) se detectanprincipalmente por ciertos 1!!s tal como el en$" (!"#$") inducible por el *cidoretinoico la di'erenciación asociada del melanoma al en (34%) c6clicosintasa #31$%31 (,#%) y el "+&$ inducible por la prote6na I ("+"I) En

particular !"#$" es un 1!! clave que puede detectar %!&s derivados de virusen el citoplasma durante la in'ección como el virus de la ripe virus de lahepatitis , (VH,) y virus del sarampión que est*n estrechamente relacionadasa la en'ermedad humana. -a unión de !"#$" de su %!& liando tal como %!&7$tri'os'orilada o %!&s cortos de doble cadena activa las v6as de señalizaciónde una manera dependiente de la prote6na adaptadora mitocondrial antiviralprote6na de señalización (3%VSJ tambin conocidos como "1S$ V"S% o ,ardi')lo que lleva a la inducción de la e8presión del 'actor reulador = del "+& ("!+$=)y la e8presión del en &+$?B dependiente ('actor nuclear potenciador de lascadenas lieras ?appa de las clulas B activadas) y la subsecuente producciónde "+& tipo " y tipo """ y citoquinas in@amatorias. 1or lo tanto el !"#$"detectando %!& viral es un proceso crucial para activar las respuestas innatasantivirales para limitar la replicación viral y la activación de la inmunidadadaptativa.

En cuanto a los virus que se sabe que son la principal causa de la in@amaciónhep*tica !"#$" es la principal 1!! que inicia la respuesta inmune innata contraH,V. !"#$" de detección de VH, est* mediada a travs de su reconocimiento depoli$2A2, motivo de la reión =7 no traducida del enoma de %!& del VH, loque conduce a la activación de respuesta del "+& de tipo ". 1or otro ladoestudios anteriores han demostrado que la activación del sistema inmune

innato se deteriora y la inducción de "+& tipo " tales como "+&$C o "+&$D es enmodelos animales de in'ección por VHB en comparación con la in'ección porVH,. Sin embaro todav6a no est* aclarado completamente cómo HBV esreconocido por los hepatocitos humanos y el papel del "+&s tipo """.

%qu6 mostramos que la in'ección por el VHB induce predominantemente de tipo""" pero no de tipo " "+& inducción de enes que est* mediada por !"#$" atravs de su reconocimiento de la reión 7$0 de p%!& del HBV derivado.

:ambin mostramos que !"#$" puede contrarrestar la interacción de lapolimerasa del VHB (prote6na 1) con la reión 7 $0 de p%!& de una maneradependiente de %!& de unión lo que resulta en la supresión de la replicación

del VHB. %dem*s la liberación mediada por lisosomas y la e8presión de lareión 7 $0 !&% derivada en el h6ado suprimen la replicación del VHB in vivoen ratones quimricos con h6ados humanizados. 1or lo tanto nuestrosresultados demuestran los mecanismos de de'ensa innatos basados en lainteracción %!&$!"#$" por lo cual las 'unciones de !"#$" no sólo como unsensor de HBV para la activación de la respuesta de "+& sino tambin como un'actor antiviral directo.


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!ES2-:%4;S

"+&S 4E :"1; """ 1!E4;3"&%&:E3E&:E SE "&42,E& E& -;S HE1%:;,":;S42!%&:E -% "&+E,," y !S%4> pero no "+&$D soninducidos en estas clulas despus de la in'ección con HBV$, y que estas

inducciones 'ueron abolidas por tratamiento con -%3 (+iura 4). 1ara evaluarla siuiente respuesta inmune innata en vivo durante la in'ección por HBVhemos e8plotado la inmunode9ciencia combinada rave en los ratones quetransportan el tipo uroquinasa activador del plasminóeno transn controladopor un promotor de alb5mina (u1% M A M A S,"4 ratones) en la que m*s de NOPde los hepatocitos murinos 'ueron reemplazados por hepatocitos humanos (enlo sucesivo ratones quimrico). 4espus de que los ratones quimricos sein'ectaron por v6a intravenosa con HBV$, que se derivó de los pacientes con


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hepatitis crónica la e8presión de "+& m!&%s tipo """ aumentó en el teidohep*tico mientras que los "+&$aK e "+&$b m!&%s no se incrementaron (+iuraE). En paralelo con esta respuesta de "+& de tipo """ tambin se observó lae8presión de los enes de "+&$inducible como ,Q,-O ;%S> y !S%4> en elh6ado humano de estos in'ectados los ratones (+iura E). Estos hallazos

indican que un tipo moderado """ pero no de tipo " o tipo "" "+& da reacciónactiva en hepatocitos humanos en respuesta a la in'ección por HBV.

