tipos de estandarizacion en los bioterios...tipos de estandarizacion en los bioterios genetic...
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• La Salud del Animal – Libre de patogenos- Monitoreo de Salud
– Microbiota
• Medio Ambiente – Condiciones de crianza
– Espacio fisico
– Temperatura
– Disponibilidad de agua y comida
– Enriquecimiento
• La Calidad Genetica del Animal – Integridad Genetica-Monitoreo Genetico
– Genotipacion
– Characterizacion del Fenotipo
Factores Criticos en la Calidad del
Animal de Laboratorio
• Medio Ambiente – Condiciones de crianza
– Espacio fisico
– Temperatura
– Disponibilidad de agua y comida
– Enriquecimiento
Estandarizacion del Medio Ambiente
• Medio Ambiente – Condiciones de crianza
– Espacio fisico
– Temperatura
– Disponibilidad de agua y comida
– Enriquecimiento
Factores que influyen el Medio
Ambiente
Estabdarizacion de Calidad
Genetica
Sistemas de Apareamiento Definidos
Mantenimiento de Datos de la Cepa o Stock
Monitoreo del Fondo Genetico
Verificacion del Genotipo
Evitar Deriva Genica
Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados
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Como Mantener la Calidad
Genetica Sistemas de apareamiento definidos
Mantenimiento de datos de la cepa o Stock
Monitoreo del Fondo Genetico
Verificacion del Genotipo
Evitar Deriva Genica
Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados
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Ratones y Ratas Consanguineos o
Endogamicos
• Apareamiento hermano x hermana por 20
generaciones
• Todos los genes alelos son homozygotos
• No hay segregacion de genes de manera que la siguiente generacion es equivalente a la anterior
• Cada cepa es aproximadamente copia multiple de un solo individuo. Cada cepa tiene caracteristicas definidas
– C57BL/6, FVB, 129S6, etc
Colonias Heterogeneas –
Apareamientos No consanguineos
• Outbred Stocks • Maxima variedad genetica
– Tamano deseables, pesos, fecundidad, etc.
– A veces se desarrolla el fenotipo not observado en una cepa consanguinea
– Permite el mantenimiento de mutaciones que produce un efecto severo en cepas consanguineas
• Maxima heterogeneidad por alelo – Segregacion de alelos
– Pequenas colonias de exogmicos se tienen que reemplazar frecuentemente
– Derivaciones pueden ocacionar deriva genica
– Monitoreo genetico consiste en chequear la frecuencia de alelos*
Como Mantener la Calidad
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Mantenimiento de datos de la cepa o Stock
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Mantenimiento de Datos
Cepa usada
Nomenclatura
Historia de los
retrocruzamientos
Numero de la Generacion
El mantenimiento de Datos es critico para la precision
de la historia del modelo animal
Historia de la
modificacion
genetica del
modelo animal
Nomenclatura
• Reglas de Nomenclatura
– Mantenidas por un Comite Internacional de Nomenclatura
– Da informacion en el Fondo Genetico
– Da informacion acerca del tipo de manipulacion genetica
– Da informacion acerca del gen de interes
– Da informacion acerca del origen del modelo
http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/index.shtml
• Todo modelo animal debe tener la nomenclatura debida
para publicar el estudio cientifico
Dissecting mutations on the
Gt(ROSA)26
C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm9(Cre/ESR1)Arte
Strain Background
Lab who did it
Locus
Gene trap
26th trap by P. Soriano Trapping vector
Knock-in; here, a
fusion between cre
and a Human
estrogen receptor
Targeted mutation#9
at this locus by this
lab
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Sistemas de apareamiento definidos
Mantenimiento de datos de la cepa o Stock
Monitoreo del Fondo Genetico
Verificacion del Genotipo
Evitar Deriva Genica
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Inbred colony management at
