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INSTITUTO ITALIANO DE ROSARIO
Escuela de Medicina
EFECTO DEL TRATAMIENTO CON MONOFLUOROFOSFATO Y
FLUORURO DE SODIO SOBRE EL PROCESO DE REPARACIÓN ÓSEA EN
RATAS
TESIS DOCTORAL
Autora: Sandra Patricia Mejía Delgado
Director: Dr. Alfredo Rigalli.
2011
1
DEDICATORIAS
Especialmente a Dios por los dones que ha puesto en mí. Todo lo aquí hecho lo hizo
ÉL, a través mío.
A la memoria de mi madre “Licho” quien entregó su vida a mi formación y su amor a
los principios morales para guiarme hacia el mejor de los caminos: el conocimiento
fundamentado en el respeto por la vida, la honestidad y la entrega a los demás.
A mi madre Gabriela, quien llenó mis días de amor, dulzura y comprensión para no
desfallecer en el esfuerzo y acompañarme hasta el final con su elocuente silencio y su
total entrega.
A José Luis, ejemplo de vida, de lucha y de amor. Su inmensurable apoyo y contención
en los momentos críticos de mi carrera doctoral han sido el cimiento para construir
sobre una sólida base un nuevo mundo para mí y para mis hijos. A ellos, Daniela y
Sebastián, guerreros incansables e incondicionales. Por su irrestricto apoyo, amor y
compromiso con esta meta que, aún sintiéndola mía, es de ellos.
A mis hermanas Gaby, Cristina y Gloria. A mis hermanos Carlos, Javier y Beto, quienes
nunca dejaron de creer en mí y siempre desde lejos me apoyaron y sintieron conmigo
los buenos y los no tan buenos momentos. A todos aquellos de mi familia que sin
juzgar, simplemente creyeron y callaron.
2
AGRADECIMIENTOS
Al ilustre, bien reconocido, gran Maestro y Director de esta tesis, Doctor Alfredo
Rigalli. Sus enseñanzas en el conocimiento científico aplicadas al ser vivo, me
enseñaron a re-pensar la vida como un momento transformante del cual yo puedo ser el
artífice del cambio. Con sus consejos, su firmeza y exigencia sembró en mí la semilla
del verdadero sentido de “Ser Humano”, al enseñarme a confrontar los invaluables
aportes de la vida animal con los adelantos científicos que pueden extenderse para el
bienestar y el mejoramiento de la salud humana.
A todo el Grupo de Investigación del Laboratorio de Biología Ósea por abrir desde un
principio las puertas de sus corazones para ayudarme a cumplir con todos mis
propósitos. Por escuchar y soportar las exposiciones en mi extraño lenguaje y a pesar de
todo, continuar a mi lado como mis mejores puntos de apoyo.
Al Grupo GITCO por ser el artífice de tantos sueños conjuntos y tantas metas
concretadas. Al bien reconocido Doctor Iván Darío Vélez Bernal, por haber creído
siempre en mí y en este proyecto. Su apoyo y sabiduría han sido de alta trascendencia
para los logros que hoy se han cumplido.
A los profesores del Departamento de Morfología de la Universidad de Antioquia
quienes creyeron en mí y también a quienes no. A todos los amigos, compañeros y
colegas argentinos quienes en todas sus formas contribuyeron a la construcción y
materialización de este sueño.
3
RESUMEN
El fluoruro (F) ya sea como monofluorofosfato (MFP) o como fluoruro de sodio
(NaF) tiene efecto osteogénico. Su acción radica en el estímulo de la proliferación de
osteoblastos. No existe información sobre el efecto de estas drogas en el proceso de
reparación de defectos no críticos a nivel óseo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el
efecto del tratamiento con NaF y MFP sobre el proceso de reparación de un defecto
óseo no crítico.
Se utilizaron ratas hembras IIM/FM sublínea “e” de 7 semanas. Se produjo un
defecto óseo de 2 mm de diámetro en la epífisis proximal de ambas tibias hasta llegar a
la cavidad medular. La cirugía se llevó a cabo bajo anestesia general, en condiciones de
esterilidad y los animales recibieron antibioticoterapia y analgesia. Luego de la cirugía
fueron divididos en tres grupos: MPF (recibieron 80 µmol MFP/día en 1 ml de
solución), NaF (recibieron 80 µmol NaF/día en 1 ml de solución) y Control (recibieron
1 ml de agua). Las administraciones se realizaron por sonda orogástrica y los
tratamientos duraron 30 días. Al inicio del tratamiento y a los 10, 20 y 30 días se
tomaron muestras de sangre y se determinó la densidad mineral ósea (DMO). En plasma
se determinó calcio, fosfato, flúor y fosfatasa alcalina. Al finalizar el tratamiento se
determinó fluoruria y calcio fecal. A los 30 días se sacrificaron los animales, se
obtuvieron las tibias y se procesaron para su estudio histológico.
Los tratamientos aplicados no modificaron el peso corporal, la DMO del hueso
sano, la calcemia ni la fosfatemia. La fosfatasa alcalina plasmática se incrementó
4
significativamente a lo largo del tratamiento en los grupos NaF y MFP. La DMO de la
zona del defecto fue significativamente mayor en el grupo tratado con MFP a los 10
días de tratamiento. El estudio histológico de la zona del defecto indica que luego de 30
días de tratamiento el hueso formado en presencia de MFP es de mejor organización
histológica que el grupo Control. Se concluye que la reparación ósea de un defecto no
crítico es acelerada por la presencia de MFP y que la mineralización del defecto es más
rápida en presencia de MFP que se refleja en el aumento de la DMO del defecto a los 10
días de tratamiento.
5
Índice de contenidoDEDICATORIAS..............................................................................................................2AGRADECIMIENTOS.....................................................................................................3RESUMEN........................................................................................................................4CAPÍTULO 1....................................................................................................................8
INTRODUCCIÓN........................................................................................................8CAPÍTULO 2..................................................................................................................10
OBJETIVOS...............................................................................................................10Objetivo General....................................................................................................10Objetivos Específicos.............................................................................................10Definición del área y del problema .......................................................................10
CAPÍTULO 3..................................................................................................................12MARCO TEÓRICO....................................................................................................12
Generalidades del tejido óseo.................................................................................12Células del tejido óseo...........................................................................................19Osteogénesis ..........................................................................................................30Remodelación Ósea................................................................................................34El defecto óseo y el proceso de reparación............................................................38Flúor y su efecto sobre el tejido óseo ....................................................................39
CAPÍTULO 4..................................................................................................................43HIPÓTESIS.................................................................................................................43
Justificación............................................................................................................43Viabilidad...............................................................................................................44
CAPÍTULO 5..................................................................................................................46MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................................46
Animales de experimentación................................................................................47Esterilización del material quirúrgico....................................................................47Anestesia general...................................................................................................47Analgesia y antibioticoterapia................................................................................48Cirugías..................................................................................................................48Eutanasia ...............................................................................................................49Administración del NaF y del MFP.......................................................................49Obtención de muestras de orina y sangre...............................................................49Determinación de la concentración de fluoruro urinario.......................................50Determinación de la concentración de flúor plasmático........................................51Preparados histológicos..........................................................................................51Determinación de fosfatasa alcalina plasmática.....................................................52Determinación de fósforo inorgánico.....................................................................53Determinación de calcio plasmático......................................................................53Medición de densidad mineral ósea.......................................................................54Consideraciones sobre el efecto estrogénico en la rata..........................................55
CAPÍTULO 6..................................................................................................................56RESULTADOS...........................................................................................................56
6
Efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las ratas........................................56Efecto del tratamiento sobre la densidad mineral del hueso sano..........................56Densidad mineral ósea de la zona del defecto .......................................................57Fosfatasa alcalina plasmática.................................................................................58Calcio fecal.............................................................................................................59Calcemia.................................................................................................................60Fosfatemia..............................................................................................................62Fluoruria ................................................................................................................62Fluoremia...............................................................................................................63Análisis histológico................................................................................................65
CAPÍTULO 7..................................................................................................................73DISCUSIÓN...............................................................................................................73
CAPÍTULO 8..................................................................................................................77CONCLUSIÓN...........................................................................................................77
CAPÍTULO 11................................................................................................................78BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................78
TRABAJOS PRESENTADOS A CONGRESOS Y PUBLICACIONES.......................86
7
CAPÍTULO 1
INTRODUCCIÓN
El tejido óseo es un complejo y amplio sistema del organismo. La interacción
entre sus células, minerales y componentes de la matriz orgánica le proveen funciones
de sostén, protección y metabólica. Su integración con otros sistemas como el tejido
muscular y los tejidos conectivos blandos le confieren propiedades para el soporte y el
movimiento. El calcio y el fosfato son dos iones utilizados en la formación del cristal de
hidroxiapatita, responsable de la calcificación del hueso.1 El tejido óseo además tiene un
importante rol en la preservación y funcionalidad de la médula ósea.
El tejido óseo está sometido a lesiones de origen metabólico o traumático. Entre
estas últimas tenemos las lesiones que producen defectos críticos y no críticos. Mientras
los primeros de estos defectos requieren de aporte de estructuras de sostén que permitan
la regeneración, los segundos se reparan sin la necesidad de agregados de matrices óseas
o no óseas.
Las sales que contienen flúor tienen efecto estimulador de la formación de tejido
óseo y dicha acción ha sido validada en diferentes modelos animales, entre ellos en la
rata en crecimiento2. Se ha demostrado un efecto osteoformador luego de la
administración de monofluorofosfato de sodio (MFP) y fluoruro de sodio (NaF).
1 Ross M, Gordon I, Wojciech P. 2004. Histología texto y atlas color con biología celular y molecular. Ed. Panamericana. 4a ed. Capítulo 9. Pág. 182-215. Buenos Aires.2 Brun L, Pera L, Rigalli. A. 2010 Bone morphometry and differences in bone fluorine containing compounds in rats treated with NaF and MFP. Biomed Pharmacother. 64(1):1-6.
8
No se ha hallado información respecto de la acción del fluoruro sobre el
mecanismo de reparación de defectos no críticos. Por lo tanto, esta investigación tiene
como objetivo determinar el efecto del MFP y del NaF en el proceso de reparación ósea
y la calidad del hueso formado en tibias de rata con un defecto óseo no crítico. El efecto
se evaluará a través de la medida de la densidad mineral ósea (DMO) y la calidad del
hueso formado.
Se trata de un modelo experimental aleatorizado controlado en 18 ratas IIM/FM
sublínea “e”, que reciben MFP, NaF o placebo y se pretende demostrar que los animales
tratados con NaF y MFP tendrán una velocidad de reparación mayor. La estructura
histológica y la DMO serán las variables estudiadas para evaluar el efecto de los
tratamientos.
9
CAPÍTULO 2
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar el efecto de la administración oral de MFP y de NaF sobre el
proceso de reparación ósea en la rata.
Objetivos Específicos
Evaluar el efecto de la administración de MFP y NaF sobre la velocidad de
reparación ósea.
Determinar el efecto de la administración de MFP o NaF sobre la calidad del hueso
neoformado mediante el análisis histológico.
Evaluar el efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre la velocidad del proceso de
mineralización en el sitio de la lesión y en el hueso adyacente a través de mediciones
radiológicas.
Evaluar el contenido de flúor en orina y plasma y su relación con la velocidad de
reparación y calidad del hueso reparado.