HBV "&42,"4; EQ1!ES% "+& :"1; """ 4E1E&4"E&:E3E&:E 4E !"#$"

% continuación se determinó que la v6a de señalización mediada por sensor esresponsable de HBV inducidir "&+ tipo lll en respuesta. ,omo HBV es un virusde %4& se evaluó la contribución de los in'ormes anteriores sensores de %4&citosólicas incluyendo !"#$" "+"I y los ,#% en hepatocitos humanos. %n*lisis4esmontables revelaron que la inducción de "+&$ en Hep#> o Huh$N clulaspor trans'ección de pl*smidos para el VHB$, o VHB$%e respectivamente 'ue

suprimida por la ca6da de !"#$" pero no la de los otros sensores (+iuras >%S>% y S>B). 1ara con9rmar a5n m*s la participación de !"#$" en el tipo HBVdesencadenando una respuesta del "+& """ se midió la e8presión de %!&m de"+&$ inducida por la e8presión del pl*smido en clulas Huh$N. que portan unalelo !"#$" mutante dominante neativo que previene la !"#$" de señalizaciónen comparación con Huh$N las clulas que tienen una v6a intacta !"#$". -asclulas Huh$N. 'allaron en inducir la e8presión de %!&m de "+&$ enrespuesta a VHB$%e pl*smido enoma de la trans'ección como en el caso de laestimulación con 7 tri'os'ato !&% (=p!&%) un liando !"#$". (+iura >B). Enconcordancia con este resultado desmontables de la prote6na que contienemotivo tripartito > (:!"3 >) 3%VS la unión :%&R$quinasa (:BR) y "!+$=todos los cuales son molculas de señalización esencialmente implicados en lav6a de "+& mediada !"#$" dio como resultado la supresión de la inducción de"+&$ induccion %!&m en clulas Hep#> en respuesta a la trans'ección con elenoma del HBV$,. 1or otra parte tal e'ecto no se observó en las clulastratadas ya sea con :!"+ (tambin conocido como t",%3$) o 34FF si!&%(+iuras >, y S>,). %dem*s se con9rmó que la ca6da de !"#$" y 3%VS abolió lainducción de "+&$ en la H11 in'ectados con cada enotipo (+iura >4). 1orotra parte tambin se con9rmó mediante el ensayo de ca6da que la inducciónde "+&$ y ;%S> %!&m en las clulas Hep#>$h&:,1$,K en respuesta a lain'ección por el VHB$, depend6a de !"#$" (+iura S>E). Estos datos indican que

la inducción de enes de "+&$ durante la in'ección HBV depende en ranmedida de !"#$" v6a de señalización.


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+iura . "nducción de "+&$ en los hepatocitos humanos en respuesta a lain'ección por HBV

(%) !:$1,! cuantitativa (T!:$1,!) an*lisis de "+& (izquierda) "+&CK (centro)y "+&D (derecha) m!&% en los tiempos indicados despus de la trans'eccióncon >K veces el enoma del VHB (enotipo %e B o ,) o vector vac6o (3oc?)en las clulas Hep#>.

(B) E-"S% de "+&$l a KF o N> horas despus de la trans'ección con el enomadel HBV en las clulas Hep#>. -a l6nea de puntos indica la cantidad m6nimadetectable (=> p A ml) de "+&$ por el ?it de E-"S%. &4 no se detectaindica debao de la cantidad m6nima detectable.


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(,) T!:$1,! an*lisis de "+& "+&> y "+&= m!&% a las >K horas despus dela in'ección con HBV &4V (multiplicidad de in'ección U O) o moc? ($) omedios -amivudina tratados (-%3) como control en hepatocitos humanosprimarios (H1H). El n5mero de copias de m!&% ( S4) de cada subtipo de tipo"+& """ por m de %!& total en el momento de la in'ección HBV$, es la

siuienteW "+& (F=GN.I I>K.K) y "+&> A = (KOG>FO.I GINI.>).

(4) :iempo de an*lisis por T!:$1,! de "+& ;%S> !S%4> "+&D %!&m yp%!& en los tiempos indicados despus de la in'ección por VHB en clulasHep#>$h&:,1$,K. :ambin se analizó el e'ecto del tratamiento con lamivudina.

(E) %n*lisis de T!:$1,! de "+& "+&> "+&= "+&CK "+&D ,Q,-O ;%S> y!S%4> m!&% de teidos de h6ado en K o semanas despus de la in'eccióncon HBV$, en ratones quimricos. ($) ratones no in'ectados. -as l6neas roasrepresentan la media de cada conunto de datos. X 1 YOO y XX p YOO 'renteal control. !E e8presión relativa. (%$4) -os datos son presentan como media y

S4 (n U =) y son representativos de al menos tres e8perimentosindependientes. Vase tambin la 9ura S.

-% !E#" ?b. 4urante un ciclode vida de HBV en los hepatocitos covalentemente %4& circular cerrado(ccc4&%) se transcribe para enerar cuatro principales especies de %!&W el =.>.K >. y O.N ?b transcripciones de %!& viral. Hemos creado un %!&si parasuprimir la e8presión de todos estos transcritos de %!& y se probó su e'ectosobre la e8presión de "+&$l HBV$inducida. ,omo se muestra en la +iura =Bdesmontables con este si!&% (+iura S=%) suprimió la inducción de "+&$- enclulas Huh$N a'ectadas con HBV$%e. -o Siuientepara determinar cu*l deestas transcripciones de %!& del VHB est* A est*n involucrados en la inducciónde "+&$- mediada por !"#$" preparamos vectores de e8presión para e8presarcada uno de estos cuatro transcripciones virales en clulas HER>G=: que amenudo se utilizan para analizar !"#$" de señalización de la v6a en las clulashumanas. ,omo resultado sólo es la transcripción m*s lara = ?b es decirp%!& que tiene el potencial para provocar una inducción sini9cativa de "+&$


