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TESIS DOCTORAL
ANALISIS SEROLOGICO Y MOLECULAR DEL SISTEMA
HLA Y SU RELACION CON LA SUSCEPTIBILIDAD A
LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES) EN LA
POBLACION ESPAÑOLA.
AUTOR M” Dolores de Juan Echávarri
DIRECTOR: Dr. Antonio Amaiz Villena
LUGAR DE RIZALIZACION: Servicio de Inmunologia
Hospital Universitario
“12 de Octubre”
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
1994
1
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Amis padres, con todo mi cariño.
II
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AGRADECIMIENTOS
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INDICE
INTRODUCCION
1. SISTEMAHLA ................................................ 1
1.1. El sistema HLA. G.eneralidades. ............................. 1
1.2. Antígenos HLA .......................................... 2
1.2.1. Antígenos de clase 1 ................................ 2
1.2.2. Antígenos de clase II ............................... 3
1.2.3. Antígenos de clase III: componentes de la vía clásica y alternativa
del complemento. ................................. 5
1.2.4. Otras proteinas relacionadas con el sistema H LA. .......... 6
1.3. Genes del sistema HLA. ................................... 6
1.3.1. Estructura de los genes I-ILA de clase 1 .................. 7
1.3.2. Estructura de los genes de clase II ..................... 7
1.3.3. Estructura de los genes de clase III ..................... 9
1.3.4. Otros genes de la región de clase III .................... 10
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1.4. Estudio del polimorfismo del sistema HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4.1. Polimorfismo serológico del sistema HLA. . . . . . . . . 11
1.4.2. Polimorfismo genético de restricción: RESTRICTION
FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) . . . . . . ll
1.4.3. Asociación de antígenos HLA de clase II- RFLPs y polimorfismo de
secuencia de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2. SISTEMA HLA Y ENFERMEDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1. Mecanismos de asociación HLA-enfermedad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2. Inmunogenética HLA de las enfermedades del tejido conectivo. . . . . . . 16
3.SUCEPTIBILIDAD GENETICA A LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO (LES98
3.1. El sistema mayor de histocompatibilidad y LES . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.1.1. Déficit de factores del complemento en el LES. . . . . . . . . . . . 23
3.1.2. Sistema HLA, aspectos clínicos y serológicos del LES. . . . . . . 25
OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
PACIENTES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
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1. DETERMINACION DEL FENOTIPO HLA .......................... 29
1.1. Antígenos de clase 1: HLA-A,-B,-C,-Bw4 y Bw6 .................. 29
1.2. Antígenos de clase II: HLA-DR, -DQ. . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.3. Determinación de los alotipos del complemento: factores Bf, C2 y C4. 31
2. DETERMINACION GENICA (RFLP) DE LOS ALELOS DE LOS LOCI HLA-
DRB, DQAI, DQBl (clase II) y C4 (clase III). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.1. Obtención de sondas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.1.1. Amplificación de sondas, lisado y obtención de plasmidos puros 32
2.1.2. Digestión de plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.1.3. Electroelución y purificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.1.4. Sondas utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2. Obtención de fragmentos de restricción
(Southern blot) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.1. Extracción de ADN genómico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.2. Digestión con enzimas de restricción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.3. Electroforesis en geles de agarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.4. Transferencia a filtros de nylon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.2.5. Marcaje radiactivo de las sondas (random priming) . . . . . . . . 40
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2.2.6. Hibridación de filtros de nylon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.7. Exposición y revelado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2.8. Deshibridación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3. Interpretación de los patrones de RFLP de los loci HLA-DRB,DQA,DQB
(clase II) y C4 (clase III). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3.1. Patrones de RFLP DRB/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3.2. Patrones de RFLP DQA/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.3. Patrones de RFLP DQB/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.3.4. Patrones de RFLP C4 y 21-OH/Taq 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3. ASIGNACION DE SECUENCIAS DEL EXON 2 DE DQAl Y DQBl A PARTIR
DE LOS RFLPs de HLA-DQ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4. DETERMINACION DE AUTOANTICUERPOS ANTI- NUCLEARES EN
SUERO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.1. Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Determinación de anticuerpos anti-
nucleares y anti- DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2. Determinación de anticuerpos anti-antígenos extraibles del núcleo
(ENA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.2.1. Determinación de ENA por CIE e ID. . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.2.2. Determinación de ENA por Inmunoblotting . . . . . . . . . . . . 49
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S.SELECCION DE INDIVIDUOS ................................... 50
5.1. Sanos no relacionados ..................................... 50
5.2. Pacientes afectos de Lupus Eritematoso y familias. ................ 50
5.2.1. Clasificación de los enfermos en grupos según aspectos clínicos.51
6. ANALISIS ESTADISTICO ....................................... 52
6.1. Cálculo de riesgo relativo (R.R.) y fracción etiológica (6). .......... 53
6.2. Programa estadístico ...................................... 54
7. PREPARACION DE SOLUCIONES UTILIZADAS .................... 56
RESULTADOS .............................................. ..5 9
1. FENOTIPOS Y GENOTIPOS ESTUDIADOS ......................... 59
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
Fenotipos HLA-DR , DQ y alogenotopos obtenidos en una muestra de
individuos sanos no relacionados. ........................... 59
Fenotipos HLA-DR y DQ y alogenotopos obtenidos en unas muestra de
enfermos afectos de LES. ................................ 59
Secuencias de DQAI y DQBI. ............................. 59
Correlación tipaje HLA clase II, serologia-RFLPs. .............. 59
Descripción de “nuevos ” DNA- HLA DR-RFLPs .............. 60
Alotipos de los factores C4 y Bf del complemento. .............. 62
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1.7. Genes del factor C4 y 21-OH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2. PRINCIPALES MANIFESTACIONES CLINICAS Y SEROLOGICAS
(AUTOANTICUERPOS) EN LOS ENFERMOS DE LES. . . . . . . . . . . . 63
3. ASOCIACIONES MAS RELEVANTES DEL SISTEMA HLA Y LES EN UN
GRUPO DE LA POBLACION ESPAÑOLA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1. Antígenos de clase 1,II y LES (GNPD+ y GNPD-) . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.1. Asociaciones serológicas significativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.2. Frecuencia de alogenotopos de DRB, DQA y DQB. . . . . . 64
3.1.3. Análisis de secuencias DQA y DQB . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2. Antígenos de clase III y LES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.1. Frecuencia de alotipos Bf y C4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.2. Distribución de genotipos C4 y 21-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3. Valores de la fracción etiológica (6) y riesgo relativo (RR) en los
diferentes marcadores de susceptibilidad a LES. . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.4. Asociaciones mas relevantes entre el sistema HLA y las manifestaciones
delLES.............................................. 67
3.4.1. Asociación HLA-aspectos clínicos del LES . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.4.2. Respuesta de autoanticuerpos mediada por antígenos HLA de clase
II. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
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3.5. Lupus Eritematoso Sistémico y/o sus manifestaciones clínicas en 10 familias
con al menos un afecto de LES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...74
1.
2.
3.
4.
5.
Contribución del sistema HLA a la susceptibilidad a padecer LES. . . . . . . 74
Ausencia de concordancia entre marcadores HLA que definen la susceptibilidad
a LES en diferentes poblaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Factores del complemento implicados en la patología renal GNPD en LES. 79
Inmunogenética de las respuestas autoinmunes anti-Sm/RNP y Ro/La. . . . . 81
Estudios de familias multiplex. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
CONCLUSIONES ............................................. 83
REFERENCIAS ............................................... 85
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