Toxicologia viernes 21 de agosto 2009Dra. Liz VegaTranscribe Fabio

Relación dosis-respuesta y ensayos de toxicidad en animales

La relación dosis-respuesta es el espectro de todos los efectos tóxicos y las características de la exposición unidas en una correlación, es decir que existe relación entre la dosis aplicada y la respuesta que se obtiene. Existen dos tipos de relaciones:

Relación individual (o graduada): respuesta que tiene un solo organismo a diferentes dosis de un químico.

Relación cuantal: es la distribución de respuestas individuales en una población. Se obtiene al aplicar a toda una población varias dosis de un químico y graficar el conjunto de respuestas.

Ejemplo de relación individual: administración de un organofosforado (inhibidor de la acetilcolinesterasa). Se grafica el porcentaje de inhibición, que sería la respuesta, según la dosis administrada por Kg de peso. Normalmente uno sabe que a dosis más altas los porcentajes de inhibición de la acetilcolinesterasa (curva celeste) aumentan. Notar que además de la acetilcolinesterasa existe otra enzima llamada carboxilesterasa (curva negra) que tiene una configuración química muy parecida y los organofosforados también se unen a ella. Entonces, se mantiene la mayor afinidad por la colinesterasa, pero cuando se incrementan las dosis también se empieza a inhibir esta otra enzima.

Entonces al graficar la dosis contra el porcentaje de respuesta normalmente se obtienen curvas. Pero estas respuestas se pueden linealizar mediante la aplicación de escala logarítmica a la dosis de la droga para hacer los cálculos más simples.

Recordar que para la mayoría de agentes químicos tras su administración resulta más de un efecto, porque existen múltiples dianas en todo el organismo donde la sustancia va a actuar.

Ejemplo de relación cuantal: a este tipo de respuesta en toxicología se le llama “del todo o nada”, porque se clasifican a los individuos como “responde” o “no responde”. No hay puntos medios. Esto según un criterio que puede estar ya establecido o que el investigador define él mismo. Para graficar estas relaciones se coloca en el eje Y la fracción de población que responde y en el eje X las dosis administradas.

En el ejemplo se presentan 3 formas en las que se puede graficar la relación dosis-respuesta. La primera representa la respuesta en frecuencias o rangos, como un histograma. Al administrar una misma dosis a toda la población, muchos individuos caerán dentro del promedio, pero otros se

desviarán; algunos tendrán menos inhibición de la acetilcolinesterasa y otros con esa misma dosis tendrán muchísima. Entonces se dice que esta relación dosis respuesta sigue una curva de Gauss o distribución de frecuencias normal. También se pueden tomar las respuestas no solo para una dosis, sino para varias y sumarlas, o sea hacerlas acumulativas. Por ejemplo: si a 5 mg respondieron 10 individuos y a 10 mg respondieron 15 individuos, entonces a los 10 mg corresponderían 10+15=25 individuos que respondieron acumulativamente. De esta forma se obtienen curvas sigmoideas. Si en estas curvas se le aplica el logaritmo a la dosis y se convierte el % de respuesta acumulativa en probits, el gráfico se linealiza, lo cual es más conveniente para trabajar los datos y sacar relaciones que permitan tener parámetros de referencia como la LD50 por ejemplo.

Estimados estadísticos de exposición a un tóxico

Los más conocidos e importantes son la dosis efectiva 50 (ED50) y la dosis letal 50 (LD50). Las dos se parecen en que son la dosis necesaria para hacer que “algo” le ocurra al 50% de la población. La diferencia radica en que ese “algo” para la dosis efectiva es un efecto farmacológico, mientras que para la dosis letal siempre es la muerte.

La LD50 ha sido muy usada en toxicología. Anteriormente todos los productos nuevos tenían que venir con su LD50. Pero este parámetro en realidad no es tan útil pues no da tanta información sobre las características toxicológicas de la sustancia, y sobre todo lo que sucede en el organismo antes de la muerte. Entonces para muchas personas sólo exigir LD50 no es suficiente. Es solo un valor marginal del peligro; pero peligro como un concepto muy reducido porque por ejemplo no da ninguna información sobre el daño al medio ambiente.

Aquí se presenta un ejemplo gráfico donde está la mortalidad en probits según el logaritmo de la concentración. El probit número 5 siempre es el que cuando intercepta la recta, da la concentración correspondiente al LD50.