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l m!&% (+iuras =, y S=B). :ambin se con9rmó por an*lisis de ca6da conp%!& orientada si!&% que mostró una supresión sini9cativa de la inducciónde "+&$- en clulas Hep#> a'ectadas con HBV$%e (+iura S=,). Estosresultados suieren que la reión O $ ?b de HBV p%!& es cr6tica para laactivación de la v6a de !"#$" para inducir la e8presión de "+&$l. 1or otro lado el

tres transcripciones restante que :ambin contiene la misma secuencia departe de esta reión de ?b del VHB p%!& en el =O 9nal de sustranscripciones no indueron "+&$- %!&m (+iura =,). 2na 'orma delecionadaarti9cialmente de p%!& que carece de esta secuencia de solapamiento en lareión =O (4=) demostró la inducción de "+&$- que dicha respuesta no 'ueobservado por otro p%!& mutante que carece al O $reion (4) (+iura =4).Estos datos tambin apoyan un posible papel importante de la O secuencia deoverlappin del VHB p%!& de !"#$"mediated la inducción de "+&$-. El O $9ndel VHB p%!& se sepa que contienen la secuencia de encapsulación llamado// psilon (0) // que tiene una estructura secundaria del tallo$bucle.

1or lo tanto la hipótesis de que este 7$0 estructura podr6a con'erir unposible patrón molecular (1%31) motivo asociado a patóenos para elreconocimiento de !"#$". 1ara probar esta hipótesis se estimuló clulasHER>G=: y Hep#> con la 0 reión derivada %!& (en lo despus llamada0!&%). En consecuencia "+&amma m!&% 'ue sini9cativamenteinducida que era dependiente de !"#$" mientras que no se detectórespuesta a la estimulación con el equivalente lonitud de !&% que sederiva de HBV p%!& pero que no contiene nin5n elemento 0(,ont!&%) (+iura= E y S= !E). :ambin con9rmamos que !"#$"$dependiente de la activación de la "!+$= en respuesta a la estimulacióncon 0!&% (9uras S= 4 y S=E). 4ebido a la superposición en la secuenciade 7 y =7 de HBV p%!& como se mencionó anteriormente esteelemento 0 se encuentra en ambos e8tremos de p%!&. % continuacióneneramos varias 'ormas mutantes de HBV p%!& cada uno de loscuales lleva mutaciones dentro de reión 7 o =7$0 o ambos' parainterrumpir la estructura de bucle tallo (S:3 =S:3 o y =S:3respectivamente). En concordancia con los resultados mostrados en las+iuras = , y =4 y S= B se detectó la inducción del %!&m de "+&$ldespus de la e8presión de la transcripción =S:3 que tiene una reión7$0 intacta es similar a la intacta de p%!& =$?b ( 9ura =+). 1or elcontrario ya seaS:3 o y =S:3 no mostraron respuesta sini9cativa. Estas hallazosindican que el 7 $0 reión de HBV p%!& es cr6tica para la inducción de"+&$amma posiblemente a travs del reconocimiento por parte de !"#$".


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+iura >. !"#$" dependiente de "+&$l de inducción en respuesta a la in'ecciónpor HBV (%) clulas Hep#> tratadas con %!&si de control (,ontrol) o si!&%diriidos !"#$" "+"I o cas 'ueron a'ectadas con el enoma del HBV$, para KFo N> horas. -a cantidad de "+&$l se midieron por E-"S%. -a l6nea de puntosindica la m6nima e8presión de citoquinas detectada (=> p A ml) de "+&$l porel ?it de E-"S%. &4 no se detecta indica a continuación -as concentracionesdetectables (izquierda) y la e9ciencia desmontables se analizaron porinmunotrans'erencia ("B) (derecha).

(B) an*lisis de T!:$1,! de %!&m en "+&- Huh$N o Huh$N. clulastrans'ectadas con el enoma de HBV$%e (a las >K horas despus de latrans'ección) o estimulados con =p!&% ( m A ml) durante I hr. clulas

(,) Hep#> tratadas con %!&si de control (,ontrol) o los si!&%s indicadas'ueron a'ectadas con el enoma del HBV$,. En KF horas despus de lain'ección los %!& totales se sometieron a an*lisis de T!:$1,! para "+&-.


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(4) T!:$1,! an*lisis de m!&% en "+&- si!&% tratados 1HH a >K despus dela in'ección con el enotipo del VHB hr indicado. 3oc? el vector vac6o. &oin'ectada. -os datos se normalizaron a la e8presión de #%14H. -os datos sepresentan como media y S4 (n U =) y son representativos de al menos trese8perimentos independientes. X 1 YOO y XX p YOO 'rente al control en (B) o

el rupo de control in'ectado por el VHB en (% , y 4). &SW no sini9cativo.Vase tambin la 9ura S>.

