CAPTULO 2: El examen microscpico de los alimentos y el cuidado y uso del microscopio.Contenido del captulo Directo Examen microscpico de los alimentos (excepto los huevos) Examen microscpico directo de los huevos(2) Cuidado y uso del microscopio Iluminacin y mecanismo correcto del microscopio compuesto Referencias

Si existe alguna razn para sospechar que un alimento ha causado la intoxicacin alimentaria o ha sufrido deterioro microbiano, el producto original o de una dilucin en serie baja de la misma deben ser utilizados para preparar una lmina portaobjeto para el examen microscpico directo.La reaccin de tincin de Gram y la morfologa celular de las bacterias en el portaobjetos pueden indicar la necesidad de otros tipos de examen.Un examen microscpico deber hacerse, a pesar de que la comida pudo haber experimentado tratamiento trmico y los microorganismos implicados pueden ya no ser viables.Un gran nmero de cocos Gram-positivos en el portaobjeto pueden indicar la presencia de enterotoxina estafiloccica, que no es destruido por los tratamientos trmicos que destruyen enterotoxignicasde Staphylococcus aureuscepas.Un gran nmero de formadores de esporas, bacilos Gram-positivos en una muestra de alimentos congelados pueden indicar la presencia deClostridium perfringens, un organismo que es sensible a las bajas temperaturas.Otras bacterias formadoras de esporas gram-positivas tales comoClostridium botulinumoBacilluscereustambin pueden estar presentes en el alimento.Cuando el examen microscpico de alimento sospechoso da a conocer la presencia de muchos bacilos Gram-negativos, considerar los sntomas y perodos de incubacin reportados para la enfermedad bajo investigacin y seleccionar el mtodo de examen especfico para el aislamiento de uno o ms de los siguientes gneros:Salmonella,Shigella,Escherichia,Yersinia,Vibrio, o Campylobacter.

Directo Examen microscpico de los alimentos (excepto los huevos)

A. Equipo y materiales

1. Portaobjeto de vidrio, 25 x 75 mm, con la parte grabada en el etiquetado;1 portaobjeto por cada muestra mezclada de comida (10-1dilucin).2. Lazo de alambre, de 3-4 mm, platino-iridio o nicrom, B & S calibre N 24 o 263. Reactivos de tincin de Gram.4. Microscopio, con la lente de objetivo de inmersin en aceite (95-100X) y ocular 10x.5. Aceite de inmersin6. Metanol7. Xileno

B. Procedimiento

Preparar la pelcula de muestra mezclada de alimentos (10-1dilucin).Secar las pelculas a aire seco y fijar con calor moderado, pasando las pelculas rpidamente por encima de la llama del mechero Bunsen o Fisher unas 3 o 4 veces.Alternativamente, las pelculas a aire seco, se debe fijar con metanol 1-2 minutos, escurrir el exceso de metanol, y flamear o secar a aire seco (esto es particularmente til para los alimentos con un alto contenido de azcar).Enfriar a temperatura ambiente antes de la tincin.Para alimentos con alto contenido de grasa someter mediante la inmersin de pelculas en xileno 1-2 min;escurrir, lavar con metanol, escurrir y secar.Colorear la pelcula por la tcnica de tincin de Gram.Utilice microscopio equipado con objetivo de inmersin, en aceite (95-100X) y ocular 10X;ajustar los sistemas de iluminacin.Examine al menos 10 campos de cada pelcula, sealando los tipos predominantes de los organismos, especialmente las formas clostridiales, cocos grampositivos y bacilos Gram-negativos.

Examen microscpico directo de huevos (2)

A. Equipo y materiales

1. Microscopio, con ocular 10X y objetivo de inmersin (1,8 mm o 90-100X)2. Portaobjetos, 25 x 75 mm o 50 x 75 mm3. Pipeta bacteriolgicas o jeringa de metal, para entregar 0,01 ml4. Norte anilina (aceite)-colorante azul de metileno.5. 0,1 N de hidrxido de litio.6. Solucin salina fisiolgica, 0,85% (estril).7. Agua de dilucin tamponada con fosfato de Butterfield.8. Xileno9. Etanol, 95%

B. Procedimiento para huevos lquidos ycongelados

1. Descongelar los huevos congelados lo ms rpidamente posible para evitar aumento en el nmero de microorganismos presentes.Descongele por debajo de 45 C durante 15 minutos con agitacin continua en bao de agua controlado por termostato.Usando una pipeta bacteriolgica o jeringa de metal, coloque 0.01 ml de material no diluido del huevo en un portaobjetos limpio y seco.Difundir material de huevo de manera uniforme sobre el rea de 2 cm cuadrados (rea circular de 1,6 cm de dimetro es preferido).Aadir gota de agua para cada pelcula de esparcimiento uniforme.