Definición del área y del problema
Los defectos críticos óseos por trauma, presentan dificultades para su reparación
y reorganización tisular. Estos defectos generan cambios morfológicos, metabólicos y
10
biomecánicos por no contar con el componente celular y mineral óptimo para una
adecuada reparación debido a la pérdida tisular local. Estos cambios conducen a la
disfunción del miembro afectado dejando serias consecuencias en la movilidad y la
funcionalidad. Por otra parte lo defectos no críticos se reparan sin necesidad de
utilización de materiales de relleno, pero la inmovilidad durante tiempos prolongados es
un problema para los individuos y la sociedad.
11
CAPÍTULO 3
MARCO TEÓRICO
Generalidades del tejido óseo
El tejido óseo es un tejido conjuntivo que se caracteriza por tener una matriz
extracelular mineralizada que lo distingue de otros tejidos conectivos. Por ser un tejido
duro es capaz de proveer sostén y protección. El componente mineral está formado por
cristales de hidroxiapatita: Ca10(PO4)6(OH)2. Por su constitución actúa como depósito de
calcio y fosfato, que pueden ser movilizados del tejido óseo a la sangre según sea
necesario para mantener la calcemia y la fosfatemia dentro de valores normales.
La matriz ósea orgánica contiene principalmente colágeno de tipo I, que
constituye alrededor del 90% de esta matriz. También contiene sustancia fundamental
en la forma de glucosaminoglucanos (hialuronato, condroitinsulfato y queratansulfato),
pequeñas glucoproteínas (osteocalcina, osteonectina y osteopontina) y varias
sialoproteínas. Las glucoproteínas y las sialoproteínas de la sustancia fundamental
desempeñan un papel en la fijación del calcio durante el proceso de mineralización.
Tanto el colágeno como los componentes de la sustancia fundamental se mineralizan
para formar el tejido óseo. Cuando esta matriz no está calcificada se conoce como
osteoide y constituye la matriz extracelular ósea recién sintetizada por los osteoblastos.
El osteoide se deposita en forma de láminas, quedando los osteoblastos atrapados dentro
de él, convirtiéndose en osteocitos cuando la matriz se calcifica.
12
La matriz orgánica representa un tercio del peso óseo y juega un papel
importante en el conjunto del sistema óseo, siendo evidente este hecho cuando aparecen
enfermedades del colágeno como la osteogénesis imperfecta. Actualmente se considera
la matriz mineralizada extracelular como algo más que un reservorio de calcio y fósforo,
ya que constituye una reserva de proteínas que participan en la regulación de la
diferenciación celular y en la integridad y función del tejido óseo.
Además del colágeno tipo I, contiene pequeñas cantidades de colágeno III, V y
XII. Es característico de la molécula de colágeno la presencia de regiones RGD de
secuencia aminoacídica específica, la cual es reconocida por las integrinas de la
superficie de las células óseas. Contiene además los aminoácidos hidroxilisina e
hidroxiprolina siendo, este último, un marcador específico de todos los tipos de
colágeno y estando sus valores de excreción urinaria en relación directa con la tasa de
resorción ósea. Las fibras de colágeno se estabilizan mediante los puentes de hidrógeno,
entre aminoácidos y a través de la formación de puentes de piridinolina, entre las
hidroxilisinas y lisinas. Sin embargo, el colágeno no tiene gran afinidad por el calcio,
por lo que son otras las proteínas implicadas en el depósito mineral. La mineralización
comprende la liberación de vesículas matriciales hacia la matriz ósea. En los sitios
donde se inicia la mineralización del hueso, la concentración local de iones calcio y
fosfato debe superar un umbral. Son varios los procesos que conducen a la
mineralización. La fijación de calcio extracelular por la osteocalcina y otras
sialoproteínas crea una concentración local alta de este ion. La concentración de calcio
estimula los osteoblastos para que secreten fosfatasa alcalina, que aumenta la
13
concentración local de iones de fosfato. El aumento de las concentraciones de calcio y
fosfato contribuirán al inicio de la mineralización. La concentraciones elevadas de
calcio y fosfato inducen a que los osteoblastos liberen pequeñas vesículas matriciales
hacia la matriz ósea, que contienen fosfatasa alcalina y pirofosfatasa que escinden iones
de fosfato de otras moléculas de la matriz. Estas vesículas matriciales inducen la
cristalización y el depósito de cristales de hidroxiapatita, en la matriz que rodea los
osteoblastos. Las vesículas matriciales derivadas de los osteoblastos son los factores
esenciales que controlan el sitio donde se inicia el depósito de minerales en el osteoide.
Una vez que han precipitado los primeros cristales de hidroxiapatita, estos crecen con
rapidez hasta que se unen con los cristales vecinos producidos alrededor de otras
vesículas matriciales.
El hueso es considerado un reservorio de calcio. El mantenimiento de la
concentración sanguínea de calcio es decisivo para la salud y la vida. El calcio puede ser
llevado desde la matriz ósea hasta la sangre si la calcemia disminuye por debajo de un
valor crítico. Por el contrario, el exceso de calcio sanguíneo puede ser extraído de la
sangre, almacenado en el tejido óseo o excretado por riñón. Estos procesos son
regulados por la hormona paratiroidea (PTH) secretada por las glándulas paratiroides y
la calcitonina, secretada por las células parafoliculares de la glándula tiroides. La PTH
actúa sobre el hueso, estimulando la acción de los osteoclastos que resorben la matriz
ósea, liberan calcio y elevan la calcemia. Por su parte la calcitonina actúa disminuyendo
la calcemia, al ejercer un efecto inhibitorio sobre los osteoclastos.3
3 Ross M, Gordon I, Wojciech P. 2004. Histología texto y atlas color con biología celular y molecular. Ed. Panamericana. 4ta Ed. Buenos Aires. Capítulo 9, Pág. 188-92.
14
El hueso puede tener una estructura madura laminar o una forma inmadura o
plexiforme, estando este último menos mineralizado que el hueso laminar. Por su parte
el osteoide constituye menos del 1% del volumen total y se puede observar en forma de
finos ribetes de unas 10 micras de espesor que revisten la superficie de trabéculas y
tapizan cavidades intracorticales.4
La matriz ósea es la responsable de las propiedades biomecánicas del hueso. Las
fibras colágenas le proporcionan flexibilidad y resistencia a la tensión mientras que los
minerales le confieren dureza, rigidez y resistencia a la compresión.5
En la matriz ósea hay espacios llamados lagunas u osteoplastos, cada uno de los
cuales contiene un osteocito. El osteocito extiende una gran cantidad de prolongaciones
en estrechos túneles denominados canalículos, los que atraviesan la matriz mineralizada
para conectar las lagunas contiguas y permitir el contacto entre las prolongaciones de
osteocitos vecinos. De esta manera se forma una red continua de canalículos y lagunas
con células y sus prolongaciones en toda la masa del tejido mineralizado. El tejido óseo
depende en gran medida de los osteocitos para mantener su viabilidad. Los osteocitos
están interconectados por prolongaciones celulares que se comunican por uniones del
tipo nexo. Estas uniones permiten el transporte metabólico y de señales a lo largo de las
prolongaciones celulares y dicho transporte está limitado a una distancia aproximada de
100 µm.
4 Serrano S 1998. II Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica. Estructura y Función del Hueso Normal. http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteocl.htm.5http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteocl.htm.
15
Microscópicamente el tejido óseo está constituido por dos tipos de hueso: 80%
de hueso compacto y 20% de hueso trabecular. El hueso tiene una organización
laminillar que le confiere la dureza que lo caracteriza. El hueso compacto aparece como
una masa sólida, mientras que el hueso trabecular consiste en una red de trabéculas
óseas que delimitan los espacios ocupados por la medula ósea. Tanto el tejido óseo
compacto como el trabecular forman parte de los diferentes tipos de huesos: largos,
cortos y planos.
Los huesos largos tiene dos epífisis y una diáfisis que están separadas por las
metáfisis donde se halla el cartílago hialino llamado cartílago de crecimiento (Figura 2).
Este cartílago es el responsable del crecimiento en largo de estos huesos. El cartílago de
crecimiento pasa a llamarse línea epifisiaria en el adulto y no produce más crecimiento
en largo. La diáfisis está constituida por tejido óseo compacto que forma un cilindro
Figura 1: Osteocitos y sus comunicaciones intercelulares.
16
hueco con un espacio medular central, denominado cavidad medular. Los extremos son
llamados epífisis, están constituidos mayormente por tejido óseo trabecular, el que se
halla recubierto por una capa de hueso compacto .6
Las superficies articulares en los extremos de los huesos largos están revestidas
por cartílago hialino, denominado cartílago articular. Salvo en las superficies articulares
y en los lugares de inserción de los tendones y ligamentos, la mayor parte de los huesos
se rodean por el periostio que cubre la superficie externa y contiene vasos y células
osteoprogenitoras. Por ello se considera un tejido conjuntivo especializado con
capacidad osteogénica.
6 Modelo tomado de Kierszenbaum: Histology & Cell Biology: An introduction to Pathology 2da. Ed. Pág.128-130.
17
Figura 2: Partes de un hueso largo y tipos de tejidos óseos que lo componen.
La cavidad medular de la diáfisis y los espacios dentro del hueso trabecular están
revestidos por endostio, el cual está formado por células que pertenecen al estroma de la
médula o derivan de osteoblastos en reposo y son la principal fuente de células de
revestimiento en los canales de Havers. El endostio también tiene capacidad
osteogénica.
Figura 3: Estructura del hueso cortical formado por sistemas de Havers y sistemas intersticiales.
El hueso compacto forma su estructura alrededor de los conductos de Havers, los
cuales son rodeados por laminillas concéntricas de matriz ósea calcificada que
contienen osteocitos dispuestos entre las laminillas (Figura 3)7. Los diferentes sistemas
de Havers se comunican entre sí por conductos de Volkmann.
7 Modelo tomado de Kierszenbaum, Abraham. 2008. Histología y Biología Celular. Introducción a la Patología. 2a. ed; Ed. Elsevier. España. Pág.130-4.
18
El hueso trabecular por su parte, está constituído por una red de trabéculas que
respeta ciertos espacios que contienen en su interior medula ósea.8 El hueso trabecular
consiste en laminillas que no tienen un canal central. Esta red de trabéculas es más
afectada por cambios hormonales, especialmente de PTH, calcitonina, hormona de
crecimiento y el factor de crecimiento insulino-símil I (IGF-I). 9
El periostio está formado por dos capas:
La externa con abundantes fibras colágenas y vasos sanguíneos que entran en los
canales de Volkmann. La fibras que salen de esta parte del periostio se denominan
fibras de Sharpey y se proyectan al sistema circunferencial externo.
La interna que contiene células osteoprogenitoras que se convierten en osteoblastos
durante los procesos que requieren reparación, como las fracturas. 10
Células del tejido óseo
En el tejido óseo se encuentran diferentes tipos celulares involucrados en el
proceso de generación de células específicas, en la formación y resorción ósea y en la
nutrición del tejido.
Células del mesénquima: Estas células tienen un rol importante en la formación
del tejido óseo, pudiendo dar origen a cinco estirpes celulares distintas: fibroblastos,
8 Ross M, Gordon I, Wojciech P. 2004. Histología texto y atlas color con biología celular y molecular. Ed. Panamericana. 4a Ed. Buenos Aires. Capítulo 8. Pág. 182-93. 9Op. Cit.4. Pág.1510 Kierszenbaum, Abraham. 2008. Histología y Biología Celular. Introducción a la Patología. 2a. Ed. Ed. Elsevier. España. Pág. 131-64.