RIG-I interactúa con a Re!i"n-# $e %!ARN

% continuación se evaluó la interacción de !"#$" con la reión 0 de HBVp%!& que es 0!&%. Ensayos despleables de %!& mostraron que labandera de etiquetado !"#$" 'ue coprecipitado con 0!&% pero no con,ont!&% en las clulas HER>G=: (+iura K % arriba). 4el mismo modo!"#$" endóena interactuaba con 0!&% aunque dbilmente (+iura K %parte in'erior). Se demostró adem*s la localización intracelular de !"#$"con 0!&% en las clulas Huh$N. (+iura K B). %dem*s el ensayo deinmunoprecipitación de prote6nas de unión a %!& (!"1) reveló que sedetectó la lonitud total del HBV p%!& en el !"#$"$inmunoprecipitacióncompleo y 7 =7 de p%!& eran tambin detectado (+iura SK %) que esaparentemente incompatible con los resultados del ensayo 'uncional(+iuras =, =4 =+ y S=,). Estos resultados suieren que se requiere lareión 0 para su interacción con !"#$" pero sólo la reión 7$0 esnecesaria activar la via !"#$". \"ntentamos determinar qu reión del!"#$" media su interacción con el VHB p%!&]. :anto el ensayo de !"1 y

el ensayo de %!& despleable con varios mutantes de deleción de !"#$"mostró que la porción ,$terminal de !"#$" (,$!"#) incluyendo su helicasade dominio y dominio represor (!4) e8cepto para las ,%!4S puedeunirse a HBV p%!& (+iura K,J +iuras SKB y SK,). %dem*s el ensayode desplazamiento de el mostró que la interacción de HBV 0!&% op%!& se deterioran con el !4 o mutante ,$!"# respectivamente cadauno de los cuales lleva una mutación puntual (RFFFE) que suprime suactividad de unión al %!& (+iure K4). 2n resultado similar se obtuvotambin mediante el ensayo de !"1 en donde la de tipo salvae (^:) ,$!"# pero no el mutante RFFFE era co$inmunoprecipitacion con HBVp%!& (+iura SK 4) al iual que el %!& del H,V que se hab6ain'ormado anteriormente para interactuar con !"#$" (+iura SKE). :ambin con9rmó la interacción de HBV p%!& con !"#$" endóena enlas clulas Hep#> mientras que su interacción con otros sensores de*cido nucleico como "+"I y 34% no se detectó (+iura KE). Estosdatos indican que la reión 7 $0 viral de p!&% tiene 'unciones como

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un patrón molecular asociado al HBV para ser reconocidoespec69camente por !"#$" y puede desencadenar la respuesta de "+&$amma.

+iura =. %ctivación del !"#$" es mediada por el reconocimiento de la !eión 7del VHB p%!&

(%) -a actividad de luci'erasa de un reportero de "+&$- pl*smido despus >Khora de est6mulo con *cidos nucleicos (> m A ml) e8tra6dos de Huh$N clulastrans'ectadas con el pl*smido de control (3oc?) o el enoma HBV$%e con o sin!&asa % o el tratamiento 4&asa. !-2 (unidades relativas de luz) de luci'erasa.

(B) clulas Huh$N tratadas con el control o el VHB !&%$diriida si!&% 'uerontrans'ectadas con el #enoma del VHB$%e o 9nida. 4espus de >K horas detransin'ección %!& totales se sometieron a T!:$1,! para "+&-.


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(, y 4) una representación esquem*tica de cuatro tipos %!& de HBV p%!&(= ?b) >K ?b > ?b y ON ?b %!& en (,) y dos 'ormas de borrados p%!&4 y 4= en (4). -a reión de superposición se muestra en azul. T!:$1,!an*lisis de "+&- %!&m de las clulas HER>G=: despus de >K horas de latrans'ección con los vectores de e8presión indicados. -os datos se

normalizaron a la cantidad de cada %!& de HBV e8presión (, y 4).

(E) 2na representación esquem*tica de p%!& 0!&% u control de %!&(,ont!&%) (izquierda). -as clulas HER>G=: 'ueron tratadas con control o !"#$"si!&% sin estimular (3oc?) o estimulados con 0!&% durante > h. -os %!&stotales se sometieron a T!:$ 1,! para "+&- (en el centro). T!:$1,! an*lisisde "+&- m!&% en clulas HER>G=: despus de > h de estimulación con 0!&%o ,ont!&% (derecha). ,ada uno de los %!& 'ue preparado mediantetranscripción in vitro.

(+) -as clulas HER>G=: 'ueron trans'ectadas con cada pl*smido de mutantes

de tallo$bucle de p%!& (S:3 =S:3 o y =S:3) y despus se sometieron aan*lisis de T!:$1,! como se describe en (,). X p YOO y XX p YOO 'rente alcontrol en (% B y E) o 'rente a =.R en (, 4 y +). &SW no sini9cativo. Vasetambin la +iura S=

RIG-I e&erce 'na acti(i$a$ anti(ira a contrarre)tar o)Interacci"n $e a %oi*era)a $e HBV con %!ARN

