tesis defendida por lluvia beatriz vargas gastélum y

Tesis defendida por

Lluvia Beatriz Vargas Gastélum

y aprobada por el siguiente Comité

Dra. Meritxell Riquelme Pérez Dra. Ana Elena Escalante Hernández

Codirector del Comité Codirector del Comité

Dr. Axayácatl Rocha Olivares Dra. Rufina Hernández Martínez

Miembro del Comité Miembro del Comité

Dr. Fernando Díaz Herrera Dr. Jesús Favela Vara

Coordinador Coordinador Programa de Posgrado

en Ciencias de la Vida

Encargado del Despacho de la Dirección de Estudios de Posgrado

Septiembre de 2013.

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DE ENSENADA

Programa de Posgrado en Ciencias

En Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología

Análisis metagenómico de la diversidad fúngica de un ecosistema semi-árido de

Baja California

Tesis

para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de Maestro en Ciencias

Presenta:

Lluvia Beatriz Vargas Gastélum

Ensenada, Baja California, México 2013

ii

Resumen de la tesis de Lluvia Beatriz Vargas Gastélum, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología. Análisis metagenómico de la diversidad fúngica de un ecosistema semi-árido de Baja California

Resumen aprobado por:

________________________________

_______________________________

El suelo es considerado como el reservorio de biodiversidad más grande del planeta. En ecosistemas terrestres, los hongos del suelo juegan un papel ecológico principal en el reciclaje de nutrientes, así como por sus relaciones mutualistas y patógenas con plantas. Una tercera parte de la superficie terrestre es considerada como árida o semi-árida. A pesar del papel fundamental que juegan los hongos en la dinámica de los ecosistemas, poco es sabido sobre su distribución, diversidad y abundancia en ecosistemas áridos y semi-áridos. Para evaluar la diversidad y abundancia de hongos en un ecosistema semi-árido con clima mediterráneo de Baja California, México, el espaciador interno transcrito (ITS) del ADN nuclear fue empleado como código de barras del ADN fúngico y pirosecuenciación 454 como plataforma de secuenciación. Fueron analizados dos micro-hábitats diferentes en verano e invierno, uno influenciado por la actividad de roedores (madriguera) y otro sin disturbio (superficie). Para todas las muestras se determinaron características físico-químicas del suelo. Se obtuvieron de 148×103 a 340×103 secuencias, correspondientes a 3,800-4,500 OTUs, dependiendo de la región ITS considerada y de la muestra. Consistentemente, los filos Ascomycota y Basidiomycota fueron los más abundantes. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas en relación a la composición y abundancia de la diversidad fúngica entre micro-hábitats así como entre estaciones del año. Estas diferencias estacionales entre micro-hábitats podrían ser debidas a las variaciones de temperatura y humedad del suelo que se registraron. Para determinar la influencia de dichos factores ambientales se empleó un análisis de correspondencia canónica, el cual sugiere que las muestras de superficie pueden estar mayormente influenciadas a cambios de humedad, mientras

Dra. Ana Elena Escalante Hernández

Codirector de tesis

Dra. Meritxell Riquelme Pérez Codirector de tesis

iii

que las muestras de madriguera pueden ser más sensibles a cambios de temperatura. El índice de Simpson indicó una gran riqueza de especies, ya que se obtuvieron valores entre 0.866 y 0.976. El índice de Shannon indicó una alta diversidad ya que se estimaron valores de 3.79 hasta 5.18. El índice de Chao 1 estimó valores de riqueza de 1,454 hasta 4,548, que en comparación al número de OTUs obtenido por tipo de muestra, indicó que el esfuerzo de muestreo no fue suficiente, siendo congruente con las curvas de rarefacción las cuales no alcanzaron la asíntota. Este estudio nos muestra que la composición de la comunidad fúngica en estos ecosistemas es influenciada por factores ambientales estacionales, algo que regularmente no es considerado en este tipo de estudios.

Palabras clave: Ecosistemas semi-áridos, diversidad fúngica, región ITS, pirosecuenciación

iv

Abstract of the thesis presented by Lluvia Beatriz Vargas Gastélum as a partial requirement to obtain the Master in Science degree of Life Sciences with an orientation in Microbiology. Metagenomic analysis of fungal diversity in a semi-arid ecosystem of Baja California Abstract approved by:

________________________________

________________________________

The soil is considered the largest reservoir of biodiversity in the world. In all terrestrial ecosystems, soil fungi play an important ecological role in nutrient recycling, and in addition they establish mutualistic and pathogenic interactions with plants. One third of the terrestrial surface is considered as arid or semi-arid. Despite of the fundamental role that fungi play in the ecosystem dynamics, little is known about their distribution, diversity and abundance in arid and semi-arid ecosystems. To assess the diversity and abundance of fungi in a semi-arid ecosystem with mediterranean climate from Baja California, Mexico, the internal transcribed spacer (ITS) of nuclear DNA was used as a marker for fungal DNA barcoding and a 454 pyrosequencing approach was undertaken. Two different micro-habitats, one influenced by rodent’s activity (burrow) and the other one with undisturbed soil (surface), were analyzed both in Winter and Summer. Physicochemical characteristics of the soil were also established. Between 148×103 and 340×103 sequences were obtained, resulting between 3,800 and 4,500 OTUs, depending on the sample and ITS region considered. Consistently, the phyla Ascomycota and Basidiomycota were the most abundant. However, significant differences were found in the composition and abundance of fungal diversity between the two micro-habitats as well as between the two seasons analyzed. These differences could be primarily due the seasonal season and micro-habitat variations in temperature and moisture registered. A canonical correspondence analysis was employed to determine the influence of the environmental factors; this analysis suggest that surface samples could be influenced by humidity changes, mean while the burrow samples coul be more sensitive to temperature changes. According to indexes results, the Simpson index showed that in all kind of samples there is a great species abundance, due to

Dra. Ana Elena Escalante Hernández

Codirector de tesis

Dra. Meritxell Riquelme Pérez Codirector de tesis

v

obtained values from 0.866 to 0.976; the Shannon index showed values from 3.79 to 5.18 indicating a high diversity. The Chao 1 index estimated richness values from 1,454 to 4,548, that in comparison with the OTUs numbers obtained by sample, indicating that the sampling effort was not sufficient, being consistent rarefaction curves that not reached the asymptote. This study showed that the fungal community composition in this ecosystem is influenced by seasonal environmental factors that are not commonly considered in this kind of studies.

Keywords: Semi-arid ecosystems, fungal diversity, ITS region, pyrosequencing

vi

Dedicatoria

A mi felicidad

Porque después de todo he comprendido que no se goza lo bien gozado

si no después de haberlo padecido. Porque después de todo he comprobado

que lo que tiene el árbol de florido, vive lo que tiene de sepultado.

vii

Agradecimientos Agradezco a mis padres por todo el apoyo y el cariño a lo largo de este camino que emprendí, sé que llevo años fuera de mi hogar, pero siempre los llevo conmigo. A mis hermanos por su apoyo incondicional y por hacerme reír. Agradezco al CICESE así como al Departamento de Ciencias de la Vida, por darme la oportunidad de realizar mis estudios de posgrado, pero aún más agradezco a Adriana Mejía y a Melissa Corral, secretarias del Departamento y de la Especialidad en Microbiología, que siempre estuvieron ahí para ayudarnos. Agradezco al CONACyT, por el financiamiento otorgado a través de una beca de manutención (#263435) y al haberme concedido su beca mixta para realizar un intercambio académico nacional. Agradezco a la Dra. Meritxell Riquelme, por haberme aceptado en su grupo de trabajo y por la enseñanza y el apoyo durante el desarrollo de esta investigación, la palabra “gracias” no es suficiente. A la Dra. Ana Escalante, por su apoyo durante el desarrollo de esta investigación, y sobre todo por haber contribuído enormemente a mi desarrollo profesional, ¡Muchísimas gracias!. Al comité conformado por el Dr. Axayácatl Rocha y la Dra. Rufina Hernández, por su valioso apoyo y observaciones durante el desarrollo de este trabajo. Al Dr. Stephen Bullock, Mario Salazar y Miriam Poumian por su ayuda durante los análisis de suelo. A Guillermo González por su ayuda en campo y el laboratorio. A Olga Callejas por su apoyo en el laboratorio. Al Dr. Carlos Brizuela por su apoyo en el análisis de los datos. Alejandro, no hay forma de que pueda expresar mi gratitud por todo el apoyo que me has dado a lo largo de esta etapa que iniciamos juntos. Gracias por el amor y sobre todo la paciencia, como siempre he dicho: mejor pareja no podría tener, eres único. Ana Karina, amiga mía de mí y de mi alma, muchísimas gracias por todo, Oh! Karina! Llegaste a mi vida Oh Karina!. A mis amigas Leonora, Roxy y Adria, muchísimas gracias por aguantarme, por apoyarme, por hacerme reír, las adoro y las quiero niñas!. Esta investigación fue financiada por el Fondo de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico del CICESE a través del proyecto "Análisis metagenómicos de la biodiversidad nacional para la solución de problemas ambientales estratégicos".

viii

Contenido

Página Resumen español……………………………………...……...……………………… ii Resumen ingles…………………………………………………...………………….. iv Dedicatorias………………………………………………………..………………….. vi Agradecimientos…………………………………………………..………................ vii Lista de Figuras…………………………………………………….…..…………….. x Lista de Tablas……………………………………………………….……………….. xii Capítulo 1. Introducción

1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 1.1.7 1.1.8 1.2 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2

Antecedentes………………………………………………………… Microorganismos en el suelo……………………………………….. Diversidad y distribución de hongos en el suelo……….………… Importancia de los hongos en el suelo de ecosistemas áridos y semi-áridos…………………………………………………………… Estrategias para el estudio de la diversidad de hongos……….…. Región ITS como “código de barras” para la identificación fúngica………………………………………………………………... Secuenciación Sanger y secuenciación masiva…….……………. Metagenómica de hongos en suelos áridos……………….……… Ecosistemas áridos y semi-áridos de Baja California……….…… Justificación………………………………………………………….. Hipótesis……………………………………………………………… Objetivos……………………………………………………………... Objetivo general……………….…………………………………….. Objetivos específicos………………………………………………..