19
osteoblastos, condroblastos, mioblastos y adipocitos, en respuesta a diferentes señales
moleculares. Existe un gran número de estudios que han demostrado la capacidad de
estas células de reparar daños en tejidos in vivo.11
Las células madre del mesénquima se caracterizan morfológicamente por ser
células pequeñas, largas y estrechas con pocos procesos celulares. En el interior se
encuentra un núcleo grande y redondo con un nucléolo prominente, rodeado de finas
partículas de cromatina que delimitan y diferencian el núcleo claramente. El cuerpo
celular contiene además compartimentos celulares como el aparato de Golgi, retículo
endoplásmico rugoso, mitocondrias y polirribosomas. Tienen además la capacidad de
transformarse en un tejido diferente del que formaba parte y adaptarse a las nuevas
condiciones del medio.
Células osteoprogenitoras: Las células osteoprogenitoras son células en reposo
que pueden transformarse en osteoblastos. Su ubicación está confinada a la superficie
interna y externa de los huesos. Reciben la denominación de células periósticas cuando
forman la capa más interna del periostio y células endósticas cuando tapizan las
cavidades medulares, los conductos de Havers y de Volkmann.
Las células osteoprogenitoras tienen las propiedades de dividirse, proliferar y
transformarse en osteoblastos. Durante esta transformación se producen cambios de su
retículo endoplásmico rugoso, ribosomas libres y aparato de Golgi. Estas
11 http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/946/934 pág. 197-198 (Friedenstein, 1976). Damián García Olmo y Mariano García Arranz.
20
microestructuras en el estadio de célula osteoprogenitora se encuentran poco
desarrolladas y escasamente visibles.
Su origen en células mesenquimales y su aparente capacidad de diferenciarse en
varios tipos de células diferentes de los osteoblastos: adipocitos, condroblastos,
musculares y fibroblastos (Figura 4), indican que estas células pueden modificar sus
características morfológicas y funcionales en respuesta a estímulos específicos. Esto es
importante porque la reparación de fracturas óseas comprende la formación de nuevo
tejido conjuntivo y cartílago en el callo que aparece alrededor del hueso durante le
proceso reparativo.12
La diferenciación del osteoblasto viene regulada por factores de crecimiento y
transcripción. Varios miembros de la familia de las proteínas morfogenéticas óseas
(BMP) y del factor de crecimiento transformante β pueden regular el desarrollo
embrionario y la diferenciación del osteoblasto.
Ciertos genes específicos de los osteoblastos regulan la diferenciación de la
progenie. El gen Cbfa1/Runx2 codifica un factor de transcripción que induce la
diferenciación de los osteoblastos y controla la expresión de osteocalcina. Cbfa1/Runx2
es el indicador más precoz y específico de la osteogénesis y su expresión se induce por
BMP7. 13,14
12 Ross M, Gordon I, Wojciech P. 2004. Histología texto y atlas color con biología celular y molecular. Ed. Panamericana. 4a Ed. Buenos Aires. Capítulo 9, Pág. 188-92. 13 Op. Cit.4 Pág.1514 Op. Cit.4 Pág. 15
21
Un tipo de células de aspecto fibroblástico cercanas a las superficies óseas pero
separadas de estas por otros tipos celulares se conocen como preosteoblastos (Figura 5),
derivan de células osteoprogenitoras y serían estadios previos a la diferenciación a
osteoblastos.15
Osteoblastos: Son células de forma cúbica, citoplasma basófilo y ricas en una
isoenzima específica de la fosfatasa alcalina. Derivan de los preosteoblastos y suelen
considerarse células con diferenciación terminal y por tanto incapaces de dividirse. Los
osteoblastos se hallan en contacto directo con las superficies óseas formando grupos
compactos de una sola capa de espesor (Figura 5).
15 Op.Cit.4 Pág. 15.
22
Figura 4: Diferenciación de células pluripotentes a diferentes tipos celulares.
Los osteoblastos poseen retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi muy
desarrollados.16 Sintetizan el componente orgánico de la matriz ósea y controlan el
depósito de minerales. Por otra parte, expresan receptores para PTH, IGF-1 y vitamina
D, fosfatasa alcalina y ligando del receptor activador del factor KB (RANKL) entre
otros (Figura 6).17
En la medida en que los osteoblastos sintetizan su propia matriz extracelular,
también producen y secretan una proteína denominada osteoprotegerina (OPG), que es
un receptor señuelo que se une a RANKL, una proteína ubicada en la membrana de los
osteoblastos. Por su parte RANKL se une al receptor activador del factor KB (RANK)
de precursores osteoclásticos e inicia la osteoclastogénesis. De esta manera, la OPG
inhibe la osteoclastogénesis y evita la resorción ósea.
16 Op. Cit.4. Pág. 1517 Op. Cit.4. Pág.15
Figura 5: Preosteoblastos fusiformes adyacentes a osteoblastos cúbicos que revisten un ribete de osteoide.
23
Tanto in vivo como in vitro, los osteoblastos pasan sucesivamente por tres
estadios funcionales:
Proliferación celular y síntesis de los componente orgánicos de la matriz ósea.
Maduración de la matriz ósea (cambios en la composición y organización de la
matriz que la hacen competente para ser mineralizada).
Depósito de mineral. In vitro se ha comprobado que estos estadios coinciden con la
activación sucesiva de una serie de genes. Los genes c-fos, c-jun, histona H4,
colágeno tipo I, fibronectina y factor de crecimiento transformante-ß que participan
en la proliferación y síntesis de los componente orgánicos de la matriz ósea. La
expresión de fosfatasa alcalina en membrana participa en el proceso de calcificación
de la matriz ósea. La expresión de los genes que codifican la sialoproteína ósea y la
24
Figura 6: Microfotografía electrónica de un osteoblasto y proteínas de membrana más importantes.
osteocalcina participan en el depósito de mineral.18 La fosfatasa alcalina es una
isoenzima que hidroliza ésteres de monofosfato a pH alcalino y deja de expresarse
cuando el osteoblasto deja de sintetizar proteínas. La osteocalcina es necesaria para
la mineralización ósea y la sialoproteína ósea interviene en la unión de los
osteoblastos con la matriz extracelular a través de las integrinas.
El osteoblasto también tiene a su cargo la calcificación de la matriz. El proceso
de calcificación parece que es iniciado por el osteoblasto mediante la secreción hacia la
matriz de las vesículas matriciales como se explicó anteriormente.
Los osteoblastos median en la resorción, llevada a cabo por los osteoclastos a
través de la síntesis de citoquinas específicas y sintetizan factores de crecimiento. La
vida media de los osteoblastos humanos es de 1 a 10 semanas, al término de las cuales
pueden desaparecer por mecanismos de apoptosis, transformarse en células de
revestimiento o quedar incluidos en la matriz ósea en forma de osteocitos.19
Células de revestimiento: Cuando los osteoblastos que han permanecido en la
superficie finalizan la síntesis de matriz, se aplanan y se convierten en células de
revestimiento. Estas células a través de la producción de factores locales como
interleukina-6, interleukina-11 parecen desarrollar un importante papel en el control del
remodelado óseo. En contraste con los osteoblastos que se ubican donde hay depósito
18 Op. Cit.4. Pág.15 .
19 Op. Cit.4. Pág.190 y 202. Pág. 15.
25
activo de matriz, las células de revestimiento son células aplanadas o adelgazadas que
revisten la superficie ósea. Estas células se parecen a las células osteoprogenitoras.
Osteocitos: son las células más abundantes del hueso, existen diez veces más
que los osteoblastos y se organizan formando un sincitio de células interconectadas que
representan una única estructura. Esta estructura le confiere la ventaja de una gran
superficie de contacto en el interior y hacia la superficie ósea, asegurando la provisión
de oxígeno y nutrientes.20
La cavidad de la matriz ósea que contiene el cuerpo celular del osteocito se
denomina laguna osteocitaria y los canalículos que albergan sus prolongaciones
citoplásmicas reciben el nombre de conductos calcóforos. Los osteocitos son células con
una escasa actividad metabólica pero su preservación parece necesaria para que el tejido
óseo mantenga sus propiedades biomecánicas.
Los osteocitos hacen parte del estadio final desde la línea osteoblástica y son
incapaces de renovarse. Comparten algunos marcadores con los osteoblastos, pero
tienen como marcador especifico el CD44, receptor de la membrana que se expresa en
osteocitos y es negativo en osteoblastos y células de revestimiento.
Osteoclastos: Son células multinucleadas encargadas de la resorción ósea. Sus
núcleos se sitúan en el extremo más alejado de la superficie ósea sobre la que asientan
20 Op. Cit.4. Pág.133. Pág. 15.
26
(Figura 7).21 Tiene en su membrana dos especializaciones: un borde en cepillo, que es
donde tiene lugar la resorción y una zona clara, rica en microfilamentos, con integrinas
que sirven de anclaje a la matriz. La adhesión de los precursores de los osteoclastos a la
matriz ósea ocurre luego que la superficie ósea queda libre de osteoblastos y células de
revestimiento.
Derivan de la célula madre hematopoyética a través de células formadoras de
colonias de granulocitos y macrófagos (CFU-GM). Su proliferación es activada por el
factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el reclutamiento de los
preosteoclastos se inicia a partir de las CFU-GM. El papel de las citoquinas sigue siendo
controvertido, explicando la interacción de las células de la médula ósea con las células
de la línea osteoblástica; así la interleukina-1, interleukina-6, factor de necrosis tumoral-
α y prostaglandina E2 parecen incrementar la activación osteoclástica. Sin embargo el
21 Op. Cit.4 Pág. 15.
Figura 7: Imagen microscópica de osteoclastos. La flecha marca un osteoclasto.
27
factor de crecimiento transformante-β reduciría la pérdida ósea, incrementando la
apoptosis de los osteoclastos.
Para ejercer su acción en el proceso de resorción, los osteoclastos se movilizan
hacia la zona a resorber y se adhieren a la superficie ósea mineralizada por el ribete en
cepillo sellando los bordes del área mediante las integrinas. La integrina del osteoclasto,
particularmente αvβ3, reconoce la secuencia RGD existente en el colágeno. A este nivel
el pH ácido, y enzimas proteolíticas como colagenasa, metalo-proteasas, catepsina K y
glucuronidasa, van a producir la resorción del hueso mediante solubilización de la
matriz orgánica y mineral (Figura 8).22
22 Op. Cit.4. Pág.147-149. Pág. 15
28
Figura 8: Esquema de los mecanismos implicados en la resorción ósea por parte de los osteoclastos.
Un canal de cloruro impide que aumente en exceso el pH intracelular. Se
intercambia bicarbonato por cloruro que posteriormente es transportado por un canal de
cloruro a la laguna de Howship. El intercambiador bicarbonato/cloruro garantiza que el
citoplasma se mantenga neutro a nivel eléctrico. La anhidrasa carbónica II genera
protones a partir de dióxido de carbono y agua, los protones se liberan hacia la laguna
de Howship por intermedio de una bomba generando un entorno ácido que favorece la
resorción de la matriz mineralizada.
Los osteoclastos expresan diferentes proteínas, algunas características de estas
células. La fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), cuya actividad es aprovechada
para su identificación, tanto in vivo, como in vitro.23 El osteoclasto también expresa en
su membrana receptores para la calcitonina.