2. Deje secar la pelcula en una superficie nivelada a 35-40 C.Sumergir en xileno hasta 1 min;luego sumergirse en 95% de etanol hasta 1 min.Colorear la pelcula durante 1 min con norte anilina (aceite)-azul de metileno (de preferencia de10-20 min, exposicin a 2 h, no sobrecolorear).Lavar portaobjeto por inmersin repetida en un vaso con agua y secar completamente a aire seco antes de examinar (no secar con papel).Contar los microorganismos observados en 10-60 campos.Multiplique el nmero promedio por campo microscpico y por el factor de 2, ya que se utiliz 2cm cuadrados de rea.Llevar a cabo las operaciones siguientes y siga las recomendaciones como se indica en el "Mtodo microscpico directo de las bacterias,"Mtodos estndar para el examen de los productos lcteos(1).Expresar los resultados finales como el nmero de bacterias (o grupos) por g de material de huevo.

C. Procedimiento para productos de huevo secos

Mezcle bien la muestra;preparar una dilucin 1:10 pesando aspticamente 11 g de material de huevo en un recipiente estril de boca ancha o una botella de vidrio con tapn de rosca.Aadir 99 ml de diluyente o solucin salina fisiolgica estril y diluir con una varilla de vidrio estril (0,1 N de hidrxido de litio puede ser utilizado como diluyente y se prefiere para las muestras de los productos de huevo entero y yema que son relativamente insolubles).Agite cuidadosamente la dilucin 1:10 para asegurar la solucin completa o distribucin de material de huevo agitando cada contenedor rpidamente 25 veces, con movimientos para arriba-y-abajo o movimiento atrs y adelante de aproximadamente 1 pie de arco, dentro de los 7 s. Dejar que las burbujas escapen.

Coloque 0.01 ml de dilucin 1:10 o 1:100 de sustancia de huevo seco en portaobjetos limpio y extender uniformemente sobre 2 cm .Proceda como en Examen microscpico directo de huevos, B-2.Multiplicar nmero promedio de microorganismos por campo por dos veces el factor microscpico (ya que se utiliz 2 cm cuadrados de rea) y se multiplica por 10 o 100, dependiendo de si la pelcula se prepar a partir 1:10 o 1:100 de dilucin.Expresar los resultados finales como el nmero de bacterias (o grupos) por g de material de huevo.

Cuidado y uso del microscopio

Advertencias

Nunca desempolvar una lente soplando sobre ella.La saliva, inevitablemente, se deposita sobre las lentes y es perjudicial, incluso en cantidades diminutas. Si el aire a presin se utiliza para quitar el polvo, utilizar un filtro en lnea para atrapar el aceite y otros contaminantes. No utilice papel para lentes seco sobre una lente. Nunca use toallas faciales para limpiar los lentes.Pueden contener filamentos que pueda rayar el vidrio de los lentes.Lino o gamuza se pueden utilizar para la limpieza, pero pueden no ser tan conveniente como tejido fino del lente.No hay que confundir el tejido fino del lente con papel secante, que nunca debe ser usado para limpiar lentes.Siga las recomendaciones del fabricante para el uso de disolventes de limpieza que no sean agua.Pegamentos de montaje de lentes suelen ser solubles en alcohol.El xileno se usa con moderacin es aceptable en general para las manchas graves, tales como aceites residuales. Nunca deje los tubos de microscopio abierto.Siempre mantenerlos cerrados con tapn recubierto, ocular, u objetivo, segn el caso. Evite tocar las lentes.Incluso las huellas digitales ligeras, especialmente en los objetivos pueden degradar seriamente la calidad de la imagen. No intente tomar la ptica aparte para la limpieza.pticas internas no deberan necesitar limpieza de rutina y deber ser profesionalmente reparada si es necesario. Utilice lquidos adecuados de inmersin, en los objetivos de inmersin segn lo especificado por el fabricante.Evite poner lquido de inmersin en los objetivos que no sean de inmersin;pues puede daar el pegamento de montaje del objetivo. Mantenga los microscopios cubiertos cuando no est en uso.Evitar los extremos de temperatura y humedad alta.En reas de trabajo con humedad relativa consistentemente ms de 60%, almacenar los microscopios en aire circulante si es posible.En muy alta humedad, las piezas pticas deben guardarse en envases bien tapados con desecante y mantenerlas muy limpias para evitar el crecimiento de moho en la capa ptica. No utilice el diafragma en algn momento para controlar el brillo.