2 2 4 6 7

10 13 17 18 18 19 20 20 20

Capítulo 2. Metodología 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.10.1

Muestreo……………………………………………………………... Recolección de las muestras……………………………………….. Variables medidas en campo……………………...……………….. Almacenamiento de las muestras………………………………….. Caracterización de suelo……………………………………………. Potencial hidrógeno (pH)…………………………...………………. Contenido de humedad…………………………………………….. Contenido de materia orgánica…………………………………..... Textura……………………………………………………………….. Determinación de salinidad por conductividad eléctrica…………. Análisis de varianza (ANOVA) de dos vías……………………….. Diagramas de Superficie……………………………….…………… Extracción de ADN genómico total de muestras de suelo………. Cuantificación y análisis de pureza del ADN genómico total extraído……………………………………………………………..... Pruebas de PCR para seleccionar oligonucleótidos……………... Amplificación de la región ITS del rADN…………………………... Preparación de ADN genómico para secuenciación……………... Análisis de secuencias………………………………………………

22 23 24 24 25 25 25 26 26 28 29 29 29

30 30 33 33 34

ix

2.10.2 2.10.3 2.10.4 2.10.5 2.10.6 2.10.7 2.10.8 2.10.9 2.11 2.11.1 2.11.2 2.11.3 2.11.4 2.11.5

Revisión de algoritmos para determinar la calidad de las secuencias…………………………………………………………… Extracción de secuencias de ITS1 e ITS2 del rADN…………….. Revisión de archivo de mapeo (Mapping File)……………………. Revisión de archivo de secuencias………………………………… Agrupamiento de secuencias en OTUs…………………………… Selección de secuencias representativas……………...…………. Asignación taxonómica………………………...…………………… Construcción de tabla de OTUs……………………………..…….. Agrupación de OTUs por muestra…………………………………. Análisis de diversidad……………………………………………….. Índice de Chao 1 y curvas de rarefacción…………………………. Índices………………………..………………………………………. Análisis comparativo de composición………...…………………… Análisis de agrupamiento (Clustering)…………..………………... Análisis de correspondencia canónica……………………………..

35 37 37 38 38 39 39 39 40 40 40 41 42 43 43

Capítulo 3. Resultados 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.8.4 3.8.5 3.8.6 3.8.7 3.8.8

Muestreo……………………………………………………………... Variables medidas en campo………………………………………. Humedad determinada sensor…………………………………..... Temperatura sensor………………………………………………… Caracterización de suelo…………………………………………… Potencial hidrógeno………………………………………………… Contenido de humedad…………………………………………..… Contenido de materia orgánica…………………………………… Textura……………………………………………………………….. Determinación de salinidad por conductividad eléctrica…………. Extracción, cuantificación y análisis de pureza del ADN genómico total de muestras de suelo…………………………….. Pruebas de PCR para seleccionar oligoucleótidos……………… Amplificación de la región ITS del rADN………………………….. Preparación de ADN genómico para secuenciación……………. Análisis de secuencias…………………………………………..…. Extracción de secuencias ITS1 e ITS2 del rADN………………… Revisión de archivo de secuencias……………………………….. Unidad taxonómico operacional (OTU) y secuencias representativas……………………………………………………… Índice de Chao 1 y análisis de rarefacción………………………... Índices de diversidad ecológica…………..……………………….. Análisis comparativo de composición………………………..…… Análisis de agrupamiento y mapas de calor……....…………........ Análisis de correlación canónica…………………...………………

45 45 45 47 48 48 50 52 53 54

55 56 57 59 60 60 60

61 62 66 67 69 75

Capítulo 4. Discusión 4.1 4.2

Características de suelo……………………………………...…….. Diversidad, abundancia y distribución de hongos en Valle de las Palmas………………………………………………………………

79

80 Conclusiones………………………………………………………………………….. 87 Referencias bibliográficas……………….………...………………………………… 88 Anexos…………………………….........................................................................

x

Lista de figuras

Figura Página

1 Composición de un micro-hábitat en el suelo…………………………… 3

2 Organización de los genes rARN eucarióticos………………………….. 11 3 Localización y orientación de los oligonucleótidos en las regiones ITS

del rDNA……………………………………………………………………..

12 4 Diagrama de flujo del procesamiento de secuencias provenientes de

pirosecuenciación………………………………………………………….. 16 5 Ubicación de Valle de las Palmas en la Península (VDP) de Baja

California Norte y puntos de muestreo del sitio de estudio………………………………………………………………………. 23

6 Panorámica del sitio de estudio y micro-hábitats………………………. 24

7 Triángulo textural de suelo……………………………………………….. 28

8 Diagrama de flujo del manejo y análisis de secuencias………………. 35

9 Promedio de la Humedad medida por sensor………………………….... 46

10 Variación espacial de la Humedad medida por sensor en el sitio VDP… 46

11 Promedio de la Temperatura medida por sensor………….……………. 47 12 Variación espacial de la Temperatura medida por sensor en el sitio

VDP………………………………………………………………………….. 48 13 Potencial de hidrógeno…………………………………………………….. 49

14 Variación espacial de pH en VDP………………………………………… 49 15 Contenido promedio de Humedad determinada por el método de

gravimetría………………………………………………………………..… 50

16 Variación espacial de la Humedad en VDP…………………………….. 51

17 Contenido de Materia Orgánica………………………..………………… 52

18 Variación espacial de Materia orgánica en el sitio VDP………………. 52

19 Promedio de Conductividad eléctrica…………………………………… 54

20 Variación espacial de la Conductividad eléctrica en el sitio VDP……. 54 21 Prueba de oligonucleótidos para la amplificación de la región ITS del

rADN...................................................................................................... 57 22 Amplificación de la región ITS1 del rADN utilizando el par de

oligonucleótidos ITS1F e ITS2…………………………………………… 58

23 Número de secuencias obtenidas por muestra………………………… 60

24 Curvas de rarefacción…………………………………………………….. 64 25 Composición taxonómica de las secuencias de rADN metagenómicas

obtenidas por pirosecuenciación.…………………………………………. 68 26 Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada

muestra analizando la región completa…….……………………………. 70

xi

27 Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada muestra analizando la región ITS1…………………………………..…… 72

28 Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada muestra analizando la región ITS2………………..…………………….…

73

29 Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo y sitios de muestreo para la región completa………………………………………………………..… 76

30 Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo y sitios de muestreo para la región ITS1……………………………………………………………..… 77

31 Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo y sitios de muestreo para la región ITS2……………………………………………………………..… 78

xii

Lista de tablas

Tabla Página

1 Estimación del número de especies de microorganismos en el suelo…………………………………………………………………... 4

2 Oligonucleótidos desarrollados para la amplificación de las regiones ITS de rADN……………………………………………….. 13

3 Efectos de salinidad en el suelo de acuerdo a los valores de conductividad eléctrica……………………………………………… 29

4 Interpretación de los datos obtenidos en la relación A260/A280……………….............................................................. 30

5 Reactivos y programas de PCR utilizados en la selección de oligonucleótidos…………………………………………………….. 32

6 Condiciones de PCR utilizadas en la amplificación de la región ITS del rADN................................................................................. 33

7 Porcentaje de Arena, Arcilla y Limo en cada muestra……………………………………………………………….. 53

8 Concentraciones y pureza de ADN genómico total extraído…………………………………………………………….…. 56

9 Número total de OTUs por muestra…………………………..……. 61 10 Índice de Chao 1…………………………………………………….. 62

11 Índices de diversidad ecológica calculados para cada muestra……….............................................................................. 66

12 Vectores para cada variable de las propiedades físico-química del suelo para el análisis de correlación canónica….................... 75

Capítulo 1. Introducción

Se ha estimado que en un gramo de suelo existen de 103 a 106 especies

microbianas (Torsvik & Øvreås, 2002), convirtiendo al suelo en uno de los más

grandes reservorios de diversidad del planeta (Crawford et al., 2005).

La diversidad microbiológica del suelo incluye principalmente hongos y

bacterias (Giri et al., 2005) y sus funciones contribuyen principalmente a la nutrición

de las plantas así como en la estructura y fertilidad del suelo (Kirk et al., 2004). A

pesar de su importancia ecológica, el conocimiento sobre la diversidad microbiana

es aún limitado. Se estima que sólo cerca del 1% de las bacterias han sido

cultivadas y caracterizadas por métodos estándares de laboratorio (Kirk et al.,

2004). Al igual que las bacterias, se cree que la mayoría de los hongos no han

podido ser cultivados por métodos convencionales de laboratorio (Mueller & Schmit,

2007), complicando su entendimiento en cuestiones de diversidad (variedad de

especies) (Lentendu et al., 2011).

Los microorganismos del suelo no se encuentran distribuidos uniformemente,

si no que se localizan donde las condiciones nutrimentales y ambientales son las

adecuadas para su desarrollo (Chesworth, 2008). La heterogeneidad del suelo

contribuye a la coexistencia de las especies, que suelen encontrarse formando

gremios, es decir, grupos de especies de microorganismos que son

metabólicamente semejantes (Voroney, 2007).

En ecosistemas áridos y semi-áridos, la diversidad y distribución de

microorganismos puede variar en función de la humedad y la temperatura, así como

de la estructura física del suelo, las cuales interfieren con la habilidad de los

microorganismos para movilizarse (Whitford, 1996). Lluvias anuales esporádicas,

alto pH, alta temperatura del suelo e intensa radiación solar, son características

ambientales típicas en este tipo de ecosistemas (Porras-Alfaro et al., 2011); por lo

que se sugiere que la diversidad y abundancia de especies fúngicas es dependiente

de sus adaptaciones fisiológicas.

2

1.1 Antecedentes

1.1.1 Microorganismos en el suelo

Los suelos forman una capa delgada en la superficie de la Tierra, donde

interactúan componentes geológicos y biológicos, tales como partículas minerales,

fluidos y distintos microorganismos (Chapin et al., 2002). Debido a las interacciones

entre estos componentes, el suelo es considerado un sistema dinámico y complejo

(Chesworth, 2008). Los microorganismos del suelo pertenecen a 5 grupos

taxonómicos: hongos, bacterias, virus, algas y protistas; todos ellos relacionados

con las partículas del suelo y materia orgánica compleja. Las partículas del suelo

forman agregados que varían en tamaño, composición y en la relación que se

establece entre las partículas y los microorganismos. Esta relación es regida por las

condiciones a nivel del micro-hábitat (Giri et al., 2005). La formación de micro-

hábitats es posible debido al estado físico del suelo, el cual se compone de 3 fases:

una sólida (compuesta por minerales y materiales orgánicos) que ocupa el 50% del

volumen del suelo, una líquida (H2O) y una gaseosa (principalmente oxígeno); el

agrupamiento de estas fases, permite la formación de poros, los cuales son

espacios con remanente de agua y aireación (Figura 1) (Chesworth, 2008).

3

Figura 1. Composición de un micro-hábitat en el suelo. Modificado: Chesworth, 2008, p. 675.