Algunas hormonas sistémicas que estimulan la resorción ósea, no actúan
directamente sobre los precursores de osteoclastos, sino sobre los osteoblastos. Tanto la
PTH, 1,25-dihidroxivitamina D3 y las hormonas tiroideas, incrementan la expresión de
RANKL en osteoblastos, pudiendo en algunos casos inhibir la síntesis de OPG con un
efecto neto de incremento de la resorción ósea. El efecto de los estrógenos parece ser
indirecto, a través de la regulación de diversos mediadores, ya que su papel de control
en el sistema RANKL-RANK, se lleva a cabo exclusivamente incrementando los
niveles de OPG efecto que se potencia con su papel supresor sobre la síntesis de:
interleukina-1, interleukina-6, prostaglandina E2, M-CSF y factor de necrosis tumoral-
23 Fisiología y fisiopatología ósea. Physiology and bone physiopathology. http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol26/sup3/suple2a.html.Pág.7-9 Servicio de Endocrinología. Centro de Consultas Externas Príncipe de Viana. Pamplona.
29
α, frenando la diferenciación y activación de los preosteoclastos. La calcitonina inhibe
directamente la actividad osteoclástica a través de los receptores expresados en los
osteoclastos.
Existen otros factores locales que pueden condicionar el nivel de resorción ósea.
Por ejemplo, una concentración elevada de calcio, en el borde en cepillo de los
osteoclastos, es capaz de inducir su apoptosis.24
Osteogénesis
El hueso se desarrolla por la sustitución de un tejido conectivo preexistente. Los
dos procesos de formación de tejido óseo son: osificación intramembranosa y
osificación endocondral. La diferencia entre ambos tipos de osificación es que durante
la osificación endocondral el cartílago es sustituido por matriz ósea, mientras que en la
osificación intramembranosa la matriz ósea se sintetiza directamente por células del
linaje osteoblástico.25
Osificación intramembranosa: En la figura 9 cuadro 1, se observan células
mesenquimales que se agregan.26 Este proceso se controla por señales de los
polipéptidos de las familias Wnt, del factor de crecimiento fibroblástico y del factor de
crecimiento transformante-ß. En el cuadro 2, las células mesenquimales se diferencian a
osteoblastos.
24 Op. Cit.4. Pág.41. Pág.15.25 Op. Cit.4. Pág.128-30. Pág 15.26 Op. Cit.4. Pág.147-9. Pág.15.
30
En el cuadro 3, se observa el osteoide depositado por los osteoblastos.
Posteriormente, se utiliza calcio en el proceso de mineralización y los osteoclastos
inician el remodelado del tejido óseo.
Muchas trabéculas individuales aumentan de tamaño mediante crecimiento por
aposición y al final se fusionan para formar un centro de osificación primaria,
organizado durante el primer estadio de la osificación intramembranosa. Aunque la
formación del tejido óseo primario empieza como un proceso intersticial, pronto se
vuelve un proceso aposicional. Los osteoblatos quedan atrapados dentro del osteoide
calcificado, transformándose en osteocitos.27
El depósito continuo de osteoide en las superficies trabeculares determina la
oclusión de los espacios intertrabeculares y se forma el hueso compacto. En otras zonas
27 Op.Cit.4.Pág.147. Pág.15.
Figura 9: Proceso de osificación intramembranosa a partir de mesénquima.
31
no se produce el engrosamiento de las trabéculas y el tejido conjuntivo del espacio
intertrabecular se diferencia a tejido hematopoyético. Los huesos frontal y parietal y
parte de los huesos temporal, occipital, mandibular y maxilar se desarrollan mediante
osificación membranosa.
Osificación endocondral: El hueso se forma reemplazando el cartílago hialino
preexistente. El mecanismo de la deposición de matriz ósea durante la osificación
intramembranosa y la osificación endocondral es esencialmente el mismo. Se establece
una red trabecular principal y a continuación, se transforma en hueso maduro.28
La osificación endocondral es característica de los huesos largos, la columna
vertebral y la pelvis. Se observa la siguiente secuencia:
Los condrocitos del centro de la estructura de cartílago hialino se vuelven
hipertróficos y empiezan a sintetizar el colágeno de tipo X y el factor de crecimiento
endotelial vascular.
Los vasos del pericondrio invaden el centro de cartílago hipertrófico cuya matriz se
calcifica: es el establecimiento del centro de osificación primaria (Figura 10).29
Las células pericóndricas forman un delgado collarín perióstico en el tercio medio
de la diáfisis. El collarín perióstico forma hueso trabecular mediante un proceso de
osificación intramembranosa.
28 Op. Cit.4; Pág.149-50. Pág.15.29 Op. Cit.4. Pág.149. Pág.15.
32
Los vasos invaden el espacio que antes estaba ocupado por los condrocitos
hipertróficos permitiendo la llegada de las células osteoprogenitoras y
hematopoyéticas.
Figura 10: Osificación endocondral, formación de centro de osificación primario
33
Figura 11: Osificación endocondral, formación de centros de osificación secundario.
Las células osteoprogenitoras se diferencian en osteoblastos, que se alinean a lo
largo de la matriz de cartílago calcificado y empiezan a depositar osteoide. En este
momento el centro de osificación primaria comprende dos componentes: el collarín
perióstico y el centro de osificación en el interior de la estructura de cartílago. A
continuación suceden dos etapas: el crecimiento en longitud del hueso y el desarrollo
de los segundos centros de osificación en las epífisis (Figura 11).30
Los centros de osificación secundarios se producen por la sustitución del cartílago
hialino por hueso esponjoso, salvo en el cartílago articular y en el cartílago de
crecimiento epifisiario de las metáfisis.
El cartílago de crecimiento conserva la capacidad de condrogénesis y, tras la
pubertad, se sustituye por la línea epifisiaria.
Remodelación ósea
El hueso es capaz de regenerarse, permitiendo su restitución integral tras un
trauma. Por considerarse un tejido dinámico en constante formación y resorción,
mantiene un equilibrio conocido como proceso de remodelado óseo en el cual se
consigue renovar el hueso, entre un 5 y un 15% en un año en condiciones normales. El
remodelado óseo es un proceso llevado a cabo por los osteoclastos y por los
osteoblastos. La actividad conjunta de ambas células se conoce como unidad básica de
remodelado óseo.
30 Op. Cit.4. Pág.150. Pág.15.
34
La remodelación ósea consiste en el reemplazo del hueso antiguo por uno recién
formado. Es un proceso continuo a lo largo de la vida y los propósitos de la
remodelación son fortalecer el tejido óseo mediante la reparación de las microfracturas
y mantener la homeostasis del calcio.
En condiciones normales, el hueso resorbido es reemplazado por el mismo
volumen de hueso nuevo. Si el volumen de hueso resorbido no es completamente
reemplazado por hueso nuevo el tejido se debilita.
Hay dos formas de remodelación ósea: remodelación cortical y remodelación
trabecular.31
La remodelación del hueso cortical implica la resorción de un sistema
haversiano antiguo seguido por la organización de un nuevo sistema haversiano. Los
osteoclastos forman un túnel de resorción centrifuga que es rellenado centrípetamente
por osteoblastos. Para que ocurra este fenómeno, deben ocurrir cuatro fases de actividad
celular:
Activación: Los precursores de los osteoclastos son reclutados al canal de Havers y
se diferencian a osteoclastos, los cuales revisten la laminilla ósea que afronta el canal
y empiezan el proceso de resorción ósea de la laminilla interna y las consecutivas en
dirección a la laminilla externa.
31 Op. Cit.4. Pág.158-60. Pág.15
35
Resorción: Se reclutan más precursores de osteoclastos conforme progresa
ligeramente la resorción de las laminillas más allá del límite de la osteona original.
Inversión: Los osteoblastos invierten el proceso de resorción organizando una capa
dentro de la cavidad de resorción y comienzan a secretar osteoide. La línea de
cementación indica el límite de laminillas recién organizadas.
Formación: Los osteoblastos continúan depositando osteoide y al final quedan
atrapados dentro de la matriz ósea mineralizada para convertirse en osteocitos. Las
líneas de cementación son el marcador del inicio de la remodelación. Las fuerzas
externas que actúan sobre las osteonas pueden producir microfracturas las cuales
pueden ser neutralizadas por la línea de cementación y por la disposición y
orientación alternante de las fibras de colágeno mineralizadas en el hueso laminar.
Las microfracturas limitadas a la región de la osteona se pueden reparar mediante el
proceso de remodelación osteoblasto-osteoclasto. Cuando existe un defecto en la
arquitectura de la osteona, la microfractura se extiende y puede producir una fractura
ósea completa.32
Por otra parte la remodelación del hueso trabecular tiene lugar en la superficie
ósea a diferencia de la remodelación del hueso cortical, que se produce en forma de
túneles. La superficie endóstica de las trabéculas se remodela por este mecanismo,
cuyos pasos son parecidos a los de la remodelación del hueso cortical.33
32 Op. Cit.4. Pág.164. Pág.15.33 Op. Cit.4. Pág.164. Pág.15.
36
El proceso de resorción puede llegar a incrementar la fragilidad ósea, más allá de
lo esperable simplemente por la disminución de la densidad mineral. En las trabéculas
se producen erosiones durante la resorción así como aumento de porosidad. Si el
fenómeno se repite en el mismo territorio, el resultado será de pérdida de la estructura.
Además, el proceso de formación ósea requiere más tiempo que el de resorción, por lo
que si la remodelación ósea está aumentada, se compromete la mineralización, con
posterior incremento de la fragilidad del hueso.34
Reparación ósea
La regeneración tisular es la respuesta que consigue la restitución ad-integrum
del tejido tras un trauma. Por otra parte la reparación es el proceso de formación de un
tejido cicatricial, con características diferentes al original. En este sentido el hueso es un
tejido que se regenera tras una lesión. La regeneración ósea origina una respuesta en la
que están involucrados los vasos sanguíneos, las células y la matriz extracelular.
Es conocida la importancia de los vasos sanguíneos en la osteogénesis35. Tras un
trauma, se produce una respuesta inflamatoria y un hematoma inicial. Las células del
coágulo liberan interleukinas y factores de crecimiento, originando la migración de
linfocitos, macrófagos, precursores de osteoclastos y células mesenquimales
pluripotenciales. Estas señales moleculares promueven la diferenciación hacia células
endoteliales, fibroblastos, condroblastos y osteoblastos, dando origen a un nuevo tejido
que reemplazará al coágulo. Todo ello está regido por una serie de complejas
34 Op. Cit4. Pág.130. Pág.15.35 Trueta J. 1963. The role of blood vessels in osteogenesis. J Bone Joint Surg Br 45:402.
37
interacciones entre factores de crecimiento, hormonas y citoquinas. En este proceso va a
ser fundamental el aporte vascular, la síntesis proteica y la mineralización.36, 37, 38
El defecto óseo y el proceso de reparación
La Orthopaedic Trauma Association ha creado una clasificación de defectos
óseos que describe la magnitud del defecto resultante.39
El tipo de fractura obliga a valorar cada caso con sus particularidades, donde no
sólo se involucran el tejido óseo sino la vascularización del mismo, las partes blandas
que le rodean y el estado endócrino-metabólico del individuo. En dependencia de la
localización de la injuria y su magnitud será el pronóstico de la cicatrización.40
Se ha planteado el uso de injertos óseos autólogos o heterólogos en aquellas
fracturas que presenten un defecto óseo. Los implantes de hidroxiapatita empleados
como sustitutos de injerto óseo aumentan considerablemente su resistencia mecánica al
quedar invadidos por tejido óseo de neoformación.41,42,43
36 Gehron Robey P, Fedarko NS, Hefferan TE, Bianco P, Vetter UK, Grzesik W et al. 1993. Structure and molecular regulation of bone matrix proteins. J Bone Miner Res 8:483-7.37 Schonau E, Rauch F. 1997. Markers of bone and collagen metabolism. Problems and perspectives in Pediatrics. Horm Res 48:50-9.38 Canalis E, Economides AN, Gazzerro E. 2003. Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev 24:218-35.39Crenshan, A. 1992. Cirugía Ortopédical. 8ª Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires. Pág. 1211-67. 40 Escarpenter JC. 2005. Seudoartrosis Diafisiarias. Diagnóstico morfológico funcional y consideraciones terapéuticas. Ed. Ciencias Médicas. La Habana.41 Ferrer Lozano. 2008. Evaluación anatomo-funcional de defectos óseos en fracturas de tibia. http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/1163/4/Evaluacion anatomo funcional de defectos óseos en fracturas de tibia.42 Cambras R, Ceballos A. 1985. Tratado de Cirugía Ortopedia y Traumatología. Tomo 1. Ed. Pueblo y Educación, La Habana, Pág. 94-100.43 Pereda O. 2005. Metodología de empleo de hidroxiapatita coralina HAP-200 en Ortopedia y Traumatología. Rev. Cubana Ortop Traumatol 19(1): 35-40.
