Test de sensibilité de variétés clonales d’hévéa aux toxines secrétées par le champignon Corynespora cassiicola

Marine Déon1,2, Dinh Minh Tran 1,3,6, André Clément-Demange3, Daniel Bieysse3, Ricardo R Oliveira4, Frédéric Breton3, Stéphanie Massey2, Frédéric de Lamotte5, Anne Clément-Vidal3, Marc Seguin3, Valérie Pujade-Renaud1,2.

1. CIRAD, UMR-AGAP, F-63000 Clermont-Ferrand, France. 2. Clermont-Université, Université Blaise Pascal, UMR 547 PIAF, BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand, France 3. CIRAD, UMR AGAP, F-34398 Montpellier, France. 4. Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Agronomia, Maringá, Pr; CEP 8702-900, Brazil 5. INRA, UMR AGAP, F-34398 Montpellier, France.

6. Rubber Research Institute of Vietnam

Introduction Matériel et méthode

I. Comparaison de %F (% de fuite d’électrolytes) et SN (surface de nécrose)

II. Sensibilité à la toxine purifiée Cas1, à son filtrat d’origine CCP et aux filtrats de culture de différentes souches

Bilan et perspectives Références

Remerciements : Nous remercions l'Institut Français du Caoutchouc et les sociétés SIPH, SOCFIN et MICHELIN pour leur support opérationnel et leur participation financière à ces recherches.

Figure 1: Données du % de fuite d’électrolytes (%F) et de surface de nécrose (SN) mesurés pour 12 filtrats de Corynespora cassiicola sur 20 variétés d'hévéa. (A) et (B) distribution des données %F et SN par filtrat; (C) et (D) composantes de la variance (%) de %F et SN, témoin CZ (milieu de culture non inoculé) inclus.

Résultat I: -La méthode %F est plus sensible que SN pour tester la sensibilité des variétés aux filtrats de C. cassiicola avec un effet variétal plus marqué et une variance résiduelle plus faible -Pour %F, les moyennes par filtrat montrent des différences importantes, mais la distribution des données ne suit pas la loi normale. Un grand nombre de répétitions est nécessaire pour réduire la variance de l’erreur.

Résultat II: - L’intensité de la réponse augmente avec la concentration de la toxine, sans effet d’interaction variété x traitement. La variance entre variétés est importante. - Les profils de sensibilité de variétés en réponse à la toxine Cas1 purifiée ou au filtrat CCP sont similaires. Ces résultats renforcent l’hypothèse que Cas1 serait le déterminant majeur de la toxicité du filtrat CCP.

Résultat III :

- Un effet d’interaction variété x filtrat est mis en évidence (fig. 1C, tab. 2 et fig. 3). - La souche CCP (classe toxinique Cas1) génère le filtrat le plus toxique - La toxicité des filtrats Cas0 sur certaines variétés suggère l’existence d’autres effecteurs que la cassiicoline.

CD1174

FDR4575

FDR5240FDR5665

FDR5788

GT1

IRCA145

IRCA18

IRCA19

IRCA41

IRCA631

MDF180MDX607

MDX624

PB217

PB254

RRIC100

RRIM600

RRIM901

RRIM926

-1

-0.75

-0.5

-0.25

0

0.25

0.5

0.75

1

-1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1

F2

(2

3.6

1 %

)

F1 (43.39 %)

Variables (axes F1 et F2 : 67.00 %)

CCPCGAB3

CIND3

CLN16

CSB1

CSB16

CSRi5

CTHA3

CZ

E55

E70IARUD

-6

-4

-2

0

2

4

6

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

F2

(2

3.6

1 %

)

F1 (43.39 %)

Observations (axes F1 et F2 : 67.00 %)

- Le test toxinique est un outil important pour l’étude de la relation entre les variétés d’hévéa et Corynespora cassiicola, dans une perspective de sélection précoce des variétés. La toxine Cas1 serait bien un déterminant majeur de la pathogénicité de la souche CCP. - La mise en évidence d’une interaction importante entre les variétés et différents filtrats montre la nécessité de prendre en compte la diversité du champignon. - Il convient de poursuivre la recherche méthodologique pour mieux contrôler les facteurs de variabilité des mesures.