% continuación se evaluó la contribución de la v6a de !"#$" en de'ensaantiviral contra la in'ección HBV. !"#$" bloqueado en 1HH dado comoresultado un n5mero de copias del enoma del VHB superior a los O

d6as despus de la in'ección por el VHB$, en comparación con 1HHtratado con ,ontrol de si!&% (+iura %). 2na observación similar sehizo con !"#$" si!&%$tratada para clulas HuS$EA> ( +iura S%). Estosresultados indican el papel implicado de !"#$" como un sensor innatopara la respuesta antiviral contra la in'ección por el HBV. 1or otra partese ha in'ormado anteriormente de que la reión 7 _0 HBV p%!& esimportante para servir como un sitio de unión de la prote6na viral 1 parainiciar la transcripción inversa. ,onsistente con esto hemos demostradoque la 1 prote6na interact5a con 0!&% en las clulas Huh$N. y HER>G=:por la trans'erencia de ener6a por resonancia de @uorescencia (+!E:)an*lisis (+iura B) y ensayo despleable de %!& (+iura SB)

respectivamente. Estos resultados nos 'acilitaron para e8aminar si !"#$"podr6a bloquear el acceso de la prote6na 1 hacia la reión 0. :al y comoesper*bamos la prote6na de !"#$" recombinante suprimió la interacciónde la prote6na 1 con p%!& de una manera dependiente de la dosis(+iure ,). :al e'ecto inhibidor se observó tambin en las clulas Huh$N. por la e8presión de ^: !"#$" as6 como su :" o R>NO% mutante(+ iuras 4 y S,) los cuales no son capaces de inducir la activacióndependiente de liando de la señalización descendente pero conservan

https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10


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su actividad de unión a %!&. 1or otra parte la RFFFE mutante no pod6ainhibir la unión de 1rote6na 1 con p%!& (+iuras 4 y S,). %dem*s eltratamiento con "+&$amma recombinante en clulas Huh$N. aumentala cantidad de la prote6na mutante !"#$" (:") (+iura S4) lo queresulta en una inhibición parcial de la interacción de la prote6na 1 con

p%!& y este e'ecto inhibidor 'ue revocado por la reducción de !"#$"(+iura E). 4e hecho el an*lisis +!E: mostró que la interacción de laprote6na 1$0!&% se suprimió sini9cativamente mediante la e8presiónde la !"#$" !4 (^:) solo pero no el !4 mutante (RFFFE) (+iura SE).1or otra parte la replicación del HBV tambin 'ue suprimida por lae8presión de la !"#$" !4 (^:) en las clulas Huh$N. en donde cualquierinducción de "+& no se observa mientras que el !4 mutante (RFFFE) noa'ectó la replicación viral (+iura +). Estos resultados revelaron otroaspecto de !"#$" como un 'actor antiviral directo a travs de suinter'erencia con la unión de la prote6na de 1 de HBV con p%!& en unv6a de "+& de manera independiente.

+iura K. !"#$" interact5a con la !eión de 0 p%!&

(%) Ensayo despleable de %!& que muestra la actividad de unión de los%!& indicados a la Bandera de etiquetado !"#$" (Bandera$!"#$") en

https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#8https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10https://translate.googleusercontent.com/translate_f#10


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clulas HER>G=: (arriba) o endóeno !"#$" en las clulas Hep#> (partein'erior).

(B) +!E: an*lisis de la interacción de etiquetado +1$!"#$" (+1$!"#$")con rodamina (!;Q) y conuado con 0!&% (0!&%$!;Q) o ,ont!&%

(,ont!&%!;Q). "m*enes de @uorescencia representativos de +1 !;Qy +!E:, A +1 (la relación de +!E: correido (+!E:,) para +1). -aspuntas de @echa indican el *rea que muestra una alta e9ciencia de +!E:.-a barra de escala representa >O micom. 4erecha r*9co de puntos derelación +!E:, A +1 (pequeñas 'ranas horizontales sini9can).

(,) Ensayo !"1 con lisados de clulas HER>G=: que e8presan variosmutantes de deleción de la bandera (@a) de etiquetado de !"#$" yvector de e8presión p%!& mediante el uso de un anticuerpo anti$+la."nmunoprecipitaron p%!& se cuanti9có mediante q!:$1,! y se

normalizó a la cantidad de prote6nas inmunoprecipitadas (+iura SK,) yse representa como 'racción de %!& de entrada antes de lainmunoprecipitación (entrada de porcentae).

(4) %n*lisis de el de cambio de la 'ormación de compleos entre 0!&% y!"#$" recombinante !4 (^:) o !4 (RFFFE). -as puntas de @echa indicanla posición de los %!& no unido y los compleos de %!&$!"#$".

(E) Ensayo !"1 con lisados de clulas Hep#> preparadas despus de KFh de trans'ección del enoma del HBV$, mediante el uso de anti$!"#$"

anti$"+"I anti$34% o control inmunolobulina #. -ainmunoprecipitación p%!& se midió mediante T!: 1,! (parte superior)como se describe en (,). -a e8presión de clulas enteras y cantidadesinmunoprecipitadas de !"#$" "+"I y 34% (parte in'erior). -os datos sepresentan como media y S4 (n U =) y son representativos de al menostres e8perimentos independientes. X 1 YOO y XX p YOO 'rente alcontrol en (B y E). &SW no sini9cativo. Vase tambin la 9ura SK.