La formación y composición de los micro-hábitats del suelo permite que los

microorganismos (principalmente hongos y bacterias) formen comunidades que

regulan entre el 80 y el 90% de los procesos que ocurren en el suelo (Chapin et al.,

2002; Nannipieri et al., 2003); tales como la descomposición de la materia orgánica,

la formación del suelo, la degradación de contaminantes, y el mantenimiento de la

calidad de las aguas subterráneas (Fierer et al., 2003).

Las estimaciones realizadas sobre el número de especies presentes en los

suelos (Giri et al 2005; Tabla 1), dan una idea de la poca información con la que se

cuenta de la diversidad de especies de microorganismos en los suelos, así como de

sus funciones. El entender lo anterior en ecosistemas terrestres es particularmente

relevante dada la importancia de los microorganismos en las funciones

ecosistémicas (Konopka, 2009).

4

Tabla 1: Estimación del número de especies de microorganismos en el suelo. Modificado: Giri et al., 2005, p. 26.

Grupos

Número de especies de microorganismos

Especies descritas

Especies estimadas

Total especies conocidas (%)

Hongos 69,000 1,500,000 5

Bacterias 3,000 30,000 10

Algas 40,000 60,000 67

En el caso de los hongos, durante casi dos décadas se había estimado que

existen 1.5 millones de especies fúngicas de las cuales sólo cerca del 5% han sido

descritas (Hawksworth & Rossman, 1997; Mueller & Schmit, 2007); sin embargo un

estudio reciente, cuya estimación está basada en la relación hongo:planta (17:1) en

suelos de bosque, sugiere la existencia de 6 millones de especies fúngicas (Tayor

et al., 2013). Si estos cálculos son ciertos, aún quedarían por caracterizar cerca de

5.931 millones de especies de la diversidad fúngica global (Taylor et al., 2013). El

número limitado de especies fúngicas caracterizadas se debe principalmente a que

muchas especies requieren de métodos de muestreo especializados (Cannon,

1999), así como de condiciones específicas de cultivo (e.g., nutrientes, pH,

temperatura), lo que dificulta su aislamiento y caracterización. Otro problema de la

caracterización de la diversidad fúngica no cultivada, es el gran número de especies

crípticas, es decir que son morfológicamente indistinguibles por medio de técnicas

de microscopía en muestras ambientales (Jones & Richards, 2011; Shivas & Cai,

2012). La falta de conocimiento que se tiene actualmente sobre la diversidad fúngica

ha llevado a una comprensión limitada sobre su estructura y dinámica en el suelo

(Van Elsas et al., 2000), en donde sus actividades son importantes para el

funcionamiento del ecosistema.

5

1.1.2 Diversidad y distribución de hongos en el suelo

En ecosistemas terrestres, los hongos tienen un papel importante en la

descomposición de materia orgánica (e.g., lignina y celulosa), reciclan nutrientes

(e.g., carbono y nitrógeno), y establecen relaciones mutualistas y patógenas con

plantas (Cannon, 1999; Hunt et al., 2004; van Elsas et al., 2000).

Los hongos, además de contar con una amplia diversidad (Tabla 1), tienen

la cualidad de poder desarrollarse en todos los tipos de suelo (Giri et al., 2005), así

como la capacidad de ocupar un amplio rango de nichos ecológicos (Magan, 2007).

La unidad de crecimiento de los hongos filamentosos es la hifa, una

estructura tubular que se extiende apicalmente y a su vez ramifica, dando lugar al

micelio (Gadd et al., 2008; Hillel, 2008; Paul & Clark, 1989). Cuando pocos recursos

están disponibles, ocurre un crecimiento, así como también una disminución en la

densidad del micelio, mientras que con el aumento de los recursos incrementa la

densidad, la liberación de enzimas y como consecuencia la absorción de los

nutrimentos (Dighton, 2003). En la mayoría de los ambientes, la distribución espacial

de nutrientes no es homogénea (Allen et al., 2003), por lo que el crecimiento miceliar

permite a los hongos filamentosos expandirse hasta encontrar una fuente de

nutrimentos (Davidson, 2007). Todo ello sugiere que la distribución de los hongos

está regida por la disponibilidad de los nutrientes en el suelo, y a su vez, su actividad

puede verse limitada por factores abióticos (e.g., temperatura, pH, disponibilidad de

agua) (Giri et al., 2005).

El papel principal de estos organismos eucarióticos en el suelo reside en los

procesos de descomposición y mineralización. Durante la descomposición de

materia orgánica, los hongos liberan enzimas extracelulares para degradar

moléculas orgánicas complejas contenidas en la hojarasca (e.g., lignina), y los

productos de esta actividad enzimática pueden ser absorbidos por otros organismos

(principalmente plantas; Coleman et al., 2004; Dighton, 2003). La mineralización se

lleva a cabo durante el proceso de descomposición, donde los nutrimentos

minerales son solubilizados como iones inorgánicos (Dighton, 2003). Además, los

6

hongos son actores importantes en la generación de partículas de suelo, al ser

capaces de modificar su composición química, permitiendo la asociación de las

especies fúngicas con la materia orgánica, y cambiar la estructura física del suelo.

Estos cambios influyen en la porosidad y estabilidad del suelo así como en la

capacidad de retención de agua (Dighton, 2003), lo que afecta el tamaño de los

poros del suelo y permite el establecimiento de los hongos y su desarrollo.

1.1.3 Importancia de los hongos en el suelo de ecosistemas áridos y semi-

áridos

Los hongos son capaces de desarrollarse en una amplia variedad de

ecosistemas terrestres, tales como praderas (Brodie et al., 2003; Hunt et al., 2004),

pastizales (Jumpponen et al., 2010), tundras (Lentendu et al., 2011), bosques (Buee

et al., 2009), e incluso en ecosistemas áridos y semi-áridos (Durrell et al., 1960;

Oliveira et al., 2013; Porras-Alfaro et al., 2011; Romero-Olivares et al., 2013). Los

suelos en ecosistemas áridos se consideran hábitats terrestres porosos (Thorn &

Linch, 2007), lo cual permite que estructuras como las hifas realicen la exploración

y la translocación de nutrientes, formando parte de los ciclos biogeoquímicos (Gadd

et al., 2007). Por ejemplo, Collins et al (2008), demostraron que los hongos en

ecosistemas áridos tienen una relación cercana con productores primarios, siendo

los principales actores en el proceso de transformación de nitrógeno, y además los

de mayor actividad en la descomposición de la poca materia orgánica presente en

este tipo de ecosistemas.

Un tercio de la superficie del planeta es ocupado por ecosistemas áridos y

semi-áridos (MEA, 2005), que se caracterizan por precipitaciones esporádicas y

estacionales, temperaturas elevadas y alta radiación solar (Scott et al., 2012). En

los ecosistemas áridos y semiáridos los eventos de precipitación tienen una gran

influencia en la actividad biológica. Cuando llueve, dependiendo de su porosidad, el

agua se infiltra en el suelo, activando el metabolismo de los microorganismos

(Huenneke & Noble, 1996).

7

En los suelos de ecosistemas áridos y semi-áridos, los espacios libres y

distancias entre plantas son ocupados por diversas comunidades de organismos

considerados altamente especializados, los cuales son capaces de “tolerar” la falta

de agua; estos organismos (e.g., cianobacterias, micro-hongos, bacterias, algas,

líquenes) forman costras biológicas (BSC, por sus siglas en inglés: Biological Soil

Crusts) (Grishkan et al., 2006). Estas BSC tienen una función importante dentro de

ecosistemas áridos y semi-áridos, ya que incrementan la fertilidad y estabilidad de

los suelos e influencian los ciclos hidrológicos del ecosistema donde se encuentran

(Belnap & Lange, 2005).

Los líquenes (organismos autotróficos) son fundamentales en las BSC.

Cerca del 49% de los hongos Ascomycota son liquenizados formando asociaciones

simbióticas estables con algas y cianobacterias las cuales les proveen de nutrientes

(Bidartondo & Gardes, 2005). En las BSC, los líquenes participan como los actores

principales para incrementar el contenido de materia orgánica y la retención de

humedad en el suelo, así como para reducir la lixiviación de nutrientes (Bidartondo

& Gardes, 2005), funciones importantes para el mantenimiento de ecosistemas

áridos y semi-áridos. La presencia de hongos liquenizados y micro-hongos en

suelos de ecosistemas áridos permite que se magnifiquen las actividades de BSC,

proveyendo al suelo de fertilidad y estabilidad (Grishkan et al., 2006).

1.1.4 Estrategias para el estudio de la diversidad de hongos

Se conoce que una amplia diversidad de hongos se encuentran en el suelo,

pero hasta el día de hoy, hay una deficiencia en el estudio de su morfología, filogenia

y papel ecológico (Jeewon & Hyde, 2007); posiblemente debido a que la mayoría

de los estudios se han basado en técnicas dependientes de cultivo.

Para el estudio de la diversidad fúngica del suelo mediante métodos

tradicionales (dependientes de cultivo), se usa una técnica de dilución en un medio

de enriquecimiento y microscopía para la observación de la morfología de los

hongos obtenidos (Jeewon & Hyde, 2007).

8

A partir de los años 90, el uso de la técnica de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction) ha

permitido superar las limitaciones de los métodos asociados al cultivo (Chris et al.,

2010), y profundiza en los estudios de diversidad fúngica en el suelo y otros hábitats.

La construcción de genotecas de amplicones, por ejemplo, es útil en la identificación

y caracterización de tipos dominantes de hongos en suelo. Esta se lleva a cabo a

partir de la extracción de ADN genómico de una muestra ambiental (e. g., suelo,

sedimento marino), la obtención de amplicones ITS (Internal Transcribed Spacer)

mediante PCR, seguido de su ligación en plásmidos, así como de la replicación de

éstos en células de Escherichia coli. Posteriormente se realiza la selección de

colonias positivas, es decir que contienen el plásmido con el amplicón ligado (Jones

& Richards, 2011), se secuencian y comparan los fragmentos. Esta técnica es

costosa y requiere de una gran cantidad de tiempo, limitando el número de réplicas

o secuencias individuales que pueden obtenerse por muestra (Daniel, 2005). Una

de las principales consecuencias de un muestreo limitado de secuencias es la

subestimación de diversidad y la imposibilidad de registrar la presencia de especies

poco comunes que podrían ser funcionalmente importantes (Lim et al., 2010).