1. Déon M et al., 2012a. Characterization of a cassiicolin-encoding gene from Corynespora cassiicola, pathogen of rubber tree

(Hevea brasiliensis). Plant Science 185-186, 227-237.

2. Déon M et al., 2012b. First characterization of endophytic Corynespora cassiicola isolates with variant cassiicolin genes

recovered from rubber trees in Brazil. Fungal Diversity 54, 87-99.

3. Déon M et al., 2013. Diversity of the cassiicolin gene in Corynespora cassiicola and relation with the pathogenicity in Hevea

brasiliensis. Fungal Biology. doi:10.1016/j.funbio.2013.10.011.

4. Breton et al., 2000. Role of cassiicolin, a host-selective toxin, in pathogenicity of Corynespora cassiicola, causal agent of a

leaf fall disease of Hevea. J Rubber Res 3(2)/115-128

5. de Lamotte F et al., 2007. Purification and characterization of cassiicolin, the toxin produced by Corynespora cassiicola,

causal agent of the leaf fall disease of rubber tree. J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 849, 357-362.

6. Barthe P et al., 2007. Structural analysis of cassiicolin, a host-selective protein toxin from Corynespora cassiicola. J. Mol. Biol.

367, 89-101.

- Hevea brasiliensis est la seule source commerciale de caoutchouc naturel, agro-matériau utilisé principalement (70 %) dans l’industrie du pneumatique. L’hévéa est sensible à une maladie foliaire due au champignon Corynespora cassiicola. Ce champignon secrète une toxine protéique, la cassiicoline, dont six isoformes ont été identifiées1,2,3. L’isoforme Cas1, issue une souche très agressive (CCP), jouerait un rôle important en tant qu’effecteur de la maladie4,5,6.

- Dans un objectif de sélection précoce, une méthode d’évaluation de la sensibilité des variétés à cette maladie a été mise au point, par application sur folioles détachées de la toxine Cas1 purifiée ou de filtrats de culture de différentes souches du champignon.

RRIC103 sensible GT1 résistant

10e Journées Jean Chevaugeon,Aussois – Janvier 2014

- Feuilles stade C , en survie

- Gouttes de 15µl appliquées sur épiderme gratté

- 2 à 7 répétitions par combinaison variété x filtrat

Incubation 48h,

25°C , obscurité

Découpe de

fragments foliaires

MESURE DE LA

SURFACE DE NECROSE

SN

TRAITEMENT

� Toxine Cas1 purifiée (témoin 0, et 1, 5 ou 10 ng/µl)

� Filtrats de culture de 12 souches (et témoin CZ = simple milieu de culture)

MESURE DU % DE FUITE

D’ELECTROLYTES

%FC1: conductivité électrique après 24h de

macération dans l’eau (25°C, obscurité)

Autoclavage

C2: conductivité après autoclavage

%F = (C1/C2)*100

� Sur 20 variétés

1 2 3 5 10 20

2040

6080

100

Pou

rcen

tage

de

fuite

d é

lect

roly

tes

(R)

CZ Tox0 Tox1 Tox5 Tox10 CCP

Traitement

% f

uit

e d

’éle

ctro

lyte

s (%

F)

CZ Tox0 Tox1 Tox5 Tox10 CCP

Traitement

Tableau 1: Sensibilité de 20 variétés à la toxineCas1 purifiée (1, 5, 10 ng/µl) et au filtrat CCPmesurée par conductimétrie (%F). Témoins: Eau(Tox0)

Figure 3: Plan 1-2 d’une ACP montrantla variabilité des relations variété x filtratpour 12 filtrats sur 20 variétés .

15%

14%

15%

56%

Variété

Filtrat

Interaction

Erreur

%F(C)

3%9%

15%

73%

Variété

Filtrat

Interaction

Erreur

(D)SN

48%

16%

36%Variété

Traitement

Erreur

(B)%F

Tableau 2: Sensibilité des 20 variétés aux 4 filtrats lesplus toxiques. Témoin: CZ (milieu de culture noninoculé). Analyse par conductimétrique (%F).

a_CZ b_RUD c_CGAB3 d_CSB16 e_CSB1 f_IA g_E70 h_E55 i_CLN16 j_CTHA3 k_CIND3 l_CSRi5 m_CCP