Recordar que la curva de respuestas en una población va a tener forma de campana de Gauss, o sea es una distribución normal de frecuencias. En esta distribución los extremos existen porque siempre hay diferencias individuales en la respuesta hacia los químicos, las cuales llamamos idiosincrasia. Existen individuos hipersusceptibles que con poca dosis experimentan toxicidad o individuos resistentes que necesitan una dosis más alta para alcanzar el mismo nivel de toxicidad.

Continuando con la relación dosis-respuesta cuantal, es importante tener en cuenta que en cada punto de una curva dosis-respuesta no hay un solo individuo, sino que hay muchos individuos que se distribuyen en frecuencias normales como las que acabamos de ver. El ejemplo a continuación es parte de un estudio para evaluar dosis de referencia. CEF significa critical effect size o tamaño de efecto crítico. En este caso el efecto crítico es que se produzca atrofia. En la gráfica de la izquierda hay más error estadístico y hay más heterogeneidad que en la de la derecha, porque en la de la izquierda, dentro de cada distribución normal hay mezclas de individuos que responden (negro) y no responden (blanco), mientras que en la de la derecha prácticamente todos los individuos en cada distribución normal están dentro de una misma categoría (excepto en la distribución del centro que quedan aprox. 50%-50%), es decir responden de una misma manera prácticamente. Sólo esta sutileza estadística hace que las ED50 sean completamente diferentes. Esto porque al graficar estos mismos datos en curvas sigmoideas, dichas curvas son diferentes y de ellas se obtienen valores de DE50 diferentes. En el caso de la curva de la izquierda la DE50

resulta más alta que en la curva de la derecha en donde los resultados de la población son muy exactos. Se puede decir que en la curva de la izquierda hay muchos idiosincráticos, mientras que en la derecha hay pocos. Se podría decir que en la curva izquierda hay una especie animal que responde muy variadamente y en la derecha todos los individuos tienden a responder de la misma forma. Así uno se puede dar una idea de la seguridad de una sustancia en distintas especies.

Si el número de individuos que responde a cada dosis consecutiva se suma, se obtiene la relación dosis-respuesta acumulativa. Si se ha usado un buen número de animales por dosis se obtiene una curva dosis-respuesta sigmoidea. Ahora, la dosis efectiva mínima (marcada en verde) de un químico, que evoca respuesta de todo o nada, es llamada la dosis umbral. Por ejemplo, la dosis mas baja para producir una atrofia, lo mas bajo para producir dilatación de pupilas, etc. Pero esa dosis no es experimental, pues hay variaciones en el umbral de cada individuo. Entonces lo que se hace es construir la curva con los datos experimentales y luego extrapolar la dosis umbral. Cuando se linealiza la gráfica, el punto 0 es esa dosis umbral que no existe realmente.

Probits (probability units)

Se puede convertir el porcentaje de respuesta a unidades de desviación de la media (normal equivalent deviations o NEDs). La NED del 50% es 0 + 5. Se le suma este 5 para evitar que resulten curvas en las que sean negativos los datos. La NED siguiente o NED+1 se equipara con 84,1% de respuesta. Es por eso que el probit 5 siempre es el del 50%.

Entonces, de un probit a otro siempre hay una desviación estándar equivalente (NED) de distancia. Estos gráficos van generalmente de 3 probits a 7 probits, pues el 100% de respuesta se alcanza generalmente alrededor de 7 probits y el 0% alrededor de 3 probits. Importante que siempre debe haber log de la dosis en el eje X y probits en el eje Y para que los datos se ajusten a una ecuación lineal.

Pregunta: No entiendo qué es el probit!!R/ Es simplemente una unidad que se utiliza para decir que tan tóxico es algo y para hacer que las respuestas tóxicas estén en una escala más factible para analizarlas. Pero realmente un probit es solamente una transformación, es una unidad de probabilidad de que ocurra la respuesta que se está buscando.

La pendiente de las curvas puede obtenerse, y para una exposición a tóxicos distintos las pendientes de las curvas va a ser distintas. En este ejemplo aparecen 2 tóxicos A y B. Las curvas grises representan la desviación estándar.

A tiene una pendiente menor, por lo tanto requiere cambios mayores en la dosis para observar cambios en la respuesta; mientras que B se comporta de forma contraria: tiene una pendiente mayor por lo que con cambios pequeños en la dosis se observa una gran diferencia en la respuesta que los animales presentan. Entonces el tóxico más peligroso es B.

Nota: el libro en el que viene el gráfico dice que los dos tóxicos tienen la misma LD 50, pero esto no puede ser porque esto ocurre cuando las 2 rectas se intersecan en el mismo punto y este punto está en el probit 5.