Taconic- The Pyramid
In Isolators
In Isolators
In Barrier
Genetic Risk Point
Genetic Background Testing
• SNP testing using Illumina Platform
– SNP Panels available
• Illumina 1449 SNP Panel –use to test all Inbred Foundation
colonies
• Illumina 377 SNP Panel –not use internally
• Taconic’s 96 SNP Genetic Monitoring Panel –use to test all
other inbred production and outbred colonies
• Taconic’s 96 SNP C57BL/6 sub-strain Panel – use to test
potentially mixed C57BL/6 models
• Taconic’s 96 SNP Rat Panel
Verificacion de Cepas – Tecnicas
usadas
• Pruebas Bioquimicas – Pruebas proteicas
• ADN de Microsatelite
• Polimorfismo de Nucleotido – Single Nucleotide
Polymorphisms or SNPs
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Biomarker Data from 96
GenMon Panel: Inbreds
Model
Number Nomenclature
Ptprc (a
or b)
Tyr(+ or
c)
Tyrp1 (+
or b)
Pde6b (+
or rd1 )
4007 B6.SJL-Ptprc<a>/BoyAiTac a + + +
129SVE 129S6/SvEvTac b + + +
AJTAC A/JCrTac b c b +
BALB BALB/cAnNTac b c b +
BALJBO BALB/cJBomTac b c b +
BALBOM BALB/cABomTac b c b +
BLBANU C.Cg/AnBomTac-Foxn1<nu>N20 b c b +
4010 C57BL/10SgSnAiTac b + + +
4011 B10.A-H2<a>H2-T18<a>/SgSnAiTac b + + +
B6 C57BL/6NTac b + + +
B6JBOM C57BL/6JBomTac b + + +
B6NU B6.Cg/Ntac-Foxn<nu>NE10 b + + +
DB BKS.Cg-m+/+Lepr<db>/BomTac b + + +
OB B6.V-Lep<ob>/JBomTac b + + +
C3H C3H/HeNTac b + + rd1
CBA CBA/JBomTac b + + rd1
SOP 3851 SOP 3852
Verificacion del genotipo- verificar
todos los alelos presentes
SOP 3851
SOP 3852
PURO
Top band
amplification
when deleted
Top band
amplification
when deleted
Top band
amplification
when puro
present
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Como Evitar la Deriva Genica
• Con Criopreservacion – Proteccion del ADN
– Reduccion de riesgo
– Extension de la vida
Reproductiva de la colonia
• Con Recuperacion de cepas congeladas – Refresco de la colonia
– Obtener nuevo Stock
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Problemas Geneticos
• Mixed backgrounds of the different genetically
modified mice
• Lack of verification of alleles present
• All lines are not equivalent mice segregation
of the transgene was not verified with
Mendelian ratios
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Resultados Inconsistentes
• Deriva Genica del Fondo Genetico
• Posible Variation del Fenotipo
• Difficultad en interpretar los datos debido a la
presencia de alelos no deseados
Estandarizacion Microbiologica
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• Usar animales saludables
• Infecciones pueden alterar el resultado de la investigacion cuando no hay sintoma o patologia
• Infecciones alteran la immunologia, fisiologia, reproduccion del animal
• Infecciones pueden interferir con el resultado del estudio
• Algunas infecciones alteran el animal por corto tiempo y otras por muy largo tiempo
Tipo de Microorganismo
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• Bacteria- microorganismo unicelular que puede producir
infeccion
– Microbioma
• Virus-microorganismo acelular que se replica dentro de la
celula que infecta
• Parasito-organismo que obtiene nutricion del huesped
Tipos de muestras que se colectan
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• Sangre
• Piel
• Nariz
• Conjuntiva del ojo
• Oido medio
• Traquea
• Pulmones
• Contenido cecal o muestra del contenido del intetino grueso
• Vagina
• Glande
• Higado
• Rinon
• Saliva
• Heces
Tipo de Test Microbiologicos
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• Cultivo Bacteriologico en placas de Agar
– Cultivo de bacterias aerobicas
– Cultivo de Bacterias anaerobicas
– Sensitividad antibiotica
• Microscopia
• Tincion Gram-
• ELISA- Ensayo de Immunoabsoricon Ligado de Enzimas
• IFA- Ensayo de Immunofluorescencia
• Test Bioquimicos
• PCR- Reaccion de cadena de polimerasa
• Flow Cytometry- Cytometria de Flujo
Medios de Cultivo