38
La vascularización y las características histológicas que rodean la lesión serán
fundamentales para su recuperación. Aquellas fracturas que tengan una localización en
el tercio medio o por debajo de los agujeros nutricios tendrán un aporte vascular
limitado y dificultarán el aporte sanguíneo. Un periostio intacto es un elemento que
favorece el pronóstico, su defecto requiere de un tejido puente que aporte una
neovascularización.
Flúor y su efecto sobre el tejido óseo
El flúor se encuentra en la naturaleza en suelos, agua, aire y organismos vivos.
La concentración es muy variable dependiendo de la región investigada. El flúor puede
ingresar al organismo a lo largo de la vida, ya sea en forma espontánea o como recurso
terapéutico bajo la forma química de fluoruro. La forma más común de ingestión de
fluoruro es con la ingesta de agua. El contenido de fluoruro en el agua puede variar
desde valores menores a 10-6 mol/l y alcanzar hasta 0,15 mol/l.44 Algunos alimentos
poseen elevado contenido de flúor, como ciertos peces, el té 45 y vegetales de zonas con
suelos con alto contenido de flúor.46 El fluoruro es utilizado en distintas terapias
farmacológicas, en las formas de fluoruro de sodio (NaF)47 y monofluorofosfato
(MFP).48
44 World Health Organization. 1969. Fluoride: Guidelines for drinking water quality. Vol 2. Health Criteria and other supporting information. Geneva. 1985.45 Cook HA. Fluoride and tea. Lancet 2:329. 46 Kramer L, Osis D, Wiatrowski E, Spencer H. 1974. Dietary fluoride in different areas in the United States. Am J. Clin. Nutr. 27:590-4. 47 Aloia JF, Zange I, Vaswarri A, Ellis D, Cohn SH. 1982. Combination therapy for osteoporosis with estrogen, fluorides and calcium. J. Am. Geriatr. Soc 30:13-7. 48 Resch H, Libanati C, Talbot J, Tabuenca M, Farley S, Bettica P, Tritthart W, Baylink,D. 1994. Pharmacokinetic profile of a new fluoride preparation: sustained-release monofluorophosphate. Calcif.Tissue Int 54:7-11.
39
El fluoruro es un mitógeno de las células óseas que produce incremento de la
masa ósea.49 El mecanismo de acción sobre el osteoblasto es parcialmente conocido y la
hipótesis con mayor sustento experimental se basa en su actividad inhibitoria sobre la
tirosin fosfatasa ácida del osteoblasto50 encargada de defosforilar proteínas involucradas
en la transducción de señales.
Los parámetros farmacocinéticos del MFP son diferentes de los obtenidos para
el NaF.51 A igualdad de dosis de fluoruro, el hueso de ratas tratadas con MFP presenta
un contenido de flúor óseo superior al de las ratas tratadas con NaF. La
biodisponibilidad de fluoruro cuando se administra MFP es el doble que si se utiliza
NaF en dosis equimolares. Al administrar NaF en plasma se encuentra fluoruro como
especie química predominante. En cambio, luego de la administración oral de MFP,
además del fluoruro, se encuentra en plasma una fracción de flúor ligado a proteínas52,53
que se origina a partir de una fracción de MFP que se absorbe en el estómago y se liga a
las alfa-macroglobulinas (AM).
49 Lau KH, Farley JR, Freeman TK, Baylink DJ. 1989. A proposed mechanism of the mitogenic action of fluoride on bone cells inhibition of the activity of an osteoblastic acid phosphatase. Metabolism 38:858-68. 50 Farley JR, Tarbaux N, Hall S, Baylink DJ. 1990. Mitogenic action(s) of fluoride on osteoblast line cells; determinants of the response in vitro. J. Bone Miner. Res. 5, Supp 1:S107-13. 51 Rigalli A, Cabrerizo M, Beinlich A, Puche RC. 1994. Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittelforschung.44:651-5. 52 Pera LI, Brun LRM, Rigalli A, Puche RC. 2003. Identificación de proteínas derivadas de la alfa2-macroglobulina en el hueso de ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio. Rol de estas proteínas en la biodisponibilidad de flúor. Rev. Med. Rosario. 69:36-43. 53 Rigalli A, Morosano M, Puche.RC. 1996. Biovailability of fluoride administered as sodium fluoride or sodium mo,ofluorophosphate to human volunteers. Arzneimittelfoschung 46:531-3.
40
Las AM son antiproteasas del plasma a las que se liga el MFP. Estas proteínas
pierden su actividad biológica cuando se ligan al MFP in vitro e in vivo.54 La absorción
de MFP y la formación del complejo AM-MFP se encuentra aumentada en ratas tratadas
con MFP y calcio, situación en la que aumenta la absorción intestinal del MFP debido a
inhibición de la enzima fosfatasa alcalina.55 El complejo AM-MFP es biológicamente
activo con respecto al metabolismo óseo, debido a que su catabolismo genera fluoruro
que vuelve al espacio extracelular. Una ventaja adicional del MFP es que la fracción de
F ligada a las proteínas no produce efectos adversos que si produce el NaF.56
El complejo AM-MFP es captado in vitro e in vivo por receptores presentes en
hígado y hueso de rata.57,58 La diferenciación y proliferación de osteoblastos a partir de
células pluripotentes del estroma de la médula ósea involucra a las cascadas de
señalización del sistema Wnt/beta-catenina. Los precursores de osteoblastos expresan el
receptor LRP de las proteínas Wnt.59 Algunas isoformas del receptor LRP reconocen a
la AM luego de su inactivación, proceso que puede ser llevado a cabo por la unión a
proteinasas o a moléculas como el MFP.
54 Rigalli A, Esteban L, Pera L, Puche RC. 1997. Binding of monofluorophosphate to alpha-2-macroglobulin and C3. Calcif Tissue Int 60:86-9. 55 Beinlich A, Brun L, Rigalli A, Puche RC. 2003. Intestinal absorption of disodium monofluorophosphate in rat as affected by concurrent adminstration of calcium. Arzneimittelforschung 53:584-9. 56 Rigalli A, Ballina JC, Roveri E, Puche RC.1990.Inhibitory effect of fluoride on the secretion of insulin. Calcif.Tissue Int 46:333-8. 57 Esteban L, Rigalli A, Puche RC. 1999. Metabolism of the complex monofluorophosphate- a2-macroglobulin in the rat. Medicina (Buenos Aires) 59:151-6. 58 Pera LI. Tesis doctoral: Identificación de las especies Químicas con flúor presente en hueso de ratas tratadas con monofluorfosfato de sodio (MFP) . Doctorado en Ciencias Biomédicas Facultad de Ciencias Medicas. UNR59 Krishnan V, Bryant HU, MacDougald A. 2006. Regulation of bone mass by Wnt signaling. J. Clin. Invest. 226:1202-9.
41
El efecto del MFP sobre el hueso podría en parte, atribuirse al fluoruro liberado
por su hidrólisis. Sin embargo el mecanismo no parece ser igual al ejercido por el
fluoruro, ya que al suspender el tratamiento la masa ósea de los animales se mantiene
elevada, respecto de los controles y los animales tratados con NaF.60 Los resultados
mencionados sugieren una posible interacción del complejo AM-MFP con el receptor
LRP de precursores osteoblásticos. Esta interacción podría aumentar la afinidad entre
LRP y Wnt, disminuir la acción de proteínas inhibidoras del receptor LRP como las
proteínas Dkk y esclerostina o, la relación del receptor LRP con el co-receptor Kremen.
En cualquiera de estas situaciones la acción de Wnt sobre la diferenciación de
osteoblastos sería mayor.
60 Op. Cit.Pág 8.
42
CAPÍTULO 4
HIPÓTESIS
Como se detalló en el capítulo anterior, el MFP y el NaF producen un aumento
del tejido óseo trabecular en ratas normales, evidenciado a través de un aumento del
número de trabéculas y de su grosor. Además el MFP tiene un efecto adicional
aumentando el hueso cortical y la biodisponibilidad de flúor del MFP es el doble de la
NaF. Por estas razones se plantea la hipótesis que en presencia de NaF o MFP se
debería obtener una mejor reparación de los defectos óseos, comparado con animales
controles. Por las razones expuestas, se debería observar un proceso de reparación más
evidente en animales tratados con MFP comparado con el NaF.
Justificación
Este estudio de tipo experimental aleatorizado controlado está motivado por las
diferentes revisiones realizadas tanto en Ortopedia como en Odontología sobre
mecanismos de reparación de defectos óseos.61,62,63 Sus revisiones debaten la
confiabilidad científica de los procedimientos realizados para aumento óseo, sugiriendo
que hacen falta más estudios clínicos de tipo aleatorios para su validación64. Asimismo,
no existe información sobre el efecto del MFP y del NaF en la reparación de lesiones o
61 Esposito M, Grusovin MG. 2006. The efficacy of various bone augmentation procedures for dental implants: a Cochrane systematic review of randomized controlled clinical trials. Int J Oral Maxillofac Implants 21(5): 696-710. 62 Aghaloo L. 2007. Which hard tissue augmentation techniques are the nost successful in furnishing bony support for implant placement?. Int J of Oral Maxillofacial Implants. 63 Gielkens P F. Bos RRl. 2007. Is there evidence that barrier membranes prevent bone resorption in autologous bone grafts during the healing period? A systematic review. Int J Oral Maxillofac Implants 22(3): 390-8.64 Op. Cit. 23. Pág.29
43
defectos óseos en animales de experimentación. Investigaciones previas han sido
enfocadas a los estudios metabólicos en animales sanos, especialmente en ratas en
crecimiento y en las cuales se indican que el tratamiento con NaF o MFP podría
aumentar la masa ósea por estímulo de la formación ósea.65
Los individuos afectados por lesiones óseas que requieren de reparación del
tejido sufren limitaciones en su calidad de vida en cuanto a movilidad y salud oral entre
otros. En la recuperación del tejido óseo postrauma es necesario el mejoramiento en el
volumen y densidad ósea en el sitio de la lesión para proveer firmeza, estabilidad y
funcionalidad procurando además que perduren en el tiempo.
Se consideró entonces que el fluoruro contribuiría a una mejor producción de
masa ósea y depósito mineral por su efecto estimulante sobre los osteoblastos. Por otra
parte el fluoruro aumentaría la velocidad de reparación del defecto no crítico.