Alometría

Es el campo de estudio que examina las relaciones entre peso corporal y otros parámetros físicos y biológicos como la tasa de metabolismo basal, la frecuencia cardiaca, el flujo de sangre, etc. Esto es importante porque los estudios de toxicidad se hacen en animales y estos tienen una masa diferente, frecuencia cardiaca diferente, tasa metabólica diferente, etc. a las nuestras. Entonces hay que buscar alguna manera de hacer extrapolable lo que encontramos en los animales. Esto es la alometría, es hacer cálculos basados en varios parámetros como tasas de metabolísmo, etc. Con los estudios de alometría se han obtenido los datos de la sig. tabla:

Esta tabla permite extrapolar dosis de estudios animales a humanos. Por ejemplo, como el ratón tiene un metabolismo tan acelerado, para obtener en estos la misma respuesta que se observa en humanos ante un fármaco habría que administrarles una dosis 7 veces mayor.

Además hay una fórmula que obtuvieron, que dice que la relación entre área superficial y peso corporal entre las especies de mamíferos es:

AS = 10,5*(peso en g)0,67

Las medidas de área superficial son mejores para hacer los cálculos que simplemente el peso, pues toman en cuenta más variantes fisiológicas.

Cálculo de probits manual y con SPSS

El ejemplo siguiente se basa en un estudio ya hecho sobre mortalidad de un pesticida “a” en peces cebra. En la tabla, en azul aparecen las dosis que se administraron a los peces en mg/kg. Se emplearon 10 peces, y aparece el número de respuestas (muertes) observadas para cada dosis administrada. Para expresar la respuesta como porcentaje, como son 10 animales, 8 respuestas corresponden a 80% y así sucesivamente.

Si se quiere hacer el cálculo manual se utiliza la siguiente tabla (que es de 1952!):

Error: Liz lo corrigió porque un ratón pesa aprox. 30g no 300g.

Para graficar, se toma una de las dosis, por ejemplo la de 24 mg/kg, y se calcula su porcentaje de respuesta, que como vimos anteriormente es 80%. Como el primer dígito es 8, se busca en la columna de la izquierda el 80; y como el segundo dígito es 0 se busca la columna correspondiente a 0. El valor correspondiente en probits a ese porcentaje es entonces 5,84.

Entonces se grafica el logaritmo de la dosis en el eje X y el valor en probits encontrado en la tabla en el eje Y para cada dosis administrada.

Calculado mediante el programa (SPSS) queda así:

Y se puede ver como el valor que se encontró en la tabla (5,84) coincide con el log de 25mg/kg que es 1,39 ≈ 1,4. Entonces tanto de la forma manual como con el programa nos da una muy buena representación de los datos. Esta recta tiene un valor de R de 0,963, lo que indica una correlación bastante buena.

Hormesis

La hormesis es el fenómeno que se observa con sustancias no nutricionales (que uno normalmente no consume en la dieta) que pueden tener efectos benéficos a dosis bajas pero efectos muy dañinos a dosis altas. Por ejemplo el alcohol. A dosis bajas puede prevenir eventos cardiacos porque mejora

5,84

la circulación coronaria mientras que a altas dosis puede provocar una depresión respiratoria o un cáncer hepático.

En la figura siguiente, en la curva A se ven los efectos adversos según la dosis y en la B los efectos protectores según la dosis. Si se unen las dos curvas de la hormesis resulta un efecto total (curva C), que es el mismo que presentan los nutrientes esenciales como las vitaminas (figura de la derecha).

Esto porque si se consumen muy pocas vitaminas aparece una deficiencia. Por ejemplo, para la vitamina A, la deficiencia se manifiesta como problemas visuales, la piel pierde su consistencia, etc. Ahora, si se consume demasiada vitamina A, que es liposoluble, puede aparecer daño hepático o en caso de embarazo efectos adversos en el feto. Entonces existe una región de homeostasis definida por la dosis umbral del nutriente, en la cual se está en equilibrio entre la deficiencia y la toxicidad; y un rango que permite consumir la vitamina sin que aparezcan daños. Otro ejemplo es la vitamina C, que con una deficiencia se presenta escorbuto, pero si se consume demasiada pueden aparecer cálculos renales.