E #RNA Re)trin!e a re%icaci"n $e VHB en H'*ana+

,e%atocito)-'i*.rico) $e rat"n/Un ratón quimérico es un ratón combinado con genes humanos, cuyo sistemainmunológico responde al ser humano)

1or 5ltimo con base en los resultados anteriores tratamos deaprovechar el potencial teraputico de la interacción con la prote6na 1con 0!&% para el control de la in'ección por HBV. 2n vector 'ue diseñadopara incluir un olio %4& de I= pb que se transcribe en un 0!&%. -os


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e8perimentos in vitro nos con9rmaron que usando clulas Huh$N. queinducen 0!&% por la e8presión del vector$ impulsado capaz de 'uncionarcomo un señuelo de%!& que inter9era con la unión de la prote6na 1 del HBV a p%!& y parainhibir la replicación viral de una manera independiente de "+&

(+iura I% y IB izquierda). 1or otro lado 0!&% no mostró ninunadi'erencia en la replicación del VH, en comparación con el control(+iura IB derecha). ,on el 9n de evaluar la e9cacia teraputica de0!&% in vivo hemos aprovechado el modelo de in'ección HBV dehumanos en ratones con hepatocitos quimrico. !atones in'ectados porel VHB se sometió a la administración intravenosa con el vector dee8presión 0!&% carado en un veh6culo liposomal un dispositivomulti'uncional tipo envoltura nanometrico (3E&4) para la entreae'iciente durante > semanas. El tratamiento con 0!&%$3E&4 suprimiósini9cativamente la elevación del n5mero de copias del enoma viralen el suero por menos de un dcimo de los de los ratones de control

(+iura I,). ,onsecuentemente -os an*lisis de inmuno@uorescenciamostró que la e8presión de ant6eno core de HBV (HBc%) en los teidosdel h6ado de ratones quimricos con el tratamiento de 0!&%$3E&4 sereduo notablemente en comparación con los de control de los ratones(+iura I4).

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+iura . +unciones !"#$" como un +actor antiviral contrarrestando lainteracción de la prote6na 1 de HBV con p%!&

(%) an*lisis de q1,! de n5mero de copias de encapsuladas del %4& del

VHB (izquierda) y T!:$1,! de RIG-I (centro) y IFNL1 %!&m (derecha) enel control o !"#$"$si!&% tratada 1HH despus de O d6as de la in'eccióncon el VHB$,.(B) %n*lisis +!E: para la interacción entre +1$bandera prote6na 1 (+1$1) o +1 y 0!&%$!;Q como se describe en la +iura KB. -a barra deescala representa >O microm. -as puntas de @echa indican el *rea quemuestra una alta e9ciencia de +!E:.

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(,) -isados de clulas HER>G=: que e8presan p%!& y H%$etiquetadosprote6na 1 (H%$1) se incubaron con la cantidad indicada de !"#$"recombinante (r!"#$"). -a interacción de p%!& con H%$1 era analizadapor ensayo !"1 y an*lisis de T!:$1,! como se describe en la +iura K,.

(4) -os lisados celulares a partir de clulas Huh$N. que e8presan VHBp%!& H%$1 y la bandera$!"#$" o sus mutantes como indicadores 'ueronsometidos al ensayo !"1 para la caracterización de la capacidad de !"#$"de contrarrestar la interacción de p%!& con H%$1 como se describeen la +iura K,.

(E) El e'ecto del tratamiento r"+&$amma en la interacción de p%!&con H%$1 en las clulas Huh$N. era evaluada por el ensayo !"1. En lasclulas Huh$N. que e8presan tanto p%!& y H%$1 'ueron tratados conr"+&$amma (OO nAml) durante >K horas y se sometió a ensayo !"1como se describe en la +iura K,. :ambin se determinó la dependencia

!"#$" por an*lisis !"#$" bloqueado.

(+) -a clulas Huh$N. se trans'ectaron con un vector de e8presión de!"#$" !4 (^:) o !4 (RFFFE) unto con el enoma del HBV$%e. 4espusde N> h de trans'ección el n5mero de copias de %4& HBV encapsuladasse midieron (a la izquierda) como se describe en (%). -a e8presión de labandera$!"#$" !4 (^:) y !4 (RFFFE) (derecho). X 1 YOO y XX p YOO'rente al control. &S insini9cante. Vase tambin la 9ura S

4"S,2S"= K). Eneste sentido tambin ha habido varios in'ormes que muestran que elHBV Q o prote6na 1 interact5a con 3%VS o compite por la unión con

44Q= :BR respectivamente e inhibe el !"#$" v6a mediada por "+& tipo" que posiblemente permite evadir al BHV la respuesta antiviral inmuneinnata. Esto re@ear6a el importante papel de la señalización mediada de!"#$" para la de'ensa antiviral contra la in'ección por HBV aunque ser*necesario realizar m*s investiaciones para determinar si otra detecciónde molculas a e8cepción de !"#$" est*n involucrados en la activaciónrespuestas de innatas en otros tipos de clulas incluyendo subconuntosde clulas dendr6ticas. ,uriosamente han mostrado recientemente que

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la enotipo 4 de HBV es detectado por 34% pero no !"#$" que esbasada 5nicamente en los an*lisis con el pl*smido enoma del VHB (>veces) trans'ección en una 5nica l6nea de clulas Huh$N. En este sentidosuponemos que estos resultados aparentemente contradictorios pudierasurir principalmente de la di'erencia en el enotipo del VHBW Se ha

in'ormado de que el enotipo 4 es 9loenticamente di'erente de losenotipos % B y , que hemos analizado en este estudio.

