TESIS DOCTORAL

2018

ESTUDIO DEL CINAMALDEHÍDO Y EL

EUGENOL COMO COMPUESTOS

POTENCIALMENTE BIOACTIVOS EN EL

CONTROL DE LA OBESIDAD Y ALTERACIONES

ASOCIADAS

Alberto Ángel Martín

TESIS DOCTORAL

2018

Doctorado en Nutrigenómica y Nutrición Personalizada

ESTUDIO DEL CINAMALDEHÍDO Y EL

EUGENOL COMO COMPUESTOS

POTENCIALMENTE BIOACTIVOS EN EL

CONTROL DE LA OBESIDAD Y ALTERACIONES

ASOCIADAS

Alberto Ángel Martín

Director: Prof. Andreu Palou Oliver

Directora: Dra. Juana Sánchez Roig

Tutora: Dra. Ana María Rodríguez Guerrero

Doctor por la Universidad de las Islas Baleares

Los directores de Tesis Doctoral

El interesado

Sr. Alberto Ángel Martín

Prof. Andreu Palou Oliver

Catedrático de Universidad

De Bioquímica y Biología Molecular

Dra. Juana Sánchez Roig

Investigadora Ramón Y Cajal

Laboratorio de Biología Molecular,

Nutrición y Biotecnología

Agradecimientos

I

Agradecimientos

Al profesor y director de tesis Dr. Andreu Palou Oliver le expreso mis más sinceros

agradecimientos por aceptarme en su equipo de investigación. Lo respeto y admiro por

su profesionalismo y trayectoria. Es un honor trabajar con usted. Gracias por el apoyo

que me brindo todos estos años. Realmente es un ejemplo para todos los que hemos

decidido recorrer el camino de la ciencia. Muchas gracias.

Gracias a mi directora, la Dra. Juana Sánchez Roig, puedo afirmar con el corazón que

me faltarían hojas para expresar todo el agradecimiento que tengo, porque tu amistad

que es muy valiosa para mí. Gracias por aceptar dirigir mí trabajo sin conocerme. Por tu

constante ejemplo de esfuerzo y dedicación. Por enseñarme a hacer las cosas bien. Por

tu ayuda y apoyo incondicional en los momentos más difíciles. Por la confianza que me

tienes desde la primera vez que nos vimos en el aeropuerto de Palma. Eres parte de mi

familia. Muchas gracias Joana.

Gracias a los profesores del LBNB, Dra. Catalina Picó, Dra. Luisa Bonet, Dra.

Francisca Serra, Dra. Paula Oliver, Dra. Ana María Rodríguez, Dra. Mariona Palou, Dr.

Joan Ribot, Dra. Bárbara Reynes, Dr. Pep Mercader, Cada uno de ustedes aporto sus

consejos y recomendaciones que me ayudaron a realizar un buen trabajo diario en el

laboratorio.

Gracias Enzo por tu excelente trabajo y por poner a mi disposición, de forma muy

generosa, equipos, materiales y mucho conocimiento. Gracias porque siempre tienes

una palabra de ánimo que nos alegra el día a todos.

Gracias a mis amigos de laboratorio, Dr. Petar, Dra. Alice, Dr. Xisco, Dra. Nara, Dr,

Heriberto, Dra, Andrea Arreguin, Dra. Marga Cifre, Andrea Guille, Miguel García, Bea,

Ángel, Madhu, Paula Nuñez, David Otero, Marta Alonso, Antoni Asencio, Bojan

Stojnić, gracias por su calidad humana y apoyo. Las verdaderas amistades no tienen

barreras.

Gracias a la Dra. Estefanía García por sus recomendaciones, ejemplo, por ser una

persona transparente y tener un alma noble, gracias por tu amistad.

Gracias Alba Serrano Bengoechea, por tus consejos y comentarios que siempre alegran

el alma.

Gracias Zhi Xin Yau Qiu, por tu experiencia, espíritu científico y esfuerzo, pero lo más

importante por tu amistad. Fue un privilegio compartir contigo este camino.

Gracias Raúl Gil, realmente el humor es algo muy serio. Gracias por el kit de canelo

deportivo y el kit de CNA y EU. Gracias por el diseño gráfico de la portada de esta

tesis. Gracias por toda tu ayuda y gracias por tu amistad. Espero verte en Colombia.

Gracias CatiDora, me daba ilusión y alegría llegar temprano al laboratorio por tu calidad

como persona. Te deseo de corazón lo mejor de la vida. Gracias por tu amistad.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

II

Gracias a mi socio y amigo Sebastià Galmés, por el diseño de la señalización de los

adipocitos, por curso de Mallorquín intensivo C1, gracias por los viejos tiempos de

fútbol. También espero verte en Colombia para que Raúl no se sienta solo en el vuelo.

Gracias Agustí Sabater por tu calidad como investigador y como persona. Gracias por

que también contribuiste a ampliar mis expresiones Mallorquinas “M’agrada molt el pa

amb oli”, “Ja diré cosas” Gracias por tus consejos y tu amistad.

Gracias Andrea Mosqueda, con tu compañía ir al estabularío fue una tarea ligera,

gracias por tu ayuda y lo más importante, gracias por tu amistad. Nos vemos en México.

Gracias a la mis amigos, Carol, Miguel, Azucena, Mónica, Oliva, Tania, Julia, Natalia,

Marisol, Gaby, Raúl, Hernel, Luis, José, Sandra, Stelia, Jonny, Vika, Martha, Oscar,

Elizabeth, Diana, Gloria, Edna, Libia, Karolay, Javier, Ramón, Antonio, Michaela,

Noely, Joan, Presides y Rafael, gracias por sus oraciones y por confiar en mí.

Gracias a la Fundación Carolina y especialmente a Júan Torres, Coordinador del

Doctorado.

Gracias a la Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

No tengo palabras para agradecer todo el apoyo incondicional de mi familia. Gracias a

mis hermanos, Amanda, Andrés y Estella, por su ejemplo de constancia y rectitud. A mi

hermano Nelson gracias por su compañía y consejos en cada instante de mi vida.

A mi padre Andrés Ángel porque allí donde esté su alma, hoy no habrá nadie más

orgulloso.

Gracias a Jesús, el mejor ejemplo de obediencia y rectitud en toda la historia de la

humanidad, del mundo mundial, cuyo ejemplo es digno de imitar. A Él que me ha dado

la oportunidad de existir y conocerlo, que me guía y a pesar de todo no me abandona.

Le dedico esta tesis al Ángel que DIOS envió para protegerme, mi madre, María Susana

Martín Puentes, mujer virtuosa que con su amor incondicional siempre ha estado

conmigo, dándome su ejemplo de superación y cada día se levantaba muy temprano a

enseñarme que las cosas se logran con sacrificio. Ha hecho tantos esfuerzos para que yo

llegara hasta aquí y quien aún pone toda su esperanza en mí.

Gracias a todos.

Índice

III

ÍNDICE

Agradecimientos I

Abreviaturas V

Resumen XI

Lista de artículos originales derivados de la tesis XVII

1. Introducción 1

1.1. La obesidad y su prevalencia en el mundo

1.2. Enfermedades metabólicas asociadas a la obesidad

1.3. Factores que afectan a la obesidad

1.3.1. Factores genéticos

1.3.2. Factores ambientales

1.3.3. Programación metabólica

1.4. El tejido adiposo blanco

1.4.1. Adipogénesis

1.4.2. Hiperplasia e hipertrofia del adipocito

1.4.3. Metabolismo lipídico

1.5. Compuestos bioactivos en el tratamiento de la obesidad y

enfermedades metabólicas asociadas

1.5.1. Ejemplos concretos de compuestos bioactivos: eugenol,

cinamaldehído

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21

2. Objetivos y planteamiento experimental 25

3. Materiales y métodos 33

3.1. Cultivo In vitro de la línea celular 3T3-L1

3.1.1. Tratamientos experimentales In vitro

3.1.2. Tinción oil red en cultivos celulares

3.1.3. Determinación de la viabilidad en cultivos celulares

3.2. Experimentación Animal

3.2.1. Composición de la dieta

3.2.2. Tratamientos experimentales In vivo

3.2.3. Composición corporal

3.2.4. Extracción de sangre en ayuno

3.2.5. Sacrificio y toma de muestras

3.3. Análisis morfométrico del tejido adiposo blanco

3.4. Extracción de ARN

3.4.1. Aislamiento de ARN mediante E.Z.N.A® Total RNA Kit 1

3.4.2. Aislamiento de ARN utilizando TriPure

3.4.3. Cuantificación del ARN

3.5. Análisis de RT-PCR a tiempo real

3.5.1. Retrotranscripción

3.5.2. PCR a tiempo real

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Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

IV

4. Resultados y Discusión 55

4.1. Capítulo 1

4.1.1. Resultados

4.1.2. Discusión

4.1.3. Conclusiones

4.2. Capítulo 2

4.2.1. Resultados

4.2.2. Discusión

4.2.3. Conclusiones

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5. Recapitulación 93

6. Conclusiones 99

7. Referencias 103

3.6. Western blot

3.6.1. Preparación de las muestras

3.6.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico

(SDS- PAGE)

3.6.3. Electrotransferencia

3.6.4. Inmunodetección

3.6.5. Escaneado y cuantificación

3.7. Determinación de parámetros séricos por técnicas inmunológicas

3.7.1. Determinación de la concentración de leptina

3.7.2. Determinación de la concentración de insulina

3.7.3. Determinación de la concentración de ghrelina

3.8. Determinación de parámetros séricos por técnicas enzimáticas.

3.8.1. Determinación de triglicéridos circulantes

3.8.2. Determinación de ácidos grasos libres circulantes NEFAs

3.8.3. Determinación de los niveles de colesterol

3.8.4. Determinación de fosfatasa alcalina

3.8.5. Determinación de los niveles de aspartato aminotransferasa (AST)

3.8.6. Determinación de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT)

3.8.7. Determinación de la concentración de glucosa

3.9. Determinación del índice HOMA-IR

3.10. Análisis estadístico

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Abreviaturas

V

Abreviaturas

Lista de las abreviaturas utilizadas en la tesis:

°C: Grado Centigrado

µg/mL: Microgramos por mililitro

µm: Micras

Abs: Absorbancia

Acetil-CoA: Acetil-coenzima A

ACOD: Acil-CoA oxidasa (Acil-CoA oxidase)

Ad libitum: Como lo desee (As you Desire)

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario

(Desoxirribonucleico Acido Complementary)

ALP: Fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase)

ALT: Alanina aminotransferasa (Alanine Aminotransferase)

ANOVA: Analisis de varianza (ANalysis Of VAriance)

Apo B-100: Apolipoproteína B-100

ARN: Ácido ribonucleico

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero

AST: Aspartato aminotransferasa (Aspartate Aminotransferase)

ATGL: Lipasa de triglicéridos (Adipose Triglyceride Lipase)

ATP: Trifosfato de adenosina (Adenosine Triphosphate)

AxTto: Ayuno por Tratamiento

BAT: Tejido adiposo blanco

BBS: Síndrome de Bardet-Biedl (Bardet-Biedl Syndrome)

BDNF: Factor neurotrófico derivado del cerebro (Brain-Derived Neurotrophic Factor)

BHT: Butil Hidroxitolueno

BSA: Albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin)

C/EBPs: Proteína de unión al potenciador CCAAT

(CCAAT/Enhancer-Binding Proteins)

CAM: Medicina complementaria y alternativa

(Complementary and Alternative Medicine)

Cd36: Grupo de diferenciación 36 ó Translocasa de ácidos grasos

(Cluster of Differentiation 36 or Fatty Acid Translocase)

CDKs: Enzimas quinasas dependientes de ciclinas (Cyclin-Dependent Kinase Enzymes)

CIBERobn: Centro de investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y

Nutrición

Cidea: Efector tipo A subunidad α de fragmentación de ADN inductor de muerte

celular/ (Cell Death-inducing DNA fragmentation, α Subunit-like Effector A)

CKI: Proteínas inhibidoras de Cdk (Cdk Inhibitory Proteins)

cm2: Centímetro cuadrado

CNA: Cinamaldehído

CO2: Dióxido de carbono (Carbon Dioxide)

CPK: Creatina fosfoquinasa (Creatine Phospho Kinase)

Cpt1b: Carnitina palmítoiltransferase 1b (Carnitine Palmitoyl Transferasa 1b)

Ct: Ciclo umbral (Cycle Threshold)

dATP: Trifosfato de desoxiadenosina (Deoxyadenosine Triphosphate)

dCTP: Desoxicitidina trifosfato (Deoxycytidine Triphosphate)

dGTP: Desoxiguanosina trifosfato (Deoxyguanosine Triphosphate)

DMEM: Medio de Eagle modificado por Dulbecco

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

VI

(Dulbecco's Modified Eagle's médium)

DMS: Desviación media estándar (Means Standard Deviations)

dTTP: Desoxitimidina trifosfato (Deoxythymidine Triphosphate)

ECV: Enfermedades cardiovasculares

EEUU: Estados Unidos (United States)

EIA: Inmunoensayo enzimático (Enzyme Immunoassay)

EL: Lipasa endotelial (Endotelial Lipese)

ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

ET: Capacidad Antioxidante como Equivalente Trolox

(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)

ETV5: Factor de transcripción variente 5 (Transcription Factor Etv5)

EU: Eugenol

F: Sentido (Forward)

Fab: Fracmento de unión al antígeno (Fragment Antigen Binding)

FABP4: Proteína de unión a ácidos grasos 4 (Fatty Acid Binding Protein 4)

FAIM2: Molécula inhibidora de la apoptosis Fas 2

(Fas Apoptotic Inhibitory Molecule 2)

Fasn: Ácido graso sintasa (Fatty Acid Synthase)

FBS: Suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum)

Fc: Fragmento cristalino o cristalizable (Fragment Crystallizable)

Fgf21: Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (Fibroblast Growth Factor 21)

FTO: Proteína asociada a la masa grasa y obesidad

(Fat Mass and Obesity-Associated Protein)

Gck: Glocoquinasa (Glucokinase)

GGT: Gamma-glutamil transpeptidasa (Gamma Glutamyl Transpeptidase)

Ghsr: Receptor de secretagogos de la hormona del crecimiento

(Growth Hormone Secretagogue Receptor)

GLUT4: Proteína transportadora de glucosa tipo 4 (Glucose Transporter Type 4)

GNPDA2: Glucosamina-6-fosfato desaminasa 2

(Glucosamine-6-Phosphate Deaminase 2)

GWAS: Estudios de asociación del genoma completo

(Genome-Wide Association Studies)

H2O2: Peróxido de hidrógeno

HbA1c: Hemoglobina glicosilada A1c

HDL: Lipoproteínas de alta densidad (High Density Lipoproteins)

HFD: Dietas ricas en grasa (High Fat Diets)

Hk2: Hexoquinasa 2 (Hexokinase 2)

HL: Lipasa hepática

HOMA-IR: Modelo homeostático de resistencia a la insulina

(Homeostatic Model of Insulin Resistance)

HOXB5: Homeobox B5 (Homeobox B5)

HPS: Síndrome de Happy-Puppet (Happy-Puppet Syndrome)

HRP: Peroxidasa del rábano (Horseradish Peroxidase)

HSL: Lipasa sensible a hormonas (Hormone-Sensitive Lipase)

HSP90: Proteína de shock térmico de 90 kDa (Heat Shock Protein 90)

IL-6: Interleucina-6 (Interleukin-6)

IMC: Índice de masa corporal

IngTAB: Tejido adiposo blanco inguinal

Insr: Receptor de insulina (Insulin Receptor)

Abreviaturas

VII

INTERHEART: Estudio del efecto de los factores de riesgo potencialmente

modificables asociados con el infarto de miocardio (Study The Effect of Potentially

Modifiable Risk Factors Associated with Myocardial Infarction)

Irs1: Receptor de insulina sustrato 1 (Insulin Receptor Substrate 1)

KCTD15: Canal de potasio que contiene dominio 15 de tetramerización

(Potassium Channel Tetramerization Domain Containing 15)

kDa: Kilodalton

kg: Kilogramo

LBNB: Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología

LCAT: Enzima lecitin-colesterol-aciltransferasa

(Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase Enzyme)

LDL: Lipoproteínas de baja densidad (Low Density Lipoproteins)

LEP: Síndrome deficiencia de leptina (Leptin Deficiency Syndrome)

Lep: Leptina (Leptin)

Lepr: Receptor de la leptina (Leptin Receptor)

LEPR: Síndrome deficiencia del Receptor de Leptina

(Leptin Receptor Deficiency Syndrome)

Lipe: Gen que codifica a la Lipasa sensible a hormonas

(Gene Encoding Hormone-Sensitive Lipase)

LMF1: Proteína lipasa 1

Lp(a): Lipoproteína (a)

Lpl: Lipoproteina lipase (Lipoprotein Lipase)

MC4R: Receptor de la melanocortina 4 (Melanocortin 4 receptor)

MDH: Enzima malato deshidrogenasa (Enzyme Malate Dehydrogenase)

MEHA: 3-metil-N-etil-N β-hidroxieti-Anilina

(3-methyl-N-ethyl-N β-hydroxyeti-Aniline)

mg: Miligramo

MgCl2: Cloruro de Magnesio (Magnesium Chloride)

MGL: Lipasa de monoglicéridos (Monoglyceride Lipase)

Mgll: Leucemia mieloide linfoide (Myeloid-Lymphoid Leukemia)

MIM: Herencia mendeliana en el hombre (Mendelian Inheritance in Man)

min: Minuto

miRNAs: Ácido ribonucleico no codificante (Small Non-coding RNA Molecule)

mL: Mililitro

MTCH2: Homólogo portador mitocondrial 2 (Mitochondrial Carrier Homolog 2)

NADH: Cofactor dinucleótido de nicotinamida (Nicotinamide Dinucleotide Cofactor)

NEGR1: Regulador de crecimiento neuronal 1 (Neuronal Growth Regulator 1)

NEFA: Ácidos grasos no esterificados (Non Esterified Fatty Acids)

NHANES: Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición

(The National Health and Nutrition Examination Survey)

nm: Nanómetro

nM: Nanomolar

Npy: Neuropeptido Y (Neuropeptide Y)

O2-: Aniones superóxido

OECD: Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico

(Organisation for Economic Co-operation and Development)

OH-: Radicales hidroxilo

OLFM4: Olfactomedina 4 (Olfactomedin 4)

ORAC: Capacidad de absorbancia de radicales libres

(Oxygen Radical Absorbance Capacity)

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

VIII

p53: Proteína supresora de tumores p53 (p53 Tumor Suppressor Protein)

PBS: Solución salina tamponada con fosfato (Phosphate Buffered Saline)

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

Pdk4: Piruvato deshidrogenasa lipoamida quinasa isozima 4

(Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 4)

Per se: Por sí mismo

pH: Potencial de hidrógeno (Potential of Hydrogen)

PLTP: Proteína transferidora de fosfolípidos (Phospholipid Transfer Protein)

Pnpla2: Triglicélido lipase adiposa ATGL

(Patatin-like Phospholipase Domain Containing 2)

POD: Peroxidasa (Peroxidase)

POMC: Proopiomelanocortina (Pro-opiomelanocortin)

Pparα: Receptor Alpha Activado por el Factor Proliferador de Peroxisomas

(Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha)

PPARγ: Receptor Gamma Activado por el Factor Proliferador de Peroxisomas

(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma)

PQQ: Coenzirna quinona de pirroloquinolina (Pyrroloquinoline Quinone)

pRb: Gen que codifica a la proteína del retinoblastoma

(Gene that codes for the Retinoblastoma Protein)

PWS: Síndrome de Prader-Willi (Prader-Willi Syndrome)

QM: Quilomicrones

R: Antisentido (Reverse)

RIPA: Tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación

(Radioimmunoprecipitation Assay Buffer)

RMN: Resonancia magnética nuclear

rpTAB: Tejido adiposo blanco retroperitoneal

S1c2a4: Transportador 4 de glucosa (GLUT4)

(Solute Carrier Family 2 Facilitated Glucose Transporter Member 4)

SCD1: Esteroil conezima A desaturasa 1 (Stearoyl-Coenzyme A Desaturase 1)

SDS - PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (Sodium

Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

SDS: Dodecil sulfato de sodio (Sodium Dodecyl Sulfate)

Se: Selenio

SEC16B: Proteína transportadora de proteínas Sec16B

(Protein transport protein Sec16B)

SEM: Error estándar de la media (Standard Error of the Mean)

SH2B1: Proteína adaptadora 1 SH2B (Adapter Protein 1 - SH2B)

Slc24a: Familia SLC24 de intercambiadores de sodio / potasio / calcio

(Family of Sodium/Potassium/Calcium Exchangers)

SNPs: Polimorfismos de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphisms)

Socs3: Supresor de señalización de citocinas 3 (Suppressor of Cytokine Signaling 3)

SPSS: Paquete estadístico para ciencias sociales

(Statistical Package for the Social Sciences)

Srebf1: Factor de transcipción de unión al elemento regulador de esteroles 1

(Sterol Regulatory Element Binding Transcription Factor 1)

SREBP-1c: Proteína de unión al elemento regulador del esterol 1c

(Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1c)

Stat3: Transductor de señal y activador de la transcripción 3

(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)

T0: Tiempo 0

Abreviaturas

IX

T2: Tiempo 2

T4: Tiempo 4

T8: Tiempo 8

TAM: Tejido adiposo marrón

TBS: Solución buffer de transferencia (Transfer Buffer Solution)

TMEM18: Proteína transmembrana 18 (Transmembrane Protein 18)

TNFα: Factor de necrosis tumoral α (Tumor Necrosis Factor Alpha)

TNNI3K: Kinasa interactuante TNNI3 (Interacting Kinase TNNI3)

Tto: Tratamiento

U/mL: Unidad de actividad enzimática por mililitro

UCP1: Proteína desacoplante 1 (Uncoupling Protein 1 Mitochondrial Proton Carrier)

UIB: Universidad de las Islas Baleares (Universitat de les Illes Balears)

V: Voltios

VLDL: Lipoproteínas de muy baja densidad (Very Low-Density Lipoprotein)

WD: Dieta obesogenica (Western Diet)

WHO: Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)

WR: Reactivo de trabajo (Working reagent)

Resumen

XI

Estudio del cinamaldehído y el eugenol como compuestos

potencialmente bioactivos en el control de la obesidad y

alteraciones asociadas

Programa de doctorado de Nutrigenómica y Nutrición Personalizada

Universidad de las Islas Baleares

RESUMEN

La obesidad y la diabetes mellitus afectan a más de un tercio de la población mundial

actual y, si la tendencia continúa, para 2030 se estima que el 38% de la población adulta

mundial tendrá sobrepeso y otro 20% será obeso. En un intento de mejorar los

resultados de los tratamientos de la obesidad y enfermedades asociadas hay una

tendencia emergente en la investigación científica actual, que busca nuevas moléculas

que puedan usarse como biomoléculas funcionales para el control de la obesidad y sus

comorbilidades. El clavo de olor y la canela se han utilizado tradicionalmente por sus

propiedades para manejar numerosas condiciones de salud y como especias en la

industria de alimentos, estas especias han sido descritas ampliamente por tener

propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, y/o antidiabéticas. El cinamaldehído

(CNA), es el compuesto mayoritario de la canela y el eugenol (EU) es el compuesto

mayoritario del clavo de olor.

En esta tesis doctoral se han seleccionado dos compuesto potencialmente bioactivos,

cinamaldehído y eugenol, con el objetivo de estudiar su efecto in vitro e in vivo, de

forma individual y de forma conjunta, para caracterizar los mecanismos moleculares de

sus efectos en el control de la adiposidad, y un posible efecto sinérgico de estos dos

compuestos.

Nuestro primer objetivo ha sido caracterizar in vitro el efecto del eugenol y

cinamaldehído y su combinación en la expresión de genes clave implicados en el

metabolismo lipídico en el adipocitos maduro y durante la adipogénesis. Para ello se

trataron los cultivos de preadipocitos de la línea 3T3-L1 durante todo el proceso de

diferenciación y en etapa de adipocitos maduros con diferentes dosis de EU, CNA y

EU+CNA durante 24 horas. Los resultados indican que el eugenol y cinamaldehído

afectan la expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos

maduros de la línea celular 3T3-L1. En concreto, el tratamiento con EU (400 μM)

disminuye la expresión del ARNm de Fasn y Lipe y el tratamiento con CNA (400 μM)

disminuye la expresión de Fasn y aumenta la expresión de Cpt1b en comparación con el

tratamiento control. El tratamiento combinado EU+CNA tiene un efecto sinérgico en la

inhibición dosis-respuesta de la expresión de los genes lipogénicos (Srebf1, Pparg,

Fasn), sugiriendo un efecto antilipogénico de estos compuestos. Los compuestos

bioactivos eugenol, cinamaldehído y su tratamiento combinado afectan la expresión de

genes clave implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos maduros, pero no

afectan al proceso de diferenciación o adipogénesis.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

XII

El segundo objetivo ha sido estudiar en ratas Wistar macho adultas la capacidad del

eugenol y el cinamaldehído para contrarrestar el desarrollo de obesidad ante una dieta

obesogénica. Para ello, estudiamos in vivo el efecto de la administración oral de EU,

CNA y la combinación de ambos EU+CNA en ratas Wistar macho de 4 meses de edad

alimentadas con una dieta obesogénica. Distribuimos los animales en cinco grupos

experimentales: CONTROL (ratas alimentadas con una dieta estándar), WD (ratas

alimentadas con dieta obesogénica comercial, rica en grasas y azúcares simples (dieta

western diet)), WD+EU (ratas alimentadas con una dieta obesogénica comercial y que

recibieron diariamente vía oral 40mg/kg/día de eugenol), WD+CNA (ratas alimentadas

con una dieta obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral

250mg/kg/día de cinamaldehído), WD+EU+CNA (ratas alimentadas con una dieta

obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral 40+250 mg/kg/día de

eugenol y cinamaldehído, respectivamente). El tratamiento se realizó durante 30 días.

Se analizó diariamente la evolución del peso y la ingesta de alimento. Se tomaron

medidas de la grasa corporal al inicio y al final del estudio. En el día 15 de

experimentación se extrajeron muestras de sangre de la vena safena de los animales en

condiciones de ayuno. Analizamos la expresión de genes de interés relacionados con el

metabolismo lipídico y el tamaño de los adipocitos del tejido adiposo blanco

retroperitoneal e inguinal. Hemos observado que el tratamiento con CNA parece ejercer

un cierto efecto anorexigénico que podría explicar la menor ganancia de peso y grasa

corporal de los animales. Además, la administración de CNA a ratas alimentadas con

una dieta obesogénica reduce el tamaño de los adipocitos y mejora los niveles

circulantes de insulina. Los animales del grupo WD+EU, pese a tener una ingesta

calórica similar al grupo WD, presentaron un menor peso corporal al final del

tratamiento comparado con el grupo WD. Los animales que recibieron el tratamiento

combinado presentan efectos muy similares a los observados en animales tratados sólo

con CNA, por lo que deducimos que los efectos observados del tratamiento combinado

se deben principalmente a los efectos del CNA

Por tanto, el cinamaldehído y el eugenol emergen como posibles compuestos bioactivos

potenciales como terapia de control de la obesidad y alteraciones asociadas. La

administración de cinamaldehído (250mg/kg/día) previene del incremento en el peso

corporal y del aumento del porcentaje de grasa en animales alimentados con una dieta

obesogénica. Además, el tamaño de los adipocitos en el tejido adiposo blanco

retroperitoneal es menor en los que recibieron WD+CNA que en animales WD, y

similar a los adipocitos de los animales del grupo control. Estos compuestos,

particulamente el CNA, se muestran eficaces para contrarrestar el desarrollo de

obesidad ante una dieta obesogénica.

Resum

XIII

Estudi del cinamaldehid i l’eugenol com a compostos

potencialment bioactius en el control de l’obesidad i alteracions

associades

Programa de doctorat de Nutrigenòmica i Nutrició Personalitzada

Universitat de las Isles Balears

RESUM

L'obesitat i la diabetis mellitus afecten més d'un terç de la població mundial actual i, si

aquesta tendència continua, s'estima que l’any 2030 el 38% de la població adulta tindrà

sobrepès i un 20% serà obès. Per millorar els resultats dels tractaments de l'obesitat i

malalties associades hi ha una tendència emergent en la recerca científica actual, que

cerca noves molècules que puguin emprar-se com biomolècules funcionals per al

control de l'obesitat i les seves comorbiditats. El clau d'olor i la canyella s'han utilitzat

tradicionalment per les seves propietats relacionades amb la salut i com espècies a la

indústria d'aliments. S’ha descrit àmpliament a la bibliografia científica que aquestes

espècies poden tenir propietats antioxidants, antiinflamatòries, i/o antidiabètiques. El

cinamaldehid (CNA), és el compost majoritari de la canyella i l'eugenol (EU) és el

compost majoritari del clau d'olor.

En aquesta tesi doctoral s'han seleccionat dos compostos potencialment bioactius,

cinamaldehid i eugenol, amb l'objectiu d'estudiar el seu efecte in vitro i in vivo, de

forma individual i de forma conjunta, per caracteritzar els mecanismes moleculars dels

seus efectes en el control de l’adipositat, i per caracteritzar un possible efecte sinèrgic

d'aquests dos compostos.

El nostre primer objectiu ha estat caracteritzar in vitro l'efecte del cinamaldehid i de

l'eugenol, i de la seva combinació en l'expressió de gens clau implicats en el

metabolisme lipídic al adipòcits madur i durant l’adipogènesi. Per a això es van tractar

els cultius de preadipòcits de la línia 3T3-L1 durant tot el procés de diferenciació i en

etapa d'adipòcits madurs amb diferents dosis d'EU, CNA i EU+CNA durant 24 hores.

Els resultats indiquen que l'eugenol i cinamaldehid afecten l'expressió de gens implicats

en el metabolisme lipídic en adipòcits madurs de la línia cel·lular 3T3-L1. En concret, el

tractament amb EU (400 μM) disminueix l'expressió de l'ARNm de Fasn i Lipe i el

tractament amb CNA (400 μM) disminueix l'expressió de Fasn i augmenta l'expressió

de Cpt1b en comparació amb el tractament control. El tractament combinat EU+CNA té

un efecte sinèrgic en la inhibició dosi-resposta de l'expressió dels gens lipogènics

(Srebf1, Pparg, Fasn), el que suggereix un efecte antilipogènic d'aquests compostos.

L’eugenol, cinamaldehid i el seu tractament combinat afecten l'expressió de gens clau

implicats en el metabolisme lipídic en adipòcits madurs, però no afecten el procés de

diferenciació o adipogènesi.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

XIV

El segon objectiu ha estat estudiar en rates Wistar mascle adultes la capacitat del

cinamaldèhid i de l’eugenol per contrarestar el desenvolupament d'obesitat front d'una

dieta obesogènica. Per a això, vam estudiar in vivo l'efecte de l'administració oral d'EU,

CNA i la seva combinació EU+CNA en rates Wistar mascle de 4 mesos d'edat

alimentades amb una dieta obesogènic. Els animals es distribuïren en cinc grups

experimentals: CONTROL (rates alimentades amb una dieta estàndard), WD (rates

alimentades amb dieta obesogènic comercial, rica en greixos i sucres simples (dieta

western diet)), WD+EU (rates alimentades amb una dieta obesogènic comercial i que

van rebre diàriament via oral 40 mg/kg/dia d’eugenol), WD+CNA (rates alimentades

amb una dieta obesogènica comercial i que van rebre diàriament via oral 250mg/kg/dia

de cinamaldehid), WD+EU+CNA (rates alimentades amb una dieta obesogènic

comercial i que van rebre diàriament via oral 40+250 mg/kg/dia d’eugenol i

cinamaldehid, respectivament). El tractament es va realitzar durant 30 dies. Es va

analitzar diàriament l'evolució del pes i la ingesta d'aliment. Es van prendre mesures del

greix corporal a l'inici i al final de l'estudi. Després de 15 dies d'experimentació es van

extreure mostres de sang de la vena safena dels animals en condicions de dejuni.