Para analizar comunidades fúngicas se han desarrollado diferentes técnicas,

tanto cualitativas como cuantitativas (Bidartondo & Gardes, 2005):

a) Técnicas para la obtención de perfiles genéticos:

- DGGE/TGGE (Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización /

Electroforesis en Gel con Gradiente Térmico). Esta técnica permite la

separación de diferentes productos de PCR que tienen la misma longitud,

pero difieren en su secuencia nucleotídica (Souza et al., 2004). Se realiza en

geles de poliacrilamida, en donde el producto de PCR se introduce en los

pocillos; conforme migra el ADN, las condiciones de desnaturalización del gel

aumentan de forma gradual (Paul, 2007). Una de las ventajas de este tipo de

técnica, es que permite purificar y secuenciar los fragmentos de interés; en

contraste, y como desventaja, existe la posibilidad de perder resolución al

9

seleccionar amplicones mayores a 500 pb, limitando así información

taxonómica (Anderson & Cairney, 2004)

- RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción). La digestión

del ADN por medio de endonucleasas de restricción permite que la variación

en la longitud de los fragmentos resultantes indique diferencias entre

comunidades del suelo (Paul, 2007; Segal, 2005). Esta técnica puede

funcionar como un análisis previo de selección ya que permite diferenciar

entre secuencias del mismo tamaño pero que son diferentes en su

composición.

- T-RFLP (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos de Restricción

Terminales). Esta técnica se basa en la realización de una PCR con alguno

de los dos oligonucleótidos marcados con un fluoróforo, seguido de una

digestión con enzimas de restricción; los fragmentos se separan por

electroforesis de acuerdo a su tamaño en un gel o secuenciador capilar

(Pfenning & Magalhäes de Abreu, 2012).

A pesar de que los métodos anteriores (DGGE/TGGE, RFLP y T-RFLP) han

sido empleados en muchos estudios de diversidad, estos pueden subestimar

el nivel de la diversidad debido a la presencia de bandas heterogéneas o de

baja resolución (Lim et al., 2010).

b) PCR-cuantitativa en tiempo real. Esta técnica parte de la cuantificación de la

concentración de ADN, estimando la biomasa del taxón etiquetado (con

oligonucleótidos previamente diseñados) en base a técnicas de tiempo real

(Pfenning & Magalhäes de Abreu, 2012). Se determina la cinética de síntesis

del ADN en el proceso de PCR, a partir de la fluorescencia irradiada por

fluorocromos (Montesinos et al., 2008).

c) FISH (Hibridación Fluorescente in situ). Permite la enumeración,

visualización e identificación de células microbianas individuales (Moter &

Göbel, 2000). Lo anterior es posible mediante la fijación de las células,

mientras que la molécula de rARN se hibridiza con sondas de

oligonucleótidos específicos para el taxón de interés (Souza et al., 2004).

10

d) Secuenciación Sanger: El método de Sanger (también llamado método

dideoxi) es considerado como de “primera generación” (Metzker, 2009). Este

método se basa en el uso de ciertos análogos químicos de los nucleótidos

(dideoxi nucleótidos o ddA, ddT, ddC, ddG). Al carecer de un grupo hidroxilo

3’ terminal en su desoxirribosa, cuando los dideoxi nucleótidos se incorporan

a una cadena creciente de ADN, no permiten que la ADN polimerasa se una

a la consecuente base complementaria del ADN molde original (la cual está

siendo secuenciada), conteniendo la cadena de ADN en formación. Para

conocer la secuencia, cada dideoxi nucleótido se marca con un colorante

fluorescente diferente que cuenta con su propia emisión de luminiscencia;

así, cuando la cadena de ADN es finalizada, esta es separada por medio de

electroforesis (Nussbaum, 2008). Para poder realizar este método se

necesita de una gran cantidad de copias del fragmento de ADN de interés,

por lo que es necesario insertarlo en vectores de clonación. También es

posible realizar una secuenciación directa, esto con el producto de PCR

(cadena doble), utilizándolo como molde y estableciendo las condiciones

para que esta hibride con el oligonucleótido, procediendo a continuación con

el proceso de secuenciación (Soslau, 2004).

1.1.5 Región ITS como “código de barras” para la identificación fúngica

En organismos eucariotas, los genes que codifican para ARN ribosomales se

encuentran ordenados en arreglos que incluyen unidades transcripcionales en

repetición: 18S - 5.8S – 28S, dos regiones variables: espaciadores transcritos

internos (ITS1 e ITS2), así como dos secuencias externas ETS (por sus siglas en

inglés: External Transcribed Spacer) (Figura 2) (Jeewon & Hyde, 2007; Korabecna,

2007).

11

Figura 2. Organización de los genes rARN eucarióticos. Modificado de: Deacon, 2006, p. 171.

Las regiones ITS de genomas de organismos eucarióticos, pueden variar

considerablemente, tanto en tamaño como en secuencia. Por ejemplo, en un ratón,

la región ITS1 tiene una longitud de 999 pb y la región ITS2 de 1,089 pb, mientras

que en un protozoario parásito, la región ITS1 es de 41 bp y la región ITS2 de 55

pb (Korabecna, 2007).

La variabilidad de las regiones ITS permite que sean validadas como “código

de barras” (Buée et al., 2009; Wang, et al., 2011) para la identificación fúngica ya

que posibilita la identificación a nivel de género y especie (Lai et al., 2007; Schoch

et al., 2012; Tedersoo et al., 2010;), en contraste con las subunidades 18S, 5.8S y

28S, las cuales no permiten la identificación a nivel de especie, esto debido a que

se consideran regiones conservadas con poca variabilidad en su secuencia.

El uso de las regiones variables ITS para el estudio de la diversidad fúngica,

ha hecho necesario el diseño de oligonucleótidos universales; es decir, que

permitan la amplificación de la región de interés pero de todos los taxa (Bidartondo

& Gardes, 2005).

White y colaboradores (1990) diseñaron los primeros oligonucleótidos

universales (ITS1/ITS2 e ITS3/ITS4) para lograr la amplificación de estas regiones,

12

lo que dio pauta al diseño de oligonucleótidos universales y específicos para cada

taxón de hongos.

Gardes y Bruns (1993) diseñaron oligonucleótidos para la amplificación de

Basidiomicetos (ITS1F-ITS4-B). Años más tarde, Egger (1995) hizo lo mismo para

ectomicorrizas (ITS8mun, ITS9mun, ITS10mun, NL5mun, NL6Amun, NL6Bmun,

NL8mun). Estos oligonucleótidos además de amplificar regiones pertenecientes al

rADN de hongos, también amplifican rADN de plantas, por lo que Martin y Rygiewicz

(2005) diseñaron oligonucleótidos para disminuir este sesgo (NSA3, NSI1, 58A1F,

58A2F, 58A2R, NLB4, NLC2) (Figura 3).

Figura 3. Localización y orientación de los oligonucleótidos en 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S del rDNA. Modificado de: Martin & Rygiewicz, 2005, p. 11.

Así, hasta el día de hoy, se han desarrollado y combinado distintos pares de

oligonucleótidos para la amplificación, ya sea universal o taxón-específica, de las

regiones ITS en muestras ambientales (Tabla 2).

En el caso de la determinación de la diversidad fúngica donde se busca la

amplificación de la región total ITS (ITS1-ITS2, incluyendo 5.8S), se han empleado

el par de oligonucleótidos considerados “universales”: ITS1F e ITS4 (Bazzicalupo et

13

al., 2013; Christ et al., 2010; Manter & Vivanco, 2007; Monard, 2012; Porras-Alfaro

et al., 2011) y el par de oligonucleótidos: ITS1 e ITS4 (O’Brien et al., 2005).

Tabla 2. Oligonucleótidos desarrollados para la amplificación de las regiones ITS de rADN (Egger, 1995; Martin & Rygiewicz, 2005; White et al., 1990).

Nombre oligo

Secuencia (5’ 3’)

Sentido (S) / Anti-sentido

(AS) Referencia

ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG S (White et al, 1990)

ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC AS (White et al., 1990)

ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC S (White et al., 1990)

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC AS (White et al., 1990)

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG S (White et al., 1990)

ITS1F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA S (Gardes & Bruns, 1993)

ITS4-B CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG AS (Gardes & Bruns, 1993)

ITS8mun CTTCACTCGCCGTTACTA AS (Egger, 1995)

ITS9mun TGTACACACCGCCCGTCG S (Egger, 1995)

ITS10mun GCTGCGTTCTTCATCGAT AS (Egger, 1995)

NL6Amun CAAGCGTTTCCCTTTCAACA AS (Egger, 1995)

NL6Bmun CAAGCGTTTCCCTTTCAACA AS (Egger, 1995)

NL8mun TTGGTCCGTGTTTCAAGACG AS (Egger, 1995)

NSA3 AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA S (Martin & Rygiewicz, 2005)

NSI1 GATTGAATGGCTTAGTGAGG S (Martin & Rygiewicz, 2005)

58A1F GCATCGATGAAGAACGC S (Martin & Rygiewicz, 2005)

58A2F ATCGATGAAGAACGCAG S (Martin & Rygiewicz, 2005)

58A2R CTGCGTTCTTCATCGAT AS (Martin & Rygiewicz, 2005)

NLB4 GGATTCTCACCCTCTATGAC AS (Martin & Rygiewicz, 2005)

NLC2 GAGCTGCATTCCCAAACAACTC AS (Martin & Rygiewicz, 2005)

1.1.6 Secuenciación Sanger y secuenciación masiva

El método convencional de secuenciación de ADN (Sanger) fue descrito hace

ya más de 30 años. Este método ha ayudado a obtener una gran información sobre

distintos genomas, tanto procarióticos como eucarióticos, pero a su vez las

necesidades de los estudios actuales (secuenciación de genomas completos,

diversidad de microorganismos, transcriptómica, descubrimiento de variables

alélicas, secuenciación de ARN, etc.) ha dejado en claro que tiene limitaciones tanto

en rendimiento como en costo (Ronaghi, 2001).

14

El surgimiento de técnicas de secuenciación de siguiente generación (NGS,

por sus siglas en inglés: Next Generation Sequencing) ha permitido el desarrollo de

técnicas eficientes y de alto rendimiento (Xu, 2006), además de ofrecer una

alternativa menos costosa y rápida (Quince et al., 2011).