Viabilidad
La investigación se realizó en el Laboratorio de Biología Ósea de la Facultad de
Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario. El Laboratorio cuenta con un
equipo interdisciplinario de profesionales de las áreas de Química, Bioquímica,
Biotecnología y Medicina y el equipamiento necesario para el desarrollo de esta tesis:
equipo para rayos X, determinaciones bioquímicas y moleculares, sala de cirugía para
ratas, equipamiento para procesamiento de muestras y diagnóstico histológico. El grupo
65 Op. Cit.2. Pág.8
44
cuenta con treinta años de experiencia en el tema en estudio, modelos y manejo de
animales de laboratorio siguiendo normas internacionales.66,67
66 Guide for the care and use laboratory animals. 1985. National Institute of Health. Publication N° 86-23. 67Guide to the care and use of experimental animal. 1993. Volume 1. Olfert ED, Cross BM, McWilliam AA, Eds. Canadian Council on animal care Guidelines.
45
CAPÍTULO 5
MATERIALES Y MÉTODOS
A continuación se hace una breve descripción del trabajo experimental. Los
experimentos fueron realizados en ratas, las que fueron sometidas a cirugía durante la
cual se produjo un defecto óseo no crítico en la epífisis proximal de las tibias. Se
dividieron los animales en tres grupos de 6 animales cada uno: Controles, tratados con
NaF y tratados con MFP. Los tratamientos se administraron durante 30 días. Al inicio
del experimento y a los 10, 20 y 30 días se obtuvieron muestras de sangre para
determinaciones bioquímicas (calcemia, fosfatemia, fosfatasa alcalina y fluoremia), se
registró el peso corporal y se obtuvieron radiografias de las tibias para medida de
densidad mineral ósea (DMO) del hueso sano y de la zona del defecto. A los 30 días,
luego de la eutanasia se obtuvieron las tibias en las que se realizó el análisis histológico
de la zona del defecto. El efecto de los tratamientos sobre el proceso de reparación del
defecto y la calidad del hueso formado se evaluó por la DMO y las características
histológicas del hueso formado en la zona del defecto. Las variables bioquímicas fueron
utilizadas como controles adicionales del éxito de los tratamientos.
A continuación se describen de manera detallada los procedimientos y
materiales utilizados.
46
Animales de experimentación
Se utilizaron ratas de la línea IIM/FM sub-línea “e” de 7 semanas, pesos:
187±14 g. Los animales se manipularon de acuerdo a las normas internacionales de
cuidado y tratamiento de animales de experimentación.
Los animales se alojaron en jaulas colectivas (hasta 6 animales por jaula) o
individuales, según el momento del experimento. Las ratas tuvieron acceso a agua y
alimento ad libitum. El bioterio fue controlado automáticamente para mantener la
temperatura entre 23-25°C, circular y filtrar el aire y mantener el ciclo luz-oscuridad
12h-12h. La limpieza y controles se realizaron diariamente por personal del laboratorio.
Esterilización del material quirúrgico
El material quirúrgico de acero inoxidable utilizado en las cirugías fue
esterilizado en estufa durante 3 h a temperatura de 140 °C. El material a esterilizarse en
calor húmedo fue llevado al autoclave durante 30 min a 120 °C.
Anestesia general
Se realizó preanestesia por inyección subcutánea de una mezcla de 1,2 mg de
xilazina/100 g peso corporal y 3 mg ketamina/100 g de peso corporal. Luego de
alcanzado un grado adecuado de narcosis y sedación se inyectaron por vía intramuscular
clorhidrato de lidocaína y 5 minutos después en el mismo sitio se inyectaron 3 mg
ketamina /100 g de peso corporal.68
68 De Candia F, Rigalli A, Di Loreto V. 2009. Anesthesia and Analgesia. En Experimental surgical models in the laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratón. USA. Pag 21-30.
47
Analgesia y antibioticoterapia
Después de la cirugía o procedimiento experimental potencialmente doloroso
para el animal se inyectaron por vía subcutánea 2,5 mg diclofenac/100 g de peso
corporal. Se evaluó el dolor a través del estado de movilidad, agresividad y reacción al
contacto y se repitió la dosis a intervalos requeridos. Durante las intervenciones
quirúrgicas se realizó antibioticoterapia con ceftriaxona, realizando la inyección
intramuscular de 3 mg del antibiótico/100 g de peso corporal disuelto en 0,1 ml de
solución fisiológica estéril. La inyección se realizó 30 min antes de la cirugía.69
Cirugías
Se llevaron a cabo en un quirófano para ratas. El ambiente quirúrgico fue
esterilizado por medio de lámparas de luz ultravioleta 2 h previas a la cirugía. El
cirujano y asistentes utilizaron vestimenta descartable y las condiciones de asepsia
adecuada.
Se rasuró la zona a incidir en las patas traseras del animal. Previa asepsia del
campo quirúrgico con iodopovidona, se realizó una incisión longitudinal en ambas
tibias con bisturí Nº 15 y se decoló la fascia hasta llegar a exponer el hueso. Se realizó
una cavidad en la región anteropatelar de cada tibia hasta llegar al hueso medular,
utilizando una mecha acerada de 2 mm, con rotación manual para no producir necrosis
ósea por sobrecalentamiento de la zona. Dicha cavidad no se rellenó con ningún
69 Di Loreto V, Rigalli A. 2009. Antibiotics. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratón. USA. Pág 33.
48
material. Luego de realizada las intervención quirúrgica se suturó por planos con hilo
reabsorbible.
Eutanasia
Se realizó sometiendo en primer término al animal a anestesia general hasta
obtener una profunda anestesia y analgesia. Luego se realizó una inyección intra-
cardíaca de KCl saturado para producir un paro cardiorrespiratorio instantáneo.70
Administración del NaF y del MFP
El NaF o MFP se administraron por sonda orogástrica a partir del día siguiente
de la cirugía de producción del defecto óseo y se continuó por 30 días. La dosis
utilizada fue de 80 µmol de fluoruro/día. Para lograr esta dosis se administró 1 ml de
solución 80 mmol/l de NaF o MFP. El grupo Control recibió 1 ml de agua destilada. Se
utilizó sonda de polietileno K35 con jeringa descartable de 5 ml.
Obtención de muestras de orina y sangre
Al inicio del experimento y a los 10 y 20 días se extrajeron 200 µl de sangre de
la vena de la cola, en capilares heparinizados. Se centrifugaron los capilares y se
cortaron en la separación plasma-glóbulos. El plasma se guardó a -20 ºC hasta el
momento de las determinaciones. El día de la eutanasia y previo a este proceso, se
obtuvo una muestra de sangre por punción cardíaca. Se utilizó heparina como
anticoagulante, se centrifugó y se guardó el plasma a -20 ºC.
70 Rigalli A. Euthanasia. 2009. En Experimental surgical models in the laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratón. USA. Pág. 31.
49
Las muestras de orina de 24 h se obtuvieron colocando a cada animal en una
jaula individual con un dispositivo para la recolección de orina y evitar la
contaminación de la misma con materia fecal y alimento. El volumen de orina se midió
con probeta con un error de 0,1 ml. Una alícuota de la muestra se guardo a -20 ºC para
las determinaciones correspondientes.
Determinación de la concentración de fluoruro urinario
La medición de la concentración de fluoruro en orina se realizó por
potenciometría directa71 utilizando un electrodo de ion específico ORION 94-09 y un
electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La
determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los
electrodos y el logaritmo de la concentración de fluoruro en las muestras o patrones
utilizados.
Simultáneamente con las muestras se procesaron soluciones patrones de NaF de
10-3 mol/l – 10-6 mol/l. A las muestras y las soluciones patrón se les adicionó un 10% de
solución amortiguadora de pH ácido acético/acetato de sodio 2 mol/l, para ajustar el pH
a 5,0-5,5 y homogeneizar la fuerza iónica de las soluciones. La técnica requirió
muestras de orina de 50 µl o más.
71 Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR. Determinación de la concentración de flúor en muestras biológicas. 1° Ed. Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007.
50
Determinación de la concentración de flúor plasmático
La medición de la concentración de flúor plasmático se realizó por
potenciometría directa utilizando un electrodo de ion específico ORION 94-09 y un
electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analógico digital. La
determinación se basa en la relación lineal existente entre los mV desarrollados por los
electrodos y el logaritmo de la concentración de fluoruro en las muestras o patrones
utilizados. Previo a la determinación potenciométrica, el flúor se aisló de las muestras
por microdifusión isotérmica, tratando la muestra con ácido fosfórico concentrado
durante 24h a 60 °C y recuperando el ácido fluorhídrico desprendido de la muestra
sobre NaOH sólido depositado en la tapa de la cámara de destilación.
Luego de la destilación isotérmica, el NaOH de la tapa se ajustó a pH 5,5 con
ácido acético diluido 1/120 y se llevó a un volumen final de 60 µl. Este procedimiento
requiere muestras de plasma o suero de 20-100 µl y simultáneamente con las muestras
se procesaron testigos de NaF de concentraciones 10-3 mol/l - 10-6 mol/l .
Preparados histológicos
Luego de 30 días de tratamiento, se extrajeron ambas tibias y se realizó la
descalcificación de las tibias siguiendo los pasos que se detallan a continuación:
Disección de tibias y eliminación de tejidos blandos.
Fijación en formol buffer fosfato.
51
Corte transversal al 40 % desde parte proximal con la ayuda de un microtorno.
Descalcificación en EDTA 10 %, pH 7 a 4 °C. A los 15-20 días se reemplazó la
solución de EDTA, se cortaron los huesos longitudinalmente y se mantuvieron en la
solución por 20 días. Luego de asegurar una completa descalcificación, se procedió
de manera similar a los tejidos blandos, teniendo la precaución de dejarlo al menos
60 min por frasco en la deshidratación y aclaración previa a la preparación del taco.
Para la preparación del taco se aisló utilizando un bisturí la zona del defecto,
claramente visible a simple vista. Esta porción se utilizó en el taco ubicándola de
manera de obtener un corte transversal del hueso.
En el proceso de coloración con hematoxilina y eosina se siguieron los pasos de
rutina usados para los tejidos blandos y los tiempos de permanencia de las muestras
dentro de los reactivos fueron estandarizados para cada proceso. Luego se procedió a la
observación al microscopio.
Determinación de fosfatasa alcalina plasmática
La actividad de la fosfatasa alcalina plasmática se realizó utilizando un equipo
comercial ALP 405 línea líquida (Laboratorio Wiener, Rosario, Argentina). La técnica
se fundamenta en la medida del cambio de absorbancia a 405 nm, generado por la
hidrólisis del p-nitrofenilfosfato en medio alcalino por la enzima fosfatasa alcalina. Las
medidas de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11
y los resultados se expresaron en U/l.
52
Determinación de fósforo inorgánico
El fósforo inorgánico se midió utilizando el kit comercial Fosfatemia UV AA
(Laboratorio Wiener, Rosario, Argentina). El método se fundamenta en la reacción del
fósforo con el molibdato en medio ácido y la formación de un complejo fosfomolíbdico.
La determinación utilizó 5 ul de plasma y simultáneamente se procesó una solución
patrón de 4 mg/dl de fosfato, con la que se construyó una curva de calibración. La
absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración de fósforo inorgánico en la
muestra, la que se determinó utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11.
Determinación de calcio plasmático
La calcemia se midió con un equipo comercial CaColor AA (Laboratorio
Wiener, Rosario, Argentina). El método se fundamenta en la reacción del calcio con o-
cresolftaleina complexona a pH 10,8, dando un complejo de color magenta que se mide
espectrofotométricamente a 570 nm. La determinación utiliza 5-15 µl de muestra y
simultáneamente se construyó una curva de calibración utilizando una solución patrón
de 10 mg Ca/dl. La medición de la absorbancia es proporcional a la concentración de
calcio en la solución, la que se determinó utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer
Lambda 11.