Analitzàrem l'expressió de gens d'interès relacionats amb el metabolisme lipídic i la

mida dels adipòcits del teixit adipós blanc retroperitoneal i inguinal. Hem observat que

el tractament amb CNA sembla exercir un cert efecte anorexigènic que podria explicar

el menor guany de pes i greix corporal dels animals. A més, l'administració de CNA a

rates alimentades amb una dieta obesogènic redueix la mida dels adipòcits i millora els

nivells circulants d'insulina. Els animals del grup WD+EU, tot i tenir una ingesta

calòrica similar al grup WD, van presentar un menor pes corporal al final del tractament

comparat amb el grup WD. Els animals que van rebre el tractament combinat presenten

efectes molt similars als observats en animals tractats només amb CNA, de manera que

deduïm que els efectes observats en el grup que rebé el tractament combinat es deuen

principalment a l'efecte del CNA

Per tant, el cinamaldehid i l'eugenol emergeixen com a possibles compostos bioactius

potencials com a teràpia de control de l'obesitat i alteracions associades. L'administració

de cinamaldehid (250mg/kg/dia) prevé l'increment en el pes corporal i de l'augment del

percentatge de greix en animals alimentats amb una dieta obesogènica. A més, la mida

dels adipòcits en el teixit adipós blanc retroperitoneal és menor en els que van rebre

WD+CNA que en animals WD, i similar als adipòcits dels animals del grup control.

Aquests compostos, particularment el CNA, es mostren eficaces per contrarestar el

desenvolupament d'obesitat davant d'una dieta obesogénica.

Abstract

XV

Study of cinnamaldehyde and eugenol as potentially bioactive

compounds in the control of obesity and associated disorders

Doctoral Program in Nutrigenomics and Personalized Nutrition

Universidad de las Islas Baleares

ABSTRACT

Obesity and diabetes mellitus affect more than a third of the world's current population

and if the trend continues by 2030 it is estimated that 38% of the world's adult

population will be overweight and another 20% will be obese. In an attempt to improve

the results of treatments for obesity and associated diseases, there is an emerging trend

in current scientific research, which seeks new molecules that can be used as functional

bimolecular to control obesity and its comorbidities. Clove and cinnamon have

traditionally been used for their properties to manage numerous health conditions as

spices in the food industry, these spices have been widely described as having

antioxidant, anti-inflammatory, and / or antidiabetic properties. Cinnamaldehyde (CNA)

is the major compound of cinnamon and eugenol (EU) is the major compound of clove.

In this doctoral thesis two potentially bioactive compounds cinnamaldehyde and

eugenol have been selected with the aim of studying their effect in vitro and in vivo,

individually to characterize the molecular mechanisms of their effects in the control of

adiposity, also in combination to identify a possible synergistic effect of these two

compounds.

Our first objective has been to characterize in vitro the effect of cinnamaldehyde,

eugenol and their combination in the expression of key genes involved in lipid

metabolism in mature adipocytes and during adipogenesis. For this, pre-adipocyte

cultures of line 3T3-L1 were treated during the whole process of differentiation and in

stages of mature adipocytes with different doses of EU, CNA and EU + CNA during 24

h. The results indicate that eugenol and cinnamaldehyde affect the expression of genes

involved in lipid metabolism in mature adipocytes of the 3T3-L1 cell line. In particular,

the treatment with EU (400 μM) decreases the expression of Fasn and Lipe mRNA and

the treatment with CNA (400 μM) decreases the expression of Fasn and increases the

expression of Cpt1b compared to the control treatment. The combined treatment EU +

CNA has a synergistic effect on the dose-response inhibition of the expression of

lipogenic genes (Srebf1, Pparg, Fasn), suggesting an antilipogenic effect of these

compounds. The bioactive compounds eugenol, cinnamaldehyde and its combined

treatment affect the expression of key genes involved in lipid metabolism in mature

adipocytes, but do not affect the process of differentiation or adipogenesis.

The second objective has been to study in adult male Wistar rats, the capacity of

cinnamaldehyde and eugenol to counteract the development of obesity in the face of an

obesogenic diet. To this end, we studied in vivo the effect of oral administration of EU,

CNA and the combination of both EU+CNA in 4-month-old male Wistar rats fed an

obesogenic diet. We distributed the animals in five experimental groups: CONTROL

(rats fed a standard diet), WD (rats fed commercial obesogenic diet, rich in fats and

simple sugars (western diet)), WD+EU (rats fed a commercial obesogenic diet and

received daily orally 40mg/kg/day of eugenol), WD+CNA (rats fed a commercial

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

XVI

obesogenic diet and receiving orally 250mg/kg/day of cinnamaldehyde orally),

WD+EU+CNA (rats fed a commercial obesogenic diet and received daily orally

40+250mg/kg/day of eugenol and cinnamaldehyde, respectively). The treatment lasted

for 30 days. The evolution of weight and food intake was daily analyzed. Measurements

of body fat were taken at the beginning and end of the study. On 15th day of

experimentation, blood samples were taken from the saphenous vein of the animals

under fasting conditions. We analyzed the expression of genes of interest related to lipid

metabolism and the size of the adipocytes of the retroperitoneal and inguinal white

adipose tissue. We have observed that the treatment with CNA seems to exert a certain

anorexic effect that could explain the lower weight gain and body fat of the animals. In

addition, the administration of CNA to rats fed an obesogenic diet reduces the size of

adipocytes and improves circulating insulin levels. The animals of the WD+EU group,

despite of having a caloric intake similar to the WD group, had a lower bodyweight at

the end of the treatment compared to the WD group. The animals that received the

combined treatment have very similar effects to those observed in animals treated only

with CNA, so we conclude that the observed effects of the combined treatment are

mainly due to the effects of the CNA.

Therefore, eugenol and cinnamaldehyde emerge as possible bioactive compounds in the

control therapy of obesity and associated disorders. The administration of

cinnamaldehyde (250mg/kg/day) to animals fed with the western diet, prevents the

increase in weight and increase in the percentage of fat associated with the intake of the

obesogenic diet. In addition, the size of the adipocytes in the white retroperitoneal

adipose tissue is smaller in those who receives WD+CNA than in western diet animals,

and similar to the adipocytes of the animals of the control group. It has been shown that

these compounds are effective in counteracting the development of obesity under an

obesogenic diet.

Lista artículos originales

XVII

Lista de artículos originales directamente derivados de la tesis

Esta tesis está basada en los siguientes manuscritos originales:

1.- Ángel A., Palou A., Sánchez J. La administración conjunta de eugenol y

cinamaldehído en adipocitos maduros 3T3-L1 produce un efecto hipolipídico que

podría estar mediado por la inhibición en la expresión de genes lipogénicos.

Manuscrito en preparación.

2.- Ángel A., Sánchez J., Palou A. La administración de eugenol (EU),

cinamaldehído (CNA) y el tratamiento combinado (EU+CNA) disminuye la ganancia

de peso corporal en ratas alimentadas con una dieta obesogénica. Manuscrito en

preparación.

Contribución en cada uno de los manuscritos

Manuscrito 1: Llevé a cabo los cultivos celulares así como los tratamientos en

adipocitos maduros y durante la diferenciación. Realicé la extracción de ARN y el

análisis de los genes de interés. Así como la tinción Oil-Red y el test de viabilidad

celular. Participé en el análisis, incluyendo el análisis estadístico, la representación y la

interpretación de los resultados obtenidos. Colaboré en la escritura del primer borrador

del manuscrito.

Manuscrito 2: Llevé a cabo el manejo de animales (seguimiento del peso e ingestas,

tratamientos, medida de la grasa corporal, extracción de sangre y colaboración en el

sacrificio). Realicé las determinaciones de los parámetros sanguíneos, la extracción de

ARN y el análisis de los genes de interés, el análisis por western blot de los niveles de

UCP1 en el tejido adiposo marrón y el análisis de la morfometría de los adipocitos.

Participé en el análisis, incluyendo el análisis estadístico, la representación y la

interpretación de los resultados obtenidos. Colaboré en la escritura del primer borrador

del manuscrito.

1

Jeremías 29:11-13 “Yo sé los planes que tengo

para ustedes, planes para su bienestar y no para

su mal, a fin de darles un futuro lleno de

esperanza. Yo, el Señor, lo afirmo. Entonces

ustedes me invocarán, y vendrán a mí en oración

y yo los escucharé. Me buscarán y me

encontrarán, porque me buscarán de todo

corazón.”

1 INTRODUCCIÓN

1. Introducción

3

1. Introducción

1.1. La obesidad y su prevalencia en el mundo

La obesidad es considerada una enfermedad crónica, con una etiología multifactorial

que involucra la combinación de factores genéticos y ambientales, incluyendo la

alimentación y un estilo de vida sedentario [1–4]. La obesidad presenta una elevada

prevalencia a nivel mundial y se asocia a los hábitos alimentarios poco saludables como

el exceso en el consumo de alimentos y bebidas con alto contenido calórico [3–8]. La

obesidad se caracteriza por el aumento en los depósitos de lípidos en el tejido adiposo.

Este exceso de adiposidad afecta los procesos metabólicos y endocrinos del balance

energético, especialmente el tejido adiposo localizado en la zona abdominal,

favoreciendo el desarrollo de enfermedades crónicas relacionadas con el síndrome

metabólico [4, 8, 9]. Además, hay una preocupación en particular porque la obesidad

está aumentando entre los niños y adolescentes y también porque el costo social y de

atención médica para el tratamiento de la obesidad es muy elevado [1, 2, 4, 8]. Por esta

razón la obesidad es ampliamente reconocida como una de las principales amenazas

para la salud en la mayoría de sociedades industrializadas o en desarrollo económico

alrededor del mundo y conocida como la epidemia del siglo XXI [1, 2, 4, 8].

La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD) ha presentado

el informe “Obesity Update 2017” donde se evidencia un incremento respecto a años

anteriores en las tasas de sobrepeso y obesidad entre adultos de los países miembros

[10]. Los resultados muestran que los EEUU se encuentran situados en el primer lugar

con una tasa de obesidad de 38,2%, en segundo lugar México con 32,4%, Nueva

Zelanda en tercer lugar con 30,7%, y Hungría en cuarta posición con un 30% [10].

Colombia actualmente cuenta con una tasa del 20,9% y España con 16,7% [10]. Las

proyecciones hasta el año 2030 muestran un aumento constante en las tasas de obesidad

[10]. Se prevé que las tasas de obesidad sean particularmente altas en los EE.UU con

47%, México con 39% e Inglaterra con el 35% [10]. Además, se estima que la obesidad

en España casi coincida con la de Francia, con un 21% [10].

En el Congreso Europeo de Obesidad (ECO) realizado en Portugal, se presentó un

informe de la Organización Mundial de la Salud (WHO, de sus siglas en inglés) sobre la

prevalencia de la obesidad en Europa [11, 12]. Este informe reveló que la prevalencia de

la obesidad se incrementó en todo el continente europeo en general y esta tendencia

probablemente continuará incrementando [11, 12]. También reveló que el número de

adolescentes obesos sigue aumentando en muchos países de Europa, ya que se estima

que uno de cada tres adolescentes tiene sobrepeso u obesidad [11, 12]. El estudio

también presentó datos que evidencian que las mayores tasas de obesidad están en los

países del sur de Europa y del Mediterráneo [11, 12]. Asimismo, llama la atención que

la epidemia ha tenido una rápida transición al sobrepeso y la obesidad en Europa del

Este, donde históricamente las tasas han sido más bajas [11, 12]. Los mayores niveles

de obesidad entre los adolescentes se encuentran actualmente en Grecia, Macedonia,

Eslovenia, Croacia y Portugal [11, 12].

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

4

1.2. Enfermedades metabólicas asociadas a la obesidad

La homeostasis energética es un proceso muy importante para el funcionamiento

celular, existiendo una regulación en el control del almacenamiento y el gasto de

energía [13]. Esta homeostasis es modulada por señales neuronales y endocrinas en el

sistema nervioso central, sistema endocrino, sistema gastrointestinal, y con una

participación clave del tejido adiposo [13–15]. La ruptura de este equilibrio se asocia al

desarrollo de las enfermedades metabólicas asociadas a la obesidad como la resistencia

a la insulina, diabetes mellitus Tipo 2, y las enfermedades cardiovasculares [13, 15].

Los adipocitos no son simples depósitos de almacenamiento de energía para el cuerpo.

Son un tipo de células involucradas en la generación de muchas señales endocrinas,

paracrinas y autocrinas que incluyen citocinas, factores de crecimiento y otras señales

hormonales con múltiples funciones en el metabolismo energético [13–15]. Por citar

algunos ejemplos, el tejido adiposo es responsable de la síntesis y secreción de

hormonas para el control de la ingesta alimentaria (leptina), control de la sensibilidad a

la insulina y mediadores del proceso inflamatorio (factor de necrosis tumoral α (TNFα),

interleucina-6 (IL-6), resistina, visfatina, adiponectina) Así, los pequeños adipocitos en

individuos delgados promueven la homeostasis metabólica; mientras los adipocitos

agrandados de individuos obesos tienden a reclutar macrófagos y promueven asi la

inflamación crónica asociada a la obesidad [16, 17].

Relación de la obesidad y la inflamación

Como se ha comentado anteriormente, la obesidad desencadena un estado inflamatorio

crónico de bajo grado a medida que una persona aumenta más de peso [16, 18]. Esta

inflamación provoca un efecto adverso para los adipocitos por la acumulación de

macrófagos, es mayor en el tejido adiposo de individuos obesos, ya que se induce a

moléculas derivadas de un estado pro inflamatorio [16, 18, 19].

Además, los mediadores inflamatorios como las citocinas y el exceso en la dieta de la

glucosa y ácidos grasos pro-inflamatorios de la familia omega-6 por ejemplo, (el ácido

araquidónico presente en la grasa animal de vacuno, cerdo, cordero y derivados lácteos),

actúan conjuntamente para agravar la resistencia de la insulina [20–22]. De esta manera

inicia el deterioro en la cascada de señalización de la insulina en el tejido adiposo, el

hígado y el músculo esquelético [21–23]. Este deterioro exacerba el aumento en los

depósitos de lípidos, aumenta también la resistencia a la insulina y finalmente se

produce como un círculo vicioso la constante inflamación metabólica sistémica [21, 22,

24]. Por esta razón a mayor obesidad, mayor inflamación metabólica [21, 22, 24]. Esta

respuesta inflamatoria crónica asociada a la obesidad es la razón fundamental por la

cual la obesidad afecta los procesos metabólicos y endocrinos, siendo un agente causal

del desarrollo de algunas enfermedades crónicas como el hígado graso, la hipertensión,

la dislipidemia, la diabetes tipo 2, la apnea del sueño, los trastornos

musculoesqueléticos y algunos cánceres [21, 24].

1. Introducción

5

Relación de la obesidad, las enfermedades cardiovasculares y el síndrome metabólico

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) hacen referencia a las alteraciones que

afectan el corazón y los vasos sanguíneos [25]. Estas alteraciones se deben

principalmente a la acumulación como placas en las paredes de los vasos sanguíneos o

arterias de la grasa, el colesterol, el calcio y otras sustancias que se encuentran en la

sangre [25, 26]. Con el tiempo, estas placas pueden causar endurecimiento de las

arterias, también pueden estrecharlas u obstruirlas completamente [25, 26].

El conjunto conocido como ECV, está integrado por la hipertensión, infarto de

miocardio, aterosclerosis, arritmias, enfermedad cardíaca valvular, coagulopatías y

accidente cerebrovascular [25, 27]. Estas enfermedades son la mayor causa de

morbilidad y muerte prematura en todo el mundo [25, 27, 28].

El sedentarismo, la obesidad y los hábitos alimenticios con alta presencia de sal,

carbohidratos refinados y grasas saturadas dan lugar a la disfunción endotelial [25, 27,

28]. Esto produce un aumento marcado en la presión arterial, aumenta los procesos de

coagulación sanguínea, disminuye la capacidad fibrinolítica y produce la perdida en la

remodelación vascular [25, 27, 29]. Además aumenta los niveles plasmáticos de

colesterol total y lipoproteínas de baja densidad (LDL) [25, 27, 29].

Se denomina síndrome metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas que agrupa a

la obesidad central, presión arterial elevada, niveles altos de glucemia, niveles altos de

colesterol y triglicéridos y la disminución de colesterol asociado a proteínas de alta

densidad (HDL) [30]. La obesidad es un importante factor de riesgo modificable que

contribuye al desarrollo de la diabetes mellitus tipo 2, hipertensión, ECV y el síndrome

metabólico [30]. Una de las causas más importantes del síndrome metabólico es la

obesidad, por eso, a mayores niveles de obesidad, mayor será el riesgo de desarrollar el

síndrome metabólico [25, 27, 31].

Evidencia científica proporcionada por el estudio INTERHEART, mostró que

aproximadamente el 80% de las ECV se pueden prevenir con ejercicio, hábitos

dietéticos saludables, manteniendo un peso corporal sano y no fumar [32]. Una

actividad física moderada (aproximadamente 30 min/día) tiene efectos altamente

beneficiosos en la disminución del riesgo de una ECV [32]. Cambios en los patrones

dietéticos que incluyan una dieta Mediterránea, consumo de ácidos grasos omega 3,

consumo de alimentos con capacidad antioxidante y disminución de carbohidratos de

alta carga glucémica, disminución de la ingesta de grasas saturadas, aumento del

contenido de fibra dietética y una mayor ingesta de frutas y verduras frescas también

han demostrado ser buenas estrategias para la reducción de la obesidad, y también ser

útiles para limitar la progresión de las ECV y el síndrome metabólico [25, 31, 33].

1.3. Factores que afectan a la obesidad

Existe una amplia variedad de factores que pueden influir y causar obesidad, tanto en

niños como en adultos. Estos factores se relacionan con el entorno, el comportamiento,

el estilo de vida, los mecanismos biológicos y la genética [34]. Los factores genéticos

contribuyen de forma muy importante en el desarrollo de la obesidad [3, 35–37]. Pero

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

6

sin restar importancia, el factor ambiental también es muy importante, porque al

analizar el cambio en el comportamiento de los humanos a través del tiempo se observa

una menor actividad física y la ingesta de grandes cantidades de alimentos con alta

densidad energética [35–37]. Estos cambios han ocurrido en un período muy corto,

aproximadamente en los últimos 200 años [35–37]. Este tiempo no ha sido suficiente

para modificar la carga genética y suprimir la expresión de genes que han permitido

sobrevivir frente a la escasez de alimento desde hace más de 250.000 años [36, 37].

Nuestros genes han permitido que en temporadas de escasez de alimentos, la tasa

metabólica aumente su eficiencia energética, logrando mantener las funciones del

organismo con un limitado consumo de energía [36, 37]. Por el contrario, esto permite

que en presencia de un ambiente de abundancia, la ingesta excesiva de energía también

se almacene eficientemente en forma de lípidos [35–38].

1.3.1. Factores genéticos

Varios estudios de asociación del genoma completo (GWAS, genome-wide association

studies), han analizado diferentes variaciones genéticas a lo largo de todo el genoma

humano con el objetivo de identificar su asociación a la obesidad [3, 39]. Los GWAS

han desvelado asociaciones de ciertos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con el

índice de masa corporal (IMC), la relación cintura-cadera y otros rasgos de adiposidad

[3]. En total se han identificado más de 300 SNPs [3]. Estos conocimientos son

importantes para el diseño y producción de nuevos fármacos contra la obesidad y

también para el desarrollo de la nutrición personalizada.

El desarrollo de la obesidad puede deberse a la alteración en un solo gen [3, 40].

Actualmente, la identificación de los factores genéticos han relacionado mutaciones

simples que contribuyen al desarrollo de la obesidad monogénica [3]. Aunque son poco

frecuentes y los mecanismos son múltiples, citamos como ejemplo algunos síndromes

que presentan una obesidad hereditaria originada en un gen único disfuncional como el

síndrome de Prader-Willi (PWS MIM 176270) que induce a una resistencia a la insulina

y es una forma relativamente común de herencia monogénica [40], el síndrome de

Happy-Puppet o Angelman (HPS MIM 105830) que se asocia a retardo mental,

obesidad, retraso en el desarrollo y baja estatura [40, 41], el síndrome de Bardet-Biedl

(BBS MIM 209900) que muestra herencia autosómica recesiva, caracterizado por

obesidad, hipogonadismo, retardo mental y polidactilia [41–43]. La deficiencia de

leptina en humanos (LEP MIM 164160) es debido a una mutación en el gen de la

leptina (ΔG133), también se han observado mutaciones en los exones del receptor de la

leptina (LEPR MIM 601007) que da como resultado un receptor de leptina truncado que

carece de los dominios transmembrana e intracelular [44]. Estas mutaciones se asocian

con la obesidad mórbida de inicio temprano [44]. La leptina es una hormona secretada

principalmente por los adipocitos, su deficiencia en humanos se describió por primera

vez en una familia consanguínea de origen paquistaní [44, 45]. Los padres, que eran

primos de primer grado, no manifestaron obesidad, pero dos de sus hijos mostraron

obesidad extrema [44, 45]. Además, recientemente se ha descrito que una mutación en

1. Introducción

7

el gen del receptor de las melanocortinas (MCR4) está asociado al desarrollo precoz de

obesidad severa en edades infantiles [46].

Además de las alteraciones en genes relacionadas con la obesidad, los estudios de

GWAS han determinado que variaciones en un solo SNP se asocian a caracterísitícas

relacionadas con la obesidad. Estos SNPs se asocian con la obesidad, porque aparecen

frecuentemente en individuos obesos pero no entre individuos delgados. Es así como

estas variantes genéticas parecen predisponer a las personas a consumir mayores

cantidades de alimentos [39]. En estos estudios de asociación (GWAS) se han

identificado varios loci asociados a un mayor IMC; Por ejemplo los loci en los genes

FTO, TMEM18, POMC, MC4R, FAIM2, TNNI3K, SEC16B, SH2B1, BDNF,

GNPDA2, NEGR1, ETV5, MTCH2 y KCTD15 [47, 48]. Además, se ha descrito que

existe una relación muy estrecha entre el índice de masa corporal en niños con elevada

adiposidad y dos loci (OLFM4 y HOXB5) [49, 50].

Un ejemplo claro de que estas variantes en el genoma se relacionan con la obesidad es

el caso del SNP en el gen FTO, porque se encontró que en las personas que portan dos

copias del alelo de riesgo, pesan en promedio 3 kg más que aquellas que no tienen

ninguna copia [51], además se sienten más hambrientos después de comer porque tienen

niveles más altos de la hormona estimulante del apetito ghrelina [52].

Otra evidencia, es una variante en el gen MC4R que se asocia a obesidad y a la

disminución en los niveles de saciedad, una mayor sensación de hambre en niños y

adultos y el aumento de la ingesta de energía total [53, 54]. Además se ha descrito que

una variante de riego en el gen MCR4 se asocia con la adiposidad en niños menores de

9 años [53, 55].

1.3.2. Factores ambientales

Las personas pueden obtener energía de diferentes fuentes como de proteínas (1 gramo

de proteína aporta 4 Calorías), carbohidratos (1 gramo de carbohidratos aporta 4

Calorías), grasas (1 gramo de grasa aporta 9 Calorías) y alcohol (1 gramo de alcohol

aporta 7 Calorías) y la gastan a través de tres mecanismos: la tasa metabólica en reposo,

que es la cantidad de energía que consume el organismo en reposo; el efecto térmico de

los alimentos, que es el costo energético de absorber y metabolizar los alimentos

consumidos; y la energía gastada a través de la actividad física, de esta manera se regula

el balance energético para mantener la homeostasis del peso corporal [56, 57].

Si tomamos como ejemplo a una persona que es muy activa físicamente, esta puede

mantener un equilibrio energético y un peso sano al ingerir y gastar 3.000 kcal al día

[57]. Esa misma persona, si adopta un estilo de vida sedentario, podría mantener el

equilibrio energético y el mismo peso corporal saludable al ingerir y gastar 2.000 kcal al

día [57]. Finalmente, si esa persona sedentaria no reduce suficientemente la ingesta de

alimentos altamente energéticos para igualar el gasto, con el tiempo, logra un balance

positivo de energía favoreciendo el desarrollo de obesidad [57].

La ingesta de alimentos altamente energéticos es responsable del incremento en la

prevalencia de la obesidad, aunque son diversos los factores ambientales que pueden

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

8

incidir. Por citar un ejemplo, México presenta una de las mayores tasa de obesidad en el

mundo, presentando una transición nutricional con una disminución de dietas caseras,

en contraste con un aumento en el consumo de alimentos ultraprocesados con alta

densidad energética, grasas saturadas y bajo contenido de fibra [58]. La ingesta de agua

de los niños mexicanos de 1 a 18 años tiene un total diario por debajo de los niveles

recomendados y el principal consumo de líquidos son leche rica en grasas, zumos de

frutas edulcorados y refrescos carbonatados tipo sodas [59]. Entre 1999 y 2006, se

reportó entre los niños mexicanos y adolescentes un aumento del 226% en el consumo

de bebidas carbonatadas y bebidas endulzadas [60]. De esta manera se relaciona como

el comportamiento dietético con ingesta de alimentos con alta densidad energética

influye de manera negativa en el balance de energía desarrollando obesidad en la niñez

y la adolescencia [61]. Estos hábitos alimentarios poco saludables han ocasionado un

aumento muy importante en la prevalencia combinada de sobrepeso y obesidad desde

1999 entre los niños y adolescentes mexicanos [61].

Respecto al efecto de la actividad física sobre la obesidad, un estudio mostró que en los

Estados Unidos, el gasto de energía diario debido a la actividad física relacionada con el

trabajo ha disminuido cerca de 200 kcal durante los últimos 50 años tanto en hombres

como en mujeres, y esta reducción se asocia con el aumento en el peso corporal medio

durante este tiempo [62]. Por ejemplo, desde 1960-02 hasta 2003-06 se calculó que el

gasto de la energía diaria relacionada con la ocupación disminuyó en 142 calorías en los

hombres [62]. Como resultado se observó un aumento en el peso promedio de referencia

de 76,9 kg en 1960-02, a 91,8 kg en 2003-06 en el peso medio reportado en la encuesta

de NHANES, los resultados fueron similares en las mujeres [62].

Así mismo, un estudio examinó las tendencias de la población de Finlandia desde 1982

a 2012, se evidencia que durante 30 años se han producido cambios marcados,

disminuyendo el tiempo total de actividad física del trabajo en los hombres de 17% a

12% y las mujeres de 30% a 20% [63]. La actividad física ocupacional también

disminuyo en los hombres de 48% a 36%, y las mujeres de 26% a 21%. Particularmente

se relaciona la menor actividad física con el aumento del IMC [63].

El estilo de vida sedentario aumenta la prevalencia de la obesidad y ambos afectan

negativamente las ECV [64]. En Estados Unidos se realizó una encuesta en adultos

sobre el nivel de actividad física; los resultados mostraron que las personas que

informaron no tener tiempo libre para realizar actividad física vivian en las áreas de las

ciudades donde las tasas de obesidad es mayor al 30% [64]. Así la prevalencia de la

obesidad y la inactividad física puede predecir el riesgo de muerte por ECV. Fomentar

la pérdida de peso y promover el aumento de la actividad física son terapias cruciales

para la prevención de las ECV [64].

La actividad física tiene la capacidad de regular el equilibrio energético, aumentando el

gasto de energía, pero en los ambientes que promueven un estilo de vida sedentario, la

epidemia de la obesidad continuará en aumento, mientras disminuye el gasto de energía

requerido para la vida diaria y las personas persistan consumiendo más energía de la que

1. Introducción

9

gastan [65]. Por esta razón fomentar la actividad física tiene un importante potencial en

el control de la obesidad [65].

1.3.3. Programación metabólica

La programación metabólica es un proceso de adaptación de los mecanismos biológicos

responsables del desarrollo intrauterino, influenciados por la nutrición de la madre y los

factores ambientales [66]. Esta adaptación a las condiciones de estrés durante la vida

intrauterina, pueden provocar adaptaciones metabólicas y fisiológicas en los tejidos y

órganos para que se garantice la supervivencia del feto [67]. Estos cambios pueden ser

irreversibles y persistir a lo largo de la vida produciendo una susceptibilidad en los

adultos a desarrollar enfermedades crónicas [68].

El grupo del Dr. David Barker introdujo la hipótesis que postula que los eventos durante

el desarrollo temprano, tienen un gran impacto en el riesgo para desarrollar

enfermedades en los adultos [69]. Por ejemplo, el bajo peso al nacer, es un marcador del

crecimiento y nutrición fetal deficiente y está relacionado con un mayor riesgo de

enfermedades crónicas como las ECV, la hipertensión, la obesidad y la resistencia a la

insulina [70]. La hipótesis de Barker explica una parte de los casos del síndrome

metabólico caracterizado por obesidad y diabetes tipo 2 en la edad adulta [69–71]. El

bajo peso al nacer se ve reflejado como una modificación en la programación celular en

cuanto al gasto energético y producción de insulina [69, 70]. La programación

metabólica puede afectarse por la alteración de la expresión de los genes en el útero de

acuerdo con la disponibilidad de nutrientes, que actúan directamente en las células o, de

modo indirecto por medio de señales hormonales [72, 73].

Algunos estudios realizados con animales han demostrado este fenómeno de

programación metabólica al evidenciar como el feto puede adaptarse a la malnutrición,

alterando la producción de hormonas que regulan el crecimiento fetal y la necesidad de

nutrientes [74]. También alteran la sensibilidad de los tejidos a esas hormonas [74]. Un

ejemplo de esta programación metabólica sucede cuando el feto adapta su metabolismo,

durante los días de reducción en el suministro de glucosa o hipoglucemia se estimula la

glucogenólisis, gluconeogénesis y aumenta las tasas de oxidación de aminoácidos [75].

El feto desarrolla mecanismos que tienden a mantener su metabolismo energético

relativamente constante, incluso puede redistribuir el flujo sanguíneo para proteger los

órganos más importantes de la falta de nutrientes, de esta manera es capaz de adaptarse

a un crecimiento más lento [76].

Los diversos trabajos sobre programación metabólica de la obesidad del grupo de

investigación del Dr. Palou reflejan que la programación nutricional en los primeros

períodos de la vida es un fenómeno que afecta las funciones metabólicas y fisiológicas a

lo largo de la vida (Revisado en [77, 78]). La restricción de alimentos durante la

gestación puede conducir a adaptaciones permanentes con efectos duraderos en el

metabolismo de la descendencia e influir en el desarrollo de diferentes enfermedades

crónicas asociadas con la obesidad [78]. Una restricción de calorías del 20% durante los

primeros 12 días de gestación programa a la descendencia para una mayor ingesta de

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

10

alimentos en ambos sexos, que en el caso de los machos resulta en un mayor peso

corporal [79]. Estos animales están programados para una alteración de la sensibilidad a

la insulina y una resistencia central a la leptina [80]. Esta restricción calórica moderada

durante la gestación afecta la estructura y la función hipotalámica de la descendencia,

repercutiendo en su respuesta a condiciones de alimentación/ayuno [81]. Estos efectos

de programación podrían estar asociados con la ausencia del pico de leptina que se

produce durante la lactancia (leptin surge) [82]. De hecho algunas de las alteraciones

producidas por la restricción calórica moderada durante la gestación son revertidas con

la ingesta oral de dosis fisiológicas de leptina durante la lactancia [83–86].

La suplementación con leptina durante la lactancia en ratas tiene efectos protectores

contra el desarrollo de la obesidad y otras alteraciones metabólicas en la vida adulta [87,

88]. La suplementación oral con dosis fisiológicas de leptina durante la lactancia en

crías produce una disminución en la ingesta de alimentos, preferencias a favor del

consumo de hidratos de carbono frente a las grasas, reducción del peso corporal y

también la protección contra el sobrepeso en la edad adulta [89]. Además, esta

suplementación oral con leptina durante la lactancia mejora la sensibilidad a la insulina

y también protege contra la obesidad en la adultez [89–91].

Al contrario de lo que sucede con la restricción calórica materna durante la gestación, la

restricción calórica materna durante la lactancia en ratas se ha asociado con una mejora

de la sensibilidad a la insulina y la leptina en la descendencia [92]. Además la

restricción calórica materna durante la gestación programa la descendencia para un

mejor metabolismo de los lípidos y tener un peso corporal más saludable [93].