%dem*s de acuerdo con nuestros resultados (-a 9ura , y S,) HBVinduce un respuesta de "+& tipo """ que no parece ser e9caz encomparación con el caso de la in'ección por &4V. Especulamos que ladebilidad de la respuesta del "+& durante la in'ección VHB podr6a atribuiral menos en parte a estas evasivas virales de la clula husped decontrol que se apoya en nuestros datos preliminares mostrando quemutante HBV que enera %!& virales incluyendo p%!& pero carece dela capacidad de e8presar toda viral prote6nas incluyendo VHB Q y

prote6nas 1 pueden inducir una mayor cantidades de "+&$amma deVHB intacta (+iura S#). En relevancia con esto nuestros datosactuales indican que la interacción de la prote6na 1 de HBV con el 70tallo$bucle a'ecta a la reconocimiento de p%!& viral mediado por !"#$"y la posterior señalización descendiente d eventos lo queprobablemente podr6a suprimir la inducción de "+&$s0 E)to %'e$e%ro%orcionar 'n a)%ecto $e a %rote1na $e HBV P en t.r*ino) $ea e(a)i"n (ira a %artir $e a acti(aci"n $e RIG-I. ,omo para elmecanismo de la inducción pre'erencial del "+&s tipo """ en hepatocitosen respuesta a HBV as6 como en el H,V 1odr6amos especular lae8istencia de un hepatocito espec69co del 'actor (s) que participa

selectivamente en la inducción del en del "+& tipo """ aunque estacuestión merece mayor investiación incluyendo la evaluaciónepientica de hepatocitos humanos. :ambin se encontró que una delas reiones 7 o =7 $0 de p%!& pod6a interactuar con !"#$" pero 'ue solola reión 7$0 que contribuyó a la inducción de "+&$ (-as 9uras =4y SK%). En relevancia con esto suponemos que alunos co'actor(s)podr6an determinar adicionalmente la utilización pre'erente de lareión 7$0 para la activación !"#$"J sin embaro ser6a el siuienteproblema interesante que hay que resolver. En adición a esto nuestrosdatos demuestran una 'unción hasta ahora no identi9cado de!"#$" como un 'actor antiviral directa contra la in'ección por el VHB

(+iura ). 3ec*nicamente !"#$" se ha encontrado para contrarrestar laaccesibilidad de la prote6na 1 de HBV al 7$0 tallo$bucle de p%!& quees una proceso importante para la iniciación de la replicación viral. ,omoes el caso con esto varios 1%31s virales conocidos son reconocidos por!"#$" por eemplo la poli$2A2, tracto en la reión =7 no traducida delenoma del VH, y la reio terminal 7 del enoma del virus de lain@uenza se in'ormó anteriormente ser directamente o indirectamentecr6tico para la replicación viral. En relevancia con esto se podr6a prever

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que dichas sean eleidas como blanco por !"#$" con'erir6a un mecanismo5nico para aseurar la actividad e9caz antiviral de !"#$". 1or lo tanto!"#$" es probable que desempeñe un papel doble como un sensor innatoy como un e'ector antiviral directo para la de'ensa del husped durantela in'ección viral.

En relación con la evaluación de los e8perimentos se muestra en la+iura I, y I4 se analizaron adem*s los siuientes puntosW ,uando setrataron clulas Hep#> con 0!&%$3E&4 o ,ontrol El 3E&4 en amboscasos casi no detectó la inducción masiva e citoquinas talescomo TNF IL-6 y CXCL10 (datos no mostrados). Esto 'ue con9rmadopor el an*lisis de los ratones S,"4 inyectados con 0!&%$3E&4 o ,ontrol$3E&4 (datos no mostrados). %dem*s 0!&%$3E&4 tiene un e'ectoespec69co sobre la replicación de HBV pero no H,V en las clulas Huh$N. (+iura IB). Estos datos suieren que los resultados (+iuras I, yI4) podr6an no ser in@uenciado principalmente por la producción masiva

de citoquinas antivirales aunque la reactividad cruzada de lascitoquinas debe ser tomada en cuenta cuidadosamente. 1or lo tanto sepresume que el e'ecto de 0!&% podr6a basarse en no sólo su actividadantaonista sino tambin en la actividad de citoquinas queinducen. Estos hallazos podr6an permitirse una nueva modalidadteraputica en sustitución de la medicación antiviral convencionalmedicamentos que han sido reportados a tienen un rieso de desarrollardroas la resistencia del VHB. El presente estudio podr6a proporcionaruna meor apro8imación a la estrateia para el desarrollo de medicina de*cido nucleico y o'recer no sólo una opción atractiva para la terapiacl6nica contra el VHB sino tambin posiblemente a la in'ección por otros

virus.


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+iura I. "nhibición de la replicación de HBV por 0!&%

(%) ,lulas Huh$N. se trans'ectaron con la e8presión vectores para H%$1

y 0!&% unto con el enoma del VHB$%e. El ensayo !"1 se realizó paraevaluar el e'ecto de 0!&% en la interacción entre H%$1 y p%!& como sedescribe en +iura 4.(B) -os n5meros de copia de %4& del VHB encapsulado en clulas Huh$N. que e8presa el enoma del VHB$%e y 0!&% determinado por q1,!(izquierda). -a replicación del VH, en las clulas Huh$N..A!ep$+eo$be8presando 0!&% como se determina por ensayo de luci'erasa(derecha).