Limpieza

1. Cuerpo del microscopio.Use alcohol o agua jabonosa en el pao para limpiar el cuerpo.Lubrique las piezas deslizantes con una vaselina o utilizar un lubricante recomendado por el fabricante2. Lentes y ptica Arenilla y el polvo pueden rayar las lentes y los revestimientos. Sople el polvo con pera de goma. Para la limpieza de la luz, respirar en la lente para empaarlo, y luego usar la tela para objetivo como se describe a continuacin.La nebulizacin es bsicamente agua y no es perjudicial. Para lentes sucias, emplear solucin limpiadora de lentes, como el fabricado por Kodak, disponible en cualquier tienda de suministros de la cmara.Quite las manchas difciles mediante el uso de xileno con moderacin. Utilice el siguiente procedimiento para lentes adecuadamente limpias de microscopios y otros equipos pticos.Arrugar un trozo de tela para objetivos creando muchos pliegues para atrapar la suciedad en la lente.No toque la parte de la telapara objetivo que se aplicar a la lente;la excesiva manipulacinpuede tocar los aceites naturales con los dedos ensuciandola tela para objetivo.Aplique una pequea cantidad de solucin de limpieza de lentes sobre el cristalino y secar con otro material absorbente para evitar que el lquido entre en la montura del objetivo.Limpie la lente muy ligeramente para eliminar la suciedad gruesa que no ser soplada con la pera de goma.Si es necesario, repita el proceso de limpieza con una nueva pieza de tela para objetivos y con ms presin para eliminar el residuo aceitoso o grasiento.Completar el proceso mediante el procedimiento de limpieza de la luz (la respiracin y la tela para la lente) se ha descrito anteriormente. Ajustes.Siga las recomendaciones del fabricante para los ajustes del microscopio que se pueden hacer por el usuario.La tensin del mecanismo de enfoque macromtrico por lo general se puede ajustar por el usuario.Instrucciones para el ajuste de la iluminacin y seguimiento ocular.

Iluminacin y mecanismo correcto del microscopio compuesto

Los lentes (oculares) deben ajustarse a los ojos del usuario.Solamente los microscopios con tubos binoculares se discuten aqu.A excepcin de la distancia interpupilar, otros ajustes son vlidos para los microscopios con tubo monocular.Para ajustar la distancia interpupilar, alargar o acortar la distancia entre los centros de los oculares para que coincida con la distancia entre los centros de los ojos de los alumnos.Ajuste el microscopio para cada ojo.Un ocular, o el tubo en el que se inserta, es generalmente ajustable.Coloque un portaobjetos sobre la platina del microscopio, encienda la iluminacin, y enfoque a bajo aumento.Cubra el ocular que tiene el tubo de enfoque del ojo con una tarjeta y, con los dos ojos abiertos, traen enfoque la muestra para el otro ojo con la perilla de enfoque fino.Es importante que la visin se relaje por mirar hacia arriba con frecuencia a los objetos distantes o hasta el infinito por la mirada "a travs de la pared."Esto ayudar a prevenir la fatiga visual causada por tratar de "acomodar" el objeto, con lo que se enfoca con el ojo en un punto ms cerca de lo infinito.