También se ha observado que existe una programación metabólica debido a la

sobrealimentación temprana, es decir en el periodo pre y postnatal se establece una

disposición permanente a la obesidad, hiperleptinemia, hiperglucemia, hiperinsulinemia

y un aumento en la resistencia a la insulina debido al exceso de energía durante estas

etapas [94]. Esta programación metabólica se puede originar por modificaciones

epigenéticas adquiridas por la dieta que alteran los patrones de metilación del ADN de

las regiones promotoras de los genes claves en la regulación de por vida de la ingesta de

alimentos y el peso corporal [95]. Los mecanismos epigenéticos de regulación génica

tales como la metilación de ADN, modificación de histonas y el ARN no codificante

(miRNAs), pueden ser alterados por la influencia del estado nutricional [95]. Estas

alteraciones son determinadas por el ambiente celular sin cambios en la secuencia del

ADN [96]. Estos cambios genéticos afectan el patrón de metilación, específicamente en

la zona del promotor de genes críticos para la regulación del metabolismo energético

[96]. Esta es la razón por la que la sobrealimentación puede ser un factor de riesgo

epigenético de programación de la obesidad y las complicaciones asociadas al síndrome

metabólico [96, 97]. De esta manera se ha podido identificar que la obesidad estará

determinada por la carga genética, sumada en gran medida a los factores ambientales,

entre ellos los cambios producidos durante el desarrollo en etapas tempranas de la vida

[98]. Estos cambios pueden dar lugar a una huella metabólica que genera alteraciones

fisiológicas y bioquímicas a largo plazo con sus consecuencias para la salud a largo

plazo [98].

1. Introducción

11

Por ejemplo, se ha descrito en ratas que están lactando a sus crías y que durante la

lactancia consumen una dieta de cafetería, existen efectos duraderos en el metabolismo

de sus crías. Estos efectos no están asociadas con un mayor peso corporal pero sí con

una mayor acumulación de grasa, de forma similar al fenotipo “falso delgado” [99].

Además, un corto período de exposición a una dieta de cafetería en las crías jóvenes de

rata, es suficiente para alterar la respuesta metabólica en condiciones de

alimentación/ayuno en el tejido adiposo blanco, y por lo tanto induce una acumulación

de grasa corporal exacerbada y un aumento del riesgo metabólico, sin efectos aparentes

sobre el peso corporal [100].

1.4. El tejido adiposo

Como se ha comentado anteriormente, el metabolismo energético se mantiene en

equilibrio mediante un complejo sistema homeostático en el que participan múltiples

tejidos y órganos [101]. Por consiguiente, algún defecto adquirido o heredado en

cualquier parte de este complejo sistema puede conducir al desarrollo de varios

trastornos metabólicos, como la diabetes mellitus tipo 2, la obesidad y el síndrome

metabólico [101]. En la regulación metabólica, el tejido adiposo desempeña un papel

muy importante porque tiene la capacidad para almacenar el exceso de lípidos,

protegiendo a los demás tejidos y órganos de los efectos nocivos de la acumulación de

grasa y también porque secreta una variedad de hormonas que coordinan la respuesta

metabólica en los tejidos y órganos en todo el cuerpo [101].

El tejido adiposo puede clasificarse en tejido adiposo blanco, tejido adiposo marrón y

adipocitos beige o brite (del inglés brown in white) [102]. La característica principal del

tejido adiposo blanco es almacenar el exceso de energía en forma de triglicéridos en una

gran vacuola lipídica en su interior. El tejido adiposo marrón presenta muchas

mitocondrias y disipa la energía química en forma de calor a través de los altos niveles

de la proteína desacoplante 1 (UCP1) para contrarrestar la hipotermia y la obesidad

quemando lípidos principalmente [102, 103]. Su red de vascularización y los citocromos

en sus mitocondrias son los responsables de su color oscuro [103]. En términos

fisiológicos, el aumento del tejido adiposo marrón podría ser útil en la prevención de la

obesidad, ya que permite que la energía se disipe en forma de calor sin producir ATP, lo

que protegería contra el desarrollo de obesidad [104]. Los adipocitos beige también

tiene características termogénicas por la expresión de UCP1 que puede estar estimulada

por el estrés, el frío o los agonistas selectivos de receptores β-3 adrenérgicos que imitan

el estrés por frío [102]. La función termogénica del tejido adiposo BAT y los adipocitos

beige también tendrían potencial aplicación terapéutica en las enfermedades

metabólicas asociadas a la obesidad [102, 105].

1.4.1. Adipogénesis

El adipocito, es la célula encargada de secretar hormonas y administrar los lípidos

corporales. El correcto tamaño y la cantidad de los adipocitos presentes en un

organismo determinan la capacidad para almacenar el exceso de nutrientes de forma

segura y sin sobrecarga metabólica.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

12

La adipogénesis es el proceso mediante el cual las células madre precursoras se

diferencian en adipocitos maduros (Revisado en [106]). Se ha demostrado que un

miembro de la superfamilia de receptores nucleares, el receptor gamma activado por el

factor proliferador de peroxisoma (PPARγ), actúa como el regulador principal de la

adipogénesis [104, 107]. Las proteína (C/EBPs, "CCAAT/enhancer-binding proteins")

α, β y son proteínas implicadas en el proceso de regulación en el inicio la adipogénesis

[106]. Por otro lado, la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4), adiponectina y la

ácido graso sintasa (FAS) son caracteristicos en la formación y maduración de los

adipocitos [106]. El complejo mecanismo de la adipogénesis da como resultado el

desarrollo del tejido adiposo y a su vez contribuye en el control de la homeostasis

energética sistémica [108]. El tejido adiposo blanco puede almacenar el exceso de

lípidos hasta un cierto grado; de no ser así, el exceso de lípidos se depositaría en otro

lugar, con efectos potencialmente nocivos [109].

La diferenciación de los adipocitos, así como la lipogénesis y la lipólisis están

modulados por la maquinaria de la división celular [110]. Los reguladores del ciclo

celular responden a las señales intra y extracelulares, estas señales influyen sobre la

actividad de los reguladores centrales para controlar la progresión a través del ciclo

celular y aseguran los diferentes puntos de control para la proliferación celular [111].

Las señales positivas, como los factores de crecimiento, aumentan la actividad de las

ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas (Cdks) mientras que las señales negativas

como el daño al ADN, generalmente disminuyen o bloquean la actividad [111]. Cuando

hay daño del ADN, las células deben ser capaces de repararlo si es posible o prevenir la

división celular si no es posible [111]. La proteína supresora de tumores p53 es clave en

la respuesta al daño del ADN, ya que trabaja en múltiples niveles para asegurar que las

células no transmitan su ADN dañado a través de la división celular [111, 112].

Primero, detiene el ciclo celular en el punto de control G1 al activar la producción de las

proteínas inhibidoras de Cdk (CKI) [111, 112]. Las proteínas CKI se fijan a los

complejos Cdk-ciclina y bloquean su actividad, ganando tiempo para la reparación del

ADN [111, 112]. La segunda función de p53 es activar las enzimas de reparación del

ADN [111, 112]. Si el daño al ADN no es reparable, p53 desempeñará su tercera

función, activar la muerte celular programada para que el ADN dañado no sea

transmitido [111, 112].

Tras la activación del mitógeno, CDK4/6 y CDK2, con las ciclinas de tipo D y E,

respectivamente, fosforilan las proteínas del retinoblastoma (pRB), p107 y p130,

liberando así los factores de transcripción E2F y permitiendo la transcripción de genes

necesarios para la transición de G1/S y para la síntesis de ADN [111, 112]. CDK2 y

CDK1, con las ciclinas tipo A y tipo B, respectivamente, aseguran la progresión a las

fases G2 y M [111, 113]. Para evitar la proliferación de células no saludables, varios

puntos de control de calidad activan el arresto del ciclo celular para permitir la

reparación de los defectos identificados o para prevenir la multiplicación de las células

dañadas [113, 114].

Un paso inicial del proceso de adipogénesis es el reingreso al ciclo celular del

preadipocito que estaba detenido por el gen Rb que codifica a la proteína del

1. Introducción

13

retinoblastoma (pRb), una proteína supresora de tumores que impide la proliferación

celular [115, 116]. Cuando la pRb se une al factor de transcripción E2F se desfosforila y

se impide la transcripción de sus genes diana. De esta manera se inhibe la progresión del

ciclo celular antes de la entrada en mitosis [115, 116]. Pero al unirse con las enzimas

quinasas dependientes de ciclinas (Cdk), este complejo hiperfosforila la pRb y se activa

la progresión del ciclo celular de G1 a la fase S [115, 116]. Y justo antes que el

preadipocito entre en estado de diferenciación terminal, Rb vuelve a un estado

hipofosforilado, secuestrado por el factor de transcripción E2F haciendo que las células

salgan permanentemente del ciclo celular [115, 116]. El preadipocito que entra en un

estado terminal diferenciado sufre una inducción a la etapa de diferenciación mediada

por los dos factores de transcripción más importantes para el proceso de diferenciación

C/EBPα y el receptor nuclear PPARγ [117]. La implicación de la proteína del

Retinoblastoma en la adipogénesis fue descrita por primera vez en nuestro

laboratorio[118, 119], y también se describió su potencial impacto en las alteraciones de

la obesidad [120].

1.4.2. Hiperplasia e hipertrofia del adipocito

La distribución de la grasa corporal varía entre individuos, pero es bien conocido que

las mujeres suelen tener un mayor porcentaje de grasa corporal que los hombres [121].

Las diferencias en el número de receptores hormonales, y en las concentraciones

plasmáticas de leptina, contribuyen a las diferencias de género en la distribución de la

grasa corporal [122]. Este porcentaje de grasa corporal se puede ver reflejado en una

mayor hipertrofia de los adipocitos [121]. Además las personas obesas tienen un

número total de adipocitos más alto, y esto se puede apreciar ya en la obesidad infantil

[123].

Los preadipocitos están localizados en los espacios perivasculares que rodean los

pequeños vasos del tejido adiposo, pero los preadipocitos derivados del tejido adiposo

subcutáneo tienen una mayor capacidad de proliferación en comparación con los

preadipocitos viscerales [124]. Igualmente, el número de adipocitos depende del

equilibrio entre la adipogénesis y la muerte celular. En la obesidad suele ser evidente el

aumento excesivo de la grasa corporal total en virtud de la hiperplasia e hipertrofia de

los adipocitos [121, 125].

La alteración en la estructura morfológica del tejido adiposo, también altera su función,

esto se relaciona con graves trastornos metabólicos, incluyendo la propia obesidad, el

síndrome metabólico, la lipodistrofia y la caquexia [126]. La falla del tejido adiposo se

inicia cuando se alteran algunos de los factores clave implicados en la lipogénesis como

PPAR , FASN, SCD1, y FABP4 [127]. Por otro lado, los mecanismos implicados en la

capacidad de expansión del tejido adiposo también se ven afectados, hipertrofia

predominante a través de un aumento de la apoptosis y una disminución de la

adipogénesis y la angiogénesis [127].

La hipertrofia de los adipocitos no es solo una característica del tejido adiposo en la

obesidad, también se asocia con el desarrollo de la obesidad asociada a una patología

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

14

[128]. En particular, la hipertrofia dada por el crecimiento excesivo y anormal del

tamaño de los adipocitos se correlaciona con la alteración de la homeostasis de glucosa,

la dislipidemia y la inflamación [129]. Esto sugiere que la inflamación y la liberación de

adipocinas determinan gran parte de las consecuencias patológicas de la obesidad [129].

Por el contrario, en individuos obesos sin enfermedad metabólica se encuentran

adipocitos de tamaño más pequeño, a esto se le considera una "obesidad

metabólicamente sana" en comparación con la obesidad de individuos que presentan

complicaciones metabólicas [130]. Los adipocitos grandes son más deletéreos, en la

medida en que han perdido la capacidad para expandirse, limitando así el

almacenamiento de ácidos grasos en el tejido adiposo y la consecuencia es que

aumentan los niveles de lípidos circulantes [130]. También se ha podido observar que

los adipocitos viscerales de individuos obesos con una mayor alteración metabólica se

caracterizan por tener una alta proporción de adipocitos con hipertrofia [131]. Si se

comparan a dos personas con obesidad y que tienen el mismo peso, se predice que

aquella que presenta una “obesidad metabólicamente sana” tiene un mayor número de

adipocitos en comparación con la persona obesa que presenta resistencia a la insulina y

que presenta una mayor hipertrofia de los adipocitos. Esto sugiere que la hipertrofia de

los adipocitos está mucho más asociada con alteraciones metabólicas que la adiposidad

con hiperplasia [130].

En condiciones normales de balance energético los adipocitos blancos tienen una gota

lipídica grande, que abarca la mayor parte de su citoplasma y el núcleo está localizado a

un lado de la célula [131]. En contraste, en condiciones de un consumo excedente de

energía, los adipocitos se vuelven hipertróficos y el tejido adiposo presenta hiperplasia a

fin de aumentar su capacidad de almacenamiento lipídico, manteniendo así los niveles

de glucosa en sangre y los de ácidos grasos por debajo de los niveles tóxicos [131]. No

obstante, los adipocitos tienen un punto de saturación en que pierden la capacidad de

almacenar más lípidos [131, 132], y cuando los adipocitos están completamente llenos

de lípidos, expresan señales de estrés [131, 132]. Se ha demostrado que los adipocitos

hipertróficos con gotículas de lípidos grandes y uniloculares han reducido la capacidad

para la absorción de la glucosa, aumentan la respuesta proinflamatoria y desarrollan

resistencia a la insulina [133]. Esta resistencia a la insulina se asocia con el déficit de la

movilización a la membrana plasmática de la proteína transportadora de glucosa tipo 4

(GLUT4) [133]. Por lo tanto, la capacidad de expansión limitada del adipocito y el

aumento en los lípidos circulantes son los principales contribuyentes del progresivo

deterioro metabólico sistémico [134]. El deterioro en los adipocitos de la absorción de

los ácidos grasos y el aumento de las tasas de lipólisis, dan como resultado un mayor

flujo de ácidos grasos hacia el hígado [134]. Esto conduce al síndrome del hígado graso

no alcohólico, que puede progresar a esteatosis hepática no alcohólica que implica

inflamación lobular y fibrosis [135]. El desarrollo de la enfermedad hepática crónica

progresiva está fuertemente asociadas con la enfermedad cardiometabólica [135].

1. Introducción

15

1.4.3. Metabolismo lipídico

El interés científico por el tratamiento del síndrome metabólico y las enfermedades

cardiovasculares, han favorecido el estudio y ayudado a entender la fisiología del

metabolismo lipídico incluyendo el efecto de la absorción intestinal de colesterol, el

metabolismo periférico de las partículas ricas en triglicéridos, el metabolismo hepático

de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y el papel de las lipoproteínas de alta

densidad (HDL) [136]. Los triglicéridos, los fosfolípidos y el colesterol ingeridos en la

dieta son absorbidos en los enterocitos intestinales, transportados hacia los tejidos a

través del sistema linfático por lipoproteínas transportadoras denominadas

quilomicrones (QM), estas lipoproteínas son de baja densidad y gran diámetro [137].

Absorción intestinal de lípidos

Los triglicéridos y el colesterol ingerido en la dieta, primero deben ser hidrolizados por

acción de varias lipasas en el seno del lumen intestinal para poder ser absorbidos

principalmente en el yeyuno proximal [138]. Los ésteres de colesterol serán

hidrolizados a colesterol libre y ácidos grasos libres [138]. Una vez hidrolizado son

absorbidos y para ello deben ser solubilizados en micelas formadas con las sales biliares

[139]. La lipasa pancreática digiere los triglicéridos hasta ácidos grasos libres y

monoglicéridos, estos productos se transportan en forma de micelas al epitelio intestinal

donde son absorbidas a través de la membrana plasmática de los enterocitos [139, 140].

Allí se difunde en el retículo endoplasmático, donde son reesterificados de nuevo a

triglicéridos y posteriormente son empaquetados en los quilomicrones [141]. Los

quilomicrones se transportan por la linfa y de allí a la circulación sanguínea llegando a

los diferentes tejidos [140].

Catabolismo de partículas ricas en triglicéridos

Los quilomicrones transportan los triglicéridos absorbidos de la dieta y las lipoproteínas

de muy baja densidad (VLDL), transportan los triglicéridos provenientes del hígado

[142]. Estas lipoproteínas al llegar al torrente sanguíneo se unen a la superficie

endotelial de los capilares sanguíneos donde son sustratos de la lipoproteína lipasa

(LPL) [142]. Esta LPL es la enzima encargada de la hidrólisis de los triglicéridos, que

requiere como activador la Apo-CII que está presente en las VLDL [143]. Un potencial

inhibidor de la acción de la LPL es la angiopoyetina 4 (Angptl4), una proteína

plasmática que se activa en condiciones de ayuno e inhibe la actividad de LPL y,

presumiblemente, de la lipasa hepática (HL) y la lipasa endotelial (EL), promoviendo la

conversión de los dímeros activos de las lipasas en monómeros inactivos [144]. Las dos

lipasas EL y HL participan también en la hidrólisis de fosfolípidos y los triglicéridos de

las VLDL [145]. La LPL es sintetizada por los adipocitos y para volverse activa, se

debe someter a un proceso de maduración y ser transportada al endotelio de los vasos

sanguíneos [144]. Estos procesos dependen, al menos en parte, del factor de maduración

de la proteína lipasa 1 (LMF1) [144].

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

16

Lipoproteínas de baja densidad

Las LDL son partículas ricas en colesterol que son captadas por las células que, de ese

modo, se proveen del colesterol que requieren [146]. La hipercolesterolemia favorece el

desarrollo de la aterogénesis y como las LDL comprenden el 60-70% del colesterol total

sérico, son las principales lipoproteínas aterogénicas [147]. Un colesterol LDL

aumentado constituye un factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular [148]. La

Apo B-100 es su principal apolipoproteína [146, 149]. Por otro lado, cabe destacar la

Lipoproteína (a) Lp(a) que es sintetizada y secretada por el hígado e incluye una masa

lipídica de colesterol LDL y apo B-100 rodeada por una apoliproteína (a) [146, 149].

Lp(a) posee una relación 1:1 de apo(a) y apo B-100, y ambas apolipoproteínas se unen

por un enlace disulfuro [146, 149]. Lp(a) ha sido detectada en la pared arterial donde

parece ser retenida con mayor avidez que la partícula de LDL y también se han hallado

fragmentos de Lp(a) en ateromas humanos [150]. Todo esto indicaría que Lp(a)

atraviesa la barrera endotelial para acumularse dentro del espacio subendotelial y podría

sufrir diversas modificaciones que la harían más aterogénica [150, 151]. De hecho Lp(a)

oxidada ha sido encontrada en lesiones ateroscleróticas y más estrechamente asociada

con el engrosamiento de las capas íntima-media de la arteria carótida [150, 151].

Además los niveles plasmáticos elevados de Lp(a) oxidada están asociados con la

presencia y severidad del síndrome agudo coronario [151]. También, basados en la gran

homología existente entre Lp(a) y plasminógeno, se ha postulado que Lp(a) podría

interferir con el plasminógeno e inhibir de ese modo la lisis de los coágulos sanguíneos

[149]. Todas esas acciones convierten a la Lp(a) en un factor de riesgo independiente de

ECV [149]. Por último es necesario considerar que los niveles aumentados de los

triglicéridos con frecuencia se asocian con niveles disminuidos de colesterol HDL y con

la presencia predominante de partículas de LDL pequeñas y densas [152]. A estos tres

hallazgos (niveles altos de triglicéridos, niveles altos de LDL y niveles bajos de HDL),

se les considera la triada aterogénica y suelen encontrarse en personas con resistencia a

la insulina, diabetes tipo 2 y obesidad [152].

Lipoproteínas de alta densidad

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se caracterizan por ser las lipoproteínas más

densas y pequeñas del plasma, compuestas por 25% de fosfolípidos, 3% de triglicéridos,

4% de colesterol libre, 12% de ésteres de colesterol y un 50% de proteínas [153]. La

Apo-AI es la principal proteína de las HDL y constituye aproximadamente el 70% del

contenido proteico [154]. La Apo-AI se transforma en una partícula más esférica por

acción de la enzima lecitin-colesterol-aciltransferasa (LCAT) en una reacción donde el

colesterol libre se transforma en colesterol esterificado [155]. La partícula esférica se

considera una HDL madura, capta colesterol de células extrahepáticas y los esterifica

por acción de la LCAT [155]. De esta forma la HDL se carga de colesterol esterificado

y aumenta su tamaño [156]. Además, la HDL madura intercambia el colesterol

esterificado por triglicéridos con las lipoproteínas VLDL, LDL y los quilomicrones

[156]. La HDL madura recibe también fosfolípidos de la VLDL por medio de la

proteína transferidora de fosfolípidos (PLTP) [156]. La Apo-AI también puede liberarse

por la acción de la PLTP, mediante la fusión de dos partículas de HDL con la liberación

1. Introducción

17

subsecuente de esta proteína [156]. Finalmente la partícula de HDL llega al hígado y

descarga su contenido de colesterol esterificado [156]. Esto es seguido por el

desprendimiento de la HDL que al perder parte de su contenido ha reducido su tamaño y

su contenido de colesterol esterificado, y así retorna al torrente sanguíneo para iniciar un

nuevo ciclo [156].

Lipogénesis

La lipogénesis es el proceso de biosíntesis de ácidos grasos a partir de acetil-CoA,

también se suele considerar que incluye la formación de triglicéridos a partir de la unión

(esterificación) de tres ácidos grasos libres con un glicerol [157]. La síntesis ocurre

principalmente en el citoplasma de las células del tejido adiposo y el hígado [158].

Después de la ingesta de alimentos, el hígado absorbe nutrientes a través de la vena

porta y el exceso de carbohidratos se convierte en triglicéridos, mientras que en

condiciones de ayuno, este proceso lipogénico se reduce [159]. La ácido graso sintasa

(FAS) cataliza la síntesis de novo de los ácidos grasos en el hígado [160]. La proteína

de unión al elemento regulador del esterol (SREBP-1c) también juega un papel

importante para controlar la lipogénesis hepática [159]. En ayuno, la expresión del

ARNm del gen Srebf1 disminuye, resultando en cantidades reducidas de proteína

SREBP-1c, con las correspondientes disminuciones de la expresión de dianas activadas

por SREBP-1c, entre ellas el gen que codifica para FAS [159].

Los triglicéridos sintetizados de novo en el hígado se empaquetan en las VLDL que se

secretan a la circulación [161]. Una vez en la circulación, las VLDL entran en contacto

con la LPL en los capilares del tejido adiposo, músculo cardíaco y esquelético; estos

tejidos requieren cantidades importantes de ácidos grasos para almacenamiento o para

obtener energía [161].

Como se ha comentado anteriormente, la LPL participa de manera fundamental en la

captación de lípidos plasmáticos [161]. Por ejemplo, en la glándula mamaria, la síntesis

de LPL se induce durante embarazo y la lactancia, tal vez por los efectos de la

prolactina [162]. En el tejido adiposo marrón, la actividad de la LPL aumenta durante la

exposición al frío por una estimulación β-adrenérgica [163]. El estrés, tanto crónico

como agudo, disminuye la actividad de la LPL en el tejido adiposo blanco pero aumenta

la actividad LPL en el músculo cardíaco, esquelético y las glándulas suprarrenales; estos

cambios pueden estar mediados por catecolaminas [164]. Durante el ayuno, el aumento

de la actividad de la LPL proporciona una fuente complementaria de ácidos grasos

libres, lo que permite que el corazón mantenga su alto gasto energético [165]. Durante

la diferenciación de los adipocitos, la insulina aumenta la transcripción de genes de la

LPL al aumentar el nivel de ARNm de LPL y regulando la actividad de LPL a través de

mecanismos postranscripcionales y postraduccionales [161]. La glucosa también

aumenta actividad de la LPL en el tejido adiposo, además, la glucosa potencia el efecto

estimulante de la insulina pero no afecta el nivel de ARNm de la LPL [166].

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

18

Lipólisis

La liberación por el tejido adiposo de energía metabólica en forma de ácidos grasos está

controlada por una compleja serie de cascadas de señalización que resultan en la

activación de la lipólisis [167]. La lipolisis inicia con la movilización de las grasas,

mediante la hidrólisis secuencial de los triglicéridos almacenados en las gotas lipídicas

de los adipocitos [168]. Los triglicéridos se transforman en diglicéridos, luego en

monoglicéridos y finalmente resultan tres moléculas de ácidos grasos libres y una

molécula de glicerol utilizados como precursores esenciales para la síntesis de lípidos y

membranas, también como mediadores en procesos de señalización celular o como

sustratos energéticos [167]. La lipólisis es estimulada en los períodos de estrés

metabólico durante el ayuno o el ejercicio prolongado. El exceso de ácidos grasos

circulantes se relaciona con el deterioro de la acción de la insulina [169]. Es por esto

que el aumento en la lipólisis se asocia con la obesidad, y con el desarrollo de

resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2, la hipertensión y la aterosclerosis [169]. La

movilización de los ácidos grasos desde las reservas de triglicéridos en el tejido adiposo

requiere de las enzimas lipolíticas como la lipasa de triglicéridos (ATGL), la lipasa

sensible a hormonas (HSL) y la lipasa de monoglicéridos (MGL) [170]. La ATGL

(codificada por el gen Pnpla2) es una lipasa principalmente responsable de la hidrólisis

de los triglicéridos en el tejido adiposo, para generar diglicéridos y ácidos grasos de

cadena larga, su expresión es inducida por PPARα, glucocorticoides y el ayuno [171,

172]. La HSL (codificada por el gen Lipe) es una lipasa intracelular capaz de hidrolizar

triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos y ésteres de colesterol [173]. La MGL

(codificada por el gen Mgll) es una serina hidrolasa de 33 kDa, que cataliza la hidrólisis

de monoglicéridos, incluida la liberación de ácido araquidónico y glicerol [174].

1.5. Compuestos bioactivos en el tratamiento de la obesidad y enfermedades

metabólicas asociadas

La nutrición adecuada no solo debe proporcionar nutrientes para cumplir con los

requerimientos del metabolismo, también debe disminuir la promoción de muchas

enfermedades y sus factores de riesgo asociados, incluida la obesidad, contribuyendo a

mejorar la salud humana [175]. Gracias a la nutrigenómica, los conocimientos

nutricionales actuales comienzan a reflejar un cambio fundamental en la comprensión

de la regulación por la dieta a nivel genético, y su impacto en la salud, lo que resulta en

nuevas estrategias dietéticas [176]. En consecuencia, la industria alimentaria y

farmacéutica está desarrollando en el mercado alimentos basados en los extractos de

plantas o compuestos bioactivos con el fin de complementar de forma saludable una

dieta balanceada [177]. Además, debido a la baja tasa de éxito de los medicamentos

para el tratamiento de la obesidad, la industria farmacéutica está ampliando el estudio

del papel de los fitoquímicos de los alimentos y de algunos extractos de plantas para

desarrollar nuevos medicamentos en el tratamiento de la obesidad y muchos científicos

centran sus trabajos en los efectos de los fitoquímicos sobre los procesos de

adipogénesis y lipogénesis [178].

1. Introducción

19

A lo largo de los siglos, los seres humanos han encontrado en la naturaleza, la forma de

satisfacer sus necesidades de producción de alimentos, ropa, fragancias, y, no menos

importante, medicamentos [179]. Las plantas han formado la base de sistemas de

medicinas tradicionales que aún están en uso y que la industria farmacéutica ha

comercializado como medicamentos [179]. Los registros más antiguos del uso

terapéutico de los compuestos bioactivos se encontraron representados en tabletas de

arcilla en escritura cuneiforme de Mesopotamia (2600 a. C.) donde se evidencia el uso

del aceite de Commiphora (mirra), Glycyrrhiza glabra (regaliz), Cupressus

sempervirens (ciprés), y Papaver somniferum (amapola), los cuales todavía están en uso

hoy en día para el tratamiento de dolencias que van desde la tos y resfriados a

infecciones parasitarias e inflamación [179]. El papiro Ebers de medicina egipcia data

aproximadamente de 2900 a. C., donde se encuentra el registro farmacéutico egipcio de

más de 700 medicamentos [180]. El médico griego Dioscorides (100 a. C.) registró la

colección tratado con hierbas medicinales [179, 180]. "Deja que la comida sea tu

medicina y la medicina sea tu comida", esta frase fue citada por Hipócrates de Cos,

(460-370 a.C.) hace 2.500 años, él ya sabía que la alimentación tiene una influencia

decisiva en nuestra salud [181]. El médico, filósofo y poeta persa, Avicenna en el siglo

VIII contribuyo a las ciencias de la farmacia y la medicina a través de trabajos como el

Canon Medicinae [179].

La medicina tradicional china

La medicina tradicional China tiene registros milenarios donde se documenta el uso de

plantas medicinales Wu Shi Er Bing Fang (1100 a. C.) contiene 52 recetas, Shennong

Herbal (~ 100 a. C.) 365 recetas y Tang Herbal (659 a. C.) 850 recetas. La medicina

tradicional china, con una historia de aproximadamente tres mil años, ha formado un

sistema de diagnóstico de enfermedades y su tratamiento utilizando extractos de plantas

medicinales [182]. Durante la dinastía Han, (206 a. C) el primer libro herbario chino, el

“Shennong Bencao Jing”, enumera el uso de 365 plantas medicinales [182]. En este se

incluía plantas como ma-Huang, el arbusto que introdujo la efedrina en la medicina

moderna [180]. El tratamiento de las enfermedades por la medicina tradicional china

basado en el empleo de plantas y extractos vegetales dio origen al término chino de

medicina herbal [183]. En el siglo VII, en la dinastía Tang se elabora el popular tratado

de las hierbas naturales medicinales “Treatise on the Nature of Medicinal Herbs” [180].

En occidente el concepto de medicina herbal se conoce generalmente como fitoterapia

[184]. El concepto de fitoterapia lo propuso el médico francés Henri Leclerc, (1870-

1955), quien publicó en 1922 la primera edición del “Précis de phytothérapie”

("Manual de fitoterapia") [184–186]. La fitoterapia se define como la ciencia que

estudia la utilización de los productos de origen vegetal con finalidad terapéutica, ya sea

para prevenir, para atenuar o para curar un estado patológico [185]. El impacto positivo

de la medicina tradicional china en el tratamiento de diversas enfermedades ha

contribuido al desarrollo de la fisiología, la farmacología y la clínica moderna [180].

Hoy en día, el avance en el conocimiento de las propiedades de los fitoquímicos

presentes en las plantas, ha creado un renacimiento en la investigación de la nutrición y

la salud humana con el desarrollo de nuevos productos o medicamentos [180, 187]. Un

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

20

ejemplo del impacto positivo de la medicina tradicional china es el Premio Nobel de

Medicina concedido en 2015 a la doctora Tu Youyou, de la Academia de Medicina

Tradicional China, por sus aplicaciones en el tratamiento de la malaria [188]. El equipo

científico de la doctora Youyou demostró la actividad antimalárica en humanos de la

artemisinina, un extracto aíslado de la planta Artemisia annua [188]. Este

descubrimiento de los efectos positivos en el tratamiento de la malaria ha salvado

millones de vidas en todo el mundo [188].

Los compuestos bioactivos son sustancias químicas que se encuentran en plantas y

ciertos alimentos que influyen en los mecanismos fisiológicos y en la actividad celular

[189]. Estos compuestos naturales han sido evaluados por su potencial actividad

biológica, y su interés sigue en aumento, ya que poseen efectos beneficiosos para la

salud humana [190]. Históricamente se ha considerado la utilización de extractos

vegetales de plantas como fuentes naturales de agentes antimicrobianos para el

tratamiento de llagas, forúnculos, heridas, control de la diarrea y la conservación de

alimentos [191–194]. Estos extractos vegetales también son considerados como

nutricionalmente seguros y fácilmente degradables [195]. La medicina tradicional china

ha usado los aceites esenciales extraídos directamente de la corteza, flor, fruta, hoja,

semilla o raíz de una planta o árbol. Por lo general, se obtienen a través del proceso de

destilación, que separa el aceite esencial de los otros compuestos [196]. Los aceites

esenciales son aceites altamente concentrados que tienen un fuerte aroma, y a veces se

les llaman aceites aromáticos volátiles debido a su alta concentración de compuestos

aromáticos [197]. Estos aceites actúan como un mecanismo que protege a las plantas de

los insectos y les permiten adaptarse a su entorno, como están compuestos de moléculas

muy pequeñas, pueden penetrar en sus células, de aquí su efecto terapéutico a nivel

celular y los humanos podrían beneficiarse de este efecto terapéutico [198]. Los aceites

esenciales pueden tener beneficios antibacterianos o antimicóticos, muchos aceites de

manera tópica pueden ayudar a tratar afecciones de la piel, como quemaduras o cortes y

raspaduras. Otros pueden ayudar a estimular el sistema inmunitario, ayudar con el

insomnio y ayudar con la digestión [199].