Un ejemplo de este tipo de tecnologías, es HiSeq y MiSeq desarrollada por

la compañía Illumina, la cual se introdujo en el 2006. Están basadas en la

secuenciación por síntesis, produciendo lecturas pequeñas de alrededor de 32-150

pb, y permiten la secuenciación simultánea de miles de secuencias en pocos días

(Mardis, 2007). Otra tecnología de siguiente generación es SOLiD (siglas en inglés:

Sequencing by Oligo Ligation and Detection), implementada por Applied

Biosystems. Esta tecnología requiere de un mínimo de 5 días para producir 3-4 Gb

de secuencias de una longitud de 25-35 pb, y utiliza un adaptador ligado a un

fragmento de la biblioteca utilizando PCR de emulsión acoplado a pequeñas esferas

magnéticas para amplificar los fragmentos y secuenciar (Mardis, 2008). La principal

desventaja de las tecnologías HiSeq, MiSeq y SOLiD, es que proveen de

secuencias cortas, además de que fueron diseñadas para la re-secuenciación de

genomas ya conocidos. A pesar de esto, las tecnologías pertenecientes a Illumina

cuentan con una mejor cobertura de secuenciación que otras tecnologías

implementadas por la compañía Roche (plataforma Pirosecuenciación), esto se ve

reflejado en un menor número de errores en las secuencias provistas por las

tecnología Illumina lo cual facilita la detección de ambigüedades de la

secuenciación, como el caso de los homopolímeros (Luo et al., 2012).

La plataforma de secuenciación de Pirosecuenciación (Roche 454) permite

obtener secuencias de mayor longitud (de hasta poco menos de 1,000 pb) y un

menor tiempo (7-8 horas) (Marsh, 2008). Se basa primeramente en la fragmentación

del ADN, seguida de la incorporación de las secuencias de identificación (“barcode”,

secuencias de no más de 12 pb las cuales ayudan a la identificación una vez

realizada la secuenciación) y adaptadores (A y B) los cuales actuarán

posteriormente en el proceso; una vez realizada la ligación de las secuencias de

identificación, el ADN se separa en cadenas sencillas y es sujeto a una PCR de

15

emulsión (permite la amplificación del ADN en un medio de agua y aceite, formando

pequeños micro-reactores) en donde se encuentra una sola cadena de ADN ligada

a una esfera (Mardis, 2008). Una vez realizada la PCR de emulsión, las esferas son

incorporadas a una placa con pequeños pocillos (44 µm), de modo que haya una

sola esfera en cada pozo.

Este método no utiliza fluoróforos para detectar las bases incorporadas de

ADN, si no que tan pronto un nucleótido es incorporado dentro de la cadena de ADN

creciente, se libera una molécula de pirofosfato, que se convierte de forma

enzimática a ATP (Adenosín trifosfato); la cual entra en contacto con la luciferasa,

produciendo una luz (Fakruddin et al, 2012; Hert et al., 2008;) que es captada por

una cámara de alta resolución. La cantidad de luz emitida es proporcional al número

de nucleótidos incorporados (Mardis, 2008).

Uno de los retos que conlleva el uso de este tipo de plataformas de

secuenciación, es el manejo de la gran cantidad de secuencias obtenidas. Para

esto, se han desarrollado diferentes programas o paquetes informáticos los cuales

permiten el análisis de las secuencias, ya sean de un organismo (genoma), de un

grupo de organimos (metagenoma) o de una o múltiples muestras (multiplexing).

Un ejemplo de programas es QIIME (por sus siglas en inglés: Quantitative

Insights Into Microbial Ecology, www.qiime.org), el cual ha permitido realizar análisis

de las secuencias obtenidas a partir de una secuencia de programas en tándem

(Figura 4):

16

Figura 4. Diagrama de flujo del procesamiento de secuencias provenientes de pirosecuenciación.

A pesar de que la mayoría de los programas están pensados para el análisis

de diversidad de bacterias, se han logrado realizar adaptaciones para el análisis de

17

secuencias ITS de rADN de hongos, lo que ha incrementado el interés en probar

nuevas metodologías que permitan la secuenciación de comunidades enteras

(Nilsson et al., 2009).

En proyectos de diversidad fúngica, la plataforma de pirosecuenciación se ha

convertido en la más empleada, ya que posibilita la secuenciación de las regiones

ITS completas, mientras que, por el momento, las plataformas desarrolladas por

Illumina/Solexa, no son capaces de cubrir la región completa (Monard et al., 2012).

1.1.7 Metagenómica de hongos en suelos áridos

La metagenómica se refiere al análisis del material genético recuperado de

una muestra para acceder, por medio de tecnologías genómicas y herramientas

bioinformáticas, a comunidades enteras de microorganismos (Thomas et al., 2012).

La mayoría de los trabajos de diversidad de hongos en el suelo han sido

enfocados a ecosistemas húmedos y templados (Brodie et al., 2003; Bueé et al.,

2009; Christ et al., 2010; Jumpponen et al., 2010; Lentendu et al., 2011; Lim et al.,

2010; McGuire et al., 2012), mientras que los trabajos de diversidad fúngica en

ecosistemas áridos y semi-áridos son escasos (Durrell & Shields, 1960; Oliveira et

al., 2013; Porras-Alfaro et al., 2011; Romero-Olivares et al., 2013).

En estudios de ecosistemas áridos y semi-áridos la presencia de diversos

grupos taxonómicos de hongos hace notoria su habilidad de adaptación al estrés

hídrico así como también a las altas temperaturas; entre los grupos de hongos

encontrados en este tipo de ecosistemas destaca el filo Ascomycota como uno de

los más abundantes, y dentro de éste los órdenes Pleosporales, Sordariales,

Pezizales, Hypocreales, Dothideales, seguido del filo Basidiomycota y dentro de

éste los órdenes Agaricales, Filobasidiales, Trechisporales, (Oliveira et al., 2013;

Porras-Alfaro et al., 2011; Romero-Olivares et al., 2013); en menos abundancia se

pueden encontrar a los filos Zygomycota y Chytridiomycota (Porras-Alfaro et al.,

2011)

18

1.1.8 Ecosistemas áridos y semi-áridos de Baja California

Los ecosistemas áridos y semiáridos abarcan aproximadamente el 40% de

la superficie terrestre y su área se está expandiendo (MEA, 2005). En México,

aproximadamente la mitad del territorio es considerado como árido y semiárido. En

particular, la península de Baja California, localizada en el noroeste de México, está

caracterizada por contar con una amplia variedad de ecosistemas, donde

predominan las zonas áridas y semiáridas, existiendo en menor medida zonas

templadas (Rzedowski, 2006). Su climatología, al igual que sus ecosistemas, es

variada, contando con climas áridos, semiáridos, mediterráneos, templados y

húmedos (Rzedowski, 2006). Esta variedad de climas es principalmente debida a

que la península se encuentra geográficamente en una celda de alta presión, lo que

favorece a los climas áridos y semiáridos, pero además está influenciada por una

corriente marina fría que tiene efectos considerables a lo largo de la península

(Rzedowski, 2006). Los patrones de precipitación en la península de Baja California

se pueden dividir en tres grandes regiones (Arriaga-Ramírez & Cavazos, 2010): el

sur de la península, la región central (donde las lluvias están influenciadas

principalmente por el monzón de Norte América, presentando periodos de lluvias

principalmente en Julio y Septiembre) y la región noroeste (periodo de lluvias desde

enero hasta abril, debido al anticiclón del Norte del Pacífico).

1.2 Justificación

Se conoce poco acerca de la diversidad microbiana en ecosistemas áridos y

semi-áridos de México, y aún menos en el estado de Baja California. Los hongos,

en este tipo de ecosistemas, juegan un papel importante como mediadores en el

reciclaje de nutrientes, formando interacciones simbióticas con plantas y bacterias,

así como también en la formación de agregados del suelo, por lo que resulta

importante ampliar el estudio sobre su interacción con los componentes bióticos y

abióticos de este tipo de ecosistemas.

19

En nuestro grupo de trabajo (Laboratorio de Biología Celular y Molecular de

Hongos), se han realizado estudios de diversidad fúngica en algunos ecosistemas

áridos y semi-áridos de Baja California (Romero-Olivares et al., 2013), y se ha

reportado que los hongos en los sitios de estudio cuentan con un patrón de

distribución que tienen cierta similitud con patrones de distribución de plantas y su

diversidad se encuentra influenciada por las características climáticas de cada sitio.

Dentro de estos estudios, la región de Valle de las Palmas presentó mayor

diversidad fúngica que el resto de los ecosistemas, lo cual podría sugerir que sus

características edáficas son las óptimas para el desarrollo fúngico. A pesar de la

diversidad reportada en ese trabajo, se considera que el estudio tuvo ciertas

limitaciones de acuerdo al número de secuencias obtenidas para su análisis,

además que el estudio fue dirigido hacia especies fúngicas pertenecientes al sub-

reino Dikarya.

Este proyecto profundiza en los estudios de diversidad de hongos en Valle

de las Palmas, considerando dos micro-hábitats presentes en el sitio los cuales se

diferencian por el grado de perturbación de roedores así como sus cambios

edafológicos y de diversidad en dos estaciones del año que difieren en temperatura

y precipitación. Lo anterior permitiría expandir el conocimiento sobre la ecología de

los hongos en este tipo de ecosistemas.

1.3 Hipótesis

Los hongos en el suelo no son cosmopolitas, su diversidad se encuentra

regida de acuerdo a las características físico-químicas del micro-hábitat que

habitan, así como a las características climáticas del ecosistema donde se

encuentra dicho micro-hábitat, es por esto que su distribución puede ser explicada

por la heterogeneidad del suelo dentro del ecosistema. Lo anterior se encuentra

plasmado en las siguientes hipótesis.

20

1. Las características físico-químicas de muestras de suelo de dos micro-

hábitats (madriguera y superficie) en Valle de las Palmas, Baja California,

serán diferentes.

2. Las características físico-químicas de muestras de suelo en Valle de las

Palmas, Baja California, serán diferentes entre estaciones (verano e

invierno).

3. La diversidad y composición de comunidades de hongos en el suelo de dos

micro-hábitats (madriguera y superficie) en Valle de las Palmas, Baja

California, serán diferentes y tales diferencias estarán relacionadas con las

características físico-químicas de los micro-hábitats.

4. La diversidad y composición de comunidades de hongos en el suelo en Valle

de las Palmas, Baja California serán diferentes entre estaciones (verano e

invierno) y las diferencias estarán relacionadas con las características físico-

químicas de las muestras en cada estación.

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo general

Evaluar la diversidad fúngica de Valle de las Palmas, en dos micro-hábitats

que contrastan en el grado de perturbación por roedores y durante dos estaciones

del año que difieren en temperatura y precipitación, mediante la obtención de

perfiles metagenómicos basados en secuencias de ITS-rADN.

1.4.2 Objetivos específicos

Determinar las características edafológicas de cada punto de muestreo en

verano e invierno.

Obtener y analizar información metagenómica de la micobiota de los suelos

colectados.