Forma de las curvas dosis-respuesta

Existen curvas que no son tan sigmoideas; estas son de inducción de tumores. En este caso la dosis umbral es la dosis bajo la cual la probabilidad de que se dé una respuesta individual es 0. Esto depende mucho del número de individuos que se tengan en el estudio, porque si se tienen 1000 ratas y a una sola le da un tumor uno puede decir que es algo esporádico, idiosincrático, pero si se tienen solo 10 ratas y a una le dio un tumor, no se puede decir lo mismo. Es muy difícil realmente, en lo relacionado con tumores, establecer un umbral para el efecto, por las variaciones idiosincráticas. Entonces, para carcinogénesis se habla de un umbral aparente que en inglés es

llamado NOAEL (no observable adverse effect level), que es un punto en el que podrían haber efectos adversos, pero no son observables. En el gráfico aparece marcado por un círculo morado. Los gráficos corresponden a un estudio de inducción de tumores de vejiga y de hígado. Observar que en los tumores de vejiga (línea negra) conforme aumenta la dosis la respuesta se va manteniendo en 0 hasta que de pronto en la dosis marcada se dispara. Entonces en este caso se ve muy claramente la dosis umbral. Pero para los tumores de hígado (línea celeste) no es posible hallar claramente una dosis umbral puesto que desde la primera dosis aparecen tumores, y no hay cambios bruscos en la pendiente.

La forma de la curva dosis-respuesta además varía con el tiempo de exposición al tóxico. Ver en la figura anterior que en el primer gráfico se administró el tóxico por 24 meses y en el segundo por 35 meses, y se obtienen comportamientos muy diferentes.

Las pendientes a dosis altas y a dosis bajas son muy diferentes por la disposición del químico, depende de cómo los animales metabolicen ese químico.

¿Qué es lo que hace variar las pendientes según la dosis? ¿Qué es lo que hace que a partir de cierta dosis las pendientes se eleven y se disparen los tumores? Es la saturación de las vías de transformación, la saturación de los sitios de unión a proteínas plasmáticas, unión a receptores, o supresión de cofactores intracelulares. Por ejemplo puede necesitarse mucho ácido glucurónico para poder eliminar el tóxico en el hígado, pero llega un punto en el que se acaba el ácido glucurónico y se dispara la toxicidad hepática y/o sistémica.

Como ejemplo de esto tenemos al acetaminofén:

El metabolito hepatotóxico del acetaminofén es el NAPQI (N-acetil-para-benzoquinona-imina). El acetaminofén sufre diferentes vías de biotransformación. Una es que se excrete por orina sin cambios, otra es que se conjugue con el ácido glucurónico, otra es que se sulfate (que se conjugue con grupos sulfato) y la más importante es que lo transforme el citrocromo P450 2E1 en NAPQI, y esta benzoquinona es altamente reactiva, con proteínas, con ADN, es muy mutagénica, por lo que el cuerpo debe deshacerse de ella muy rápido. Para esto se conjuga con el glutatión convirtiéndose en un metabolito inactivo. En una intoxicación por acetaminofén hay niveles muy grandes en sangre, el hígado hace demasiada NAPQI y llega un punto en el que se acaba el glutatión que hay en el hígado y se dispara la toxicidad hepática. Esto puede ocurrir a corto o a largo plazo.

Supuestos para la relación dosis-respuesta

Son 3: La respuesta es debida al químico administrado. No se debe al agua, a la comida, etc. La magnitud de la respuesta es relacionada con la dosis. Normalmente a mayor dosis mayor

cantidad de respuesta. Esta subyace de otros 3 supuestos:o Existe un sitio diana molecular con el que interactúa el químico para iniciar esta

respuesta.o La producción y el grado de la respuesta están relacionados con la concentración del

tóxico justamente en el sitio diana.o La concentración en el sitio diana está relacionada con la administración. Esto tiene

que ver con biodisponibilidad, no es solo que la concentración en el sitio de acción hace una respuesta sino que la cantidad de tóxico administrado por una vía externa debe alcanzar el sitio diana. Por ejemplo, a las mujeres diabéticas embarazadas se les puede administrar insulina porque tiene un elevado peso molecular y no atraviesa la placenta, pero no se les puede administrar glibenclamida porque sí la atraviesa gracias a su bajo peso molecular y si puede generar toxicidad fetal.

Existen métodos cuantitativos con precisión significativa para expresar la toxicidad. Por ejemplo para un medicamento tóxico que aumenta las enzimas hepáticas se debe contar con un método para cuantificar estas enzimas.