Los compuestos bioactivos presentes de manera natural en los alimentos pueden

producir modificaciones epigenéticas, incluida la transferencia de microARN a nuestra

dieta y por tanto regula la expresión de genes en humanos [200]. Dentro de los

principales compuestos bioactivos en la dieta con potencial capacidad antioxidante están

algunas vitaminas (E, C y A), minerales (Se), compuestos fenólicos, flavonoides,

carotenoides, antocianinas, y otros compuestos bioactivos minoritarios capaces de

neutralizar los radicales libres [201, 202]. De esta manera los compuestos bioactivos

proporcionan beneficios para la salud más allá de la nutrición básica [200]. Cabe

resaltar que la mayor ingesta de los compuestos bioactivos, pueden aumentar la

diversidad microbiana intestinal, mejorar la función endotelial y mejorar la función

cognitiva [200, 203]. También se ha descrito el papel de los compuestos bioactivos en la

prevención de numerosas enfermedades como ECV, enfermedad coronaria, infarto

cerebral, hipertensión arterial, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma,

diferentes tipos de cáncer como gastrointestinal, próstata, mama, enfermedades

1. Introducción

21

neurodegenerativas, inflamatorias, oculares (degeneración macular asociada a la edad,

cataratas), obesidad, diabetes y osteoporosis [204].

El estrés oxidativo es causado cuando hay una sobreproducción de especies reactivas de

oxígeno y radicales libres [201] activando una cascada de reacciones que dañan las

proteínas, lipidos y particularmente al ADN, estas reacciones comprometen la función y

viabilidad celular [201]. Frente al efecto nocivo del estrés oxidativo, se han descrito

muchos beneficios para la salud del papel antioxidante de los compuestos bioactivos

[202] a través de diferentes mecanismos como el secuestro de radicales libres [205], la

inhibición de la producción de peróxido de hidrógeno [206], la activación endógena de

procesos fisiológicos de defensa como catalasa, superóxido dismutasa y quelación de

metales [207, 208]. Otros mecanismos biológicos de la acción antioxidante son la

modulación de la expresión genética [209], la activación de sistemas enzimáticos para la

destoxificación de cancerígenos de fase I y II [210, 211], la inducción de muerte celular

(apoptosis y supresión de la mitosis) [212], la protección del ADN [213], la modulación

del perfil lipídico [214, 215], la estimulación del sistema inmunitario [216], el efecto

antiinflamatorio [217] y la actividad antimicrobiana [218].

1.5.1. Ejemplos concretos de compuestos biactivos: Eugenol y cinamaldehído

Eugenol

El eugenol, que se encuentra principalmente en los cogollos de las flores secas de árbol

Syzygium aromaticum (clavo de olor) [219]. Los botones florales se recogen en la fase

de maduración antes de la floración, se secan hasta que se ponen marrones y son usados

para diferentes preparaciones culinarias y usados también, tradicionalmente durante

siglos, por sus propiedades medicinales [219]. Después de moler los clavos, se obtiene

el aceite esencial por destilación [219]. El aceite esencial del clavo es un líquido oleoso

de color amarillo pálido, contiene aproximadamente un 80% de eugenol, es un

compuesto fenólico muy volátil que le aporta el olor y el sabor característico al clavo de

olor [220]. El valor ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), o capacidad de

absorbancia de radicales libres de oxígeno, mide el potencial que tiene una muestra para

disminuir una cantidad determinada de radicales de peroxilo, ya que tienen una menor

reactividad que el radical hidroxilo y por ello, su vida media es mayor [221]. Si una

muestra analizada, tiene un valor ORAC alto, mayor será su capacidad antioxidante

[221]. El valor ORAC se expresa en micromoles de Equivalentes Trolox (ET) por cada

100 gramos de muestra analizada [221]. Se ha determinado que el valor ORAC del

clavo de olor es de 290.283 unidades [221]. La actividad antioxidante del eugenol ha

sido probada in vitro por la capacidad de absorción de radicales de oxígeno, y la

disminución de radicales hidroxilo (OH-), aniones superóxido (O2

-), y peróxido de

hidrógeno (H2O2) [222]. Se ha descrito que el eugenol es usado como conservante

alimentario por sus propiedades antioxidantes comparables con el butil hidroxitolueno

(BHT), un compuesto sintético comúnmente utilizado como conservante alimentario

[223]. El eugenol tiene también acción antimicrobiana [220], y es útil en el tratamiento

de dermatitis y afecciones de la piel [224]. Tiene propiedades antimicrobianas con un

mayor control frente a la Escherichia coli y ejerce también su capacidad antimicrobiana

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

22

sobre Staphylococcus aureus que provoca infecciones en la piel como el acné, y

Pseudomonas aeruginosa que causa neumonía [225]. El eugenol es ampliamente

aceptado como una solución confiable para aliviar el dolor de dientes y es un antiséptico

usado contra las infecciones orales [226, 227]. Así mismo, en el 2006 se demostró que

el eugenol tenía un efecto anestésico similar a la benzocaína, un anestésico tópico

comúnmente utilizado por los dentistas antes de la inserción de la aguja [228]. También,

se han demostrado sus propiedades antivirales [229], antiinflamatorias [230] y

anticancerígenas [231]. Varios estudios han demostrado su efecto antifúngico [232,

233]. En el 2015 se realizó un estudio para ver el efecto del eugenol frente a otros

tratamientos antifúngicos contra el hongo Candida albicans y se observó que el eugenol

puede ser eficaz como la nistatina, un medicamento comúnmente recetado para tratar las

infecciones por candidiasis [234]. Por otra parte también es usado en la fabricación de

numerosos productos cosméticos [235].

El eugenol puede disminuir la presión arterial mediante su interacción con los canales

de calcio celulares [220], así como de reducir los niveles de glucosa en sangre gracias a

un incremento de la sensibilidad a la insulina [220]. En un estudio en animales con

dietas ricas en grasa (HFD) se observó que la administración de eugenol por vía oral,

disminuyo significativamente los niveles de glucosa en plasma en un 31% y los niveles

de insulina en un 63%, en comparación con el grupo control alimentado con dieta rica

en grasa [236]. Así mismo se observó que el eugenol disminuyo la hiperglucemia a

través de la inhibición de la gluconeogénesis hepática [236]. La administración de

eugenol a ratas diabéticas demostró mejores niveles de las enzimas claves del

metabolismo de la glucosa y mejorando el peso corporal, por esta razón tiene efectos

positivos en el control de la diabetes [237]. El Eugenol ha mostrado tener efectos

beneficiosos al disminuir el % de la hemoglobina glicosilada (HbA1c), normalizando

los niveles de alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa

alcalina, creatina fosfocinasa (CPK) y gamma-glutamil transpeptidasa (GGT), las tasas

de bilirrubina total, creatinina, urea y ácido úrico [238]. El eugenol ha sido descrito

como un antidiabético por reducir la resistencia a la insulina y disminuir los niveles de

glucosa en sangre [238]. De esta manera, la suplementación dietética con el extracto de

clavo que contiene eugenol podría modificar beneficiosamente el metabolismo de la

glucosa y los lípidos y contribuir a la prevención de la hiperglucemia y el síndrome

metabólico [239]. Por esta razón las investigaciones del tratamiento oral con eugenol

han demostrado que podría ser un prometedor agente terapéutico para prevenir la

diabetes tipo 2 [236].

Cinamaldehído

La canela se considera una de las especias más antiguas utilizadas en la historia de la

humanidad. Durante miles de años ha sido utilizada para tratar muchos síntomas y

dolencias, ya sea en forma de extracto, licor, té o hierba, la canela ha proporcionado

alivio a las personas durante siglos [240]. El aceite esencial de la canela

(cinamaldehído) se obtiene de la destilación de la corteza de la planta Cinnamomum

zeylanicum [241]. Este aceite es un líquido amarillo pálido y viscoso que se compone

aproximadamente de un 90% de cinamaldehído que es el responsable del sabor y del

1. Introducción

23

olor característico de la canela [241]. Se ha determinado que el valor ORAC de la

Canela en polvo es de 131.420 unidades [221]. Muchos estudios en animales y humanos

han descrito la capacidad antioxidante y múltiples efectos beneficiosos del aceite de

canela [242], como agente antimicrobiano contra bacterias resistentes [243, 244], acción

inmunomoduladora en trastornos inflamatorios [240, 245, 246] anticancerígeno natural,

útil en la prevención y/o tratamiento del cáncer [247], cardioprotector en la enfermedad

cardíaca crónica aumentando el óxido nítrico o mejorando la agregación antiplaquetaria

en la circulación sanguínea [248].

En estudios in vitro, el cinamaldehído previene la diferenciación y la adipogénesis vía

PPAR en adipocitos 3T3-L1 [249], se ha descrito un cierto efecto anticancerígeno por

la inhibición del crecimiento neoplásico cuando se usa en altas concentraciones [250].

En un modelo animal de roedores se ha descrito que el aceite de canela puede ser usado

de manera segura en el tratamiento de la diabetes tipo 2 como antidiabético natural

[251]. Se ha descrito que mejora la absorción de la glucosa al aumentar la acción de la

insulina [252], mejora la vía de señalización de la insulina en el músculo esquelético

[253]. En un modelo animal de diabetes tipo 2 se administró el aceite de canela a dosis

de 25, 50 y 100 mg/kg durante 35 días y se observó una disminución en las

concentraciones séricas de la glucosa, los niveles plasmáticos de péptido C, los

triglicéridos, el colesterol total, el colesterol LDL, mientras que los niveles de colesterol

HDL aumentaron y se mejoró la resistencia a la insulina [254, 255]. También, se mejoró

la función en los islotes pancreáticos de las células B [255].

Un estudio con animales identifico el efecto anti-hiperglucémico y anti-obesidad del

tratamiento con cinamaldehído al encontrar una reducción significativa en la ingesta de

alimentos, una reducción significativa en la ganancia acumulada de peso corporal y un

aumento en la expresión del gen del receptor de insulina; también se encontró una mejor

tolerancia a la glucosa [256]. Particularmente, en el tejido adiposo se observó una

regulación positiva de genes relacionados con la oxidación de ácidos grasos [256]. La

administración oral con aceite de canela aumentó significativamente la expresión de la

proteína UCP1 en el tejido adiposo subcutáneo y redujo el peso corporal en ratones,

también se observó un efecto de marronización en adipocitos subcutáneos [257]. Y a

nivel hepático se observó que la suplementación oral con extracto de canela en ratas,

tiene un efecto hepatoprotector frente a la peroxidación de los lípidos y el daño hepático

[258].

Los estudios realizados en humanos demuestran que la suplementación de canela sería

capaz de mejorar significativamente el control de la glucosa en sangre de pacientes con

diabetes tipo 2 [259–261], mejorando los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c)

[262], también reduce la presión arterial sistólica y mejora la composición corporal en

pacientes con síndrome metabólico [263–269]. Los anteriores resultados sugieren que la

complementación de la alimentación con un extracto natural de canela puede reducir los

factores de riesgo asociados con la diabetes y las enfermedades cardiovasculares [263].

25

Efesios 1:7 “Dios es tan rico en gracia y bondad

que compró nuestra libertad con la sangre de su

Hijo y perdonó nuestros pecados."

2 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

2. Objetivos y Planteamiento Experimental

27

2. Objetivos y Planteamiento Experimental

Durante las últimas décadas, el sobrepeso y la obesidad se han convertido en un

problema alarmante de salud pública en los países que han adoptado un estilo de vida

occidental, que incluye tanto un estilo de vida sedentario como el consumo excesivo de

alimentos ricos en energía y pobres en micronutrientes [270, 271]. El aumento en la

prevalencia de la obesidad causa numerosas alteraciones metabólicas y comorbilidades

tales como resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, dislipidemia e hipertensión [272,

273].

La investigación científica busca constantemente nuevas moléculas que puedan usarse

como biomoléculas funcionales para el control de la obesidad y sus comorbilidades

[274, 275]. Los compuestos bioactivos de los alimentos y los aceites esenciales que se

encuentran en plantas aromáticas han recibido gran interés en los últimos años porque

se ha observado que tienen efectos beneficiosos para la salud humana [177, 276, 277].

El clavo de olor y la canela se han utilizado tradicionalmente por sus propiedades para

tratar numerosas condiciones de salud y como especias en la industria de alimentos

[278]. De hecho, se han atribuido diferentes propiedades a la canela como propiedades

antioxidantes, antiinflamatorias y antidiabéticas [240, 269, 278–280] (véase el apartado

1.5.1).

El cinamaldehído es el compuesto mayoritario del aceite esencial de la canela, y se ha

demostrado que tiene efectos antiadipogénicos [249], antihiperglucemiantes y

antiobesidad en ratones [256, 281]. El eugenol (EU), es el compuesto mayoritario del

aceite esencial del clavo de olor, sus efectos antidiabéticos se han descrito ampliamente

en la literatura [220, 236–238].

Por tanto nuestra hipótesis es que el cinamaldehído y el eugenol y quizá su

combinación podrían afectar a los mecanismos moleculares implicados en la

adipogénesis, por ejemplo afectando los niveles de expresión de genes claves del

metabolismo lipídico. Consideramos la posibilidad de que la administración de forma

conjunta de estos dos compuestos, uno con acciones descritas más antiadipogénicas

(CNA) y el otro con una acción más antidiabética (EU), podrían tener un efecto

sinérgico en el control de la obesidad.

Así, el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar el efecto de la administración

del cinamaldehído y el eugenol in vitro e in vivo, de forma individual para

caracterizar los mecanismos moleculares de sus efectos individuales en el control

de la adiposidad y de forma conjunta para estudiar un posible efecto sinérgico de

estos dos compuestos.

Para ello, nos planteamos los siguientes objetivos específicos:

Objetivo 1. Caracterización in vitro del efecto del eugenol y cinamaldehído y su

combinación en la expresión de genes claves implicados en el metabolismo lipídico

en el adipocitos maduro y durante la adipogénesis.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

28

Objetivo 2. Estudiar en animales adultos la capacidad del eugenol y el

cinamaldehído para contrarrestar el desarrollo de obesidad ante una dieta

obesogénica.

La presente tesis ha sido desarrollada en el grupo de investigación “Nutrigenomica y

Obesidad” en el Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología (LBNB)

de la Universidad de las Islas Baleares, perteneciente al Centro de Investigación

Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), dentro del

programa de doctorado de Nutrigenómica y Nutrición Personalizada, bajo la supervisión

del Prof. Dr. Andreu Palou y la Dra. Juana Sánchez. Para la realización de la presente

tesis, el doctorando, D. Alberto Ángel ha sido beneficiario de una comisión de estudios

de la Universidad Industrial de Santander, Colombia y una beca de la Fundación

Carolina-España. La investigación llevada a cabo para la realización de la presente tesis

forma parte del proyecto de investigación “AGL2015-67019-P, Agencia Estatal de

Investigación, MINECO/FEDER, EU”.

Objetivo 1. Caracterización in vitro del efecto del eugenol y el cinamaldehído y de

la combinación de ambos en la expresión de genes clave implicados en el

metabolismo lipídico en el adipocitos maduro y durante la adipogénesis.

Tarea 1.1. Análisis in vitro del efecto dosis/respuesta de los bioactivos (eugenol,

cinamaldehído, y la combinación de ambos) en el metabolismo lipídico en adipocitos

maduros.

Se realizó el cultivo de la línea celular 3T3-L1 y en la etapa de adipocito maduro, se

trataron con diferentes concentraciones de EU, CNA y la combinación de ambos

EU+CNA. Las concentraciones testadas fueron (10, 50, 100, 200, 400 μM) de EU, CNA

y EU+CNA. Las células control recibieron tratamiento con vehículo. El esquema del

diseño experimental se presenta en la Figura 2.1. Se realizó un test de viabilidad

(ReliablueTM

Cell Viability Reagent) y la determinación del contenido lipídico por

Tinción Oil-Red. Se recogieron las células después de los tratamientos, se aisló el

ARNm y se estudiaron los niveles de expresión de genes de interés. En concreto se

analizó la expresión de los genes lipogénicos (Srebf1, Pparg y Fasn), la expresión de

genes relacionados con la movilización de los lípidos (Pnpla2 y Lipe) y la oxidación de

los ácidos grasos (Cpt1b) y la expresión del gen del receptor de insulina (Insr).

2. Objetivos y Planteamiento Experimental

29

Figura 2.1. Esquema del diseño experimental en Adipocitos maduros descrito en la Tarea 1.1

Tarea 1.2. Análisis in vitro del efecto dosis/respuesta del eugenol, cinamaldehído y la

combinación de ambos en el metabolismo lipídico durante la diferenciación de células

3T3-L1.

Se trataron preadipocitos de la línea 3T3-L1 durante todo el proceso de diferenciación

con la dosis de 10 μM de EU, CNA y EU+CNA. Las células control recibieron

tratamiento con vehículo. Se recogieron muestras en diferentes tiempos. En concreto se

recogieron células a punto inicial (T0), y a los 2, 4, 6, 8 días de diferenciación (T2, T4,

T6 y T8 respectivamente). Además, se estudió el efecto dosis respuesta del tratamiento

durante la diferenciación con de EU, CNA y EU+CNA. Las dosis testadas fueron 10, 50

y 100 µM de EU, CNA y EU+CNA y aunque el tratamiento se realizó durante toda la

diferenciación se recogieron muestras solo a tiempo final (T8). El esquema del diseño

experimental se presenta en la Figura 2.2. Se realizó un test de viabilidad (ReliablueTM

Cell Viability Reagent) y la determinación del contenido lipídico por Tinción Oil-Red.

Se recogieron las células, en los puntos indicados anteriormente y se aisló el ARNm.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

30

Figura 2.2. Esquema del diseño experimental del tratamiento durante la diferenciación de

células 3T3-L1 descrito en la Tarea 1.2. (R= Recogida).

Tarea 1.3. En ambos estudios se realizó el análisis de la expresión de los genes

lipogénicos (Srebf1, Pparg y Fasn), la expresión de genes relacionados con la

movilización de los lípidos (Pnpla2 y Lipe) y la oxidación de los ácidos grasos (Cpt1b)

y la expresión del gen del receptor de insulina (Insr).

Los resultados obtenidos en el objetivo 1 se presentan en el capítulo 1.

Objetivo 2. Estudiar en ratas Wistar macho adultas la capacidad del eugenol y el

cinamaldehído para contrarrestar el desarrollo de obesidad ante una dieta

obesogénica.

Tarea 2.1. Estudiar el efecto de la administración oral eugenol, cinamaldehído y la

combinación de ambos en ratas Wistar macho de 4 meses de edad y alimentados con

una dieta obesogénica.

Ratas Wistar macho de 4 meses de edad fueron distribuidas en cinco grupos

experimentales:

CONTROL, ratas Wistar machos de 4 meses de edad alimentadas con una dieta

estándar, (n=5). Estas ratas recibieron PBS como vehículo.

WD, ratas Wistar macho de 4 meses de edad alimentadas con dieta obesogénica

comercial (western diet), rica en grasas y azúcares simples (n=5). Estas ratas

recibieron PBS como vehículo.

2. Objetivos y Planteamiento Experimental

31

WD+EU, ratas Wistar macho de 4 meses de edad alimentadas con una dieta

obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral por sonda

40mg/kg/día de eugenol (n=5).

WD+CNA, ratas Wistar macho de 4 meses de edad alimentadas con una dieta

obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral por sonda

250mg/kg/día de cinamaldehído (n=6).

WD+EU+CNA, ratas Wistar macho de 4 meses de edad alimentadas con una

dieta obesogénica comercial y que recibieron diariamente vía oral por sonda 40

y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído, respectivamente (n=4).

Este tratamiento se realizó durante 30 días. El esquema del diseño experimental se

presenta en la Figura 2.3. Se analizó diariamente la evolución del peso y la ingesta de

alimento. Se tomaron medidas de la grasa corporal al inicio y al final del estudio. En el

día 15 de experimentación se extrajeron muestras de sangre de la vena safena de los

animales en condiciones de ayuno. Al final del experimento, en el día 30, las ratas se

sometieron a eutanasia por decapitación con guillotina, se obtuvo sangre troncal y se

recogieron los tejidos de interés (hipotálamo, tejido adiposo inguinal, mesentérico,

retroperitoneal, epididimal, hígado y tejido adiposo marrón).

Figura 2.3. Esquema del diseño experimental descrito en la Tarea 2.1. Estudio del efecto de la

administración oral eugenol, cinamaldehído y la combinación de ambos en ratas Wistar macho

de 4 meses de edad y alimentados con una dieta obesogénica. (WD= Western diet, EU=

eugenol, CNA= cinamaldehído, Tto= Tratamiento).

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

32

Tarea 2.2. Análisis de parámetros sanguíneos de interés.

Se realizaron medidas bioquímicas para estudiar el estado metabólico de estos animales.

En concreto, se analizaron los niveles circulantes de glucosa, triglicéridos y ácidos

grasos libres de los diferentes grupos experimentales en condiciones de alimentación ad

libitum y tras un ayuno de 12 horas, y los niveles circulantes de colesterol medidos en

condiciones de alimentación ad libitum. Además analizamos los niveles circulantes de

hormonas claves implicas en el balance energético (leptina, insulina y ghrelina) en

condiciones de alimentación ad libitum y tras un ayuno de 12 horas. Finalmente, para

comprobar si había daño hepático por efecto de los diferentes tratamientos, se

determinaron los niveles de fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST) y

alanina transaminasa (ALT).

Tarea 2.3. Análisis morfométrico del tejido adiposo blanco retroperitoneal (rpTAB) e

inguinal (IngTAB).

Se ha medido el diámetro de los adipocitos en cortes histológicos de rpTAB e IngTAB,

para inferir el tamaño de los adipocitos.

Tarea 2.4. Analisis la expresión génica de genes implicados en el balance energético en

tejidos claves.

Se analizaron los niveles de ARNm de Lepr, Ghsr, Socs3, Stat3, Npy y Pomc en el

hipotálamo. En el hígado, se determinó la expresión de genes relacionados con la

captación de ácidos grasos (Cd36), lipogénesis (Srebf1, Fasn, Scd1), oxidación de

ácidos grasos (Ppara, Fgf21, Cpt1a, Pdk4), metabolismo de la glucosa (Gck) y

señalización de leptina e insulina (Insr, Irs1 y Lepr). En el tejido adiposo blanco

retroperitoneal se analizó la expresión de genes relacionados con la captación de ácidos

grasos (Lpl, Cd36,), captación y metabolismo de glucosa (Slc24a, Hk2), lipogénesis

(Srebf1, Pparg, Fasn), leptina, lipólisis y oxidación de ácidos grasos (Pnpla2, Cpt1b),

fisiología de las gotas lipídicas (Cidea) y señalización de insulina (Insr).

Tarea 2.5. Análisis de los niveles proteicos de UCP1 en tejido adiposo marrón. Se

analizó por western blot los niveles de UCP1 en tejido adiposo marrón.

Los resultados obtenidos en el objetivo 2 se presentan en el capítulo 2.

33

Hebreos 1:3 “Él es el resplandor glorioso de

Dios, la imagen misma de lo que Dios es y el

que sostiene todas las cosas con su palabra

poderosa. Después de limpiarnos de nuestros

pecados, se ha sentado en el cielo, a la derecha

del trono de Dios.”

3 MATERIALES Y MÉTODOS

3. Materiales y Métodos

35

3. Materiales y Métodos

3.1. Cultivo in vitro de la línea celular 3T3-L1

Para estudiar el efecto in vitro del tratamiento con eugenol (EU), cinamaldehído (CNA)

y (EU+CNA) sobre la adipogénesis y el metabolismo lipídico, se cultivaron células

3T3-L1 en pase 11. Para ello se siguieron las recomendaciones de la casa comercial

(ZenBio, Inc, Research Triangle Park, NC). Estas células 3T3-L1 son una línea celular

de fibroblastos embrionarios de ratón comprometida a diferenciarse en adipocitos. Se

cultivaron entre 4.000–5.000 células/cm2 en placas de 24 pocillos con 500 µL de medio

3T3-L1 Preadipocyte Medium (ZenBio, Inc). El cultivo celular se mantuvo a 37 °C y

10% de CO2. Después de la siembra de la placa las células se verificaron diariamente

hasta la confluencia completa (día -2). Tras 2 días de expansión clonar (día 0), se indujo

la diferenciación durante dos días usando un medio compuesto de DMEM (Dulbecco's

Modified Eagle's medium), 5 µg/mL de insulina, 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL

de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 5 mL de piruvato de sodio, 0,5 µmol/L de

dexametasona y 0,5 µmol/L de isobutilmetilxantina. Además a partir de día 0 se matuvo

el cultivo a 37ºC y 8% de CO2. Día 2, se cambió a un medio de mantenimiento, que

consitía en un medio compuesto de DMEM, 5 µg/mL de insulina, 10% de suero fetal

bovino, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 5 mL de piruvato de

sodio. Durante todo el cultivo se cambió de medio cada dos días.

Reactivos:

- DMEM – D5796 (Dulbecco's Modified Eagle's medium) (Sigma)

- Penicillin-Streptomycin (Sigma)

- Insulin human (Sigma)

- Dexamethasone (Sigma)

- 3-Isobutyl-1-methylxanthine (Sigma)

- FBS (Fetal Bovine Serum) (GIBCO)

- Sodium pyruvate (Sigma)

- 3T3-L1 Preadipocyte Medium (ZenBio, Inc)

3.1.1. Tratamientos experimentales In vitro

En el caso de adipocitos maduros se trataron durante 24 horas con diferentes

concentraciones (10, 50, 100, 200, 400 μM) de EU, CNA y EU+CNA. En el estudio de

los efectos durante la diferenciación se recogieron células a diferentes tiempos (T2, 4, 6

y 8) de células control o células tratadas con 10 µM de EU, CNA y EU+CNA y a

tiempo final (T8) células control y tratadas con 10, 50 y 100 µM de EU, CNA y

EU+CNA desde día 0 de diferenciación. En el caso del grupo control, se utilizó el

mismo volumen de medio de cultivo DMEM.

Reactivos:

- Eugenol ReagentPlus®, 99% (Sigma)

- Trans-Cinnamaldehyde, 99% (Sigma)

- DMEM – D5796 (Dulbecco's Modified Eagle's medium) (Sigma)

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

36

3.1.2. Tinción oil red en cultivos celulares

Para determinar el efecto de los diferentes tratamientos sobre la acumulación de los

lípidos en las células 3T3-L1, se realizó la coloración oil-red. Este colorante tiñe

específicamente los triglicéridos en la célula con una coloración rojiza. Las células

tratadas previamente con las diferentes dosis de eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y

el tratamiento combinado (EU+CNA), fueron lavadas dos veces con 500 μL por pocillo

de solución salina tamponada con fosfato (PBS celular), se fijaron con 500 μL de

formaldehído al 10% durante 10 min. Se descartó el formaldehido y se agregó 500 μL

de formalina fresca y se incubó por 1 h. Se retiró la formalina con una pipeta. Se

realizaron dos lavados con 500 μL de agua MilliQ. Se incubaron las células con 500 μL

de isopropanol al 60% durante 5 min. Se descartó el isopropanol y se secó cada pocillo

con ayuda de un secador de pelo. Se añadió 1 mL de solución de trabajo oil-red durante

10 min. Se descartó la solución de trabajo y se realizaron cuatro lavados con 500 μL de

agua MilliQ. Se descartó el agua y se colocó 250 μL de agua MilliQ para poder tomar

las fotografías en el microscopio. Después de realizar las fotografías, se descartó el agua

y se colocó 1 mL de isopropanol al 100% durante 10 min con agitación suave. Se

pipeteo el isopropanol varias veces arriba y abajo para asegurar que todo el oil-red

estuviera en la solución. El contenido de cada pocillo se transfirió a un tubo eppendorf

de 1,5 mL y después a una placa de ELISA donde se midió la densidad óptica a 500 nm

utilizando 100% de isopropanol como blanco.

Reactivos:

- Oil-red Stock: 0,35 g de oil-red en 100 mL de Isopropanol. Agitar durante toda la

noche, luego filtrar con un filtro de 0,2 μm y almacenar a temperatura ambiente.

- Solución de trabajo oil-red. 6 mL de la solución Stock oil-red con 4 mL de agua

doblemente destilada.

- Formalina al 10% (Merck)

- Isopropanol al 100% (Merck)

- Isopropanol al 60% 6 mL de isopropanol al 100% con 4 mL de agua doblemente

destilada.

3.1.3. Determinación de la viabilidad en cultivos celulares

Para determinar la viabilidad celular, se usó el ReliablueTM

Cell Viability Reagent

ATCC®. Este es un reactivo que se adiciona al cultivo celular para la evaluación de la

viabilidad celular y el metabolismo en las células vivas. Las células viables reducen

inicialmente el reactivo azul oscuro no fluorescente en un producto rojo altamente

fluorescente que se puede cuantificar con un lector de placas. Las células no viables o

sólo el medio de cultivo celular no reducen el reactivo, por lo que no generan cambios

de color. Existe una fuerte relación lineal entre la señal colorimétrica y el número de

células viables presentes. Debido a que no se requiere lisis celular, después de realizar

un ensayo con el reactivo ReliablueTM

las células se pueden usar para otras aplicaciones

posteriores.

3. Materiales y Métodos

37

Para ver la viabilidad celular en relación al efecto de diferentes dosis del tratamiento de

EU, CNA y el tratamiento combinado (EU+CNA), en el caso de adipocitos maduros se

trataron durante 24 horas con diferentes concentraciones (10, 50, 100, 200, 400 μM) de

EU, CNA y EU+CNA. En el estudio de los efectos durante la diferenciación se

recogieron células a tiempo final de células tratadas con 10, 50 y 100 µM de EU, CNA

y EU+CNA durante toda la diferenciación. Se sembraron células en una placa de 96

pocillos siguiendo el protocolo explicado en el apartado 3.1. Para realizar el test de

viabilidad, en una cabina de bioseguridad, se agregaron 10 μL del reactivo ReliablueTM

a cada pocillo con una pipeta multicanal de 8 canales. Se realizó una agitación

suavemente para asegurar una dispersión pareja del reactivo. Se devolvió la placa a la

incubadora de cultivo celular. Se registró la absorbancia usando un espectrofotómetro

para placas de ELISA (Sunrise de TECAN). El reactivo es visualmente azul oscuro y el

control positivo indica muerte celular. Como control positivo se utilizó pocillos de

células tratadas con el detergente Triton X-100 para inducir la muerte celular. También

se usó un control negativo, correspondientes a células tratadas sólo con el vehículo.

También se realizó una prueba para descartar la interacción entre los compuestos

utilizados como tratamiento y el reactivo ReliablueTM

. Las lecturas más altas sugieren

baja citotoxicidad, mientras que las bajas lecturas sugieren alta citotoxicidad.

Reactivos:

- Línea celular adipocitos 3T3-L1 (ZenBio, Inc)

- Placas para cultivo celular de 96 pocillos (Costar™)

- Pipeta multicanal 8 canales, 50-300 μL (biopette plus)

- Kit Reliablue™ Cell Viability Reagent (ATCC®)

3.2. Experimentación Animal

La presente tesis doctoral cuenta con la aprobación del Comité de Bioética de la

Investigación de la Universidad de las Islas Baleares (Número de Resolución 7916,

Octubre 2015). Además se siguió el protocolo y las recomendaciones generales para el

uso y cuidado de animales de laboratorio.

Para los experimentos con animales se utilizaron machos de ratas albinas Wistar de 4

meses. Durante el periodo de experimentación los animales se mantuvieron en el

estabulario de la Universidad de las Islas Baleares (UIB) con un ciclo de 12 h de luz y

12 h de oscuridad y aclimatados a una temperatura constante de 22 °C. Los animales

estuvieron con acceso libre a agua, bajo condiciones de alimentación ad libitum o

ayuno, dependiendo el día de experimentación. Se separaron en cinco grupos de

experimentación, el grupo control se alimentó con una dieta comercial estándar y los

otros cuatro grupos se alimentaron con una dieta obesogénica comercial. Diariamente se

registraron el peso corporal y la ingesta de alimentos.

3.2.1. Composición de la dieta

Los animales del grupo control se alimentaron con una dieta normolipídica comercial

estándar (Pienso A04, Panlab). La composición de esta dieta era: 3,3 kcal/g, con 73%

de las calorías procedentes de carbohidratos, 8% de grasa y 19% de proteínas.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

38

En el caso de los animales alimentados con una dieta obesogénica, se usó para la

alimentación una dieta comercial, rica en grasas y azúcar, en concreto la dieta western

diet D12079B de Research Diets. La composición de esta dieta era: 4,7 kcal/g, con 43%

de las calorías procedentes de carbohidratos, 41% de grasa y 17% de proteínas.