02

46

8

Filtrat

Sur

face

de

nécr

ose

(S) e

n cm

2

CZ RUD CGAB3 CSB16 CSB1 IA E70 E55 CLN16 CTHA3 CIND3 CSRi5 CCP

Filtrat

Su

rfa

ce d

e n

écr

ose

en

cm

2(S

N)

a_CZ b_RUD c_CGAB3 d_CSB16 e_CSB1 f_IA g_E70 h_E55 i_CLN16 j_CTHA3 k_CIND3 l_CSRi5 m_CCP

2040

6080

Filtrat

Pou

rcen

tage

de

fuite

d'é

lect

roly

tes

(R)

CZ RUD CGAB3 CSB16 CSB1 IA E70 E55 CLN16 CTHA3 CIND3 CSRi5 CCP

Filtrat

% d

e f

uit

e d

’éle

ctro

lyte

s (%

F) (B)

SN

Variété Tox0 Tox1 Tox5 Tox10 CCPIRCA631 9,0 42,0 58,0 68,0 73,3RRIM901 8,5 25,0 42,0 62,0 66,3FDR4575 11,1 16,0 45,0 73,0 63,6RRIM926 8,5 18,0 36,0 40,2 58,8MDF180 11,5 19,0 27,6 35,0 57,0IRCA19 10,0 33,0 44,0 60,0 56,8IRCA18 11,0 38,0 48,5 44,0 55,4PB217 12,0 15,3 53,0 56,0 51,2PB254 9,0 45,6 58,0 67,9 42,1

RRIC100 10,3 12,3 19,0 25,8 34,4IRCA145 7,0 12,5 34,0 41,0 22,7FDR5788 12,8 15,0 16,0 15,0 17,4IRCA41 10,7 14,7 25,0 53,0 17,4MDX624 7,9 10,0 12,2 19,0 16,3

GT1 11,0 9,4 11,1 9,0 12,1RRIM600 9,0 13,7 12,0 11,0 10,9CD1174 8,8 8,0 12,6 17,2 10,4FDR5240 9,0 10,0 10,2 12,6 9,8MDX607 8,0 9,0 11,0 18,0 9,3FDR5665 8,0 7,0 7,4 11,4 6,9

Remarque: Intensité de la réponse %F0 + +++

Variété\Souche CZ CSRi5 CIND3 CTHA3 CCPGroupe génétique A4 A4 F1 CClasse toxinique cas0 cas0 cas0 cas1

IRCA631 9,5 39,1 37,5 19,9 73,3

RRIM901 14,5 47,6 32,6 37,7 66,3FDR4575 17,3 55,9 57,3 38,9 63,6

RRIM926 9,8 46,8 53,3 13,0 58,8

MDF180 19,2 12,3 22,1 37,8 57,0IRCA19 9,8 11,6 10,8 36,4 56,8

IRCA18 9,5 25,0 30,2 16,2 55,4

PB217 8,8 14,6 11,2 17,8 51,2PB254 9,0 10,3 11,1 30,8 42,1

RRIC100 8,7 11,4 13,3 16,6 34,4

IRCA145 9,5 22,6 10,6 20,1 22,7FDR5788 9,0 47,0 48,9 41,9 17,4

IRCA41 9,2 11,2 10,6 19,8 17,4

MDX624 8,7 18,0 23,2 13,4 16,3GT1 13,3 13,5 32,8 50,4 12,1

RRIM600 9,9 13,0 11,4 22,4 10,9

CD1174 8,8 36,8 23,3 15,0 10,4FDR5240 9,6 9,4 10,3 25,1 9,8

MDX607 7,7 9,8 12,3 23,3 9,3

FDR5665 8,5 8,0 8,7 13,8 6,9

Remarque: Intensité de la réponse %F0 + +++

(A)

%F

(A)

Figure 2: Conductimétrie %F sur 20variétés avec la toxine Cas1 purifiée (1,5, 10 ng/µl) et avec le filtrat CCP.Témoins: Eau (Tox0) et milieu de culturenon inoculé (CZ). (A): distribution desdonnées par traitement. (B): composantesde la variance (%), témoins non inclus.

Contact: dminhrriv@gmail.com

Valerie.Pujade-renaud@cirad.fr