• Medio No Selectivo – se usa si el proposito es determinar el perfil de la muestra
– Cuando el cultivo viene de organos patologicamente alterados (bacterias oportunistas)
– Exceso crecimiento de Proteus spp (cecum y genitales), evita anadiendo dtergentes, anesteticos o antibioticos)
– Agar de Sangre 5%- bacterias con demanda de pocos nutrientes (Enterobacteriacea, Micrococcacea) y bacteria que cece en medio enriquecido (Streptococcacea). No suficiente para cultivar Pasteurellaceae o Haemophilus
– Agar de chocolate preferido por Patseurella spp, utilizado para cultivos anaerobicos si se anaden suplementos (Vit K, HCl cysteina)
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Medios de Cultivo
• Medio Selectivo
– Contiene ingredientes que inhibe el crecimiento de
unos y permite el crecimiento de otros
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Medios de Cultivo- Incubacion
• Medio No Selectivo – Generalmente se incuba a 37oC, dependiendo que
bacteria se esta buscando-simple incubadora o con CO2
– Aerobico y microaerofilico-Incubacion por 18-24 horas, inspeccion y reincubado por 18-24 horas, re-inspeccion -descarta
– Anaerobico- incubacion por 72 horas antes de abrir el systema
• Medio Selectivo – Depende del Medio y el tipo de bacteria
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Aislamiento de Bacteria del Cultivo
Primario
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Organo 1 2 3 4
Nariz 1,2,3,4 5,6,7 8,9,10,11 12,13
Traquea 14 15 16,17
Cecum 18,19,20,21 22,23,24 25,26,27,28
29,30,31
32,33,34
Genitalia 35,36 37,38,39 49,41,42 43,44,45,46
Animal
Animal Individual/Organo Individual
Organo 1 2 3 4
Nariz 1,2,3,4 2,4,5 1,2,5,6 9
Traquea 7 7 7,8 7,8
Cecum 9,10,11,12 9,10,11 10,11,12 9,10,11,12,13
Genitalia 14,15 14,15,16 14,15,16,17 16,17
Animal
Animal Agrupados/Organo Individual
Identificacion de Bacteria
• Caracterizacion Inicial
– Tincion Gram
– Forma de la Bacteria
• Rod, racimos de uvas, diplococus, rod elipticos, etc
Anaerobico- incubacion por 72 horas antes de abrir el
systema
– Motilidad
– Aerobico, aeromicrofilico, anaerobico
– Catalasa, citocromo oxidasa, fermentacion de
glucosa
– Formacion de esporas
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Test Bioquimicos para deteccion de
Bacteria
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• Actividad de Aminoacido Decarboxylasa
• Utilizacion de Citrato
• Actividad de Coagulasa
• Produccion de sulfuro de hidrogeno
• Actividad de triptofanasa
• Actividad de Lecitinasa y Lipasa
• Utilizacion de Malonato
• Reduccion de Nitratos
• Actividad de beta galactosidasa (ONPG)
• Actividad de beta glucoronidasa (PGUA)
• Actividad de beta xylosidasa (PNPX)
• Actividad de Phenilalanina deaminasa
• Formacion de Porfirina
• Utilizacion de tartrato
• Actividad de Ureasa
Metodos Immunologicos
• Metodos basados en la Reaccion de Antigeno-Anticuerpo – Deteccion de Antigeno, se usan anticuerpos contra
ciento agente para demostrar la presencia del agente • Agglutinacion
• Tecnicas de Immunofluorescencia
– Serologia, usando el agente se demuestra la presencia de anticuerpos
• ELISA-Ensayo de Immunoabsorcion Ligado de Enzimas
• IFA- Ensayo de Immunofluorescencia
• Aglutinacion
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Aglutinacion
• Agglutinacion de Antigeno por suero que
contiene anticuerpos contra el antigeno
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Frequencia y Numero de
Muestras para muestrear
• Depende del tipo de caja que se tiene
– Cajas abiertas
– Cajas con sombrero
– IVC- cajas ventiladas individualmente
• Distribucion de racks
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Frequencia y Numero de
Muestras
• Numero de usuarios
• Reglamento de movimiento en las barreras
• Tecnica usada para cambiar las cajas
– Tipo de desinfectante usado
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