Cuando un enfoque ntido y relajado consistente se ha obtenido en un punto determinado de la lmina portaobjeto, cambiar la tarjeta para cubrir el otro ocular, pero esta vez utilice el anillo de enfoque del ocular abierto para llevar el mismo punto de la lmina portaobjeto en el foco.Siga el mismo procedimiento para relajarse viendo la televisin.El siguiente punto importante es la distancia desde el ojo hasta el ocular.Si los ojos estn demasiado cerca o demasiado lejos, el campo visual se reduce y la muestra puede parecer menos ntida.De unos pocos centmetros de distancia, mueva lentamente hasta que aparezca la ms ancho y ms agudo el campo.Esta distancia, de la pupila del ojo a la lente, es el punto de los ojos o la pupila de salida del microscopio.El enfoque del microscopio y el ajuste para cada ojo corregir para la mayora de condiciones de la cerca o la hipermetropa, lo que elimina la necesidad de usar gafas de correccin durante el trabajo de microscopio.Incluso astigmatismo moderado no obstaculizar la mayora del uso del microscopio;Sin embargo, para el astigmatismo ms grave, para ciertas otras condiciones de los ojos, o si se prefiere, anteojos recetados deben ser usados.Correccin para el astigmatismo en los anteojos se puede determinar fcilmente sujetando los anteojos a prudente distancia y rotndolos mientras mira un objeto a travs de un lente a la vez.Si la longitud o la anchura del objeto cambia al hacer esto, ya sea con lentes, en ese entonces hay una correccin de astigmatismo y se debe llevar puesto las gafas durante el trabajo en el microscopio puede ser recomendada.Oculares de alto punto son especiales ya que se hacen con una distancia de pupila ms larga para acomodar fcilmente a la distancia extra que se necesita cuando se usan gafas.Estos oculares estn identificados de alguna manera por el fabricante.Para aprovechar las ventajas de la resolucin ptima y la iluminacin del microscopio, se utiliza una tcnica conocida como iluminacin Koehlor.NOTA: Algunos valores pueden haber sido predeterminado por el fabricante y no ser ajustable.En una lmina portaobjeto colocar una muestra y visualizarse, utilice un nivel muy bajo (2-10X) objetivo y enfocar con el ajustes gruesos y finos.El bajo aumento proporciona un campo de visin ms amplio para facilitar la bsqueda de la muestra.Tambin proporciona una mayor distancia de trabajo de los objetivos de mayor potencia, ofrece una mayor seguridad para que el objetivo no se encuentre demasiado bajo y evitar romper el portaobjeto.El microscopio puede tener un balanceador auxiliar dentro de la lente en el condensador.Siga las recomendaciones del fabricante para el uso correcto de la lente que se mueve hacia dentro o hacia fuera con varios objetivos.Utilice los ajustes grueso y fino para enfocar la muestra.Para obtener la iluminacin Koehlor, cerrar la lmpara (campo) del diafragma de iris, si est presente, en la base del microscopio, y poner en enfocado mediante el ajuste vertical del condensador.Use los tornillos de centrado o las perillas en el condensador, si est presente, para centrar el crculo centrado en el campo.Si no en el condensador, tornillos de centrado o perillas para este propsito puede estar en la base cerca del diafragma de la lmpara.Abra el diafragma de la lmpara hasta que est un poco ms all del campo de visin.Esto puede no ser posible con intentos bajos de potencia de algunos microscopios hasta que la lente auxiliar en el condensador se ajuste correctamente.

Si el microscopio no tiene diafragma lmpara, coloque un pedazo de papel con un agujero pequeo, colocarlo sobre la abertura de la lmpara y hacer los mismos ajustes para centrarse en su borde interior.Microscopios con espejo y fuente de luz externa no se discuten aqu, pero los principios son similares.Siga las instrucciones del fabricante para ajustar el filamento de la lmpara, si es posible.Ajuste el diafragma de subetapa (apertura) despus.Este ajuste tiene un efecto crucial sobre la resolucin y el contraste de la imagen.El diafragma de subetapa es abierto o cerrado a 2/3 del tamao del campo, ver quitando un lente y recorriendo con la mirada al tubo.Para aproximar esta configuracin sin la eliminacin de un ocular, abrir el diafragma subetapa totalmente y gradualmente cerrarla mientras mira a travs del microscopio hasta que la imagen gana un aumento repentino en la nitidez y el detalle.Esto debe estar cerca de la posicin de apertura de 2/3;que se puede lograr con un poco de prctica y doble control inicialmente mediante la eliminacin del ocular y mirando hacia abajo el tubo.Vuelva a colocar el ocular.Si la iluminacin es demasiado brillante, utilice el restato, si se proporciona, que baje el volumen, o aadir densidad neutra u otros filtros.No utilice el diafragma de subetapa para controlar el brillo.La resolucin sufrir si se detiene abajo (cerrado) demasiado o se abre demasiado.Aunque dejar de abajo da ms contraste, se deteriora la resolucin y los detalles no esenciales estn formados por lneas de difraccin o flecos.Repita el procedimiento para la iluminacin Koehlor con cada objetivo utilizado.Para la microscopa de contraste de fase, siga los mismos pasos bsicos.No utilice el diafragma de subetapa pero hacer ajustes para llevar el anillo de fase y diafragma anular en coincidencia.Consulte las instrucciones del fabricante.Se recomienda el uso de un filtro verde.

Referencias

1. La Asociacin Pblica Estadunidense de Salud. 1985. Los mtodos estndar para el Examen de Productos Lcteos, ed 16. Captulo 10. APHA, Washington, corriente directa. 2. Los mtodos oficiales de Anlisis de AOAC International (2000) el 17 Ed., AOAC International, Gaithersburg, Maryland, EEUU, 940.37F Oficial de Mtodo