A) Dieta Normolipídica B) Dieta Obesogénica

Figura 3.1. Imagen de las dietas usadas en el experimento. A). Dieta normolipídica comercial

estándar (Pienso A04, Panlab). B. Dieta comercial obesogénica, (western diet D12079B,

Research Diets). Fuente: https://www.bio-serv.com/product/S3823P.html https://www.bio-

serv.com/product/HFPellets.html.

Dietas

Tipo de dieta Normolipídica Obesogénica

Casa comercial Panlab Research Diets

Referencia Pienso A04 Western Diet Dl2079B

Descripción 8% Kcal de grasa 41% de grasa

% Carbohidratos (g/100g) 60.5 50

% Lípidos (g/100g) 2,9 21

% Proteínas (g/100g) 15,4 20

% Otros (Fibra, agua, minerales) 21,2 9

% (Kcal/100kcal) Carbohidratos 73 43

% (Kcal/100kcal) Lípidos 8 40

% (Kcal/100kcal) Proteínas 19 17

% Ácidos grasos Saturados 21,2 62,4

% Ácidos grasos

Monoinsaturados

24,8 30,7

% Ácidos grasos Polinsaturados 54 6,9

Kcal/g totales 3,3 kcal/g 4,7 kcal/g

Tabla 3.1. Ficha técnica de la composición nutricional de las dietas usadas en el experimento.

Dieta normolipídica comercial estándar (Pienso A04, Panlab) y dieta comercial obesogénica

(western diet, D12079B, Research Diets).

3.2.2. Tratamientos experimentales In vivo

Los animales fueron separados en cinco grupos: El primero es el grupo CONTROL

alimentado con una dieta estándar y con un tratamiento vehículo vía oral por sonda. El

segundo es el grupo WD: western diet, alimentado con una dieta obesogénica y con un

tratamiento vehículo vía oral por sonda. El tercer grupo EU: alimentado con una dieta

WD y con un tratamiento vía oral por sonda de 40mg/kg/día de eugenol (Sigma-

Aldrich). El cuarto grupo CNA: alimentado con una dieta WD y con un tratamiento vía

3. Materiales y Métodos

39

oral por sonda de 250mg/kg/día de cinamaldehído (Sigma-Aldrich). El quinto grupo

WD+EU+CNA: alimentado con una dieta WD y con un tratamiento vía oral por sonda

de 40+250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído (Sigma-Aldrich), respectivamente.

Grupo Dieta Tratamiento

CONTROL Normocalórica Vehículo (PBS 2,5 mL)

WD Western Diet Vehículo (PBS 2,5 mL)

EU Western Diet 40mg/kg/día de eugenol

CNA Western Diet 250mg/kg/día de cinamaldehído

EU+CNA Western Diet 40+250mg/kg/día de eugenol y

cinamaldehído Respectivamente.

Tabla 3.2. Distribución de los animales por grupos de experimentación con sus respectivas

dietas y sus respectivos tratamientos.

3.2.3. Composición corporal

Durante todo el experimento, se realizó un registro del peso corporal diario.

Periódicamente y sin necesidad de anestesia, también se determinó la composición

corporal usando la tecnología de resonancia magnética nuclear (RMN). Para estas

resonancias se usó el EchoMRI700™ (Echo Medical Systems), que mide directamente

de la grasa corporal total, la masa magra o libre de grasa y el agua corporal total en

animales vivos.

Figura 3.2. Imagen del Modelo EchoMRI700™ (Echo Medical Systems) usado para determinar

la composición corporal usando la tecnología de resonancia magnética cuantitativa en animales

vivos. Fuente: http://www.sunpointworld.com/pro_con_print.php?sn=90.

3.2.4. Extracción de sangre en ayuno

En el día 15 de experimentación se extrajo muestras de sangre de la vena safena de los

animales en condiciones de ayuno. Para ello se inmovilizaba al animal, se eliminó el

pelo de la zona y, tras desinfectar con etanol y aplicar vaselina, se realizaba la punción

en la vena safena con una aguja estéril y se recolectaba la sangre con una pipeta con

punta heparinizada o directamente en un tubo tipo eppendorf heparinizado. La sangre se

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

40

guardó por 1 h a 4°C y después se centrifugo a 1000g durante 10 min para obtener el

suero que finalmente se guardó a -20°C hasta su análisis.

3.2.5. Sacrificio y toma de muestras

Al final del experimento en el día 30 y durante las primeras horas del ciclo de luz, las

ratas se sometieron a eutanasia por decapitación con guillotina. Se obtuvo sangre troncal

y después se centrifugó a 1000g durante 10 min para obtener el suero que finalmente se

guardó a -20°C hasta su análisis. Además, se recogieron los tejidos de interés

(hipotálamo, tejido adiposo inguinal, mesentérico, retroperitoneal, epididimal, hígado y

tejido adiposo marrón), posteriormente se almacenaron a -80°C hasta su respectivo

análisis.

3.3. Análisis morfométrico del tejido adiposo blanco

Se recogieron trozos de diferentes tejidos durante el sacrificio de los animales para el

análisis morfométrico. Para preservar la integridad, las muestras de tejido se fijaron

inmediatamente por inmersión en paraformaldehído al 4% preparado en tampón fosfato

0,1 M pH: 7,4. Las muestras se fijaron en bloques de parafina para proporcionar

suficiente soporte externo durante los cortes. El agua del tejido se eliminó por

deshidratación con series de etanol: etanol al 50% por 30 min, etanol al 75% por 30

min, etanol al 96% durante 45 min a temperatura ambiente y luego, durante la noche a 4

°C; y por último, tres veces durante 60 min con etanol absoluto. Luego, la parafina se

fundió primero en un horno, a 60 °C durante la noche, las muestras de tejido se

aclararon en xileno (dos veces por 45 min) y finalmente se incluyeron en parafina en

botellas de plástico para obtener las secciones de tejido. A los tejidos fijados en parafina

se realizaron cortes de 5 μm de espesor usando un micrótomo y se montó en un

portaobjetos Super-Frost/Plus. Se realizó el análisis morfométrico en muestras de tejido

adiposo retroperitoneal y tejido adiposo inguinal. Se adquirieron imágenes con un

microscopio Zeiss Axioskop 2 equipado con una cámara digital AxioCam ICc3 y el

software AxioVision 40 V 4.6.3.0. Para el estudio morfométrico, se contó el número de

los de adipocitos y se resaltó el perímetro de cada uno.

Reactivos:

- 4% de Paraformaldehído (Sigma)

- Tampón de fosfato 0,1 M pH: 7,4, tampón de fosfato 0,2 M (3,25 g NaH2PO42H2O

(Panreac); 11,24 g de NaH2PO4 (Panreac) disueltos en 1 litro de agua destilada, pH

ajustado al 7,4 diluido en agua destilada 1: 1.

- Etanol 50%: 92 ml de agua destilada por cada 100 ml de etanol al 96% (Panreac)

- Etanol 75%: 28 ml de agua destilada por cada 100 ml de etanol al 96% (Panreac)

- Etanol 96% (Panreac)

- Etanol absoluto (Panreac)

- Xileno (Panreac)

- Parafina (Sigma)

- Software AxioVision 40V 4.6.3.0 (Carl Zeiss S.A.)

3. Materiales y Métodos

41

3.4. Extracción de ARN

La extracción de ARN de cultivos celulares, hígado, tejido adiposo retroperitoneal,

tejido adiposo marrón e hipotálamo del experimento in vivo, se realizó mediante el

método de extracción por Tripure (Roche) o usando el Kit de extracción E.Z.N.A® Total

RNA Kit 1, siguiendo las instrucciones de la casa comercial.

3.4.1. Aislamiento de ARN mediante E.Z.N.A® Total RNA Kit 1

Para la extracción de ARN de muestras de los cultivos celulares, hígado y tejido adiposo

retroperitoneal del experimento in vivo se utilizó el kit de extracción E.Z.NA® Total

RNA Kit 1 (Omega Bio-Tek). Se pesaron entre 0,100-0,150 g de tejido adiposo y 0,015-

0,020 g de hígado. Las muestras se homogenizaron en 700 µL de TRK lysis buffer, con

la ayuda de un homogenizador de aspas (modelo VDI 12, VWR), y se hizo una

centrifugación a 13000 g durante 5 min a temperatura ambiente, para eliminar la grasa y

restos celulares. Al sobrenadante resultante de la centrifugación se le añadió 700 µL de

etanol al 70% y se agitó con la pipeta y se mezcló con vórtex. Esta mezcla se introdujó

en las columnas del kit, y se centrifugó a 10000 g durante 1 min a temperatura

ambiente. Después se lavaron con 250 µL de RNA Wash Bufer I, y nuevamente se

centrifugó a 10000 g durante 1 min a temperatura ambiente. Las columnas, se trataron

con 35 µL de solución de DNAasa I, y se incubó durante 15 min a temperatura

ambiente. Posteriormente se lavaron las columnas con 250 µL de RNA Wash Bufer I,

proporcionado por el Kit, y se centrifugó a 10000 g durante 1 min a temperatura

ambiente. A continuación se realizaron dos lavados con 500 µL de RNA Wash Bufer II,

y se centrifugó a 10000 g durante 1 min a temperatura ambiente. Finalmente se

centrifugó las columnas con los tubos colectores vacíos a 20000 g durante 2 min, y una

vez secas las columnas se añadieron 30 µL de H2O libre de ARNAasas, y se centrifugó

las columnas a 20000 g durante 2 min para recuperar el ARN.

Reactivos:

- E.Z.N.A. TM

Total RNA Kit I (Omega Bio-Tek)

- Kit de RNase-free DNaseI (Omega Bio-Tek)- H2O libre de ARNasas (Sigma)

- Etanol al 96%

3.4.2. Aislamiento de ARN utilizando TriPure

Los hipotálamos se homogenizaron en 1 ml de TriPure en hielo mediante el uso de un

homogenizador de aspas (modelo VDI 12, VWR). Se hizo una precentrifugación a 12000

g durante 5 min a 4ºC, para eliminar la grasa y restos celulares. Al sobrenadante

obtenido se añadió 200 µL de cloroformo, se agitó durante 15 s y se incubó en frío

durante 15 min. Seguidamente, las muestras se centrifugaron a 12000 g durante 15 min

a 4ºC y se recogió la fase acuosa que contenía el ARN. Para precipitar el ARN se añadió

500 µL de isopropanol y se incubó durante toda la noche a -20º C. Posteriormente se

centrifugaron las muestras a 12000 g durante 10 min a 4ºC para obtener el precipitado

de ARN. El ARN precipitado se lavó con 1 ml de etanol al 75%. Las muestras se

agitaron con vórtex hasta despegar el precipitado, y se centrifugó a 7500 g durante 5

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

42

min a 4ºC. Finalmente, se eliminó completamente el etanol y se resuspendió el

precipitado de ARN con el volumen adecuado de agua libre de ARNasas.

Reactivos:

- H2O libre de ARNasas (Sigma)

- Cloroformo (Sigma)

- Isopropanol (Sigma)

- TriPure (Roche)

- Etanol absoluto (Panreac)

- Etanol al 75%

3.4.3. Cuantificación del ARN

El ARN extraído se cuantificó por espectrofotometría a 260 nm utilizando el

espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, que determina la concentración de ARN usando

2 µL de muestra con gran reproducibilidad y precisión. Este espectrofotómetro

determina el ratio 260/280 que indica la pureza del ARN determinando el grado de

contaminación por proteínas; concretamente, un ratio cercano a 2,0 es un indicador de

ARN puro, no obstante un ratio mayor a 2,0 indica contaminación por ADN. El ratio

260/230 indica el grado de contaminación por solventes orgánicos, un ratio entre 2,0 y

2,2, es un indicador de la pureza del ARN.

3.5. Análisis de RT-PCR a tiempo real

Con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes de estudio, primero se

realizó una retrotranscripción del ARN de las muestras de interés a ADN copia (ADNc),

posteriormente realizamos la amplificación y cuantificación.

3.5.1. Retrotranscripción

El objetivo de la retrotranscripción es la generación de una cadena de ácido

desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a partir de un ácido ribonucleico (ARN) de

cadena simple. 250 ng de ARN total en un volumen de 5 µL de agua libre de ARNasas

se desnaturalizaron a 65°C durante 10 min en un termociclador (Thermal Cycler 2720,

Applied Biosystems). Posteriormente se añadieron 7,5 µL de RT-mix que contenía para

cada tubo de reacción: 1,25 µL de Buffer 10x, 1,25 µL de MgC12 25 mM, 2 µL de

dNTPs 2,5 mM, 0,5 µL de hexámeros sintetizados al azar, 0,5 µL de inhibidores de

ARNasas 20 U/µL, 0,5 µL de transcriptasa reversa (MuLV RT, murine leukemia virus

reverse transeriptase) 50 U/µL y 1,5 µL de agua libre de ARNasas. Las condiciones de

la reacción de retrotranscripción fueron: 15 min a 20°C, 30 min a 42°C, un paso final de

5 min a 95°C y se mantuvo a 4°C.

Reactivos:

- Buffer 10x (Promega)

- H20 libre de ARNasas (Sigma)

- Inhibidores de ARNasas 20 U/µL (Applied Biosystems)

- MgCl2 25 mM (Promega)

3. Materiales y Métodos

43

- Hexámeros (Random hexamers 50 µM) (Applied Biosystems)

- Solución de dATP 100 mM (Invitrogen)

- Solución de dCTP 100 mM (Invitrogen)

- Solución de dGTP 100 mM (Invitrogen)

- Solución de dTTP 100 mM (Invitrogen)

- Transcriptasa reversa (MuLV RT, murine leukine virus retrotranscriptase) 50 U/µL

(Applied Biosys1erns)

3.5.2. PCR a tiempo real

La PCR a tiempo real se usó para medir los niveles de expresión de un conjunto de

genes en muestras de los cultivos celulares, en el hígado, tejido adiposo retroperitoneal

y en el hipotálamo. La expresión relativa de cada ARNm de interés se normalizó en

función de la expresión de un gen de referencia de expresión estable (housekeeping) que

se determinó para cada tejido y condición experimental. Se utilizaron 2 µL del producto

de RT (dilución 1/10). A la muestra se le añadieron 9 µL de PCR-mix que contiene: 3,1

µL de H20 libre de ARNasas, 0,45 µL de cada Primer (a una concentración de (5 µM) y

5 µL de un mix comercial Power Syber Green PCR Master Mix. En las Tablas 3.3 y 3.4

se detallan el listado de cebadores usados en el experimento in vitro (diseñados para

ratón, Tabla 3.3) y en el experimento in vivo (diseñados para rata, Tabla 3.4).

Cebadores usados en muestras del modelo in vitro

Símbolo Nombre genérico Cebadores forward (F)

y reverse (R)

Cpt1b Carnitina palmítoiltransferase lb, músculo /

Carnitinepalmitoyltransferasa lb, muscle

F: AAGGGTAGAGTGGGCAGAGG

R: GCAGGAGATAAGGGTGAAAGA

Fasn Ácido graso sintasa/ Fatty Acid Synthase F: TTCGGTGTATCCTGCTGTCC

R: TGGGCTTGTCCTGCTCTAAC

Insr Receptor de insulina/ Insulin Receptor F: TGGAGAGGTGTGCCCTGGTA

R: ATCTTCGGGTCTGGTCTTGAAC

Lipe Lipasa sensible a hormonas/ Lipase Hormone

Sensitive (HSL)

F: TCACGCTACATAAAGGCTGCT

R: CCACCCGTAAAGAGGGAACT

Pnpla2 Triglicélido lipase adiposa (ATGL)/ Patatin-

Like Phospholipase Domain Containing 22

F: TGTGGCCTCATTCCTCCTAC

R: AGCCCTGTTTGCACATCTCT

Pparg

Receptor gamma activado por el proliferador

peroxisomal/ Peroxisome Proliferator-

Activated Receptor gamma

F: AGACCACTCGCATTCCTTTG

R: TCGCACTTTGGTATTCTTGG

Srebf1c

Factor de transcipción de unión al elemento

regulador de esteroles 1/ Sterol Regulatory

Element Binding Transcription Factor 1

F: CAGCGGTTTTGAACGACA

R: GCCAGAGAAGCAGAAGAGAAG

Tabla 3.3. Secuencia de cebadores usados en PCR a tiempo real para el experimento in vitro.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

44

Cebadores usados en muestras del modelo in vivo

Símbolo Nombre genérico Cebadores forward (F) y

reverse (R)

Cd36

Molécula CD36 (receptor de la

trombospondina)/ CD36. (Molecule

Thrombospondin Receptor)

F:GTGGCAAAGAACAGCAGCAA

R:CCAACAGACAGTGAAGGCTCA

Cidea

Efector tipo A subunidad α de fragmentación de

ADN inductor de muerte celular/ Cell Death-

inducing DNA Fragmentation, α Subunit-like

Effector A

F:TCAGACCCTAAGAGACAACACA

R: CATTGAGACAGCCGAGGA

Cpt1a Carnitinapalmitoiltransferasa 1a, hígado/

Carnitine Palmitoyltransferase 1a, liver

F:CGAGAAGGGAGGACAGAGAC

R:GGACACCACATAGAGGCAGAA

Cpt1b Carnitina palmítoiltransferase lb, músculo /

Carnitinepalmitoyltransferasa lb, muscle

F: GCAAACTGGACCGAGAAGAG

R: CCTTGAAGAAGCGACCTTTG

Fasn Ácido graso sintasa/ Fatty Acid Synthase F: CGGCGAGTCTATGCCACTAT

R: ACACAGGGACCGAGTAAT

Gck Glucoquinasa/ Glucokinase F: CAACTGCGAAATCACCTTCA

R: AGCATTTGTGGTGTGTGGAG

Hk2 Hexoquinasa 2/ Hexokinase 2 F: CAGCCTAGACCAGAGCATCC

R: CGCATCTCTTCCATGTAGCA

lnsr Receptor de insulina/ lnsulin Receptor F: CTCCTGGGATTCATGCTGTT

R: GTCCGGCGTTCATCAGAG

Irs1 Sustrato 1 del receptor de la insulina/ Insulin

Receptor Substrate 1

F: GCAACCGCAAAGGAAATG

R: ACCACCGCTCTCAACAGG

Lep Leptina/ Leptin F: TCACACACGCAGTCGGTAT

R: AGGTCTCGCAGGTTCTCCAG

Lepr Receptor de la leptina/ Leptin Receptor F: AGCCAAACAAAAGCACCATT

R: TCCTGAGCCATCCAGTCTCT

Lpl Lipoproteina lipase/ Lipoprotein Lipase F: TATGGCACAGTGGCTGAAAG

R: TCTGACCAGCGGAAGTAGGAG

Npy Neuropéptido Y/ Neuropeptide Y F: TGGACTGACCCTCGCTCTAT

R: GTGTCTCAGGGCTGGATCTC

Pdk4 Piruvato deshidrogenasa quinasa, isozima 4/

Pyruvate Dehydrogenase Kinase, Isozyme 4

F: TCCTTCACACCTTCACCACA

R: AAAGAGGCGGTCAGTAATCC

Pnpla2 Triglicélido lipase adiposa (ATGL)/ Patatin-

like Phospholipase Domain Containing 2

F: TGTGGCCTCATTCCTCCTAC

R: AGCCCTGTTTGCACATCTCT

Pomc Proopiomelanocortina/ Proopiomelanocortin F: CCTGTGAAGGTGTACCCCAATGC

R: CACGTTCTTGATGATGGCGTTC

Ppara

Receptor alpha activado por el proliferador

peroxisomal/ Peroxisome Proliferator Activated

Receptor alpha

F: TGTCGAATATGTGGGGACAA

R: AAACGGATTGCATTGTGTGA

Pparg

Receptor gamma activado por el proliferador

peroxisomal/ Peroxisome Proliferator-activated

Receptor gamma

F: GATCCTCCTGTTGACCCAGA

R: TCAAAGGAATGGGAGTGGTC

Scd1 Esteroil-ConezimaA desaturasa 1/ Stearoyl-

Coenzyme A Desaturase 1

F: ATCCCCTCCTCCAAGGTCTA

R: CGGGCCCATTCATATACATC

S1c2a4

Transportador 4 de glucose (GLUT4)/ Solute

Carrier Family 2 Facilitated Glucose

Transporter, Member 4

F: GGCATGCGTTTCCAGTATGT

R: GCCCCTCAGTCATTCTCATC

Socs3 Supresor de la señalización de citoquinas 3/

Suppressor of Cytokine Signaling 3

F: ACTGAGCCGACCTCTCTCCT

R: CCCCTCTGACCCTTTCTTTG

Srebf1

Factor de transcipción de unión al elemento

regulador de esteroles 1/ Sterol Regulatory

Element Binding Transcription Factor 1

F: CCCACCCCCTTACACACC

R: GCCTGCGGTCTTCATTGT

Stat3

Transductor de señal y activador de la

transcripción 3/ Signal Transducer and

Activator of Transcription 3 (Acute-phase

Response Factor)

F: GCTGACCAATAACCCCAAGA

R: ACACCCTGAGTAGTTCACACCA

Ucp1 Proteína descaclopadora 1/ Uncoupling protein

1 (mitochondrial, Proton Carrier) (Ucp1),

F: ACACCTGCCTCTCTCGGAAA

R: TAGGCTGCCCAATGAACACT

Fgf21 Factor de crecimiento de fibroblastos 21/

Fibroblast Growth Factor 21

F: ACAGATGACGACCAGGACAC

R: AGGCTTTGACACCCAGGATT

Tabla 3.4. Secuencia de cebadores usados en PCR a tiempo real para el experimento in vivo.

3. Materiales y Métodos

45

La reacción de amplificación se realizó en un termociclador (StepOnePlusTM

) y

consistió en una desnaturalización de 10 min a 95°C (estas condiciones son específicas

para la activación de la polimerasa comercial), posteriormente siguieron 40 ciclos de

temperaturas: 15 s a 95°C (desnaturalización) y 1 min a 60°C (alineamiento y

elongación), por último una curva final de desnaturalización para verificar la pureza de

los productos obtenidos que consistió en: 15 s a 95°C, 1 min a 60 °C y 15 s a 95°C.

Al final de cada ciclo de amplificación se detectó la fluorescencia y se determinó el

ciclo en el que el incremento de fluorescencia empieza a ser exponencial, lo que se

conoce como ciclo umbral (Ct del inglés cycle threshold), con el programa específico

del instrumento (StepOne v 2.2.2). La expresión relativa se calculó con el método 2CT

.

Además se consideró el 100% la expresión génica del grupo control, y los demás se

expresaron en función de dicha expresión.

Reactivos:

- H20 libre de ARNasas (Sigma)

- Power Syber Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)

- Forward and reverse Primers (Sigma)

3.6. Western blot

El western blot es un método semicuantititativo para identificar proteínas específicas a

partir de una mezcla más compleja de estudio. Se emplea una electroforesis

desnaturalizante en geles de poliacrilamida (PAGE) en presencia de dodecilsulfato

sódico (SDS) para hacer una separación de las proteínas en función de su peso

molecular. Posteriormente las proteínas son transferidas a una membrana adsorbente

donde es detectada la proteína en estudio utilizando anticuerpos específicos para dicha

proteína. La membrana es escaneada y se realiza una cuantificación de las bandas.

3.6.1. Preparación de las muestras

Se homogenizaron muestras de tejido adiposo marrón con un homogeneizador (modelo

VDI 12, VWR) en hielo y en una dilución 1:5 (w:v), empleando buffer de lisis lx RIPA

(radioimmunoprecipitation assay buffer) más inhibidor de proteasas y fosfatasas

(Therrno Fisher, Rockford, USA). Después de la homogenización se hizo una

centrifugación a 7500 x g durante 2 min y a 4°C, el sobrenadante resultante se utilizó

para medir la concentración de proteínas.

El contenido total de proteínas se cuantificó con el kit comercial Pierce BCA protein

assay (Thermo scientific) usando Bovine Serum Albumin BSA en concentración de 2

mg/mL como estándar. Se añadieron 25 µL de las muestras y el patrón en una placa de

ELISA (96 pocillos) más 200 µL de WR (Working reagent) incluido en el kit. La placa

se cubrió para protegerla de la luz exterior y se incubó durante 30 min a 37ºC.

Finalmente se leyó la absorbancia a 562 nm en un espectrofotómetro para placas de

ELISA (Sunrise de TECAN).

Las muestras se prepararon diluyendo 10 μL de la muestra y 90 μL de RIPA en un

volumen final de 100 μL. Para la electroforesis, se tomó el volumen de muestra

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

46

necesario para cargar 5 μg de proteína, Se añadió 3 µL de tampón de carga Laemmli

Sample buffer, por cada 10 µg de proteína total, las muestras se calentaron 3 min en

agua en ebullición para desnaturalizar las proteínas.

Reactivos:

- HaltTM

Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail 100x (Thermo Fisher Scientific)

- RIPA Lysis buffer 1x: 50 mM Tris-HCL (Sigma) buffer pH:7,4, 150 mM NaCl

(Panreac), ácido desoxicolico 0,25% (Panreac), NP40 1% (Sigma) y EDTA 1 mM

(Merck)

- Pierce BSA Protein assay kit (Thermo scientific)

- Albúmina estándar (2 mg/mL) (Thermo scientific)

- Tampón de carga (Laemmli sample buffer): Tris-HCL 0.5 mM (Sigma) pH:6,8, SDS

5% (Sigma), glycerol 10% (Sigma), β-mercaptoetanol 5% (Sigma) y azul bromofenol

1% (Panreac)

3.6.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-

PAGE)

Para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética, se usaron geles de

policrilamida CriterionTM

TGXTM

Pre-cast de 4-15% (Bio-Rad), usando tris-glicina como

buffer de electroforesis. Se cargaron los pre-cast con 13 μL de muestra y 3 μL del

marcador de peso molecular bicolor (Bio-Rad). Las condiciones de la electroforesis

fueron 120 V, 90 min.

Reactivos:

- Gel de policrilamida Precast 4-15 % CriterionTM

TGXTM

, Bio-Rad

- Tris-glicina 0,5x pH=8.3: Tris-Base 0,025 M (Sigma), glicina 0,195 M (Sigma) y SDS

0,02% (Sigma)

- Marcador de peso molecular bicolor (Precision Plus ProteinTM Standard, Dual color)

(Bio-Rad)

3.6.3. Electrotransferencia

Una vez hecha la electroforesis se hizo una transferencia de las proteínas fraccionadas

hacia una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm, para ello se utilizó el sistema de

transferencia turbo Trans-blot (Bio-Rad), el proceso consiste en humedecer los papeles

de transferencia en la solución Trans-blot Turbo Transfer buffer, colocarlos en el fondo

del cassette electrodo (ánodo). A continuación la membrana de transferencia también se

humedeció con la misma solución y se colocó sobre la parte superior de la pila

humedecida de papeles dentro del cassette, después el gel se colocó sobre la membrana.

Finalmente se colocaron sobre el gel los papeles de transferencia humedecidos en

solución Trans-blot Turbo Transfer buffer. Se colocó el cassette (cátodo) para cerrar el

sistema de transferencia y se inserto dentro del equipo. Las condiciones de

electrotransferencia fueron: 7 min a 2.5 A constantes hasta 25 V.

Reactivos:

- 0,2 μm nitrocellulose membrane (Bio-Rad)

3. Materiales y Métodos

47

- Trans-Blot® TurboTM

Transfer buffer solution (Bio-Rad)

3.6.4. Inmunodetección

La membrana fue bloqueada con una solución de bloqueo (Odyssey®) en TBS 1x (1:1)

durante 12 horas a temperatura ambiente. Después del bloqueo, la membrana fue lavada

con TBS con Tween-20 al 0,1% durante 60 s y posteriormente incubada 1 h a

temperatura ambiente en agitación constante con anticuerpo primario específico para

UCP1 en el tejido adiposo marrón (anti-UCP1). Después de la incubación la membrana

fue lavada 4 veces durante 5 min cada vez a temperatura ambiente con TBS con Tween-

20 al 0,1% en agitación constante. Después la membrana fue incubada 30 min a

temperatura ambiente con agitación constante y con protección de la luz exterior con

anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo (IRDye®

800 CW Goal AntiRabbit

IgG, Li-cor Ref: 926-32211). El anticuerpo secundario se preparó según la especie

huésped del anticuerpo primario.

Para la detección las membranas fueron lavadas 4 veces durante 5 min cada vez en TBS

con Tween-20 al 0.1% a temperatura ambiente en agitación constante. Se realizó un

último lavado con TBS durante 5 min.

Reactivos:

- Odyssey® Blocking Buffer Solution (LI-COR Biosciences)

- TBS 10x wash buffer, pH: 7,4: 500 ml de Tris-Cl 1M (Sigma), pH: 7,4 y 300 ml de

NaC1 5M (Panreac) y arrasar hasta 1 L con agua destilada.

- TBS 1 con Tween-20 al 0,1%: TBS 10 diluido 1:10 con agua destilada y 1 g de Tween-

20 (Sigma)

- Anticuerpo primario policlonal de conejo anti UCP1 de rata (Genetex, Ref: 10983-

Rabbit) diluido 1:1000 en TBS lx con 0,1% de BSA (Sigma), 0,1% de ácida sódica

(Sigma) y 0,1% de Tween-20 (Sigma)

- Anticuerpo primario policlonal de conejo anti HSP90 de rata (Cell Signaling

Technology, Inc. Ref: 4877-Rabbit), diluido 1:1000 en TBS lx con 0,1% de BSA

(Sigma), 0,1% de ácida sódica (Sigma) y 0,1% de Tween-20 (Sigma)

- Anticuerpo secundario anti anticuerpos de conejo (Canal de detección infrarroja: 800)

(LI-COR Biosciences), diluido 1:20000 en Odyssey® Blocking Buffer y TBS lx con

0,1% de BSA (Sigma), 0,1% de ácida sódica (Sigma) y 0,1% de Tween-20 (Sigma)

- Anticuerpo secundario anti anticuerpos de ratón (Canal de detección infrarroja: 680)

(LI-COR Biosciences), diluido 1:20000 en Odyssey® Biocking Buffer y TBS lx con

0,1% de BSA (Sigma), 0,1% de ácida sódica (Sigma) y 0,1% de Tween-20 (Sigma).

3.6.5. Escaneado y cuantificación

Las membranas fueron escaneadas en un escáner Odyssey® con sistema de imagen

infrarroja (LI-COR Biosciences) en los canales de detección apropiados respecto al

anticuerpo escaneado (canal verde en 700 nm cuando se utilizó el anticuerpo secundario

anti-anticuerpos de ratón y canal rojo en 800 nm cuando se utilizó el anticuerpo

secundario anti-anticuerpos de conejo. Para la cuantificación de las bandas se utilizó el

Odyssey® software V 3.0 (LI-COR Biosciences).

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

48

3.7. Determinación de parámetros séricos por técnicas inmunológicas

3.7.1. Determinación de la concentración de leptina

Para la determinación de los niveles circulantes de leptina, se utilizó el kit comercial de

inmunoensayo enzimático, Quantikine ELISA Mouse/Rat Leptin Immunoassay (R&D

Systems, USA & Canadá). La técnica empleada se basa en el principio de un ELISA tipo

sándwich, donde un anticuerpo policlonal anti leptina se encuentra adherido en los

pocillos de la placa. En cada pocillo de las placas incluidas en el kit que estaban

recubiertas con un anticuerpo policlonal anti leptina, se introducían 50 µL de suero

(previamente diluido) y los diferentes puntos del patrón de concentración conocida, y se

incubaba 2 h a temperatura ambiente. Después de una serie de lavados (cuatro lavados

con el tampón de lavado), se añadieron 100 µL del anticuerpo anti leptina conjugado a

una peroxidasa de rábano horseradish peroxidase (HRP), y nuevamente se incubó

durante 2 h a temperatura ambiente. Se hicieron 5 lavados con 400 µL de Wash Buffer,

suministrado por el kit para eliminar el anticuerpo excedente y se añadió 100 µL de

solución sustrato del conjugado anti-leptina, y se incubó por 2 h a temperatura

ambiente. Pasadas las 2 h de incubación, se realizaron 5 lavados con 400 µL de Wash

Buffer, suministrado por el kit. Se añadió 100 µL de Substrate Solution, Se incubó por

30 min a temperatura ambiente, protegiendo la placa de la luz. Finalmente se añadió 100

µL de Stop Solution para detener la reacción y se leyó la absorbancia a 450 nm en un

espectrofotómetro para placas de ELISA (Sunrise de TECAN). La intensidad del color

registrado es proporcional a la cantidad de leptina presente en las muestras.