Si no hay mecanismo de acción (por ejemplo si se trata de una droga nueva), se deben tomar medidas de toxicidad clara, en forma de biomarcadores relacionados con el efecto. Es decir, se administra la sustancia a los animales y se les empieza a medir todo: enzimas hepáticas, niveles de eritrocitos y neutrófilos, etc. Como ejemplo de biomarcadores relacionados con el efecto están las enzimas hepáticas ALT (alanina aminotransferasa) y AST (aspartato aminotransferasa) que cuando aumentan en sangre es porque está habiendo un daño en el hígado y se están liberando a sangre. Entonces si se tiene un medicamento de uso crónico y a los pacientes se les hacen exámenes de enzimas hepáticas y resultan elevadas, uno diría que esta medición es un biomarcador relacionado con el efecto que permite deducir que el medicamento está dañando el hígado.

Entonces para un químico nuevo lo primero que se hace es medir la toxicidad aguda, en la que se da una dosis única alta. Para esto el investigador debe ser muy meticuloso y observador y detallista y analizar el comportamiento y la fisiología de la respuesta de los animales. Se toma el animal y se observa durante 14 días tanto intacto como luego de que se le ha dado la dosis. Luego se sacrifica y se hacen estudios histológicos de todos los principales órganos (bazo, hígado, riñón, útero, etc.). Definir la dosis que se va a administrar para evaluar esta toxicidad aguda es algo complicado, se debe tratar de utilizar lo que sugiera la literatura, lo que sugieran los estudios in vitro, o lo que han mostrado otras moléculas similares y que estén en el mercado.

Evaluación de la relación dosis-respuesta

Se basa en marcadores estadísticos como la dosis efectiva (ED), la dosis tóxica (TD) y la dosis letal (LD).

En la gráfica anterior aparecen 3 curvas para una misma sustancia, por ejemplo un anestésico. Tenemos una dosis efectiva en donde el fármaco produce anestesia. Si se aumenta un poco más se llega a dosis tóxicas, provocando en este caso daño hepático. Si se aumenta la dosis aun más se alcanza la dosis letal. Al ver que las rectas de la ED y la LD son paralelas, esto sugiere que ambas reacciones se dan por el mismo mecanismo de acción. En este caso, a dosis efectivas se obtiene anestesia por su acción en el tallo cerebral pero al aumentar la dosis esa misma acción en el tallo cerebral induce un fallo cardiorespiratorio. No se cumple esto para todos los tóxicos. Para asegurarse de que en realidad ambos procesos involucran al mismo mecanismo de acción no basta con este análisis, hay que hacer pruebas más específicas.

Puede haber más de una dosis tóxica para una misma sustancia, una para cada órgano o parte del cuerpo. Estas distintas toxicidades se dan todas al mismo tiempo, en mayor o menor grado, de acuerdo a la dosis tóxica de ese químico para ese órgano en particular.

También podría ocurrir que se cruce la recta de la dosis tóxica con la recta de la dosis efectiva. Un ejemplo muy cercano a esto es la digoxina, en el caso de esta droga no se cruzan pero están muy cerca, y hay un punto en que la dosis efectiva es prácticamente dosis tóxica también.

También existen varios índices:

El índice terapéutico o TI (therapeutic index) se define como:

TI = TD50/ED50.

Este índice tiene la desventaja de que solo nos dice los puntos medios del 50% de la población, no dice como están los extremos de las curvas. Por esta razón se inventó otro criterio llamado MOS

(margin of safety), que es el margen de seguridad y exposición. Hace una mejor relación por que resulta de dividir la primera dosis tóxica entre la última dosis efectiva:

MOS = TD1/ED99

Entonces dice qué tan separadas o qué tan juntas están las rectas de dosis tóxica y dosis efectiva, de una forma más descriptiva.

Estos índices no dicen qué ocurre con la exposición crónica. Para evaluar esto se crea el índice de cronicidad que se define como la dosis tóxica 50 del primer día entre la dosis tóxica 50 del día 90:

CI = TD501D/TD5090D

Esto tomando en cuenta que se administra el tóxico a los mismos animales durante 90 días seguidos. Entonces, para un tóxico que no se acumule se da la primera dosis, se elimina, se da la segunda, se elimina y así sucesivamente hasta la dosis 90, que sería la misma dosis que la primera y CI sería 1. Pero si hay acumulación de tóxico, hay que ir disminuyendo la dosis cada día, porque si se siguiera dando la misma dosis todos los animales se mueren. Entonces, por ejemplo, la dosis del primer día fue 1 mg/kg y a los 90 días ya se tuvo que dar una dosis de 0,011 mg/kg para que los animales no se murieran. Entonces CI = 1/0,011 ya no está cerca de uno sino que es aprox. 90. Esto quiere decir que el tóxico evaluado es muy acumulativo y muy peligroso.