21

Identificar las diferencias de la diversidad y patrones de distribución fúngica de

muestras obtenidas de superficie y suelo de madriguera.

Determinar la relación que existe entre las características edafológicas de cada

micro-hábitat y la diversidad fúngica observada.

22

Capítulo 2. Metodología

2.1 Muestreo

El Valle de las Palmas (VDP), se encuentra al noroeste de la península de

Baja California, y se caracteriza por tener un clima mediterráneo con veranos cálidos

y secos, los cuales contrastan con sus inviernos húmedos y fríos. VDP se clasifica

como chaparral desértico, con temperatura mínima de 4 ºC, máxima de 35.2 ºC y

precipitación media anual de 209 mm. Las principales especies vegetales con las

que cuenta son: Simmondsia chinensis, Ephedra californica, Adenostoma

fasciculatum, Yucca schidigera, Mammillaria dioica, Acacia greggii, Eriogonum

fasciculatum y Artemisia californica (Romero-Olivares et al., 2013).

Se realizaron dos muestreos, uno en verano (11 de julio del 2012) y otro en

invierno (18 de enero del 2013). Cada uno se realizó en una zona delimitada con

actividad de roedores. Los puntos de muestreo se seleccionaron de forma aleatoria

y se trazaron con ayuda de un GPS (Sistema de Posicionamiento Global, por sus

siglas en inglés: Global Positioning System) (Figura 5). En el muestreo de invierno,

se colectó el suelo ubicando el punto geográfico marcado durante el muestreo de

verano; en el caso de las muestras de suelo de madriguera, la toma de muestra fue

de la madriguera más cercana con actividad de roedores.

23

Figura 5. Sitio de estudio Valle de las Palmas (VDP). (A) Ubicación de VDP en la península de Baja California Norte. (B) Puntos de muestreo de verano en Valle de las Palmas, Tecate, Baja California, México. S: Superficie (puntos amarillos). M: Madriguera (puntos azules). (Google Earth 7.1, 2013).

2.1.1 Recolección de las muestras

En cada uno de los muestreos se recolectaron 20 muestras de alrededor de

500 gramos cada una, correspondientes a dos micro-hábitats (Figura 6): 10

muestras suelo-superficie (S) (sin perturbación y sin cubierta vegetal) y 10 muestras

de suelo influenciadas por madrigueras de roedores (M), resultando en un total de

40 muestras de suelo. La profundidad a la cual se recolectó el suelo fue entre 10 y

20 cm, ya que en este tipo de ecosistemas se considera que en la superficie del

suelo, al recibir radiación solar directa, las condiciones son inhóspitas para el

desarrollo fúngico.

Para la recolección de las muestras se utilizó una pala, que fue lavada con

cloro al 10% entre puntos de muestreo para evitar contaminación cruzada. Para la

recolección de las muestras se utilizó una pala la cual, entre puntos de muestreo,

fue lavada con cloro al 10% para evitar contaminaciones. Para contener las

muestras se utilizaron bolsas Ziploc® y se almacenaron en una hielera para su

traslado al laboratorio.

24

Durante el muestreo se utilizaron cubre bocas para evitar contacto con el

hongo patógeno Coccidioides spp. cuya presencia se ha reportado en Valle de las

Palmas (Baptista-Rosas et al., 2012; Cairns et al., 2000).

Figura 6. Panorámica del sitio de estudio en la estación de verano (A), suelo superficie (B), suelo madriguera (C). Panorámica del sitio de estudio en la estación de invierno (D), suelo madriguera (E), suelo superficie (F).

2.1.2 Variables medidas en campo

En cada punto de muestreo (en verano e invierno) se midieron las variables

de temperatura y humedad, con los sensores LI-8100A (sensor temperatura) y

ECH2O (sensor humedad), acoplados a un sistema Analizador de Gases en Infra

Rojo (IRGA, por sus siglas en inglés) de LI-8100 (LICOR).

2.1.3 Almacenamiento de las muestras

Una vez que las muestras estuvieron en el laboratorio, se tomaron 50 gramos

de suelo de cada una y se almacenaron a -80ºC para posteriores análisis

moleculares. El resto de las muestras fue almacenado a temperatura ambiente para

su análisis edafológico. Los nombres de cada una de las muestras se asignaron de

acuerdo al tipo de suelo (Madriguera (M) o Superficie (S)) así como a la estación

del año en la cual se realizó el muestreo (verano (V) o invierno (I)).

25

2.2 Caracterización de suelo

2.2.1 Potencial hidrógeno (pH)

A cada muestra de suelo, se le determinó el pH medido en agua a través del

método AS-02 de la NOM-021-RECNAT-2002, en el cual se mide la concentración

del ion hidrógeno (H) mediante el uso de un electrodo cuya membrana es sensible

a [H]. Se utilizaron 10 gramos de cada muestra de suelo, a los cuales se les

añadieron 20 mL de agua desionizada; esta mezcla fue agitada por intervalos de 5

minutos durante 30 minutos; posteriormente se dejó en reposo por 15 minutos y se

procedió a la medición de pH con un potenciómetro (Corning Pinnacle M530 pH

meter, Woburn, MA USA; precisión de +/- 0.01).

2.2.2 Contenido de humedad

La determinación del contenido de humedad de cada muestra de suelo, se

realizó de acuerdo al método de gravimetría especificado en la AS-05 de la NOM-

021-RECNAT-2002. Primeramente se introdujeron los crisoles a una estufa para

eliminar los residuos de humedad que pudieran contener y se pesaron hasta obtener

un peso constante. Se utilizaron 10 gramos de cada una de las muestras (suelo

húmedo) y se introdujeron en los crisoles. Todas las muestras fueron expuestas a

calor en una estufa para evaporar su contenido de agua. Las muestras se pesaron

hasta obtener peso constante. Los datos obtenidos fueron introducidos a la

siguiente fórmula:

%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = (𝑃𝑀𝐻−𝑃𝑀𝑆)

(𝑃𝑀𝑆)× 100 (1)

Donde:

PMH = Peso muestra húmeda

PMS = Peso muestra seca

26

2.2.3 Contenido de materia orgánica

El procedimiento para determinar el contenido de materia orgánica de cada muestra

de suelo, se llevó a cabo a partir del método de pérdida de peso por ignición

(Reeuwijk, 2002). Se utilizaron 10 gramos de suelo de cada muestra, las cuales

fueron sometidas a sequedad hasta obtener un peso constante, posteriormente

fueron introducidas a una mufla a una temperatura de 550°C durante 8 horas, hasta

obtener un peso constante. Los datos obtenidos fueron introducidos a la siguiente

fórmula:

%𝑀𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎 𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑎 = (𝑃𝑀𝑆−𝑃𝑀𝑄)

(𝑃𝑀𝑄)× 100 (2)

Donde:

PMS = Peso muestra seca

PMQ = Peso muestra quemada

2.2.4 Textura

La determinación de textura se realizó en 3 muestras de cada tipo de micro-

hábitat provenientes de las dos estaciones (verano e invierno). Las muestras fueron:

2SI, 5SI, 9SI, 1MI, 3MI y 7MI (de la estación de invierno) y 2SV, 5SV, 9SV, 1MV,

3MV y 7MV (de la estación de verano). El método utilizado fue el de Bouyoucos

(AS-09) de la NOM-021-RECNAT-2002. Se utilizaron 60 gramos de cada muestra

de suelo, a los cuales se les agregaron 40 mL de agua oxigenada hasta sequedad,

con el fin de eliminar la materia orgánica; posteriormente se añadieron 40 mL de

hexametafosfato de sodio, con la finalidad de separar las partículas no reconocidas

como de suelo. Pasadas 24 horas se agregaron 5 mL de oxalato de sodio y 5 mL

de metasilicato de sodio, dejando reposar durante 15 minutos. Después se licuó

durante 5 minutos y se vació todo el contenido a una probeta de 1 litro agregando

agua hasta completar el volumen. Se agitó con cuidado por 1 minuto. Con un

27

hidrómetro y un termómetro, se midió la densidad y la temperatura a los 40

segundos a las 2 horas. Una vez obtenidos estos datos, se corrigieron las lecturas

del hidrómetro con las mediciones de temperatura de acuerdo a la tabla contenida

en la NOM-021-RECNAT-2002. Ya corregidos los datos, se calcularon los

porcentajes de arena, arcilla y limo de acuerdo a lo siguiente:

- La lectura a los 40 segundos multiplicada por 2 es igual al porcentaje de

arcilla más limo.

- El porcentaje de arena se obtiene restando de 100 el porcentaje de arcilla

más limo.

- La lectura obtenida a 2 horas multiplicadas por 2 es igual al porcentaje de

arcilla.

- El porcentaje de limo se obtiene por diferencia.

Para determinar a qué tipo de suelo pertenecían las muestras, se

relacionaron sus porcentajes de limo, arcilla y arena de acuerdo al triángulo textural

de suelo de la Figura 7.

28

Figura 7. Triángulo textural de suelo. Modificado de: Chesworth, 2008, p 506..

2.2.5 Determinación de salinidad por conductividad eléctrica

La determinación de salinidad se llevó a cabo por medio de la medición de la

conductividad eléctrica. Para formar el extracto de saturación, se utilizaron 50

gramos de cada una de las muestras y se les agregó agua destilada hasta la

saturación (el suelo debe tener una apariencia brillosa). Posteriormente se dejó

reposar durante 24 horas. Pasado el tiempo de reposo se procedió a filtrar el

extracto por medio de una bomba de vacío a través de filtros Whatman Número 1.

Una vez que se realizó el filtrado, se procedió a medir la conductividad

eléctrica por medio del sensor Field Scout Direct Soil EC Meter (Spectrum

Technologies, Inc.).

29

La salinidad se determinó de acuerdo a los resultados de conductividad

eléctrica de cada muestra, de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 3. Efectos de salinidad en el suelo de acuerdo a los valores de conductividad eléctrica. (CE) Conductividad Eléctrica, (dS) deci-siemmens (NOM-021-RECNAT-2002).

CE dS m-1 Efectos

< 1.0 Efectos despreciables de la salinidad

1.1 – 2.0 Muy ligeramente salino

2.1 – 4.0 Moderadamente salino

4.1 – 8.0 Suelo salino

8.1 – 16.0 Fuertemente salino

> 16.0 Muy fuertemente salino

2.3 Análisis de varianza (ANOVA) de dos vías

Para determinar las diferencias de las características de suelo entre MV, SV,

MI y SI, se realizó un ANOVA de dos vías, usando el programa Statistica 10

(Statsoft, Inc. Tulsa, OK, USA). Los factores fueron: estación del año y tipo de micro-

hábitat.