Reactivos:

- Quantikine ELISA Mouse/Rat Leptin (R&D Systems, USA & Canada)

3.7.2. Determinación de la concentración de insulina

Los niveles de insulina en suero se determinaron con el kit comercial Rat Insulin ELISA

de Mercodia. Este kit se basa en el principio de un inmunoensayo enzimático (ELISA)

directo tipo sándwich, donde la incubación de los anticuerpos monoclonales anti-

insulina unidos a los pocillos de la placa y los anticuerpos monoclonales anti-insulina

conjugados con peroxidasa, reaccionan con la insulina presente en las muestras.

Se añadió a cada pocillo 10 µL de suero o de patrón de concentración conocida y 100

µL de enzyme conjugate 1X, previamente preparado a partir del enzyme conjugate 11X

proporcionado por el kit. Se incubó en agitación durante 2 h a temperatura ambiente.

Pasadas las 2 h se lavó 6 veces con Wash Buffer 1X para eliminar el exceso de

anticuerpo marcado con enzimas marcadas. Se añadió 200 µL del sustrato específico

3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina (Substrate TMB) y se incubó por 15 min a temperatura

ambiente. Esta reacción genero un producto coloreado que se cuantifico por

espectrofotometría. Se añadió 50 µL Stop solution para detener la reacción,

proporcionada por el kit, y finalmente se leyó la absorbancia a 450 nm, en un

espectrofotómetro para placas de ELISA Sunrise de TECAN. La cantidad de producto

3. Materiales y Métodos

49

coloreado que se produjo es directamente proporcional a la cantidad de insulina que hay

en la muestra. Paralelamente se realizó una curva patrón.

Reactivos:

- Rat Insulin ELISA (Mercodia)

3.7.3. Determinación de la concentración de ghrelina

Los niveles séricos de Ghrelina se determinaron mediante el kit comercial Ghrelin (Rat,

Mause) EIA Enzyme Immunoassay Kit Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Este kit está

diseñado para medir la concentración de un péptido específico basado en el principio

del inmunoensayo enzimatico "competitivo". Este inmunoensayo utiliza una enzima

como marcador del antígeno sin marcar y la muestra se mide por su capacidad para

competir con un antígeno marcado en el inmunoensayo. En cada pocillo de la placa

incluida en el kit se encuentra adherido un anticuerpo secundario, cuyos sitios de enlace

no específicos están bloqueados. El anticuerpo secundario se puede unir al fragmento Fc

del anticuerpo primario y el fragmento Fab está ligado competitivamente por ambos

péptidos, ya sea el péptido biotinilado o el péptido de la muestra desconocida. El

péptido biotinilado interactúa con la enzima conjugada con Streptavidin-HRP

peroxidasa que cataliza la solución de sustrato. La intensidad del color amarillo

resultante es directamente proporcional a la cantidad de complejo de péptido biotinilado

con la peroxidasa, pero inversamente proporcional a la cantidad del péptido de la

muestra desconocida. Esto se debe a la competencia entre el péptido biotinilado y el

péptido diana para unirse al anticuerpo primario. Se realizó una curva estándar trazando

la medida del aumento de la concentración como una función de las diversas

concentraciones de péptido estándar conocidas. La concentración del péptido

desconocido en las muestras se puede determinar a través de la extrapolación basada en

la curva estándar.

Se agregaron 50 µL de las diluciones de la curva estándar y la muestra. Se incubó a

temperatura ambiente 20-23 °C durante 2 h. Se agregó 100 µL en cada pocillo de la

solución de la enzima conjugada con Streptavidin-HRP. Se incubó a temperatura

ambiente 20-23 °C durante 1 hora. Se lavaron todos los pocillos de la immunoplaca 4

veces con 350 µL assay buffer1X. Se agregó 100 µL de la solución de sustrato TMB en

cada pocillo. Se incubó a temperatura ambiente 20-23 °C durante 1 hora. Se terminó la

reacción con 100 µL por pocillo de 2N HCl. Se leyó la absorbancia a 450 nm y se tuvo

en cuenta la curva estándar para realizar los cálculos de la concentración de ghrelina.

Reactivos:

- Ghrelin (Rat, Mouse) EIA Enzyme Immunoassay Kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc)

3.8. Determinación de parámetros séricos por técnicas enzimáticas

3.8.1. Determinación de triglicéridos circulantes

La determinación de los triglicéridos en suero se realizó con el kit comercial Serum

Triglyceride Determination Kit (Sigma-Aldrich), basado en la hidrolisis enzimática de la

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

50

lipoproteína lipasa sobre los triglicéridos presentes en la muestra, produciéndose

glicerol y ácidos grasos. El glicerol producido sufre una serie de reacciones enzimáticas

(fosforilación, oxidación y peroxidación), primero es fosforilado formando glicerol-1-

fosfato (G-1-P), dicha reacción es catalizada por la glicerol quinasa (GK). Después G-1-

P es oxidado por acción de la glicerol fosfato oxidasa (GPO) resultando en la formación

de dihidroxi-acetona fosfato (DAP) produciendo peróxido de hidrógeno (H202).

Finalmente se produce la catálisis de H202 que produce quimioluminiscencia con

absorbancia a 540 nm.

En placas de ELISA (96 pocillos) se pipeteaban 240 µL del reactivo Free Glycerol,

incluido en el kit. Se añadieron 3 µL de suero o de los puntos de la curva patrón de

concentración conocida, y se incubó durante 5 min a 37ºC agitando suavemente la

placa. Se realizó una lectura de la absorbancia inicial a 540 nm en un espectrofotómetro

para placas de ELISA (Sunrise de TECAN) determinándose así la concentración de

glicerol en el suero. Se añadieron 60 µL de Triglyceride Reagent, proporcionado por el

kit. Se agitó una vez más y se volvió a incubar por 5 min a 37°C. Finalmente se realizó

una lectura de la absorbancia final a 540 nm. Para determinar la concentración de

triglicéridos reales, se calculó mediante la resta entre triglicéridos totales y el glicerol.

Reactivos:

- Serum Triglyceride Determination kit (Sigma-Aldrich)

3.8.2. Determinación de ácidos grasos libres circulantes NEFAs

La determinación en suero de los niveles de ácidos grasos no esterificados (NEFA, non

esterfled fatty acids) se realizó con el test colorimétrico enzimático NEFA-HR2

(WAKO-Chemicals). El fundamento del test colorimétrico para la cuantificación de los

NEFA en suero consiste en que los NEFAs de la muestra son convertidos a Acyl-CoA,

adenosín monofosfato (AMP) y ácido pirofosfórico (PPi) por la acción de la Acyl-CoA

sintetasa (ACS, Acyl-coenzyme A synthetase 1), bajo la presencia de coenzima A (C0A)

y trifosfato de adenosina (ATP). El Acyl-CoA resultante de la reacción es oxidado por la

acción de la Acyl-CoA oxidasa (ACOD), generando peróxido de hidrógeno, en presencia

de una peroxidasa (POD), que permite la condensación oxidativa de 3-metil-N-etil-N

(β-hidroxietil)-Anilina (MEHA) con 4-aminoantipirina (4-AA). Formándose un producto

de color azul púrpura que se puede medir colorimétricamente a 550 nm.

En placas de ELISA (96 pocillos) se pipetearon 7 µL de la muestra en placas de ELISA

(96 pocillos), posteriormente se añadió 150 µL del reactivo 1 (reconstituido

previamente con la solución A (buffer fosfato 50 mmol/L, pH 7,0 y ácida sódica 0,05%)

y la solución color A (0,53 U/mL ACS, 0,31 mmol/L CoA, 4,3 mmol/L ATP, 1,5

mmol/L 4-AA, 2,6 u/mL AOD, 0,062% acida sódica, y color A 0,8%) incluidos en el

kit), se agitó vigorosamente la muestra y se incubó por 5 min a 37°C. A continuación se

añadieron 75 pL del reactivo 2 (reconstituido previamente con solución B (MEHA) y la

solución color B (12U/mL ACOD y 14U/mL POD) incluidos en el kit), nuevamente se

agitó vigorosamente y se dejó reposar durante 5 min a temperatura ambiente.

3. Materiales y Métodos

51

Finalmente se leyó la absorbancia a 550 nm en un espectrofotómetro para placas de

ELISA (Sunrise de TECAN).

Reactivos:

- Kit calorimétrico enzimático NEFA-HR2 (WAKO-Chemicals)

3.8.3. Determinación de los niveles de colesterol

Los niveles de colesterol total se determinaron en muestras de suero usando el kit de

Química Clínica Aplicada S.A. Este kit colorimétrico se fundamenta en la reacción de la

oxidasa / peroxidasa. El colesterol esterificado con anticuerpo presente en muestras de

plasma pasa por la acción de la enzima oxidasa, originando peróxido de hidrógeno que

está sujeto a la acción de la peroxidasa generando un complejo coloreado que puede

cuantificarse por espectrofotometría. Primero se dejaron a temperatura ambiente los

reactivos y las muestras. Fue mezclado 200 µL del reactivo suministrado en el kit con 2

µL de muestra y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después se midió la

absorbancia a 500 nm usando un espectrofotómetro para placas de ELISA (Sunrise de

TECAN).

Reactivos:

- Kit de Colesterol oxidasa / peroxidasa (BioSystems.)

3.8.4. Determinación de los niveles de fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina es un enzima cuya elevación en la concentración sérica puede

reflejar diversas enfermedades de daño hepático. Se fundamenta en el control de la

liberación del ácido fosfórico y fenolftaleina por la acción de la fosfatasa alcalina sérica

sobre el sustrato de monofosfato. En condiciones óptimas de la reacción en un medio

básico, vira a una tonalidad rosa, esto permite la determinación de la actividad del

enzima. El ΔAbs/min es proporcional a la concentración de fosfatasa alcalina presente

en la muestra.

Se atemperó los reactivos de trabajo a 37ºC. Se mezcló 10 µL del sustrato A en 50 µL

de agua desionizada. Se mezcló suavemente e incubó durante 5 min a 37ºC. Se añadió 5

µL del reactivo estándar C ó de las muestras a analizar. Se mezcló e incubó por 20 min

a 37ºC. Se terminó la reacción con 250 µL del reactivo B para el revelado del color.

Después se midió la absorbancia a 550 nm usando un espectrofotómetro (Sunrise de

TECAN).). La concentración de la Fosfatasa alcalina se determinó usando la siguiente

ecuación:

Fosfatasa alcalina (U/L) = (ΔAbs/min)·((Vt·106) / ( ·L·Vs))

Donde Vt: Volumen total de la mezcla de la reacción. Vs: Volumen de le muestra. L:

Paso de luz de la cubeta o placa de medición. : Coeficiente de extinción molar de p-

Nitrofenol en medio alcalino (405 nm: 18500).

Reactivos:

- Kit de Fosfatasa Alcalina (Química Clínica Aplicada, S.A.)

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

52

3.8.5. Determinación de los niveles de aspartato aminotransferasa (AST)

La actividad enzimática de la AST (aspartato aminotransferasa) refleja el daño hepático.

La reacción se fundamenta en que AST, cataliza la reacción entre la L-aspártico y el

ácido α-cetoglútamico. El ácido oxalacético formado se reduce por el cofactor

dinucleótido de nicotinamida NADH en presencia de la enzima malato deshidrogenasa

MDH, produciéndose un cambio en la absorbancia (Abs) del medio. En condiciones

óptimas de reacción, el ΔAbs/min es proporcional a la concentración de enzima AST

presente en la muestra.

Según el protocolo, se atemperó los reactivos de trabajo a 37ºC y se mezcló 50 µL del

reactivo A con 10 µL de la muestra. Se mezcló e incubó por 1 min. Se detuvo la

reacción con 12,5 µL del reactivo B. Las absorbancias se determinaron con el equipo

Mithras LB 940, Berthold Technologies. La concentración de la AST se determinó

usando la siguiente ecuación:

AST (U/L) = (ΔAbs/min)·((Vt·106) / ( ·L·Vs))

Donde Vt: Volumen total de la mezcla de la reacción. Vs: Volumen de le muestra. L:

Paso de luz de la cubeta o placa de medición. : Coeficiente de extinción molar de

NADH (340 nm: 6,31·103).

Reactivos:

- Kit de Transaminasas GOT/AST (Química Clínica Aplicada, S.A.)

3.8.6. Determinación de los niveles de alanina aminotransferasa ALT

La actividad enzimática de la ALT (alanina aminotransferasa), refleja específicamente

cuando hay daño hepático. La reacción se fundamenta en que ALT, cataliza la reacción

entre la L-Alanina y el Ac. Ceto-Glutárico. El Ac. Pirúvico formado se reduce por el

cofactor NADH en presencia de la enzima lactato deshidrogenasa LDH, produciéndose

un cambio en la absorbancia (Abs) del medio. En condiciones óptimas de reacción, la

ΔAbs/min es proporcional a la concentración de enzima ALT presente en la muestra.

Se atemperó los reactivos de trabajo a 37ºC y se mezcló 50 µL del reactivo A con 5 µL

de la muestra. Se mezcló e incubó por 1 min. Se detuvo la reacción con 12.5 µL del

reactivo B. Las absorbancias se determinaron con el equipo Mithras LB 940, Berthold

Technologies. La concentración de la ALT se determinó usando la siguiente ecuación:

ALT (U/L) = (ΔAbs/min)·((Vt·106) / ( ·L·Vs))

Donde Vt: Volumen total de la mezcla de la reacción. Vs: Volumen de le muestra. L:

Paso de luz de la cubeta o placa de medición. : Coeficiente de extinción molar de

NADH (340 nm: 6,31·103).

Reactivos:

- Kit de Transaminasas GPT/ALT (Química Clínica Aplicada, S.A.)

3. Materiales y Métodos

53

3.8.7. Determinación de la concentración de glucosa

La determinación de la glucosa en sangre (glucemia) se realizó mediante el glucómetro

AccuChek Aviva system (Róche Diagnostics). Para ello, se colocaba una gota de sangre

sobre la tira reactiva hasta cubrir completamente la ranura por capilaridad a un nivel

suficiente para poder obtener una óptima lectura. La mayoría de los glucómetros actúan

como un biosensor que se fundamenta en la reacción enzimática de la glucosa

deshidrogenasa y ante la presencia de la coenzima PQQ (quinona de pirroloquinolina)

que se encuentran en las tiras reactivas. Cuando la gota de sangre se introduce en la tira

reactiva inicia la reacción enzimática que provoca la oxidación de la glucosa,

convirtiendo la glucosa en gluconolactona. Esta reacción enzimática genera una

liberación de electrones y es así como el glucómetro traduce esta corriente eléctrica en

la cantidad de glucosa de la muestra de sangre. La medición obtenida varía dependiendo

la cantidad de glucosa y se lee en la pantalla del glucómetro en mg/dL.

Reactivos:

- Accu-Chek Aviva system (Roche diagnostics)

- Tiras reactivas Accu-Chek Aviva system (Roche diagnostics)

3.9. Determinación del índice HOMA-IR

La resistencia a la insulina se determinó mediante la evaluación del modelo

homeostático de resistencia a la insulina (HOMA-IR). Los niveles de HOMA-IR se

determinaron al conocer las concentraciones séricas de insulina y glucosa en

condiciones de ayuno. La fórmula para la determinación del índice HOMA-IR es:

HOMA-IR: (Glucosa en ayuno (mmol/L) x Insulina en ayuno (mU/L)) / (22,5)

3.10. Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± el error estándar de la media (SEM). El

análisis estadístico usado fue elegido según el objetivo experimental. Para estudiar las

diferencias individuales entre grupos de experimentación con comparaciones múltiples,

se aplicó el análisis de varianzas ANOVA de un factor seguido de la prueba post hoc

DMS o ANOVA de medidas repetidas seguido de la prueba T para muestras pareadas,

según el caso. Las comparaciones simples (dos grupos de experimentación) se

realizaron mediante la prueba no paramétrica aplicada a dos muestras independientes de

U de Mann-Whitney. El software utilizado para el análisis fue SPSS para Windows. En

todos los casos el nivel de confianza fue del 95% (p <0,05), y se identificó en la gráfica

cuando fue diferente.

55

1 Juan 5:13 “Les escribo estas cosas a ustedes

que creen en el nombre del Hijo de Dios, para

que sepan que tienen vida eterna.”

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

57

4.1. Capítulo 1

La administración conjunta de eugenol y cinamaldehído en adipocitos

maduros 3T3-L1 produce un efecto hipolipemiante que podría estar

mediado por la inhibición en la expresión de genes lipogénicos

Se pretende analizar con este estudio el efecto del tratamiento con eugenol (EU),

cinamaldehído (CNA) y su tratamiento combinado (EU+CNA) en células 3T3-L1

durante su diferenciación y en adipocitos maduros sobre la expresión de marcadores

adipogénicos de genes implicados en el metabolismo lipídico. También, se ha analizado

si el tratamiento ejerce algún efecto sobre la acumulación de triglicéridos durante la

diferenciación de los preadipocitos y en adipocitos maduros. Para ello se cultivaron en

placas de 24 pocillos las células 3T3-L1, que es una línea celular de fibroblastos

embrionarios de ratón comprometida a diferenciarse en adipocitos. En el caso de

adipocitos maduros se trataron durante 24 horas con diferentes concentraciones (10, 50,

100, 200, 400 μM) de EU, CNA y EU+CNA. En el estudio de los efectos durante la

diferenciación se recogieron células a diferentes tiempos (T0, T2, T4, T6 y T8) de

células control o células tratadas con 10 µM de EU, CNA y EU+CNA y a tiempo final

(T8) células control y tratadas con 10, 50 y 100 µM de EU, CNA y EU+CNA. En el

caso del grupo control, se utilizó el mismo volumen de medio sin tratamiento. Se

recogieron las células para la extracción de ARN. La expresión génica se evaluó por

RT-PCR. En adipocitos maduros tratados durante 24 h, el tratamiento con EU (400 μM)

produce una disminución en los niveles ARNm de Fasn y Lipe y el tratamiento con

CNA (400 μM) disminuye los niveles del ARNm de Fasn y aumenta los niveles del

ARNm de Cpt1b en comparación con el tratamiento control. Con el tratamiento

EU+CNA se observa una inhibición dosis-respuesta en la expresión de los genes

lipogénicos (Srebf1, Pparg, Fasn) y de Lipe y una inducción dosis-respuesta en la

expresión de Cpt1b. El tratamiento EU+CNA, pero no los tratamientos individuales,

resulta en un menor contenido lipídico respecto al grupo control. Además, el EU, CNA

y su tratamiento combinado afectan la expresión de genes clave implicados en el

metabolismo lipídico en adipocitos maduros, pero no afectan al proceso de

diferenciación o adipogénesis. Por tanto, los resultados sugirieren un efecto

antilipogénico de estos compuestos, sobretodo en el caso del tratamiento combinado.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

58

4.1.1. Resultados

Efecto del tratamiento con eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y el tratamiento

combinado (EU+CNA) en genes relacionados con el metabolismo lipídico en

adipocitos maduros de la línea celular 3T3-L1.

Viabilidad celular

Adipocitos maduros de la línea celular 3T3-L1 fueron tratados durante 24 horas con

diferentes concentraciones (10, 50, 100, 200, 400 μM) de EU, CNA y EU+CNA. En la

Figura 4.1 se puede observar que estos tratamientos no comprometieron ni la

morfología ni la supervivencia de las células, ya que el test de viabilidad realizado

(ReliablueTM

Cell Viability Reagent) reportó para los tratamientos unas lecturas

comprendidas entre el control positivo y el control negativo. Ver apartado 3.1.3 para

más detalles sobre ReliablueTM

Cell Viability Reagent.

Figura 4.1. Resultados test viabilidad o metabolismo celular (ReliablueTM

, ATCC) en

adipocitos maduros 3T3-L1 tratados durante 24 h con 10, 50, 100, 200 y 400 μM de eugenol

(EU), cinamaldehído (CNA) y eugenol + cinamaldehído (EU+CNA). Las células control

recibieron tratamiento con vehículo. Se usó Diaforasa/NAD+, un conocido citotóxico, como

control de muerte celular. En las gráficas se representa la media en porcentaje ± SEM (n=5) de

la viabilidad o tasa metabólica en comparación con los valores del grupo de control. Estadística:

* p<0,05 versus control + vehículo, U de Mann-Whitney; # p<0,05 versus control + tóxico, U de

Mann-Whitney. Se muestra para cada tratamiento una imagen representativa (fotografía original

con una magnificación a 20X/400 μm; la línea negra dentro de cada fotografía representa 50

μm).

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

59

Expresión génica

La expresión de Srebf1, Pparg y Fasn se examinó para explorar el efecto del

tratamiento de EU, CNA y EU+CNA sobre la lipogénesis (Figura 4.2).

Figura 4.2. Expresión de genes relacionados con la lipogénesis en adipocitos maduros 3T3-L1

tratados durante 24 h con 10, 50, 100, 200 y 400 μM de eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y

eugenol + cinamaldehído (EU+CNA). Las células control recibieron tratamiento con vehículo.

Los datos son la media ± SEM (n=6-9) en comparación con los valores del grupo de control

(100%). Estadística: T, p<0,05, efecto del tratamiento, ANOVA de un factor; a≠b≠c, DMS,

prueba post hoc; * p<0,05 versus control, U de Mann-Whitney.

Se observo claramente en los adipocitos maduros de la línea celular 3T3-L1 un efecto

significativo dosis dependiente con los tratamientos de las combinaciones equimolares

de EU+CNA en los niveles de expresión de Srebf1, Pparg y Fasn (p<0,05, ANOVA de

un factor). La expresión más baja se observa en respuesta al tratamiento con 400 μM

EU+CNA, aunque ya es evidente a 100 μM, en el caso de Srebf1 y Pparg y a 50 μM

para Fasn.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

60

Al comparar las dosis individuales con el control, se encontraron niveles disminuidos

del ARNm de Srebf1 en células tratadas con 100 μM de EU (p<0,05, U de Mann-

Whitney). Además, las células tratadas con CNA 100 μM y CNA 200 μM también

presentaron niveles disminuidos de Srebf1 y Pparg en comparación con las controles

(p<0,05, U de Mann-Whitney). Se observó un efecto dosis dependiente con los

tratamientos con EU y CNA en los niveles de expresión del ARNm de Fasn (p<0,05,

ANOVA de un factor). En concreto, se encontraron niveles del ARNm de Fasn

incrementados en células tratadas con EU 10 μM en comparación con el control

(p<0,05, DMS, prueba post hoc). Este aumento se atenuó en las células tratadas con

dosis más altas de EU, alcanzando niveles de expresión más bajos que en las controles,

como en células tratadas con EU 400 μM (p<0,05, DMS, prueba post hoc). En el caso

del tratamiento con CNA, se encontraron niveles disminuidos de ARNm de Fasn en

células tratadas con CNA 50, 200 y 400 μM respecto al células control (p<0,05, DMS,

prueba post hoc).

La expresión del ARNm de los genes relacionados con la movilización de los lípidos

(Pnpla2 y Lipe) y la oxidación de los ácidos grasos (Cpt1b) también se analizó (Figura

4.3).

Los niveles del ARNm de Pnpla2, que codifica para la proteína ATGL, y Lipe en

adipocitos maduros fueron significativamente afectados por el tratamiento con EU de

forma dosis dependientes (p<0,05, ANOVA de un factor). Concretamente, las células

tratadas con EU 50 o 100 μM mostraron los menores niveles de expresión de Pnpla2

(p<0,05, DMS, prueba post hoc). Las células tratadas con EU a dosis de 200 y 400 μM

presentaron una disminución en la expresión de Lipe en comparación con las dosis más

bajas de EU y el control (p<0,05, DMS, prueba post hoc). La expresión de Cpt1b no fue

alterada por el tratamiento con EU.

Con respecto al tratamiento con CNA, los niveles de ARNm de Pnpla2 y Cpt1b en

adipocitos maduros fueron significativamente afectados por el tratamiento de forma

dosis dependiente (p<0,05, ANOVA de un factor). La dosis más baja de CNA (10 μM)

produjo una disminución en la expresión del ARNm de Pnpla2 y que se mantiene en

niveles bajos con los tratamientos CNA 100 y 200 μM (p<0,05, U de Mann-Whitney).

El tratamiento con CNA 400 μM aumenta la expresión de Cpt1b a niveles más altos que

los observados en todos los demás grupos (p<0,05, DMS, prueba post hoc).

Las células tratadas con las combinaciones equimolares de EU y CNA (EU+CNA)

presentaron una disminución significativa dependiente de la dosis en la expresión de

Lipe y un aumento significativo dependiente de la dosis en la expresión de Cpt1b

(p<0,05, ANOVA de un factor). Al comparar frente al control se observó un efecto

significativo de disminución en la expresión de Pnpla2 en los tratamiento con dosis

mayores de 50 μM del tratamiento combinado (p<0,05, U de Mann-Whitney).

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

61

Figura 4.3. Expresión de genes relacionados con la movilización y oxidación de ácidos grasos

en adipocitos maduros 3T3-L1 tratados durante 24 h con 10, 50, 100, 200 y 400 μM de eugenol

(EU), cinamaldehído (CNA) y eugenol + cinamaldehído (EU+CNA). Las células control

recibieron tratamiento con vehículo. Los datos son la media ± SEM (n=6-9) en comparación con

los valores del grupo de control (100%). Estadísticas: T, p<0,05, efecto del tratamiento,

ANOVA de un factor; a≠b≠c, DMS, prueba post hoc; * p<0,05 versus control, U de Mann-

Whitney.

También se ha medido la expresión del ARNm del gen del receptor de insulina (Insr).

(Figura 4.4). Se observó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de

Insr en las células tratadas con CNA (p<0,05, ANOVA de un factor). Los niveles del

ARNm del Insr alcanzaron niveles estadísticamente significativos más bajos que el

control con CNA 100 o 200 μM. Sin embargo, en células tratadas con CNA 400 μM los

niveles del ARNm del Insr fueron mayores que con CNA 100 o 200 μM y no diferentes

al control (p<0,05, DMS, prueba post hoc). La señalización de la insulina no se ve

afectada ni con el tratamiento de EU, ni con el tratamiento combinado EU+CNA ya que

no se observan cambios en los niveles del ARNm del Insr en comparación con el

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

62

control. Aunque curiosamente, se observó una respuesta gradual en forma de “U con el

tratamiento con EU, CNA y EU+CNA sobre el nivel de expresión del ARNm del Insr.

Figura 4.4. Expresión de genes relacionados con la señalización de la insulina en adipocitos

maduros 3T3-L1 tratados durante 24 h con 10, 50, 100, 200 y 400 μM de eugenol (EU),

cinamaldehído (CNA) y eugenol + cinamaldehído (EU+CNA). Los datos son la media ± SEM

(n=6-9) en comparación con los valores del grupo de control (100%). Estadísticas: p<0,05,

ANOVA de un factor; a≠b≠c, DMS, prueba post hoc.

Tinción Oil-Red para determinar el contenido lipídico

Los resultados de la tinción con Oil-Red mostraron que cuando los adipocitos maduros

son tratados con la dosis más alta de EU o CNA hay una disminución del contenido

lipídico. Los resultados se presentan en la Figura 4.5. Esta disminución se observa tanto

en las fotografías, con la desaparición de las gotas de lípidos del citoplasma, como con

la cuantificación de la absorbancia a 500 nm, que permite inferir la cantidad de lípidos

presentes. Cabe resaltar que el tratamiento combinado de EU+CNA produce una

disminución del contenido lipídico, que se observa ya incluso con la menor dosis

testada, sugiriendo un efecto hipolipidico de los dos compuestos.

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

63

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

64

Efecto del tratamiento con eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y el tratamiento

combinado (EU+CNA) en genes relacionados con el metabolismo lipídico durante la

diferenciación en preadipocitos de la línea celular (3T3-L1).

Viabilidad celular

Para estudiar el efecto durante la diferenciación de los adipocitos se trataron

preadipocitos de la línea 3T3-L1 durante todo el proceso de diferenciación con la dosis

de 10 μM de EU, CNA y EU+CNA. Las células control recibieron tratamiento con

vehículo. Se recogieron muestras en diferentes tiempos de la diferenciación (punto

inicial (T0), y a los 2, 4, 6, 8 días de diferenciación (T2, T4, T6 y T8 respectivamente).

Además, se trataron preadipocitos de la línea 3T3-L1 durante todo el proceso de

diferenciación con diferentes dosis de EU, CNA y EU+CNA. Las dosis estudiadas

fueron: 10, 50 y 100 µM. Las células control recibieron tratamiento con vehículo. En

este caso, aunque el tratamiento se realizó durante toda la diferenciación se recogieron

muestras solo a tiempo final (T8). En la Figura 4.6 podemos observar que estos

tratamientos no afectan ni la viabilidad ni producen efectos citotóxicos, como se puede

observar en las fotografías obtenidas a tiempo final del tratamiento. Además, las

lecturas del test viabilidad realizado (ReliablueTM

Cell Viability Reagent) están

comprendidas entre el control positivo y el control negativo (que indica efecto

citotóxico).

Figura 4.6. Resultados del test viabilidad o metabolismo celular (ReliablueTM

, ATCC) en

adipocitos maduros 3T3-L1 tratados durante toda la diferenciación 10, 50, 100 μM de eugenol

(EU), cinamaldehído (CNA) y eugenol+cinamaldehído (EU+CNA). Las células control

recibieron tratamiento con vehículo. Se usó Diaforasa/NAD+, un conocido citotóxico, como

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

65

control de muerte celular. En las gráficas se representa la media en porcentaje ± SEM (n=4) de

la viabilidad o tasa metabólica en comparación con los valores del grupo de control. Estadística:

* p<0,05 versus control + vehículo, U de Mann-Whitney; # p<0,05 versus control + tóxico, U de

Mann-Whitney. Se muestra para cada tratamiento una imagen representativa (fotografía original

con una magnificación a 20X/400 μm; la línea negra dentro de cada fotografía representa 50

μm).

Expresión génica

Se analizó la expresión génica de genes claves implicados en el metabolismo lipídico

para determinar el efecto del tratamiento de EU, CNA y EU+CNA 10 µM durante toda

la diferenciación. Los resultados se presentan en la figura 4.7. Para ello se recogieron

células en distintos tiempos durante la diferenciación (punto inicial (T0), y a los 2, 4, 6,

8 días de diferenciación (T2, T4, T6 y T8 respectivamente).

Como era de esperar, los niveles de expresión de genes lipogénicos (Srebf1, Pparg y

Fasn) aumentan progresivamente a lo largo de la diferenciación en las células control

(p<0,05, ANOVA de un factor). Este aumento se observó ya desde el día 2 de

diferenciación en el caso de Srebf1, Pparg y Fasn. Con los diferentes tratamiento (10

μM EU, 10 μM CNA y 10 μM EU+CNA) durante la diferenciación se observó también

un aumento progresivo en la expresión de Srebf1, Pparg y Fasn (p<0,05, ANOVA de

un factor).

Los niveles de expresión de Pnpla2 y Lipe aumentan progresivamente conforme

progresa la diferenciación de preadipocito a adipocito. Este aumento se observó tanto en

las células tratadas con el vehículo y en el resto de tratamientos (p<0,05, ANOVA de un

factor). Curiosamente, los niveles de expresión del ARNm de la Cpt1b se mantienen a

niveles basales hasta el final de la diferenciación, cuando se produce un gran incremento

en los niveles de su mensajero (p<0,05, ANOVA de un factor). Esto ocurre tanto en las

células tratadas con el vehículo como en las células tratadas con los diferentes

tratamientos.

Además, tanto en las células tratadas con el vehículo como en células tratadas con los

diferentes tratamientos (10 μM EU, 10 μM CNA y 10 μM EU+CNA), los niveles de

expresión del Insr aumentan rápidamente del 2 al 4 día de diferenciación,

manteniéndose altos el resto del periodo estudiado (p<0,05, ANOVA de un factor).

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

66

Figura 4.7. Expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico en distintos

tiempos durante la diferenciación de adipocitos 3T3-L1 (punto inicial (T0), y a los 2, 4,

6, 8 días de diferenciación (T2, T4, T6 y T8 respectivamente). Las células fueron

tratadas durante toda la diferenciación (desde T0) con 10, μM de eugenol (EU), cinamaldehído

(CNA) y cugenol+cinamaldehído (EU+CNA). Los datos son la media ± SEM (n=6) en

comparación con los valores del grupo de control a T0 (100%). Estadísticas: Para cada

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

67

tratamiento cuando existe un efecto diferenciación: a≠b≠c, DMS, prueba post hoc; * p<0,05

versus control, U de Mann-Whitney.