53
Medición de densidad mineral ósea
Se realizaron medidas de la DMO de la zona del defecto óseo y de zonas
circundantes de hueso que no fue afectado por el defecto. La medida de la DMO se
realizó por análisis de las radiografías de la tibia simultáneamente, con un patrón con
una escala de densidades de calcio de 51,9; 40,7; 28,6; 18,7 y 7,9 mg Ca/cm2 (Figura
12).72 Las mediciones se realizaron con el software de procesamiento de imágenes
digitales ImageJ 1.40 (National Institutes of Health, Maryland, USA). Para el análisis se
utilizaron imágenes digitales de las radiografías obtenidas con un equipo de rayos X de
70KV.
Brevemente, el procedimiento consiste en obtener a partir de la imagen digital y
con el software mencionado, el valor de la densidad óptica del sector del hueso a
72 Moreno H, Lombarte M, Di Loreto V. 2009. Bones and Bone Tissue. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratón. USA. Pág. 229-32.
Figura 12: Radiografía de una tibia y el patrón con concentraciones de calcio conocidas.
54
evaluar y de cada uno de los sectores del patrón con una densidad de calcio. Con los
valores de densidad de calcio conocidos del patrón y la densidad óptica medida se
construye una curva de calibración. Cada radiografía de un hueso se hace
simultáneamente con el patrón debido a que la curva de calibración no siempre tiene los
mismos parámetros. En cada caso se realiza el ajuste correspondiente, se obtienen los
parámetros de la curva y con estos se calcula la densidad de calcio en el sector de hueso
en estudio, utilizando la densidad óptica de éste sector.
Consideraciones sobre el efecto estrogénico en la rata
Teniendo en cuenta que el ciclo estral de la rata tiene una duración de 5 días y
que cada una de las etapas dura tan sólo unas horas (estro 12 h, metaestro 21 h, diestro
65 h, proestro 12 h), no se consideró la etapa en que cada rata se encontraba al inicio del
experimento, considerando que en el experimento total (30 días), se incluirían
aproximadamente 6 ciclos.
55
CAPÍTULO 6
RESULTADOS
Efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las ratas
El tratamiento no afectó el crecimiento de los animales en ninguno de los grupos
experimentales. Luego de 30 días de tratamiento los animales alcanzaron el peso
correspondiente a la edad. El peso en función del tiempo fue ajustado por una función
lineal. Este ajuste pudo utilizarse debido al tiempo de duración del experimento y a la
edad de los animales. El crecimiento se evaluó por la pendiente de la recta de regresión
(g/día), el que fue significativamente diferente de cero (regresión lineal, p<0,05) para
los tres grupos experimentales, Controles: 1,4±0,2 g/día; NaF: 1,0±0,2 g/día; MFP:
1,2±0,3 g/día, y no fue diferente entre los grupos experimentales, regresión lineal,
p>0,05, n=6 por grupo. El peso final alcanzado al día 30 de experimento tampoco fue
diferente entre los grupos experimentales, Controles: 217±10 g; NaF: 213±12 g; MFP:
228±4 g, (ANOVA, p>0,05).
Conclusión parcial: el crecimiento corporal similar en todos los grupos permite
descartar posibles efectos adversos de la medicación sobre el crecimiento.
Efecto del tratamiento sobre la densidad mineral del hueso sano
La DMO del hueso sano no se modificó a lo largo del tratamiento, como lo
evidencia la pendiente de la regresión lineal de la DMO en función del tiempo para los
56
tres grupos experimentales (regresión lineal, p>0,05). Controles: 0,16±0,12 g
Ca/cm2.día; NaF: -0,13±0,11 g Ca/cm2.día; MFP: 0,08±0,16 g Ca/cm2.día, n=6 por
grupo.
Conclusión parcial: la constancia de la DMO en zonas de hueso no expuestas a
cirugía de creación del defecto garantiza que los tratamientos no tienen efecto adverso
sobre el hueso ya formado.
Densidad mineral ósea de la zona del defecto
La DMO del hueso formado en la reparación del defecto mostró un aumento
significativo en el grupo tratado con MFP respecto del grupo Control a los 10 días de
tratamiento (Figura 13).
57
Figura 13: Densidad mineral de la zona del defecto óseo. Los datos se muestran como media±SD. * indica diferencias significativa respecto del grupo Control, ANOVA a un criterio de clasificación, post test Newman Keuls, p<0,05. n=6 por grupo experimental.
0 10 20 300
10
20
25
30
35
40
45
CONTROLNaFMFP
DIAS DE TRATAMIENTO
DM
O,
mg
/cm
2
*
Esta diferencia se fue reduciendo con el transcurso del tratamiento no siendo
significativa a los 20 y 30 días. Este resultado indica un incremento en la velocidad de
mineralización en presencia de MFP. Por otra parte el tratamiento con NaF, si bien
produjo mayor valor medio en la DMO respecto del grupo Control, esta diferencia no
alcanzó a ser significativa. Cabe mencionar que el análisis de DMO en la zona del
defecto carece de valor basal, dado que al inicio del tratamiento no existía hueso en esa
zona.
Conclusión parcial: El aumento de DMO a los 10 días en el grupo tratado con
MFP indica una mayor velocidad de reparación del defecto. La disminución de esta
diferencia a lo largo del tratamiento confirma que un defecto no crítico se repara sin
necesidad de intervención, pero que el tratamiento con MFP podría acortar dicho
proceso.
Fosfatasa alcalina plasmática
El cambio de la fosfatasa alcalina (FAL) a lo largo del tratamiento se evaluó a
través de la regresión lineal de los valores de fosfatasa alcalina plasmática en función
del tiempo para los diferentes grupos. El cambio en el valor de fosfatasa alcalina a lo
largo del tratamiento se evaluó por un valor significativamente diferente de cero de las
pendientes de las mencionadas regresiones. La FAL aumentó significativamente a lo
largo del tratamiento en los grupos tratados con NaF y con MFP (regresión lineal,
p<0,05), Tabla 1. El grupo Control no mostró cambios significativos de la actividad
plamática de FAL (regresión lineal, p>0,05).
58
Tabla 1: Pendiente de la regresión lineal de los valores plasmáticos de FAL en función del tiempo (U/l.día). * indica diferencias significativas respecto de cero, regresión lineal, p<0,05. Los resultados se expresan como media±SD, n=6 por grupo.
Control NaF MFP
1,14±1,82 3,39±0,87 * 4,01±1,19 *
Conclusión parcial: El aumento significativo de la actividad de fosfatasa
alcalina plasmática en los grupos NaF y MFP confirma la existencia de un estímulo
osteoformador.
Calcio fecal
La excreción fecal de calcio fue significativamente menor en el grupo MFP
respecto de los grupos NaF y Control (Figura 14), ANOVA a un criterio de
clasificación, post test de Newman Keuls, p<0,05. Considerando que la dieta
administrada fue la misma para los tres grupos, estos resultados indicarían una mayor
absorción de calcio en este grupo.
59
Figura 14: Excreción fecal de calcio. * indica diferencias significativas respecto del grupo Control, ANOVA a un criterio de clasificación, post test de Newman Keuls, p<0,05). Los
resultados se muestran como media±SD, n=6 por grupo.
Conclusión parcial: la menor excreción de calcio fecal en el grupo tratado con
MFP estaría indicando una mayor retención del ion en el organismo, resultado
coincidente con la mayor DMO de dicho grupo.
Calcemia
El efecto del tratamiento sobre la calcemia a lo largo del tratamiento se evaluó a
través de la pendiente de la recta de regresión lineal de los valores de calcemia en
función del tiempo para los diferentes grupos. Se consideró un cambio significativo en
la calcemia a lo largo del tiempo si la pendiente de la recta fue significativamente
diferente de cero.
*
60
La calcemia no se modificó a lo largo del tratamiento en ninguno de los grupos
experimentales. En los tres grupos experimentales la pendiente de la regresión lineal de
la calcemia en función del tiempo (mg/dl.día) no discrepó de cero. Controles:
-0,054±0,063; NaF: -0,014±0,046; MFP: 0,089±0,061, regresión lineal, p>0,05,
media±SD. El análisis fue realizado con n=6 por cada grupo y como se explicó en
materiales y métodos, la calcemia se midió al inicio y a los 10, 20 y 30 días de
tratamiento.
Los valores de calcemia estuvieron a lo largo del tratamiento dentro de valores
normales para esta línea de ratas y edad, no hallándose diferencias significativas entre
los grupos experimentales a cada tiempo (Tabla 2, ANOVA a un criterio de
clasificación, p>0,05)
Tabla 2: Concentración de calcio plasmático (mg/dl) al inicio y a los 10, 20 y 30 días de tratamientos para los grupos experimentales. Los resultados se expresan como media±SD, n=6 por grupo.
Control NaF MFP
día 0 8,9±1,5 9,8±1,4 9,3±0,9
día 10 9,0±0,7 9,2±1,1 9,9±1,4
día 20 8,8±0,5 9,8±1,2 8,9±1,1
día 30 9,9±0,9 9,5±1,1 9,9±1,1
Conclusión parcial: los valores constantes de la calcemia a lo largo del tiempo
permiten descartar importantes alteraciones del metabolismo fosfocálcico, asociadas a
los tratamientos.
61
Fosfatemia
El cambio en la fosfatemia a lo largo del tratamiento se evaluó a través de la
regresión lineal de los valores de fosfatemia en función del tiempo para los diferentes
grupos. El cambio en el valor de fosfatemia a lo largo del tratamiento se evaluó por un
valor significativamente diferente de cero de las pendientes de las mencionadas
regresiones.
La fosfatemia no se modificó a lo largo del tratamiento en ninguno de los grupos
experimentales. En los tres grupos experimentales la pendiente de la regresión lineal de
la fosfatemia en función del tiempo (mg/dl.día) no discrepó de cero. Controles:
-0,27±0,22; NaF: 0,08±0,04; MFP: 0,11±0,07, regresión lineal, p>0,05, media±SD. El
análisis fue realizado con n=6 por cada grupo y como se explicó en materiales y
métodos, la fosfatemia se midió al inicio y a los 10, 20 y 30 días de tratamiento.
Conclusión parcial: los valores constantes de fosfatemia a lo largo del
experimento permiten descartar importantes alteraciones del metabolismo fosfocálcico,
asociadas a los tratamientos.
Fluoruria
La excreción urinaria de fluoruro en 24 horas el último día de tratamiento no
difirió entre los grupos experimentales, Figura 15 (ANOVA a un criterio de
clasificación, p>0,05).
62
Conclusión parcial: la semejanza en la fluoruria entre los grupos
experimentales luego de 30 días de tratamiento está indicando que el tejido óseo habría
incorporado el fluoruro administrado durante los tratamientos con NaF y MFP.
Fluoremia
La fluoremia de los animales no discreparon entre los grupos al inicio de los
tratamientos y fueron menores que a lo largo del tratamiento. Los animales recién
destetados provienen de hembras que no recibieron fluoruro como tratamiento y sólo
ingieren el fluoruro que acompaña al alimento y al agua de bebida. Este valor puede
estimarse que corresponde a menos del 10% del flúor recibido en los tratamientos. La
concentración de flúor en plasma fue significativamente mayor a los 10 días en los
63
Figura 15: excreción urinaria de fluoruro durante 24 h en los grupos experimentales al finalizar el tratamiento (día 30). Los resultados se
muestran como media±SD, n=6 por grupo.