2.4 Diagramas de Superficie

Se llevó a cabo la elaboración de diagramas de superficie de cada una de las

características edafológicas, usando el programa Surfer 10 (Golden Software, Inc.

Colorado). Estos diagramas proporcionan información sobre la variación de cada

característica de acuerdo al punto de muestreo georeferenciado creando isolineas

interpoladas de acuerdo a la distribución espacial de la variable.

2.5 Extracción de ADN genómico total de muestras de suelo

Se realizó la extracción de ADN genómico total de cada una de las muestras

de suelo. Este procedimiento se llevó a cabo utilizando el kit de extracción de ADN

30

PowerSoil® DNA Isolation Kit (Mobio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)

siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.6 Cuantificación y análisis de pureza del ADN genómico total extraído

Una vez extraído el ADN genómico total de suelo de cada una de las

muestras, se procedió a cuantificar y determinar la pureza de los ácidos nucleicos.

Lo anterior fue posible utilizando un equipo NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Modelo: Lite Nanodrop, Waltham, MA, USA).

Los resultados de la relación A260/A280 se consideraron de acuerdo a la

siguiente tabla:

Tabla 4. Interpretación de los datos obtenidos en la relación A260/A280.

Valor obtenido Interpretación

1.8 - 2 La absorción es originada por la presencia de ácidos nucleicos

<1.8 Presencia de proteínas u otros

contaminantes

>2 Posible contaminación con cloroformo

o fenol

2.7 Pruebas de PCR para seleccionar oligonucleótidos

Se probó la efectividad de cuatro combinaciones de oligonucleótidos

universales para la amplificación de la región ITS completa (ITS1-5.8S-ITS2) y la

amplificación de la región ITS1 (ver Figura 3) utilizando ADN genómico de una

muestra de suelo escogida al azar, además de agregar un control negativo (agua)

y un control positivo (ADN del hongo Neurospora crassa).

Combinaciones de oligonucleótidos:

a) ITS1F e ITS4 (oligonucleótido sentido y antisentido respectivamente), los

cuales amplifican entre 600 y 800 pb.

31

b) ITS1F e ITS2 (oligonucleótido sentido y antisentido respectivamente), los


c) ITS1 e ITS4 (oligonucleótido sentido y antisentido respectivamente), los


d) ITS1 e ITS2 (oligonucleótido sentido y antisentido respectivamente), los


El volumen de reacción de PCR fue de 20 µl. Las condiciones de PCR se

muestran en la Tabla 5.

Para verificar la amplificación, se corrieron 10 µl de cada reacción en geles

de agarosa al 1% (para amplicones esperados de 600 a 800 pb) y al 2% (para

amplicones esperados de 150 a 250 pb), se tiñeron con bromuro de etidio y se utilizó

el marcador de peso molecular GeneRulerTM (1 kb, Thermo Scientific, Waltham, MA,

USA) y GeneRulerTM (100 pb, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA),

respectivamente. Las bandas teñidas fueron observadas con luz UV.

32

Tabla 5. Reactivos y programas de PCR utilizados en la selección de oligonucleótidos.

Reactivo Concentración Volumen en

reacción Programa PCR

10X Dream Taq buffer (con MgCl2)

10X 4 µl

Desnaturalización inicial

°C Tiempo

dNTP’s 10 mM 1.5 µl

Oligo sentido (ITS1F) 10 μM 1.25 µl 95 5 min

Oligo antisentido (ITS4) 10 μM 1.25 µl

35

cic

los Desnaturalización 95 30 seg

DreamTaq polimerasa 5U/µl 0.25 µl Alineamiento 55 40 seg

H2O HPLC --- 10.75 µl Extensión 72 40 seg

ADN genómico 10 ng/µl 1 µl Extensión final 72 5 min


10X 4 µl


°C Tiempo


Oligo sentido (ITS1F) 10 μM 1.25 µl 95 5 min

Oligo antisentido (ITS2) 10 μM 1.25 µl 3

5 c

iclo

s Desnaturalización 95 30 seg





10X 4 µl


°C Tiempo


Oligo sentido (ITS1) 10 μM 1.25 µl 95 5 min


35

cic






10X 4 µl


°C Tiempo




35

cic





33

2.8 Amplificación de la región ITS del rADN

Una vez que se seleccionaron los oligonucleótidos, se procedió a la

amplificación de la región ITS1 de todas las muestras de ADN genómico de suelo

en reacciones de 50 µl y las condiciones indicadas en la Tabla 6.

Tabla 6. Condiciones de PCR utilizadas en la amplificación de la región ITS del rADN.

Para verificar la amplificación, se corrieron 10 µl de cada reacción en un gel

de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y se utilizó el marcador de peso

molecular GeneRulerTM (100 pb, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Las

bandas amplificadas fueron observadas con luz UV.

2.9 Preparación de ADN genómico para secuenciación

La compañía seleccionada para el servicio de secuenciación por la

plataforma de pirosecuenciación fue Research & Testing Laboratory

(http://www.researchandtesting.com/).

El ADN genómico de cada muestra fue ajustado a una concentración de

alrededor de 20 ng/µl en un volumen de 25 µl (según especificaciones de la

compañía). Las muestras de las cuales obtuvieron una concentración menor a la

especificada por la compañía se enviaron sin modificaciones.

Reactivos Concentración Volumen

de reacción Programa PCR


10X 10 µl

Desnaturalización

inicial

°C Tiempo



Oligo antisentido (ITS2)

10 μM 3.1 µl

35

cic





http://www.researchandtesting.com/

34

Los ajustes de concentraciones se realizaron con ayuda de un NanoDrop

(Thermo Fisher Scientific Inc., Modelo: Lite Nanodrop). La compañía encargada de

la pirosecuenciación llevó a cabo la amplificación y secuenciación de la región ITS

completa utilizando los oligonucleótidos ITS1F e ITS4.

2.10 Análisis de secuencias

Se recibieron 3 tipos de archivos como producto del proceso de

secuenciación:

- Archivo de secuencias (.fasta o .fna). Este archivo contiene las secuencias

de la región ITS del rADN, correspondientes a cada una de las muestras.

- Archivo de calidad (.qual). Archivo que contiene las puntuaciones de calidad

de cada base de cada una de las secuencias.

- Archivo de mapeo (.txt, Mapping File). Archivo que contiene las secuencias

de identificación de cada una de las secuencias, así como la secuencia del

oligonucleótido sentido.

En la Figura 8, se muestra un diagrama de flujo del manejo y análisis de las

secuencias.

35

Figura 8. Diagrama de flujo del manejo y análisis de secuencias. (OTU) Unidad Taxonómica Operacional.

2.10.1 Revisión de algoritmos para determinar la calidad de las secuencias

El proceso de limpieza de las secuencias realizado por la compañía fue el

siguiente:

- Calidad (Quality Trimming). Este proceso se basó en determinar la calidad

de los extremos de cada lectura. Para esto se utilizó el archivo con terminación .qual

(provisto por el secuenciador) el cual ayuda a determinar en qué parte de la

secuencia se encuentran bases que no cumplen con el criterio de calidad.

- Detección de quimeras (Chimera Checking). La formación de secuencias

quiméricas se produce cuando la extensión de una secuencia es “abortada” y esta

juega un papel de oligonucleótido en procesos subsecuentes de extensión durante

los siguientes ciclos de PCR (Petrosino et al., 2009; Quince et al., 2011). El

36

procedimiento que se utilizó para detectar secuencias quiméricas, fue mediante la

ejecución del algoritmo UCHIME en modo de novo (Edgar et al., 2011).

De acuerdo con Edgar y colaboradores (2011), el algoritmo UCHIME asume,

principalmente, que la secuencia a analizar corresponde a una secuencia única en

la muestra amplificada y que las secuencias quiméricas se encuentran en menor

proporción. El programa de UCHIME en modo de novo se basa en lo siguiente:

a) Se construye una base de datos, esto es, situando a las secuencias en orden

decreciente de abundancia ya que se considera que las secuencias “reales”

tendrán una abundancia por lo menos dos veces mayor que las secuencias

quiméricas.

b) Las secuencias no consideradas quiméricas, constituyen la base de datos.

- Eliminación de ruido (Denoising). Este proceso toma los archivos-

resultado del Quality Trimming y el Chimera Checking, eliminando los errores de

bases y secuencias de mala calidad. El algoritmo que se utiliza es el siguiente:

a) El sistema lee en el archivo una lista de secuencias no quiméricas y analiza

de nuevo las secuencias que hay que conservar y las colectará.

b) Cada secuencia es comparada con una secuencia consenso usando un

patrón de alineamiento y su puntuación de calidad, de acuerdo con las

siguientes condiciones:

- Si una base ha sido marcada para ser removida y además tiene una

puntuación menor a 30, es eliminada.

- Si la base ha sido marcada para ser removida pero cuenta con una

puntuación mayor a 30, es retenida.

- Si la base es marcada como alteración y su puntuación es menor a 30, la

base es cambiada por la letra N.

- Si la base es marcada como alteración pero su puntuación es mayor a 30, la

base es retenida.

- Si el patrón indica que una base debe ser insertada dentro de la secuencia,

entonces la base se inserta en la secuencia en la posición indicada.

37

- Por cada base que es cambiada o insertada se genera una nueva

puntuación, así como por cada base que es removida de la secuencia, su

puntuación registrada es removida.

Los archivos resultado de Denoising son utilizados para análisis posteriores

(archivos .fna o .fasta y .qual).

2.10.2 Extracción de secuencias de ITS1 e ITS2 del rADN

Se realizó la extracción de las regiones ITS1 e ITS2 de cada una de las

secuencias de cada muestra, con ayuda del programa Fungal ITS Extractor (Nilsson

et al., 2009), y a partir del archivo de secuencias (.fna).

El programa Fungal ITS Extractor realiza la extracción de las regiones ITS de

la siguiente manera:

a) Las regiones ITS1 e ITS2 se localizan utilizando secuencias cortas (18 a 25

pb) y largas (30 a 50 pb) de los genes 18S, 5.8S y 28S.

b) Cada una de las secuencias problema se alinea contra secuencias largas de

18S, 5.8S y 28S a través de un modelo estadístico de cadenas ocultas de

Markov (Nilsson et al., 2008). Este modelo estadístico optimiza el

alineamiento usando reiteraciones estocásticas.

c) Las regiones ITS se extraen de la secuencia problema si se encuentran los

límites de los genes 18S, 5.8S y 28S. En caso de no ser localizados, se

realiza un re-escaneo utilizando las secuencias cortas de los genes 18S, 5.8S

y 28S.

d) Se realizan extracciones parciales de las regiones ITS si solo se reconocen

extremos del 18S y 5.8S o 5.8S y 28S.

e) Se producen archivos .fasta (por separado) de las regiones ITS.