(,) -os ratones in'ectados con VHB se les administrado v6a intravenosacon el vector de e8presión 0!&% (0!&%$ 3E&4) o vector vac6o (,ontrol$3E&4) carada en portador liposomal a una dosis de O mA? decuerpo peso cada > d6as durante K d6as. En el suero de ratonesquimricos in'ectados por el VHB se determinó el %4& HBV por q1,! (nU = por rupo). 46a O indica el momento del inicio de la administración.

(4) -as im*enes de inmuno@uorescencia 'ue realizado para ladetección de HBc% (roo) y albumina humana (verde) en las seccionesde h6ado en la in'ección de ratones quimricos a los K d6as despus


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del tratamiento con 0!&%$3E&4 o ,ontrol$3E&4 como se describe enprocedimientos e8perimentales. -os datos se presentan como media yS4 (n U =) y son representativos al menos tres e8perimentosindependientes. XX 1 YOO versus control. &SW no sini9cativo.

1!;,E4"3"E&:;S EQ1E!"3E&:%-ES-a in'ección de los hepatocitos humanos de ratones quimricos con elVHB e in vivo :ratamiento con 0!&%1ara enerar hepatocitos humanos de ratones quimricos 21%MAMAS,"4eran trasplantados con hepatocitos humanos crio conservadosdisponibles comercialmente (2na muer hispana > años de edadJ B4Bioscience) como se describió previamente. -os ratones quimricos sein'ectaron por v6a intravenosa con HBV$, (OI copias por ratón)derivadas de paciente con hepatitis crónica. %!& totales se aislaron delos teidos del h6ado a las O K o semanas despus de la in'ección y

se sometieron a !:$1,! cuantitativa (T!:$ 1,!). En preparación para eltratamiento 0!&% la in'ección por VHB a las = semanas despus de lain'ección se con9rmó mediante la medición del n5mero de copias delenoma viral en el suero de ratones quimricos HBV in'ectados poran*lisis de q1,! y en K semanas despus de la in'ección la e8presióndel vector 0!&% o el vector vac6o carado en una portadora liposomalun multi'uncional de tipo envolvente nanometrico (3E&4) 'ueadministrado por v6a intravenosa a una dosis de O m A ? de pesocorporal (n U = por rupo) cada dos d6as durante K d6as. -as muestrasde suero se sometieron a q1,! para la cuanti9cación de %4& n5mero decopias de HBV como se describe anteriormente. :odos los protocolos con

animales descritos en esta estudio se realizó de acuerdo con la #u6apara el ,uidado y 2so %nimales de -aboratorio y aprobado por el ,omitde 1rotección de los %nimales 1hoeni8 Bio ,o. -td.

-a in'ección por el VHB en hepatocitos humanos y cuanti9cación de %4&HBV encapsulado

-a in'ección por el VHB en 1HH (1rimary human hepatocytes) o clulasHep#>$h&:,1$,K se realizó a los O o OO equivalentes de enoma porclula respectivamente en presencia de KP 1E#FOOO a =N` , durante>K h como se describió previamente. -amivudina (Sima O m3) Se

añadió en Huh$N medios de cultivo durante la producción de HBV. El %4&del VHB se puri9có part6culas intracelulares de core como se describióanteriormente. Brevemente las clulas se suspendieron en tampón delisis que contiene O m3 :ris$H,l (pH NK) E4:% m3 y P de &1$KO. -os n5cleos se sedimentaron por centri'uación a K`, y .OOO rpmdurante min. El sobrenadante se austado a I m3 3;%c y se tratócon 4&asa " (>OO m A ml) y de !&asa % (OO m A ml) durante = horas a=N` ,. -a reacción se detuvo mediante la adición de O m3 E4:% y la


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mezcla se incubó durante min a I`,. 4espus de tratamiento conproteinasa R (>OO m A ml) P de S4S y OO m3 &a,l durante > horasa =N` , los *cidos nucleicos virales se aislaron por 'enolW cloro'ormoWalcohol isoam6lico (>W>KW) e8tracción y precipitación de etanol con >Om de lucóeno. El n5mero de copias de %4& del VHB se midieron por

q1,! con los cebadores indicados (S= :abla).T!:$1,! an*lisis%!& totales se aislaron a partir de clulas de cultivo de teido hep*tico oconelados utilizando "soen (&ippon #ene) y se trataron con 4&asa "("nvitroen). Se preparó %4&c a partir de %!& totales utilizando !ever:ra%ce (:oyobo). -a T!:$1,! 'ue realizada usando SB! 1remie8 E8 :aq(:a?ara) y se analizaron Step;ne1lus en sistema de 1,! en tiempo real(%pplied Biosystems). -a in'ormación detallada acerca de los primersutilizados se muestra en la :abla S=. -os datos se normalizaron a lae8presión de GAPDH o VHB %!& para cada muestra.

Ensayo !"14espus de > h de incubación con el anticuerpo como se indica parainmunoprecipitación precipitación los lisados celulares se mezclaron conla prote6na$# 4ynabeads ("nvitroen) y se incubó adicionalmentedurante h con aitación suave. 4espus de lavar tres veces los %!&precipitados se analizaron mediante q!:$1,! con apropiado cebadorespara detectar el %!& diana. -a cantidad de %!& inmunoprecipitado serepresenta como el percentil de la cantidad de %!& de entrada(porcentae entrada de edad). El detalle se describe en 1rocedimientose8perimentales suplementarios

traduccion de articulo rig-1 y el vhb

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