Además, tratamos durante toda la diferenciación preadipocitos de la línea celular 3T3-

L1 con 10, 50 y 100 µM de EU, CNA y EU+CNA y analizamos la expresión génica, en

este caso sólo al final de la diferenciación (adipocitos maduros (T8)). Los resultados se

muestran en la Figura 4.8.

El tratamiento con la dosis más baja de EU (10 μM) no afectó a los niveles de expresión

de Srebf1 y Pparg comparado con el grupo control. Sin embargo con las dosis más altas

(50 y 100 μM) produjeron una disminución en los niveles de Srebf1 y Pparg. Con todas

las dosis testadas, se encontró una disminución en la expresión del ARNm de Fasn a

finales de la diferenciación (T8) (p<0,05, U de Mann-Whitney). Si bien el efecto

inhibitorio fue más fuerte en las concentración más altas de tratamiento. Esto indica que

el tratamiento de EU podría tener un papel clave en la homeostasis lipídica

disminuyendo la expresión de un enzima clave implicado en la síntesis de triglicéridos.

No se observaron diferencias respecto a las controles en la expresión del ARNm de

Srebf1 con el tratamiento CNA 10 μM. Pero el tratamiento con CNA 10 μM durante la

diferenciación, inhibe la expresión de Pparg y Fasn a final de la diferenciación (T8)

(p<0,05, U de Mann-Whitney) respecto al grupo control. Los tratamientos con mayor

concentración de CNA (50 y 100 μM) producen una inhibición en la expresión de los

tres ARNm (Srebf1, Pparg y Fasn) con respecto a las células control (p<0,05, U de

Mann-Whitney).

El tratamiento combinado EU+CNA 10 μM no afecta la expresión de Srebf1 y Pparg

comparado con el grupo control, pero sí que se observa una menor expresión de estos

genes con el tratamiento CNA 50 y 100 μM (p<0,05, U de Mann-Whitney). La dosis de

10 μM de EU+CNA inhibe la expresión de Fasn al final de la diferenciación (T8)

respecto a las controles (p<0,05, U de Mann-Whitney). Esta disminución en las

expresión del ARNm de Fasn también se observó en las células tratadas con CNA 50 y

100 µM (p<0,05, U de Mann-Whitney).

Con el tratamiento EU 10 µM se encontraron niveles disminuidos del ARNm de Cpt1b

y Lipe con respecto al tratamiento control al final de la diferenciación (T8) (p<0,05, U

de Mann-Whitney). Además, este efecto inhibitorio fue más fuerte en las

concentraciones más altas de tratamiento. Sin embargo, no hubo cambios en los niveles

de expresión de Pnpla2 en ninguno de los tratamientos estudiados (EU 10, 50 y 100

µM).

Al final de la diferenciación (T8) las células tratadas con CNA 10, 50 y 100 µM,

presentaron menores niveles del ARNm Pnpla2, Lipe y Cpt1b respecto a las células

control (p<0,05, U de Mann-Whitney).

Las células tratadas con el tratamiento combinado EU+CNA presentaron un perfil de

expresión de los genes implicados en la movilización de triglicéridos y oxidación de

ácidos grasos, similar al del tratamiento individual de EU. Las dosis de 10, 50 y 100 μM

de EU+CNA disminuyen la expresión de Lipe y Cpt1b al final de la diferenciación (T8)

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

68

con respecto a las células control (p<0,05, U de Mann-Whitney). No se observaron

cambios en los niveles de expresión de Pnpla2 en comparación con las células control

con ninguna de las dosis estudiadas.

Figura 4.8. Expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico al final de la

diferenciación en adipocitos tratados durante toda la diferenciación con 10, 50 y 100 µM de

eugenol (EU), cinemaldehído (CNA) y el tratamiento combinado (EU+CNA). Los datos son la

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

69

media ± SEM (n=6) en comparación con los valores del grupo de control a T0 (100%).

Estadísticas: * p<0,05 versus control, U de Mann-Whitney.

Al final de la diferenciación (T8), en comparación con el grupo control, las células

tratadas con EU, CNA y el tratamiento combinado EU+CNA 10, 50 y 100 μM

presentaron una disminución en los niveles de expresión del receptor de insulina.

Tinción Oil-Red para determinar el contenido lipídico

No se observaron diferencias en el contenidos lipídico respecto al grupo control en el

caso de los tratamientos individuales EU o CNA 10 y 50 μM. Sin embargo, con los

tratamientos combinados EU+CNA 10 y 50 μM se observa una disminución en el

contenido lipídico con respecto al control, aunque estas diferencias no fueron

estadísticamente significativas. Los resultados se presentan en la Figura 4.9.

Figura 4.9. Resultados de la tinción Oil-Red en adipocitos maduros 3T3-L1 tratados durante

toda la diferenciación con 10, 50, 100 μM de eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y eugenol +

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

70

cinamaldehído (EU+CNA). Las células control recibieron tratamiento con vehículo. En la

gráfica se representa la media en porcentaje ± SEM (n=4) del contenido lipídico en comparación

con los valores del grupo de control. Se muestra para cada tratamiento una imagen

representativa (fotografía original con una magnificación a 20X/400 μm; la línea negra dentro

de cada fotografía representa 50 μm).

4.1.2. Discusión

Este estudio tenía como objetivo examinar la influencia del tratamiento de los

compuestos bioactivos EU, CNA y su combinación (EU+CNA) sobre la expresión de

genes relacionados con el metabolismo lipídico, como ayuda en las estrategias para el

control de la obesidad. Para ello se realizó un estudio in vitro usando adipocitos de la

línea celular 3T3-L1 maduros y durante su diferenciación.

Los compuestos bioactivos EU y CNA están presentes en plantas aromáticas como el

clavo de olor y la canela respectivamente [278, 280]. Estos compuestos se engloban

junto a otros compuestos que se conocen como un grupo de sustancias naturales usadas

por la industria alimentaria como especias con actividad antibacteriana [282, 283].

Además han recibido un gran interés en los últimos años debido a que se ha informado

que pueden tener efectos sobre diversas condiciones de salud ya que poseen propiedades

anticancerígenas, antimicrobiana, antioxidantes y antidiabéticas [220, 237, 240, 269,

284, 285]. Estudios in vitro, reportan de manera individual que el EU y CNA son de

baja toxicidad y eficaces en la prevención de la adipogénesis [286].

En este estudio se puede observar que los compuestos bioactivos EU y CNA afectan la

expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos maduros de la

línea celular 3T3-L1. Así, el tratamiento con EU (400 μM) resulta en una disminución

en la expresión del ARNm de Fasn y Lipe y el tratamiento con CNA (400 μM)

disminuye la expresión de Fasn y aumenta la expresión de Cpt1b en comparación con el

tratamiento de control. En adipocitos maduros, el tratamiento combinado de EU y CNA

presenta un efecto sinérgico en estos efectos ya que con el tratamiento EU+CNA se

observa una inhibición dosis-respuesta en la expresión de los genes lipogénicos (Srebf1,

Pparg, Fasn) y de Lipe y una inducción dosis-respuesta en la expresión de Cpt1b.

Además, los resultados obtenidos en este estudio parecen indicar que los compuestos

bioactivos EU, CNA y su tratamiento combinado afectan la expresión de genes clave

implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos maduros, pero no afectan al

proceso de diferenciación o adipogénesis.

La expresión de Pparg en 3T3-L1 aumenta durante la diferenciación, produciéndose un

gran aumento a finales de la diferenciación (especialmente en T6 y T8), relacionado con

su función en el control de la proliferación y diferenciación celular para favorecer el

anabolismo de lípidos. El gen Pparg se expresa principalmente en tejido adiposo donde

estimula la adipogénesis y la lipogénesis. PPARG induce la captación de ácidos grasos,

la diferenciación de pre-adipocitos a adipocitos maduros y activa la expresión de genes

involucrados en lipogénesis y almacenamiento de triglicéridos [287–289]. Pparg se ha

identificado como uno de los factores clave que inducen y controlan la diferenciación

completa de los preadipocitos a los adipocitos maduros [290]. El SREBP1c es un

4. Resultados y Discusión

Capítulo 1

71

mediador transcripcional importante de los efectos de la insulina y, en particular, tiene

efectos sobre el mantenimiento del estado de la sensibilidad a la insulina que caracteriza

a los adipocitos maduros [291]. En adipocitos maduros observamos que por sí solos el

tratamiento de EU y CNA no afectan la expresión de Pparg ni de Srebf1. Sin embargo

el tratamiento combinado muestra un efecto sinérgico en la inhibición de la expresión

tanto de Pparg como de Srebf1. Paralelamente a la disminución en la expresión de estos

dos factores de transcripción relacionados con la adipogénesis y la lipogénesis, nuestros

resultados muestran que el tratamiento individual de EU y CNA reduce

significativamente la expresión de Fasn, y además el tratamiento combinado de

EU+CNA muestra un efecto sinérgico al inhibir de manera importante la expresión de

Fasn tras 24 h de tratamiento. FASN desempeña un papel central en la lipogénesis de

novo en mamíferos y aves, está implicada en la síntesis de ácidos grasos. In vitro se ha

descrito que Fasn se expresa tanto en preadipocitos como en adipocitos maduros de la

línea celular 3T3-L1 [292, 293]. Cabe destacar, que si el tratamiento se realiza durante

el proceso de diferenciación, la expresión de estos genes lipogénicos se ve disminuida

en tanto en los tratamientos individuales como en el tratamiento combinado, pero solo

al final de la diferenciación (T8). Estos resultados sugieren que tanto el EU como el

CNA ejercerían sus efectos antilipogénicos en adipocitos ya maduros, o en estadios

finales de maduración. Interesantemente, un estudio demostró que el extracto de las

ramas de canela (Cinnamomum Ramulus) reduce la expresión de Pparg, Srebf1 y Fasn,

entre otros, en adipocitos 3T3-L1, a través de la activación de la señalización de insulina

vía AMPK/PI3K y IRS-1 [294]. Las células 3T3-L1 aumentan su capacidad de unión a

la insulina durante la diferenciación por el aumento en la síntesis de receptores de

insulina [295]. Aunque en nuestro estudio no hemos estudiado directamente la vía de

señalización de la insulina, hemos analizado los niveles de expresión del receptor de la

insulina. Nuestros datos muestran que el tratamiento con dosis mayores a 50 μM y

menores de 400 μM de CNA disminuye la expresión del Insr en adipocitos maduros.

Durante la diferenciación con los tres tratamientos EU, CNA y EU+CNA disminuyen la

expresión de Insr en el T8 al final de la diferenciación.

El CNA inhibe la expresión de Pnpla2 (que codifica para proteína ATGL, con actividad

triglicérido lipasa) en adipocitos maduros, tanto en el tratamiento durante 24 h como en

el tratamiento durante la diferenciación. Cabe destacar que estos efectos no se observan

en el tratamiento con EU, por lo que la disminución en los niveles del ARNm de Pnpla2

observado en el tratamiento combinado es probablemente debida al efecto individual del

CNA. Por tanto, el tratamiento con CNA parece atenuar la movilización de triglicéridos,

debido a la inhibición de la transcripción de Pnpla2, que codifica para el primer enzima

clave en la hidrólisis de los triglicéridos. Curiosamente, en células 3T3-L1 incubadas

con medios de cultivo libre de insulina se ha descrito un aumento dependiente del

tiempo en la expresión de Pnpla2; por el contrario la incubación en un medio

suplementado con insulina previno este aumento y promueve la disminución en la

expresión de Pnpla2 [296]. En nuestro diseño experimental las células son tratadas con

medio de cultivo que no es libre de suero y contiene insulina (5 µg/ml). Por lo que este

efecto inhibitorio en la expresión de Pnpla2 puede estar acentuado por la insulina

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

72

presente en el medio. La capacidad lipolítica de los adipocitos disminuye cuando hay

obesidad. Esta capacidad lipolítica mediada por la movilización de las reservas de

triglicéridos es coordinada por la ATGL y la HSL (codificada por el gen Lipe). La

expresión de Lipe disminuye significativamente en los adipocitos de sujetos obesos

[297]. Nuestros resultados muestran que los tratamientos con EU y CNA producen una

disminución en la expresión de Lipe al final de la diferenciación como consecuencia del

tratamiento durante toda la diferenciación. Curiosamente, cuando se tratan adipocitos

maduros durante 24 h con EU y CNA se produce una inhibición en la expresión de Lipe

solo a altas concentraciones. Sin embargo, la expresión de este gen disminuye con

tratamiento combinado EU+CNA durante 24 h en adipocitos maduros a dosis más bajas.

Por tanto, in vitro parece que existe una inhibición en la movilización de los

triglicéridos almacenados, que estaría en contra del efecto antilipogénico que tienen

estos compuestos. Tentativamente, podríamos pensar que se trata de un mecanismo

compensatorio, al haber menos lipogénesis y acumulación de lípidos por el tratamiento,

habría una disminución de la necesidad de movilizar lípidos, o las reservas existentes se

agotarían antes, por lo que se inhibiría la expresión de estos genes, al no haber más

reservas que movilizar. Los resultados de la tinción Oil-Red, apoyarían esta hipótesis.

El paso inicial en la regulación de la β-oxidación de los ácidos grasos está mediado por

la enzima CPT1 [298]. Los niveles de CPT1b permanecen basales durante la

diferenciación celular. Pero al final de la diferenciación se produce un aumento en la

expresión la Cpt1b. Esto ocurre tanto en las células tratadas con el vehículo como en las

células tratadas con EU, CNA y EU+CNA 10 μM. El tratamiento durante 24 h de EU no

afecta la expresión de Cpt1b en adipocitos maduros, pero el CNA a dosis de 400 μM y

el tratamiento combinado de EU+CNA aumenta su expresión. No se conoce el

mecanismo por el que se produce este efecto diferencial entre el EU y el CNA en la

regulación de la expresión de Cpt1b. El aumento que se observa en el tratamiento

combinado, se debe probablemente al efecto del CNA per se. Por tanto, ni el CNA ni el

EU parece tener un efecto claro en la activación de la oxidación de ácidos grasos

cuando se administra en adipocitos maduros. Además, si el tratamiento se realiza

durante toda la diferenciación, tanto el EU como el CNA, como el tratamiento

combinado, producen al final del periodo de diferenciación una inhibición en la

expresión de Cpt1b.

4.1.3. Conclusiones

El tratamiento con los compuestos bioactivos EU, CNA y EU+CNA en adipocitos

maduros 3T3-L1 o durante su diferenciación actúan como un potente inhibidor dosis-

dependiente en la expresión de los genes lipogénicos (Srebf1, Pparg y Fasn), sugiriendo

un efecto antilipogénico de estos compuestos. Este efecto en la inhibición de genes

clave implicados en la lipogénesis se produce en adipocitos maduros, pero no afectan al

proceso de diferenciación o adipogénesis. El uso combinado de estos compuestos surge

como una estrategia potencial de su efecto sinérgico en el control de la adiposidad.

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

73

4.2. Capítulo 2

La administración de eugenol (EU), cinamaldehído (CNA) y el tratamiento

combinado (EU+CNA) disminuye la ganancia de peso corporal en ratas

alimentadas con una dieta obesogénica.

En este estudio se pretendio analizar en ratas el efecto del tratamiento con EU, CNA y

EU+CNA frente a la exposición de una dieta obesogénica en el control del balance

energético. Para ello ratas albinas Wistar machos de 4 meses de edad fueron distribuidas

en los siguientes grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western

diet), alimentado con dieta obesogénica (rica en grasas y azúcares simples); WD+EU,

alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol; WD+CNA, alimentado con una

dieta WD + 250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA, alimentado con una

dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído, respectivamente. Las dosis

de tratamiento se ajusto tomando como base los experimentos en la bibliografía

consultada previamente. Los tratamientos se administraron diariamente durante 30 días.

A mitad del tratamiento (día 15) se extrajo una muestra de sangre en condiciones de

ayuno. Al final del tratamiento (día 30) los animales de los diferentes grupos fueron

sacrificados en condiciones de alimentación ad libtitum. Se recogieron muestras de

sangre y de tejidos que fueron guardados hasta su posterior análisis.

Tras el tratamiento, los animales del grupo WD+CNA y WD+EU+CNA presentaron

una menor ingesta calórica, menor incremento de peso y porcentaje de grasa corporal

comparado con el grupo WD. Los animales del grupo WD+EU, pese a tener una ingesta

calórica similar al grupo WD, presentaron un menor peso corporal al final del

tratamiento comparado con el grupo WD. Los animales que recibieron EU, CNA o su

tratamiento combinado, presentaron en ayuno mayores niveles de ghrelina circulante.

Además, los animales del grupo WD+CNA presentaron un menor tamaño de los

adipocitos, medidos en el tejido adiposo blanco (TAB) retroperitoneal y menores

niveles circulantes de insulina en condiciones de alimentación ad libitum y mayores

niveles del ARNm del InsR en el TAB retroperitoneal, comparado con el grupo WD.

Los animales del grupo WD+EU presentaron un incremento en los niveles de expresión

hipotalámica del ARNm de Lepr comparado con el grupo WD. Finalmente, los animales

alimentados con WD y que recibieron el tratamiento combinado EU+CNA presentan un

aumento en la expresión hepática del ARNm de Cd36, InsR e Irs1.

Como conclusión, la administración EU, CNA, solos o en combinación previenen del

aumento de peso y porcentaje de grasa corporal frente a una dieta obesogénica. Por

tanto, ambos compuestos emergen como posibles bioactivos potenciales como terapia

en el control de la obesidad y alteraciones asociadas. Si bien, los mecanismos

moleculares no están totalmente esclarecidos.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

74

4.2.1. Resultados

Ingesta y parámetros biométricos

El objetivo de este estudio ha sido examinar el efecto del tratamiento de dos compuestos

bioactivos, el eugenol (EU) y el cinamaldehído (CNA) y su combinación (EU+CNA) en

el control de la obesidad frente a una dieta obesogénica en ratas.

Para ello se realizó un estudio in vivo usando un modelo animal de dieta obesogénica.

Las dietas obesogénicas están asociados con el aumento de peso corporal, aumento en

los depósitos de grasa y el desarrollo de una marcada resistencia a la insulina [299], y

resultan interesantes por su similitud con la obesidad dietética en humanos. En este

estudio se han utilizado ratas albinas Wistar machos de 4 meses de edad mantenidas en

condiciones de alimentación ad libitum y distribuidas en los siguientes grupos:

CONTROL, alimentado con una dieta estándar; recibieron PBS como

tratamiento vehículo.

WD (western diet), alimentado con dieta obesogénica (rica en grasas y azúcares

simples); recibieron PBS como tratamiento vehículo.

WD+EU, alimentado con una WD+40mg/kg/día de eugenol.

WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído.

WD+EU+CNA, alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol

y cinamaldehído, respectivamente.

El tratamiento se realizó durante 30 días. Se midió la cantidad exacta del alimento

consumido en condiciones de alimentación ad libitum durante todo el experimento

(Figura 4.10). Los animales del grupo WD consumieron un total de 222 Kcal más que

los animales CONTROL. Se observó que los animales alimentados con dieta WD y que

recibieron los tratamientos de CNA y EU+CNA presentan una menor ingesta

acumulada comparado con el grupo WD (p<0,05, DMS, prueba post hoc).

Figura 4.10. Ingesta total acumulada. Cantidad de Kilocalorías totales consumidas por ratas

Wistar durante 30 días en condiciones de alimentación ad libitum distribuidas en los siguientes

grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado con

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

75

dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol;

WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA,

alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. Estadísticas:

Los datos son la media ± SEM. Tto, efecto tratamiento, p<0,05, ANOVA de un Factor. (a ≠ b ≠

c), p<0,05, DMS, prueba post hoc.

Estos cambios en la ingesta energética, podrían explicar los cambios observados en el

peso corporal de estos animales. Se realizó un seguimiento diario del peso corporal,

durante los 30 días de tratamiento y, como se observa en la Figura 4.11, los animales del

grupo WD incrementaron el peso corporal con respecto al grupo CONTROL. Sin

embargo, los animales del grupo WD+EU mantuvieron su peso muy similar a los del

grupo control y los animales de los grupos WD+CNA y WD+EU+CNA experimentaron

una reducción de peso corporal, incluso si los comparamos con el grupo CONTROL.

De hecho, el porcentaje de incremento total de peso desde el inicio al final del

tratamiento (Figura 4.11) muestra que los animales del grupo WD presentaron un mayor

incremento de peso corporal comparado con los animales de los grupos WD+CNA y

WD+EU+CNA (p<0,05, DMS, prueba post hoc). Incluso, cabe destacar que los

animales alimentados con dieta WD tratados con CNA y EU+CNA experimentaron una

pérdida de peso corporal.

Figura 4.11. Evolución del incremento de peso acumulado en gramos (A) y porcentaje del

incremento de peso total acumulado (B) durante el tratamiento de los animales distribuidos en

los siguientes grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet),

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

76

alimentado con dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de

eugenol; WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y

WD+EU+CNA, alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y

cinamaldehído. La flecha indica que los animales, a mitad del tratamiento, fueron expuestos a

un ayuno de 12 horas para la extracción de sangre en condiciones de ayuno. Estadísticas: Los

datos son la media ± SEM. Tto, efecto tratamiento, p<0,05, ANOVA de un Factor. (a ≠ b),

p<0,05, DMS, prueba post hoc.

Además, los animales WD y WD+EU incrementaron el porcentaje de grasa respecto a

su valor inicial (p<0,05, prueba T para muestras pareadas), mientras que no hubo

cambios significativos en los grupos CONTROL, WD+CNA y WD+EU+CNA (Figura

4.12). Al finalizar el tratamiento, los animales del grupo WD y WD+EU presentaron un

mayor incremento en el porcentaje de grasa corporal con respecto al grupo CONTROL

(p<0,05, DMS, prueba post hoc). Este mayor incremento se vio total o parcialmente

atenuado en los grupos WD+CNA y WD+EU+CNA respectivamente. Al finalizar el

tratamiento los animales del grupo CONTROL presentaron una pérdida del 0,40% en el

porcentaje de grasa corporal respecto al valor inicial, el grupo WD presentó un aumento

de 3,58% de grasa corporal, el grupo de animales WD+EU tuvo un incremento del

2,88% de grasa corporal, los animales del grupo WD+CNA presentaron un pequeño

incremento en el porcentaje de grasa (0,17%) y el grupo tratado con WD+EU+CNA un

presentaron un incremento del 1,25% de grasa corporal.

Figura 4.12. Porcentaje de grasa corporal medida al inicio y final de tratamiento (A) y cambio

en el porcentaje de grasa corporal (B) de los animales distribuidos en los siguientes grupos:

CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado con dieta

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

77

obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol; WD+CNA,

alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA, alimentado

con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. Estadísticas: Los datos

son la media ± SEM. A) Tto x T, p<0,05, efecto interactivo tiempo por tratamiento, análisis de

medidas repetidas. * p<0,05, para cada tratamiento valor final versus valor inicial, prueba T de

muestras pareadas. B) Tto, p<0,05, efecto tratamiento, ANOVA de un Factor. (a ≠ b), p<0,05,

DMS, prueba post hoc.

Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el peso de

los diferentes depósitos de tejido adiposo blanco (TAB), ni en el peso del tejido adiposo

marrón (TAM) (Tabla 4.1).

Tabla 4.1. Peso de los depósitos de tejido adiposo blanco y del tejido adiposo marrón y peso de

los tejidos adiposos viscerales (suma de los tejidos adiposos mesentérico, retroperitoneal y

epididimal).

Parámetros CONTROL WD WD+EU WD+CNA WD+EU+CNA

TAB

Mesentérico (g) 3,81 ± 0,94 5,54 ± 0,72 5,87 ± 1,27 5,13 ± 0,96 3,95 ± 0,57

TAB

Retroperitoneal (g) 8,53 ± 1,98 11,29 ± 1,27 11,58 ± 2,07 12,34 ± 2,13 10,18 ± 1,16

TAB

Epididimal (g) 6,69 ± 1,02 8,24 ± 1,26 9,75 ± 1,71 8,99 ± 1,73 8,51 ± 1,23

TAB

Inguinal (g) 7,26 ± 1,52 9,70 ± 1,15 8,05 ± 1,80 8,25 ± 1,47 6,78 ± 0,88

TAB

Visceral (g) 19,0 ± 3,9 25,1 ± 3,0 27,2 ± 5,0 26,5 ± 4,6 22,6 ± 2,3

TAM (g) 0,45 ± 0,02 0,57 ± 0,04 0,51 ± 0,10 0,52 ± 0,06 0,46 ± 0,05

Abreviaturas: WD, western diet; EU, eugenol; CNA, cinamaldehído; TAB, tejido adiposo blanco; TAM,

tejido adiposo marrón. TAB visceral suma de los depósitos de TAB mesentérico, retroperitoneal y

epididimal.

Parámetros sanguíneos

Niveles circulantes de glucosa, triglicéridos, ácidos grasos libres y colesterol.

Se analizaron los niveles circulantes de glucosa, triglicéridos y ácidos grasos libres de

los diferentes grupos experimentales medidos en condiciones de alimentación ad libitum

y tras un ayuno de 12 horas y los niveles circulantes de colesterol medidos en

condiciones de alimentación ad libitum. Estos resultados se muestran en la Figura 4.13.

Los niveles circulantes de glucosa fueron menores en los animales en condición de

ayuno comparado con la situación ad libitum (p<0,05, efecto ayuno, ANOVA de

medidas repetidas). Sin embargo, sólo los animales del grupo WD+EU presentaron

menores niveles circulantes de glucosa en condiciones de ayuno comparado con los

animales en condición de alimentación ad libitum (p<0,05, prueba T para muestras

pareadas).

En todos los grupos, los animales en condiciones de ayuno presentaron menores niveles

circulantes de triglicéridos comparado con los animales en condiciones ad libitum

(p<0,05, efecto ayuno, ANOVA de medidas repetidas). No hubo diferencias en los

niveles circulantes de triglicéridos entre los diferentes grupos experimentales. Los

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

78

niveles circulantes de ácidos grasos libres en respuesta a la condición de ayuno fueron

diferentes dependiendo del tratamiento (p<0,05, efecto interactivo ayuno por

tratamiento, ANOVA de medidas repetidas). Mientras que en los animales control se

observó un aumento significativo en los niveles circulantes de ácidos grasos libres en

respuesta al ayuno, este aumento no se observó en los otros grupos experimentales. Esta

falta de respuesta al ayuno puede atribuirse al ingesta de la dieta WD. Los niveles

circulantes de colesterol, medido en condiciones de alimentación ad libitum, fueron

similares en todos los grupos experimentales.

Figura 4.13. Niveles circulantes de glucosa, triglicéridos, ácidos grasos libres y colesterol. Se

midió los niveles circulantes de glucosa, triglicéridos y ácidos grasos libres en condiciones ad

libitum (al final del tratamiento) o tras 12 horas de ayuno (a mitad del tratamiento) y de

colesterol en condiciones de alimentación ad libitum, en ratas Wistar distribuidas en los

siguientes grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet),

alimentado con dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de

eugenol; WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y

WD+EU+CNA, alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y

cinamaldehído. Estadísticas: Los datos son la media ± SEM. A, efecto ayuno; AxTto, efecto

interactivo ayuno por tratamiento; p<0,05, ANOVA de medidas repetidas. *, Ayuno versus ad

libitum, p<0,05 prueba T para muestras pareadas.

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

79

Niveles de leptina, insulina y ghrelina

Los niveles circulantes de leptina, insulina y ghrelina de los diferentes grupos

experimentales medidos en condiciones de alimentación ad libitum y tras un ayuno de

12 horas. Los resultados se presentan en la Figura 4.14.

Figura 4.14. Niveles circulantes de leptina, insulina y ghrelina. Se midieron los niveles

circulantes de leptina, insulina y ghrelina en ratas Wistar en condiciones ad libitum (al final del

tratamiento) o 12 horas de ayuno (a mitad del tratamiento), distribuidas en los siguientes grupos:

CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado con dieta

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

80

obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol; WD+CNA,

alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA, alimentado

con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. Estadísticas: Los datos

son la media ± SEM. A, efecto ayuno; AxTto, efecto interactivo ayuno por tratamiento; p<0,05,

ANOVA de medidas repetidas. *, p<0,05, ayuno versus ad libitum, prueba T para muestras

pareadas. #, p<0,05, versus grupo WD, U de Mann-Whitney; (A≠B≠C) p<0,05 DMS, prueba

post hoc.

Los niveles circulantes de leptina fueron menores cuando los animales se encontraban

en condiciones de ayuno comparado con la condición de alimentación ad libitum en

todos los grupos experimentales (p<0,05, efecto ayuno, ANOVA de medidas repetidas).

No hubo diferencias en los niveles circulantes de leptina entre los diferentes grupos

experimentales.

Los niveles circulantes de insulina también fueron menores en los animales en

condición de ayuno comparado con la situación de alimentación ad libitum cuando se

analizan los datos por ANOVA de medidas repetidas (p<0,05, efecto ayuno, ANOVA

de medidas repetidas). Sin embargo, sólo los animales del grupo WD+EU presentaron

menores niveles circulantes de insulina en condiciones de ayuno comparado con los

animales en condición de alimentación ad libitum, significativos cuando se realiza una

comparación por pares (p<0,05, prueba T para muestras pareadas). Cabe destacar que

en condiciones de alimentación ad libitum, los animales del grupo WD+CNA presentan

valores inferiores de insulina circulante que los animales del grupo WD (p<0,05, U de

Mann-Whitney).

Los niveles de ghrelina en respuesta a la condición de ayuno fueron diferentes

dependiendo del tratamiento (p<0,05, efecto interactivo ayuno por tratamiento,

ANOVA de medidas repetidas). En condiciones de alimentación ad libitum no se

observaron diferencias en los niveles circulantes de ghrelina entre los diferentes grupos

experimentales. Sin embargo, si se comparan los niveles de ghrelina en situación de

ayuno se observa que los animales del grupo WD presentaron los menores valores de

ghrelina circulante, mientras que los grupos WD+EU, WD+CNA y WD+EU+CNA

presentaron mayores niveles de ghrelina circulante que los animales del grupo

CONTROL y WD (p<0,05, DMS, prueba post hoc). Además, los animales del grupo

WD en condiciones de ayuno presentaron menores niveles de ghrelina circulantes

comparado con la condición de alimentación ad libitum, mientras que los animales del

grupo WD+CNA presentaron mayores niveles de ghrelina circulante en condiciones de

ayuno que en condiciones ad libitum (p<0,05, prueba T para muestras pareadas).

Índice HOMA

Usando el modelo homeostático para evaluar la resistencia a la insulina se observa que

los grupos que fueron alimentados con WD presentan mayores niveles de este índice

comparado con el grupo control, aunque estas diferencias no resultaron ser

estadísticamente significativas. Los resultados se presentan en la Figura 4.15.

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

81

Figura 4.15. Índice HOMA a los 15 días de tratamiento en ratas Wistar distribuidas en los

siguientes grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet),

alimentado con dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de

eugenol; WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y

WD+EU+CNA, alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y

cinamaldehído respectivamente.

Niveles de fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina

aminotransferasa (ALT)

AST, ALT son enzimas hepáticas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, cuyos

niveles elevados en la sangre pueden indican trastornos hepáticos. Niveles elevados de

fosfatasa alcalina pueden estar también relacionados con trastornos hepáticos.

Analizamos los niveles circulantes de estas tres encimas en nuestros grupos

experimentales, para comprobar si había daño hepático por efecto de los diferentes

tratamientos. Los resultados se muestran en la Figura 4.16

No hubo cambios significativos en los niveles circulantes de fosfatasa alcalina entre los

diferentes grupos experimentales. Sin embargo, los animales tratados con EU y CNA y

presentaron una tendencia a mayores niveles circulantes de fosfatasa alcalina

comparado con el grupo control y WD, aunque estos resultados no fueron

estadísticamente significativos. Tampoco hubo diferencias entre los grupos en cuanto a

los niveles circulantes de AST y ALT. Los animales del grupo WD+EU+CNA

presentaron niveles más elevados de ALT que el grupo CONTROL y WD, aunque

existe una gran variabilidad en este parámetro y los resultados no fueron

estadísticamente significativos. Además, los animales del grupo WD presentaron

mayores niveles de AST comparado con los niveles de los animales control y este

aumento no se observó en los animales alimentados con WD que recibieron EU, CNA o

su tratamiento combinado, aunque estos resultados tampoco fueron estadísticamente

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

82

significativos. Esto puede indicar que no se evidencia daño hepático por efecto de los

tratamientos.