CONTROL NaF MFP0
1
2
3
4
5 CONTROLNaFMFP
µmo
l/24h
animales tratados con MFP. A los 30 días de tratamiento no se observaron diferencias
significativas entre las fluoremias de los tres grupos experimentales (Figura 16).
Conclusión parcial: el aumento de la fluoremia al inicio del tratamiento
garantiza que las drogas fueron administradas correctamente y que el proceso de
absorción fue adecuado. Por otra parte la disminución de la fluoremia en los grupos
tratados con MFP y NaF al finalizar el tratamiento indica que los tratamientos
tuvieron estímulo osteogénico y el hueso aumentó su capacidad de incorporación de
minerales. El resultado a los 30 días es coincidente con la falta de diferencias en la
fluoruria a ese mismo tiempo entre los grupos experimentales.
Figura 16: Concentración de flúor en plasma en los tres grupos experimentales a lo largo del tratamiento. Los resultados se muestran como media±SD, n=6 por grupo. * indica diferencias significativas respecto del grupo Control, ANOVA a un criterio de clasificación, post test de Newman Keuls, p<0,05).
64
*
Análisis histológico
Grupo Control: Se observa tejido óseo sin una organización laminar que
permita la formación de osteonas, en la zona del defecto. Se destaca también la
presencia de tejido cartilaginoso, escasa presencia de osteocitos y osteoblastos activos
(Figura 17).
Figura 17: Corte histológico de tejido óseo de ratas controles. La flecha marca abundante tejido cartilaginoso en la zona del defecto. H&E. 10X.
65
Se observan bordes irregulares y presencia de vasos sanguíneos en los espacios
medulares. Abundante tejido cartilaginoso en mayor cantidad que el tejido óseo. En la
zona de hueso no están bien definidas las trabéculas (Figura 18).
La figura 19 correspondiente a la zona del defecto en ratas controles, muestra
formación de hueso bien delimitado respecto del tejido adiposo que se observa entre las
Figura 18: Corte histológico de tejido óseo de ratas controles. La flecha muestras zonas de trabéculas sin buena definición. H&E.10X
66
trabéculas. Estas últimas no muestran buena conexión entre ellas y el tejido adiposo es
muy abundante respecto al tejido óseo. Se observan pequeñas zonas de mineralización
en la sustancia circundante pero no representa un hueso mineralizado en su totalidad,
observándose aun zonas de cartílago.
Figura 19: Corte histológico de tejido óseo de ratas controles. La flecha muestra cartílago y el asterisco tejido adiposo. H&E. 40X
*
67
Grupo NaF: Se observa presencia de hueso cortical con presencia de sistemas
haversianos en algunos sectores, con presencia de osteocitos (Figura 20). Se detecta la
presencia de depósito de osteoide y actividad celular. Se destacan zonas de
mineralización, trabéculas que no presentan buena disposición morfoestructural y
espacios medulares ocupados por células adiposas. No se observa buena conexión
trabecular.
Figura 20: Corte histológico de tejido óseo de ratas tratadas con NaF. La flecha marca sistemas de Havers, la punta de flecha (<) marca un osteocito y el asterisco tejido adiposo.
H&E. 40X.
<
*
68
A pesar que la organización histológica es mejor que en el grupo Control, se
observa la presencia de cartílago hialino, por lo que se considera que la formación del
callo óseo no se consolidó adecuadamente.
Grupo MFP: La observación histológica del hueso formado en la zona del
defecto, en ratas tratadas con MFP muestra la formación de sistemas haversianos
alrededor de vasos sanguíneos (Figura 22). Se observa tejido óseo con bordes bien
69
Figura 21: Corte histológico de tejido óseo de ratas tratadas con NaF, mostrando abundante cartílago hialino. H&E. 40X.
establecidos y osteocitos en sus osteoplastos. La disposición del tejido óseo es de
manera organizada con aspecto laminillar.
Se observa buena organización celular y laminar de la sustancia osteoide. El
espacio medular está bien diferenciado (Figura 23).
Figura 22: Corte histológico de tejido óseo de ratas tratadas con MFP. La flecha marca sistema de Havers y la punta de flecha (<) osteocitos. H&E. 40X.
<
70
El hueso formado en presencia de tratamiento con MFP muestra una distribución
morfocelular coincidente con hueso cortical bien formado (Figura 24).
Figura 23: Corte histológico de tejido óseo de ratas tratadas con MFP. La flecha marca células de revestimiento y el asterisco osteoblatos. H&E. 40X
*
71
Conclusión parcial: la organización histológica del tejido óseo formado en
ratas tratadas con MFP revela una mejor organización estructural, sin la presencia de
cartílago hialino.
Figura 24: Corte histológico de tejido óseo de ratas tratadas con MFP. H&E. 40X
72
CAPÍTULO 7
DISCUSIÓN
Los resultados de las variables medidas a nivel del hueso neoformado, producido
en el proceso de reparación del defecto no crítico, se han interpretado en correlación con
los valores obtenidos de las distintas mediciones en plasma.
El aumento de peso de los animales en los tres grupos tuvo un comportamiento
uniforme en lo que se refiere a la ganancia de peso. Estos resultados indicarían que el
tratamiento con MFP y NaF no modificó el crecimiento en los grupos tratados.
Los niveles de fosfatasa alcalina plasmática fueron utilizados como marcador de
formación ósea. La fosfatasa alcalina aumentó a lo largo del tratamiento en los grupos
que recibieron MFP y NaF. Por su parte este marcador en el grupo Control no mostró un
aumento significativo a lo largo del tiempo. Si bien en este trabajo se ha medido
fosfatasa alcalina total, se puede interpretar que no existiendo problemas hepáticos, el
incremento en sus valores se debería a la isoenzima ósea. Estos resultados son
coincidentes con la presencia del fenómeno protoplásico observado en los cortes
histológicos de los grupos con tratamiento farmacológico. El incremento más marcado a
lo largo del tiempo en el grupo tratado con MFP, sería coincidente con una mayor
actividad osteoblástica, con el aumento de DMO observado a los 10 días y con la mejor
arquitectura ósea observada en cortes histológicos al finalizar el tratamiento.
73
El resultado de la DMO obtenido a los 10 días en el grupo MFP,
significativamente mayor que el grupo Control, es un resultado esperado en función de
los estudios previos realizados con el MFP como droga osteoformadora. El aumento de
la DMO está indicando una mayor incorporación de calcio en la matriz ósea
neoformada. Dado que todos los grupos experimentales recibieron la misma dieta, la
mayor incorporación de calcio al hueso podría haber producido un déficit del catión a
nivel del líquido extracelular, generando un aumento en la liberación de PTH y aumento
de la síntesis de 1,25(OH)2Vitamina D3. Este último metabolito habría actuado a nivel
intestinal aumentado la absorción de calcio. La menor excreción fecal de calcio
observada en el grupo tratado con MFP está en concordancia con el razonamiento
anteriormente realizado. Los niveles constantes de la calcemia y la fosfatemia a lo largo
del tratamiento estarían indicando una integridad de los mecanismos involucrados en el
mantenimiento del metabolismo fosfocálcico. La ausencia de cambios detectables en la
DMO del hueso normal, indicarían que no se habrían producido cambios en la
remodelación ósea en otros sitios o que los cambios producidos no fueron de la
magnitud observada en la zona del defecto óseo. La constancia de los valores de la
fosfatemia a lo largo del tratamiento también está indicando un mecanismo
homeostático conservado aun en presencia de tratamientos que tienen ciertos efectos
sobre el metabolismo del fosfato.73 Los resultados de esta tesis estarían indicando que
con las dosis utilizadas, este efecto sería despreciable.
73 Di Loreto V, Rigalli A, Puche RC. Effect of sodium fluoride administration to rats on bone phosphorous content and phosphatemia. Arzneimittelforschung. 56, 760-6. 2006.
74
La fluoremia del grupo MFP aumento significativamente el día 10 del
tratamiento con respecto al Control. Este aumento también se observó en el grupo
tratado con NaF sin llegar a ser significativo. Los resultados son coincidentes con la
mayor biodisponibilidad de fluoruro obtenida a partir del MFP con respecto al NaF,
como consecuencia de la absorción del MFP a nivel gástrico y la unión a las alfa-
macroglobulinas.74,75 Contrariamente a lo observado a los 10 días, no se observaron
diferencias significativas en los valores de fluoremia luego de 30 días de tratamiento. La
disminución en la fluoremia aun cuando se está administrando la droga puede ser
explicado por experimentos previos a esta tesis. Se ha demostrado que cuando el hueso
responde al estímulo osteogénico con sales de flúor, comienza la síntesis de matriz y su
calcificación, fenómeno durante el cual no sólo se incorpora calcio y fosfato sino
también fluoruro. En estas circunstancias la fluoremia de los animales tratados puede
ser inclusive menor que en el grupo Control.76 Se ha demostrado que cuando existe una
buena respuesta al tratamiento, la fluoremia disminuye marcadamente. La fluoruria
luego de 30 días de tratamiento fue acorde a los valores de fluoremia hallados al final
del tratamiento.
74Rigalli A, Cabrerizo M, Beinlich A, Puche RC. 1994 Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittelforschung 44(I), 651-5.75Rigalli A, Esteban L, Pera L, Puche RC. 1997. Binding of monofluorophosphate to a2-macroglobulin and C3. Calcif Tissue Int. 60(I) 86-9.76Rigalli A, Ballina JC, Puche RC. 1992. Bone mass increase and glucose tolerance in rats chronically treated with sodium fluoride. Bone and Mineral, 16:101-8.
75
Es conocido que uno de los efectos adversos de la administración de NaF es la
resistencia a la insulina77,78 y la falla en su secreción.79 Estos efectos adversos se
observan cuando la fluoremia es elevada y se normalizan cuando la fluoremia alcanza
valores normales.80 El efecto negativo del fluoruro sobre la respuesta insulínica sería
una contra para la utilización de NaF en la reparación de defectos no críticos. Los
resultados de esta tesis estarían indicando que la respuesta osteogénica inducida por el
fluoruro, produce descenso de la fluoremia a valores que no discrepan de los hallados en
el grupo Control.
Quedan pendientes para futuras investigaciones la comprobación de las
propiedades biomecánicas del hueso neoformado en la zona del defecto. Los resultados
histológicos permiten anticipar que al menos el comportamiento biomecánico sería
similar o mejor en los grupos tratados con NaF y MFP con respecto al grupo Control.
77 Menoyo I, Rigalli A, Puche RC.2005. Effect of fluoride on the secretion of insulin in the rat. Arzneimittelforschung 55:455-60.78 Menoyo I, Puche RC, Rigalli A. 2008 Fluoride-induced resistance to insulin in the rat. Fluoride. 41: 260-9.79 Rigalli A, Ballina JC, Roveri E, Puche RC. 1990. Inhibitory effect of fluoride on the secretion of insulin. Calcif Tissue Int. 46:433-8.80 Op Cit 76. Pag 75.
76
CAPÍTULO 8
CONCLUSIÓN
Concluimos que la hipótesis planteada para esta investigación se comprobó con
los resultados obtenidos mediante las pruebas experimentales realizadas.
El tratamiento con MFP contribuyó a la reparación del hueso con lesiones no
críticas, en menor tiempo que los no tratados con este compuesto. El análisis histológico
indica que el hueso formado luego de 30 días de tratamiento tiene mejor estructura que
el hueso obtenido por tratamiento con NaF o en los animales controles.
77
CAPÍTULO 11
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