Figura 4.16. Niveles circulantes de fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST) y

alanina aminotransferasa (ALT) en ratas Wistar en condiciones ad libitum, distribuidas en los

siguientes grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet),

alimentado con dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de

eugenol; WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

83

WD+EU+CNA, alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y

cinamaldehído.

Análisis morfométrico del tejido adiposo blanco retroperitoneal (rpTAB) e inguinal

(IngTAB)

Se ha realizado un análisis morfométrico del rpTAB e IngTAB, en los que se ha medido

el diámetro de los adipocitos en cortes histológicos, para inferir el tamaño de los

adipocitos. Los resultados se muestran en la Figura 4.17

En el rpTAB los animales del grupo WD y WD+EU presentan adipocitos de mayor

tamaño (diámetro) que los animales CONTROL. Este aumento en el tamaño de los

adipocitos se ve total o parcialmente atenuado en los animales que recibieron

tratamiento con CNA o el tratamiento combinado, respectivamente (p<0,05, DMS,

prueba post hoc). Cabe señalar que en un animal el grupo WD+CNA se encontraron

adipocitos multiloculares (4-5 adipocitos moleculares por campo). Con respecto al

análisis realizado en el IngTAB, no se evidenciaron cambios en el tamaño de los

adipocitos entre los diferentes grupos experimentales.

Figura 4.17. A) Análisis del diámetro de los adipocitos del tejido adipos blanco retroperitoneal

(rpTAB) e inguinal (IngTAB), realizado en ratas Wistar distribuidas en los siguientes grupos:

CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado con dieta

obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol; WD+CNA,

alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA, alimentado

con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. Estadística: Tto, efecto

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

84

tratamiento, p<0,05, ANOVA de un Factor. a≠b; DMS, Post Hoc. B) Imágenes representativas

de cortes histológicos de rpTAB e IngTAB.

Expresión de genes relacionados con el balance energético en tejidos claves

Se analizaron los niveles de ARNm de Lepr, Ghsr, Socs3, Stat3, Npy y Pomc en el

hipotálamo (Figura 4.18). No se observaron cambios en los niveles de expresión de

Ghsr, Stat3, Npy y Pomc entre los diferentes grupos. Sin embargo, la expresión

hipotalámica de Socs3 disminuyó en los animales de los grupos WD+EU, WD+CNA y

WD+EU+CNA con respecto al grupo CONTROL (p<0,05 DMS, prueba post hoc).

Interesantemente, los animales del grupo WD+EU presentaron mayores niveles de

expresión del receptor de leptina, Lepr, con respecto al grupo WD (p<0,05, U de Mann-

Whitney).

Figura 4.18. Expresión de genes relacionados con el metabolismo energético en el hipotálamo

de ratas Wistar sacrificadas en condiciones de alimentación ad libitum distribuidas en los

siguientes grupos: control, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado

con dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol;

WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA,

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

85

alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. Los genes

analizados fueron: Ghsr, Lepr, Socs3, Stat3, Npy y Pomc. Estadísticas: Los datos son la media ±

SEM. Tto, efecto tratamiento, p<0,05, ANOVA de un factor. (a≠b) p<0,05, DMS, prueba post

hoc. #, versus grupo WD, p<0,05, U de Mann-Whitney.

Se analizó también la expresión de genes relacionados con el metabolismo energético

en el hígado. Los resultados se presentan en la Figura 4.19.

Los animales del grupo WD+EU+CNA mostraron un aumento en los niveles de

expresión hepática del gen Cd36, que participa en la captación de ácidos grasos,

comparado con el resto de los grupos (p<0,05, DMS, prueba post hoc). Por otra parte,

todos los grupos que recibieron una dieta WD, con o sin tratamiento, mostraron un

aumento en los niveles de expresión del ARNm de los genes lipogénicos Srebf1 y Scd1

en el hígado, en comparación con los animales del grupo CONTROL, aunque esta

diferencia fue estadísticamente significativa solo en el caso del Scd1 (p<0,05, efecto

tratamiento, ANOVA de un factor). No se observaron cambios entre los diferentes

grupos en la expresión hepática de Fasn (lipogénico) ni en los genes relacionados con la

oxidación de ácidos grasos, Ppara, Fgf21, Cpt1a y Pdk4, captación y metabolismo de

glucosa (Gck) ni en la expresión del receptor de leptina (Lepr). Aunque, cuando ese

analizan en conjunto, no se observan cambios en los niveles de expresión hepática de

los genes relacionados con la señalización de insulina entre los diferentes grupos, los

animales del grupo WD+EU+CNA presentan mayores niveles del ARNm de Insr

(p=0,016, U de Mann-Whitney) e Irs1 (p=0,063, U de Mann-Whitney)

Por último, también se analizó la expresión de genes relacionados con el metabolismo

energético en el tejido adiposo blanco retroperitoneal. Los resultados se presentan en

la Figura 4.20.

Los animales de los grupos WD, WD+CNA y WD+EU+CNA mostraron una menor

expresión del gen que codifica para GLUT4, Slc2a4, comparado con los animales del

grupo CONTROL (p<0,05, DMS, prueba post hoc). Los animales del grupo WD+CNA

muestraron una mayor expresión del ARNm del Insr comparado con los animales WD y

los animales del grupo CONTROL (p<0,05, DMS, prueba post hoc). Los animales del

grupo WD, WD+CNA, WD+EU+CNA presentaron menores niveles de expresión del

ARNm de Fasn comparado con los animales del grupo CONTROL (p<0,05, DMS,

prueba post hoc). Los animales del grupo WD+EU presentaron una menor inhibición en

la expresión del ARNm de Fasn. De hecho, el grupo WD+EU tiene niveles

incrementados del ARNm de Fasn comparado con el grupo WD (p<0,05, DMS, prueba

post hoc). En los genes relacionados con la captación de ácidos grasos (Lpl y Cd36),

lipogénesis (Pparg y Srebf1), lipólisis (Pnpla2), oxidación de ácidos grasos (Cpt1b),

metabolismo de la glucosa (Hk2) y la leptina (Lep), no se observaron cambios

significativos entre los diferentes grupos experimentales. Tampoco hubo diferencias en

la expresión de Cidea, marcador de marronización, entre los diferentes grupos

experimentales.

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

86

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

87

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

88

Análisis de los niveles proteicos de UCP1 en tejido adiposo marrón

Realizamos un western blot para cuantificar los niveles de UCP1 en tejido adiposo

marrón. Los resultados se muestran en la Figura 4.21. Se observó que no hay cambios

significativos en los niveles de UCP1 entre los diferentes grupos. Por tanto, estos

resultados parecen indicar que ni la dieta WD ni ninguno de los tratamientos produjo

una activación de la termogénesis.

Figura 4.21. Niveles de la proteína UCP1 medidos en el tejidos adiposo marrón (TAM) de ratas

Wistar sacrificadas en condiciones de alimentación ad libitum distribuidas en los siguientes

grupos: CONTROL, alimentado con una dieta estándar; WD (western diet), alimentado con

dieta obesogénica; WD+EU: alimentado con una dieta WD+40mg/kg/día de eugenol;

WD+CNA, alimentado con una dieta WD+250mg/kg/día de cinamaldehído; y WD+EU+CNA,

alimentado con una dieta WD+40 y +250mg/kg/día de eugenol y cinamaldehído. En la parte

inferior se presenta la cuantificación por western blot de los niveles de UCP1 y HSP90 en tejido

adiposo marrón.

4.2.2. Discusión

La obesidad y la diabetes mellitus afectan a más de un tercio de la población mundial

actual y, si la tendencia continúa, para 2030 se estima que el 38% de la población adulta

mundial tendrá sobrepeso y otro 20% será obeso [300]; la prevalencia de la diabetes se

espera que sea el doble, de 2,8% en 2000 a 4,4% en 2030 con la mayor proporción de

este aumento en los países de bajos a medianos ingresos de Asia, África y América del

Sur [301].

En un intento de mejorar los resultados de los tratamientos de la obesidad y al mismo

tiempo mejorar el bienestar general, hay una tendencia emergente en todo el mundo

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

89

para que los pacientes usen medicamentos complementarios y alternativos [302]. Los

medicamentos complementarios y alternativos han generado gran interés por la

académica y la industrial debido a su alta prevalencia de uso. El Centro Nacional para la

Medicina Complementaria y Alternativa de Los Estados Unidos define CAM

(Complementary and Alternative Medicine) como "un grupo de sistemas médicos y de

asistencia sanitaria, prácticas y productos que actualmente no se consideran parte de la

medicina convencional", y promueve el uso de la medicina complementaria con la

terapia convencional [302].

Se han atribuido diferentes propiedades saludables a especias como, por ejemplo, la

canela ya que se ha descrito que poseen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias,

y/o antidiabéticas [240, 269]. El cinnamaldehído (CNA), es uno de los compuestos

mayoritarios de la canela. Su administración produce efectos antihiperglicémicos y anti-

obesidad en ratones [256, 281] y en cultivos in vitro se ha observado un efecto

antiadipogénico [249]. El eugenol (EU), es un compuesto mayoritario que se puede

extraer del clavo de olor. Su efectos antidiabéticos, han sido descritos ampliamente en la

bibliografía, mejorando la hiperglicemia vía inhibición de la gluconeogénesis hepática

[236, 237]. Por tanto, compuestos bioactivos como el EU y el CNA emergen como

posibles adyuvantes en el control o tratamiento de la diabetes y la obesidad [303, 304].

Ante una dieta WD los animales ganaron más peso corporal y presentaron un

incremento en el porcentaje de grasa corporal respecto a los animales alimentados con

una dieta estándar, probablemente debido a la mayor ingesta energética observada en

estos animales. Estos efectos se previnieron si junto a la dieta WD se administra, CNA y

el tratamiento combinado de ambos compuestos. La administración de EU junto a la

dieta WD, aunque no afecta a la ingesta energética de los animales si lo comparamos

con los animales del grupo WD, presentan un menor incremento de peso corporal

aunque no un menor incremento en el porcentaje de grasa corporal tras 30 días. La

administración de CNA a animales alimentados con dieta WD, previene el incremento

en el peso y el porcentaje de grasa asociado a la ingesta de la dieta obesogénica.

Además, el tamaño de los adipocitos en el tejido adiposo blanco retroperitoneal es

menor que en animales WD, y similar a los adipocitos de los animales del grupo

control.

Curiosamente, el CNA parece ejercer un cierto efecto anorexigéncio, ya que los

animales tratados con CNA presentan una menor ingesta energética, comparada con los

animales del grupo WD, que podría explicar la menor ganancia de peso. Otros estudios

han mostrado que en ratones el tratamiento agudo con CNA reduce la ingesta [256] y

también existe una reducción en la ingesta acumulada en ratones alimentados 12

semanas con una dieta rica en grasa y después tratados durante 8 semanas con CNA

(40mg/kg/día) [305]. Cabe destacar que no se han observado cambios a nivel

hipotalámico en el expresión del Npy (vía oxerigénica), ni en la expresión del Pomc (vía

anorexigéncia).

Además, en estudios realizados en ratones se ha observado que el tratamiento con CNA

reduce la ganancia de peso corporal [256, 305], reduce el tamaño de los adipocitos

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

90

[305], mejora la tolerancia a la glucosa [256], y la sensibilidad a la insulina [305]. De

forma similar, en nuestro estudio observamos que la administración de CNA a ratas

alimentadas con una dieta WD existe un efecto hipoinsulinémico que podría indicar una

mejora metabólica en estos animales con respecto a los animales del grupo WD.

Estudios en los que se han usado extractos de canela, que contiene como compuesto

bioactivo mayoritario el CNA, un aumento en los niveles de proteínas implicadas en la

señalización de la insulina [252, 306]. En animales también se ha descrito un efecto

directo del CNA con cambios en los niveles de expresión de proteínas implicadas en la

señalización [281], que podría explicar el efecto del CNA mejorando la sensibilidad a la

insulina en ratones [281]. Aunque en nuestro estudio no hemos analizado los valores de

las proteínas implicadas en la señalización de la insulina, los animales WD+CNA

presentan un incremento en la expresión del ARNm de InsR en el tejido adiposo blanco

retroperitoneal, que podría relacionarse con una cierta mejora en la sensibilidad a la

insulina en este tejido.

Aunque se ha descrito extensamente en la bibliografía el efecto de EU en la mejora de la

glucemia en animales diabéticos [237, 238, 303], en nuestro modelo, animales

alimentados con una dieta WD y tratados con EU, no hemos observado cambios en la

glucemia. Esta diferencia puede deberse a que los estudios citados se han realizado en

ratas diabéticas y, en nuestro caso todos los animales tienen niveles glucémicos

similares a las ratas control.

Los animales del grupo WD+EU presentaron un menor incremento en el peso corporal

que los animales del grupo WD, pese a tener una ingesta calórica similar. Hemos

analizado los niveles de la proteína UCP1 en el TAM, para determinar si este menor

incremento en el peso pueda deberse a un aumento en la termogénesis. La capacidad

termogénica del TAM depende de la actividad de la de la proteína UCP1, que se

encuentra en el interior de membrana mitocondrial. La expresión de Ucp1 es sensible a

los estímulos externos como la exposición al frío o la sobrealimentación crónica que

inducen termogénesis. Curiosamente no se han observado diferencias en los niveles de

UCP1 en animales que recibieron los diferentes tratamiento, por lo que el menor

aumento en el peso corporal de los animales del grupo WD+EU no puede explicarse por

una mayor activación en la termogénesis. Creemos que quizás el tratamiento con EU

haya podido afectar a la absorción intestinal, si bien, no hemos realizado ninguna

medición, como por ejemplo análisis de la composición de las heces, para confirmar

esta hipótesis.

La proteína CD36 se encarga de la captación de ácidos grasos en el hígado facilitando la

captación y el transporte intracelular de los ácidos grasos de cadena larga. El aumento

de la expresión de la proteína hepática CD36 en respuesta a una dieta rica en grasa es

suficiente para aumentar el almacenamiento de triglicéridos hepáticos [307, 308]. En

contradicción a lo que pensábamos, el tratamiento combinado EU+CNA produce un

aumento significativo en la expresión del ARNm de Cd36, sugiriendo un aumento en la

captación de ácidos grasos y la acumulación de los triglicéridos en el hígado. Si bien, no

se observan cambios en la expresión de genes hepáticos lipogénicos, en los animales

que recibieron los diferentes tratamientos, ni tampoco en genes relacionados con la

4. Resultados y Discusión

Capítulo 2

91

oxidación de ácidos grasos, lo que sugiere que en nuestro caso los tratamientos

administrados junto a la dieta WD no han modificado la expresión de genes implicados

en el metabolismo de lipídos a nivel hepático. Cabe destacar que los animales tratados

con CNA y EU no hay diferencias en los niveles de los marcadores bioquímicos de

transaminasa, sugiriendo que estos tratamientos no han producido, aparentemente,

ningún efecto hepatotóxico. De forma análoga, se ha descrito que en ratas diabéticas la

administración de 80mg/kg/día durante un periodo de 30 días, una dosis doble a la

usada en el presente estudio, restablece los niveles de AST, ALT y ALP, mostrando el

efecto protector en la función hepática de este compuesto [238]. Además, en ratas con

diabetes inducida por estreptomicina y tratadas con CNA 20 mg/kg de peso corporal

durante 45 días se restablecieron los valores circulantes de AST, ALT y ALP [309].

4.2.3. Conclusiones

La administración de EU y CNA previene del aumento de peso corporal frente a una

dieta obesogénica. Además el CNA reduce la ingesta, el tamaño de los adipocitos y

mejora los niveles circulantes de insulina. Por tanto, ambos compuestos emergen como

posibles compuestos bioactivos en el control de la obesidad y alteraciones asociadas.

Sin embargo la combinación de EU y CNA no produce efectos sinérgicos, tal como

observamos en el experimento in vitro (capítulo 4.1). Este hecho puede deberse a

diferencia en las dosis utilizadas, ya que en el experimento in vitro se utilizaron mezclas

equimolares de ambos compuestos, a diferencia de la combinación de dosis in vivo.

Además, no pueden descartarse otros mecanismos asociados a la interacción global de

los compuestos en el organismo y que no se limitan a un tejido en particular.

93

Efesios 4:23-24 “Ustedes deben cambiar

completamente su manera de pensar, y ser

honestos y santos de verdad, como corresponde a

personas que Dios ha vuelto a crear, para ser

como él.”

5 RECAPITULACIÓN

5. Recapitulación

95

5. Recapitulación

Los experimentos y la metodología de la presente tesis doctoral fueron diseñados para

identificar el efecto del tratamiento de los compuestos bioactivos eugenol (EU),

cinamaldehído (CNA) y su tratamiento combinado (EU+CNA) sobre la expresión de

genes relacionados con el metabolismo lipídico, como posible ayuda en el diseño de

estrategias para el control de la obesidad. Nuestros resultados aportan datos novedosos

sobre la capacidad hipolipemiante de los tratamiento con EU, CNA y EU+CNA en la

línea celular 3T3-L1 durante la diferenciación y adipocitos maduros. Además, la

administración de estos bioactivos disminuyo la ganancia de peso corporal en ratas

alimentadas con una dieta obesogénica.

En primer lugar analizamos in vitro el efecto del EU, CNA y su tratamiento combinado

en células 3T3-L1 durante su diferenciación y en adipocitos maduros sobre la expresión

de marcadores adipogénicos de genes implicados en el metabolismo lipídico. La línea

celular 3T3-L1 es un modelo bien establecido en estudios de señalización ya que se ha

demostrado que presentan las características propias de adipocitos. Los resultados

obtenidos en este estudio sugirieren que los compuestos bioactivos EU, CNA y su

tratamiento combinado EU+CNA tienen un efecto antilipogénico, sobretodo en el caso

del tratamiento en adipocitos maduros pero no afectan al proceso de diferenciación o

adipogénesis.

Los resultados in vitro en adipocitos maduros tratados durante 24 horas con diferentes

concentraciones de EU, CNA y EU+CNA muestran un efecto dosis/respuesta sobre la

expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico (Capitulo 1). Los tratamientos

con dosis altas de EU y CNA por separado, ejercen un efecto positivo disminuyendo la

acumulación de triglicéridos, ya que los resultados de la tinción con Oil-Red (Figura

4.5) mostraron que estos tratamientos disminuye el contenido lipídico. Pero resaltamos

que el tratamiento combinado de EU+CNA produce una disminución del contenido

lipídico que se observa ya incluso con la menor dosis, esto nos permite sugerir que los

dos compuestos administrados conjuntamente tienen un efecto hipolipemiante. Estos

cambios en el contenido lipídico podrían ser explicados por los cambios en la expresión

de genes clave, ya que, también fue evidente el efecto de los tratamientos sobre la

expresión de marcadores adipogénicos y/o de genes implicados en el metabolismo

lipídico (Figura 4.2, 4.3 y 4.4).

La expresión de Pparg aumenta durante la diferenciación (Figura 4.7), produciéndose

un gran aumento a finales de la diferenciación (especialmente en T6 y T8). Recordemos

que tanto Pparg como Srebf1 son factores clave que inducen y controlan la

diferenciación completa de los preadipocitos a los adipocitos maduros y de esta manera

regulan la adipogénesis y la lipogénesis [290]. En adipocitos maduros observamos que,

por sí solos, el tratamiento de EU y CNA no afectan la expresión de Pparg ni de Srebf1.

Sin embargo el tratamiento combinado muestra un efecto sinérgico en la inhibición de

la expresión tanto de Pparg como de Srebf1. Paralelamente a la disminución en la

expresión de estos dos factores de transcripción relacionados con la adipogénesis y la

lipogénesis, nuestros resultados muestran que el tratamiento individual de EU y CNA

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

96

reduce significativamente la expresión de Fasn; y además el tratamiento combinado de

EU+CNA muestra un efecto sinérgico al inhibir de manera importante, y a menor dosis,

la expresión de Fasn tras 24 h de tratamiento.

Se ha descrito in vitro que Fasn se expresa tanto en preadipocitos como en adipocitos

maduros de la línea celular 3T3-L1 desempeñando un papel central en la lipogénesis

[292, 293]. Cabe destacar, que si el tratamiento se realiza durante el proceso de

diferenciación, la expresión de estos genes lipogénicos se ve disminuida tanto en los

tratamientos individuales como en el tratamiento combinado, pero solo al final de la

diferenciación (T8). Estos resultados sugieren que tanto el EU como el CNA ejercen sus

efectos antilipogénicos en adipocitos ya maduros, o en estadios finales de maduración

(Figura 4.8). Interesantemente, un estudio demostró que el extracto de las ramas de

canela (Cinnamomum Ramulus) reduce la expresión de Pparg, Srebf1 y Fasn, entre

otros, en adipocitos 3T3-L1, a través de la activación de la señalización de insulina vía

AMPK/PI3K y IRS-1 [294]. Las células 3T3-L1 aumentan su capacidad de unión a la

insulina durante la diferenciación por el aumento en la síntesis de receptores de insulina

[295]. Nuestros datos muestran que el tratamiento con dosis mayores a 50 μM y

menores de 400 μM de CNA disminuye la expresión del Insr en adipocitos maduros

(Figura 4.8). Durante la diferenciación con los tres tratamientos EU, CNA y EU+CNA

disminuyen la expresión de Insr en el T8 al final de la diferenciación.

También hemos observado cambios en la expresión de genes relacionados con la

movilización y la oxidación de ácidos grasos. CNA a dosis de 400 μM y el tratamiento

combinado de EU+CNA aumentaron la expresión Cpt1b (que codifica para CPT1b

implicada en la oxidación de ácidos grasos) en adipocitos maduros. En el caso del

tratamiento combinado, el aumento que se observa, se debe probablemente al efecto del

CNA per se. Por tanto, ni el CNA ni el EU parece tener un efecto claro en la activación

de la oxidación de ácidos grasos cuando se administra en adipocitos maduros (Figura

4.7). Por otro lado, el CNA inhibe la expresión de Pnpla2 (que codifica para proteína

ATGL, con actividad triglicérido lipasa) en adipocitos maduros (Figura 4.7 y 4.8). Cabe

destacar que estos efectos no se observan en el tratamiento con EU, por lo que la

disminución en los niveles del ARNm de Pnpla2 observado en el tratamiento

combinado es probablemente debida al efecto individual del CNA. Por tanto, el

tratamiento con CNA parece atenuar la movilización de triglicéridos, debido a la

inhibición de la transcripción de Pnpla2, que codifica para el primer enzima clave en la

hidrólisis de los triglicéridos (Figura 4.8). Curiosamente, en células 3T3-L1 incubadas

con medios de cultivo libre de insulina se ha descrito un aumento dependiente del

tiempo en la expresión de Pnpla2; por el contrario la incubación en un medio

suplementado con insulina previno este aumento y promueve la disminución en la

expresión de Pnpla2 [296]. En nuestro diseño experimental las células son tratadas con

medio de cultivo que no es libre de suero y contiene insulina (5µg/ml) (Ver 3.

Materiales y Métodos. 3.1 Cultivo in vitro de la línea celular 3T3-L1). Por lo que este

efecto inhibitorio en la expresión de Pnpla2 puede estar acentuado por la insulina

presente en el medio.

5. Recapitulación

97

La capacidad lipolítica de los adipocitos disminuye cuando hay obesidad, esta capacidad

lipolítica mediada por la movilización de las reservas de triglicéridos es coordinada por

la ATGL y la HSL (codificada por el gen Lipe). La expresión de Lipe disminuye

significativamente en los adipocitos de sujetos obesos [297]. Nuestros resultados

muestran que los tratamientos con EU y CNA producen una disminución en la

expresión de Lipe al final de la diferenciación como consecuencia del tratamiento

durante toda la diferenciación (Figura 4.8). Curiosamente, cuando se tratan adipocitos

maduros se produce una inhibición en la expresión de Lipe solo a altas concentraciones

con el tratamiento de EU. Sin embargo, la expresión de este gen sí que disminuye con

tratamiento combinado EU+CNA durante 24 h en adipocitos maduros a dosis más bajas

(Figura 4.7). Por tanto, in vitro parece que existe una inhibición en la movilización de

los triglicéridos almacenados, que estaría en contra del efecto antilipogénico que tienen

estos compuestos. Podríamos pensar que se trata de un mecanismo compesatorio, al

haber menos lipogénesis y acumulación de lípidos por el tratamiento, habría una

disminución de la necesidad de movilizar lípidos, o las reservas existentes se agotarían

antes, por lo que se inhibiría la expresión de estos genes, al no haber más reservas que

movilizar. Los resultados de la tinción Oil-Red, apoyarían esta hipótesis (Figura 4.5).

Quisimos ver también el efecto de la administración de EU, CNA y EU+CNA en un

estudio in vivo en ratas albinas Wistar machos de 4 meses de edad para analizar el

efecto de estos tratamientos frente a la exposición de una dieta obesogénica en el control

del balance energético (Capitulo 2). La administración oral de EU, CNA y el

tratamiento combinado EU+CNA disminuye la ganancia de peso corporal (Figura 4.11).

Tras el tratamiento, los animales del grupo WD+CNA y WD+EU+CNA presentaron

una menor ingesta calórica (Figura 4.10), esto podrían explicar los cambios observados

en el peso corporal de estos animales. Sin embargo, no se han observado cambios a

nivel hipotalámico en el expresión del neuropéptido orexigéncio Npy, ni en la expresión

del neuropéptido anorexigéncio Pomc. Además, los animales tratados con CNA y

EU+CNA presentaron un menor incremento en porcentaje de grasa corporal comparado

con el grupo WD (Figura 4.12). Así como, un menor tamaño de los adipocitos del

rpTAB (Figura 4.17).

La administración de CNA a ratas alimentadas con una dieta WD produce un efecto

hipoinsulinémico que podría indicar una mejora metabólica en estos animales con

respecto a los animales del grupo WD. Aunque en nuestro estudio no hemos analizado

los valores de las proteínas implicadas en la señalización de la insulina, los animales

WD+CNA presentan un incremento en la expresión del ARNm de Insr en el tejido

rpTAB, que podría relacionarse con una cierta mejora en la sensibilidad a la insulina en

este tejido.

Los animales del grupo WD+EU, pese a tener una ingesta calórica similar al grupo WD,

presentaron un menor peso corporal al final del tratamiento comparado con el grupo

WD. No se han observado diferencias en los niveles de UCP1 en estos animales, por lo

que el menor aumento en el peso corporal de los animales del grupo WD+EU no puede

explicarse por una mayor activación en la termogénesis. Los animales del grupo

Alberto Ángel Martín, Tesis Doctoral

98

WD+EU presentaron una menor inhibición en la expresión del ARNm de Fasn. De

hecho, el grupo WD+EU tiene niveles incrementados del ARNm de Fasn comparado

con el grupo WD (Figura 4.20).

Aunque se ha descrito que existe una mejora en la glucemia en animales diabéticos

tratados con EU [237, 238, 303], en nuestro modelo no hemos observado cambios en la

glucemia. Esta diferencia podría deberse a que los efectos hipoglucemiantes del EU se

observan en animales que presentan una alteración en los niveles de glucosa; los

estudios citados se han realizado en ratas diabéticas. En nuestro estudio los animales no

presentan alteración en los niveles glucémicos, y por tanto no veríamos el efecto de

mejora que sí se observa en animales diabéticos.

Para concluir, el tratamiento combinado de compuestos bioactivos EU+CNA actúa

como un potente inhibidor dosis-dependiente en la expresión de los genes lipogénicos

(Srebf1, Pparg y Fasn) y un activador de la expresión de Cpt1b en adipocitos maduros

in vitro. Esto sugiriendo un efecto antilipogénico de estos compuestos porque este

efecto en la inhibición de genes clave implicados en la lipogénesis se produce en

adipocitos maduros, pero no afectan al proceso de diferenciación o adipogénesis. Si

bien, no se han observado cambios en la expresión de estos genes in vivo, en animales

tratados con EU, CNA y su combinación EU+CNA.

Aunque in vitro se ha observado un claro ejemplo sinérgico hipolipemiante de ambos

compuestos, este efecto no se observa in vivo. Posiblemente por que las dosis de los dos

experimentos (in vitro e in vivo) no son extrapolables El tratamiento combinado en

animales presenta efectos muy similares a los observados en animales tratados sólo con

CNA, por lo que deducimos que los efectos observados del tratamiento combinado se

deben principalmente a los efectos del CNA.

El CNA parece ejercer un cierto efecto anorexigénico que podría explicar la menor

ganancia de peso y grasa corporal. Además, la administración de CNA a ratas

alimentadas con una dieta WD produce un efecto hipoinsulinémico y una mejora en la

sensibilidad a la insulina en el rpTAB. Los animales del grupo WD+EU, pese a tener

una ingesta calórica similar al grupo WD, presentaron un menor peso corporal al final

del tratamiento comparado con el grupo WD.

Estos resultados permiten concluir que el tratamiento con EU, CNA y EU+CNA

previene del aumento de peso corporal frente a una dieta obesogénica. Además el CNA

reduce la ingesta de alimentos, el tamaño de los adipocitos y mejora los niveles

circulantes de insulina. Los anteriores resultados aportan un mayor conocimiento sobre

estos biocompuestos como ayuda en las estrategias para el control de la obesidad. Por

tanto, ambos compuestos emergen como posibles compuestos bioactivos potenciales

como terapia en el control de la obesidad y alteraciones asociadas.

99

Colosenses 2:6-7 “Ustedes han aceptado a

Jesucristo como su dueño y Señor. Por eso,

deben vivir como a él le agrada. Tal como se les

enseñó, confíen cada vez más en él, y vivan

obedeciendo sus enseñanzas para ser cada vez

mejores, y den siempre gracias a Dios.”

6 CONCLUSIONES

6. Conclusiones

101

6. Conclusiones

1. El tratamiento combinado de cinamaldehído y eugenol revela un efecto sinérgico de

ambos bioactivos en la inhibición dosis-respuesta de la expresión de los genes

lipogénicos (Srebf1, Pparg, Fasn), sugiriendo un efecto antilipogénico in vitro de estos

compuestos.

2. El tratamiento in vitro con eugenol (400 μM) disminuye la expresión del ARNm de

Fasn (gen lipogénico) y Lipe (gen relacionado con la movilización de lípidos) y el

tratamiento con CNA (400 μM) que disminuye la expresión de Fasn (gen lipogénico) y

aumenta la expresión de Cpt1b (gen relacionado con la oxidación de ácidos grasos) en

comparación con el tratamiento de control.

3. Los compuestos bioactivos cinamaldehído, eugenol y su tratamiento combinado

afectan la expresión de genes clave implicados en el metabolismo lipídico en adipocitos

maduros de la línea celular 3T3-L1, pero no afectan al proceso de diferenciación o

adipogénesis.

4. La administración de cinamaldehído (250 mg/kg/día) a animales alimentados con

dieta western diet, previene del incremento en el peso y el porcentaje de grasa asociado

a la ingesta de la dieta obesogénica. Además, el tamaño de los adipocitos en el tejido

adiposo blanco retroperitoneal es menor que en animales western diet, y similar a los

adipocitos de los animales del grupo control.

5. El cinamaldehído parece ejercer un cierto efecto anorexigénico, ya que los animales

tratados con cinamaldehído presentan una menor ingesta energética, comparada con los

animales del grupo western diet, que podría explicar la menor ganancia de peso.

6. La administración de cinamaldehído a ratas alimentadas con una dieta westen diet

mejora los niveles circulantes de insulina, lo que podría indicar una mejora metabólica

en estos animales con respecto a los animales del grupo western diet.

7. Los animales alimentados con una dieta westen diet y tratados con eugenol

(40mg/kg/día) presentaron un menor incremento en el peso corporal que los animales

del grupo western diet, pese a tener una ingesta calórica similar. El menor aumento en el

peso corporal de los animales del grupo tratado con eugenol no puede explicarse por

una mayor activación en la termogénesis.

8. Los efecto sinérgico del EU+CNA que se observa in vitro no se reproduce en el

estudio in vivo con la dosis estudiada (combinación no equimolar).

9. Ambos compuestos, cinamaldehído y eugenol emergen como posibles compuestos

bioactivos en el control de la obesidad y alteraciones asociadas.

103

Filipenses 4:8 “Por último, hermanos, piensen

en todo lo verdadero, en todo lo que es digno de

respeto, en todo lo recto, en todo lo puro, en todo

lo agradable, en todo lo que tiene buena fama.

Piensen en toda clase de virtudes, en todo lo que

merece alabanza.”

7 REFERENCIAS

7. Referencias

105

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