38

2.10.3 Revisión de archivo de mapeo (Mapping File)

Se realizó una revisión del archivo de mapeo con ayuda del programa QIIME

(Quantitative Insigths Into Microbial Ecology, www.qiime.org), utilizando el script

check_id_map.py (Ver Anexo 1). Características que se revisaron:

a) Caracteres inválidos tales como: + - % . / : , ;

b) Presencia de todas las secuencias de identificación, así como del

oligonucleótido sentido.

c) Corrección de duplicados de las secuencias de identificación y que tuvieran

la misma longitud.

2.10.4 Revisión de archivo de secuencias

Las secuencias que se analizaron fueron el archivo .fna con las secuencias

completas, así como también los archivos .fna de la región ITS1 e ITS2 (por

separado).

Utilizando el script Split Libraries (Ver Anexo 2) en QIIME, se realizó un

filtrado previo de las secuencias. Los archivos que se necesitaron para la ejecución

de este script fueron el archivo de las secuencias (.fasta o .fna), el archivo de calidad

(.qual), y el archivo de mapeo (Mapping File, .txt).

Los parámetros que se especificaron en el script fueron los siguientes:

a) Longitud de la secuencia de identificación: 8 (Tipo de secuencia de

identificación Hamming: longitud de 8 nucleótidos). Esta secuencia permitió

la separación de cada una de las secuencias de acuerdo a la muestra que

pertenecían.

b) Número de bases ambiguas en las secuencias: 0 (cero) (White et al., 2013).

c) Longitud mínima y máxima de las secuencias:

- Secuencias completas: 510 pb – 550 pb

- Secuencias ITS1: 160 pb (Orgiazzi et al., 2012) – 250 pb (Buee et al., 2009).

- Secuencias ITS2: 110 pb (Orgiazzi et al., 2012) – 170 pb (Nilsson et al., 2010)

39

2.10.5 Agrupamiento de secuencias en OTUs

Se asignaron secuencias similares a OTUs, agrupándolas en base a un

porcentaje de similitud. Para este estudio se utilizó un porcentaje de similitud 97%,

esto se aplicó a las secuencias completas, así como de las regiones ITS1 e ITS2.

Se utilizó el script Pick OTUs (Ver Anexo 3) en QIIME empleando el algoritmo de

UCLUST (Edgar, 2010).

El algoritmo de UCLUST define un grupo (cluster) en base a una secuencia

representativa o centroide. Cada secuencia que sea agregada a este grupo, debe

cumplir con el porcentaje de similitud a la secuencia centroide.

2.10.6 Selección de secuencias representativas

Para un mejor manejo de las secuencias, se llevó a cabo la selección de

secuencias representativas de cada OTU en los archivos de secuencias completas

y archivos de la región ITS1 e ITS2, utilizando el script Pick Rep Set (Ver Anexo 4)

en QIIME.

2.10.7 Asignación taxonómica

La asignación taxonómica de las secuencias representativas se realizó

tomando como base de datos a UNITE (Abarenkov & Nilsson, 2010) y a través de

RDP (Ribosomal Database Program), el cual permite la asignación taxonómica

haciendo coincidir segmentos de las secuencias problema a una base de datos

asignada (Wang et al., 2007). Lo anterior se realizó con ayuda del script Assign

Taxonomy (Ver Anexo 5) en QIIME.

40

2.10.8 Construcción de tabla de OTUs

La tabla de OTUs se construyó con ayuda del script Make OTU Table en

QIIME (Ver Anexo 6). Este script tabuló el número de OTUs encontrado en cada

muestra y su correspondiente taxonomía, es decir, una tabla de frecuencias de

OTUs.

2.10.9 Agrupación de OTUs por muestra

Se realizó una agrupación de OTUs por tipo, es decir, las 40 muestras se

separaron de acuerdo a su tipo: MI, MV, SI, SV, el cual resultó en una nueva tabla

de OTUs. Lo anterior se realizó con el script Summarize OTU By Cat (Ver Anexo 7)

en QIIME

2.11 Análisis de diversidad

Con el fin de establecer las diferencias entre las muestras, se realizaron

diferentes análisis de diversidad utilizando las tablas de OTUs correspondientes a

los análisis de las secuencias completas, y las secuencias de las regiones ITS1 e

ITS2.

2.11.1 Índice de Chao 1 y curvas de rarefacción

Utilizando la tabla de OTUs (por muestra) de las secuencias completas y las

secuencias de la región ITS1 e ITS2 el programa EstimateS 9 (Colwell, 2013),

calculó el estimador no paramétrico Chao 1, un estimador de la riqueza de especies

que se basa en el número de especies raras es una muestra (Moreno, 2001).

41

Fórmula:

Schao1= Sobs + (n21/ 2n2) (3)

Donde:

SChao1 riqueza total de especies.

Sobsnúmero de especies observadas.

n1número de especies observadas una vez.

n2número de especies observadas dos veces.

Además, se construyeron curvas de rarefacción para cada muestra (MI, MV,

SI, SV) utilizando las tablas de OTUs de las secuencias completas, así como de las

secuencias de las regiones ITS1 e ITS2. El software que se utilizó para las curvas

de rarefacción fue el “Null modeling software for ecologists” EcoSim 7 (Entsminger,

2012).

Las curvas de rarefacción permiten comparar la riqueza de cada muestra así

como determinar el esfuerzo de muestreo, el cual se basa en si la cantidad de

muestras son representativas de la riqueza de especies en el sitio de estudio; es

decir si se alcanza la asíntota, lo cual significaría que un muestreo adicional no

proporcionaría la identificación de especies adicionales (Gotelli & Colwell, 2010).

La rarefacción permite estimar el número esperado de especies de diferentes

muestras si todas tuvieran un mismo tamaño de muestra. Es decir, si la muestra

fuera considerada de n individuos, cuántas especies se registraría (Moreno, 2001).

Fórmula:

𝐸(𝑆) = Σ 1 − (𝑁−𝑁𝑖)/𝑛

𝑁/𝑛 (4)

Donde:

E(S)número esperado de especies

Nnúmero total de individuos en la muestra

Ninúmero de individuos en la iésima especie

ntamaño de muestra estandarizado

42

2.11.2 Índices

Utilizando la tabla de OTUs (muestra) de las secuencias completas y las

secuencias de la región ITS1 e ITS2, se estimaron los siguientes índices en el

programa EstimateS 9 (Colwell, 2013):

a) Índice de diversidad Shannon-Wiener. Este índice es una medida del grado

de incertidumbre asociado con la selección aleatoria de un individuo/especie

en una comunidad. Sus valores varían de 0 hasta el Logaritmo natural del

número de especies. Entre más alto sea su valor, mayor diversidad existe

(Moreno, 2001).

Fórmula:

H’= - Σp1 (ln (pi)) (5)

Donde:

pi Proporción de especies en una muestra.

b) Índice de dominancia Simpson. Este índice evidencia la probabilidad de que

dos individuos (tomados al azar) pertenezcan a la misma especie; cuando su

valor se acerca a 1, se considera una riqueza alta, mientras que cuando más

alejado de 1, se considera una riqueza menor (Moreno, 2001).

Fórmula:

D= ∑pi2 (6)

Donde:

pi2 Abundancia proporcional de la especie i.

2.11.3 Análisis comparativo de composición

Utilizando el script Summarize Taxa (Ver Anexo 8) en QIIME se realizó un

análisis de los grupos taxonómicos a nivel de Clase, utilizando la tabla de OTUs (por

43

muestra) de las secuencias completas y las secuencias de las regiones ITS1 e ITS2.

Este script sirvió como análisis previo a la construcción de la gráfica de la

distribución taxonómica a nivel de Clase. Para la construcción de la gráfica se utilizó

el script Plot Taxa Summary (Ver Anexo 8) en QIIME.

Este análisis permite observar la composición taxonómica (en porcentaje)

presente en cada muestra, posibilitando la comparación entre ellas.

2.11.4 Análisis de agrupamiento (Clustering)

Se realizó un análisis de agrupamiento con el paquete estadístico R (R

v.3.01, script: BiodiversityR). Para ello se utilizó la tabla de OTUs (por muestra) de

las secuencias completas, región ITS1 e ITS2. Este análisis permitió calcular

matrices de distancia de Bray & Curtis para la construcción de un dendograma, el

cual reveló las diferencias de la composición a nivel de clase entre distintas

muestras (Kindt & Coe, 2005), así como también entre el nivel taxonómico.

La distancia ecológica de Bray & Curtis permite establecer las diferencias

entre muestras a partir del cálculo de la abundancia de cada especie; la distancia

final será influenciada por especies con mayor diferencia en abundancia, esto bajo

el supuesto de que estas especies están mejor muestreadas, permitiendo

representar las diferencias entre muestras de una mejor manera (Kindt & Coe,

2005).

La representación de estos dendogramas se acompañó con mapas de calor,

los cuales, por medio de diferentes intensidades de colores, representaron la

abundancia relativa de cada taxón en cada muestra.

2.11.5 Análisis de correspondencia canónica

El análisis de correspondencia canónica (CCA) es una técnica estadística

multivariada que permite representar la proximidad entre variables dependientes

(sitios por especies) e independientes (variables ambientales). El CCA utiliza un

44

modelo cuadrático, que en comparación con el PCA (Análisis de Componentes

Principales), que utiliza un modelo lineal (Euclidiano), no se sesga ante la presencia

de valores extremos (Kindt & Coe, 2005), tomando en cuenta las especies poco

abundantes.

El CCA arroja coeficientes canónicos (CCA1 y CCA2), los cuales son los

coeficientes de la regresión múltiple ponderada. En el gráfico de ordenación del

CCA, las variables independientes están representadas por aquellas, en su caso

variables ambientales, que fueron estadísticamente significativas en el estudio, y en

el gráfico de ordenación se presentan como una proyección (por medio de vectores)

que equivale a su correlación con el eje y estas parten del centro de gravedad

(centro del gráfico). En los cuadrantes del gráfico de ordenación se proyectan las

variables dependientes (muestras) para observar su correlación en relación a los

vectores (variables independientes o explicativas), esperando patrones de

agrupamiento entre muestras.

Este análisis se llevó a cabo a partir del programa R (R v.3.01, paquete de

scripts: BiodiversityR).

45

Capítulo 3. Resultados

3.1 Muestreo

Se obtuvieron 10 muestras de suelo madriguera (M) y 10 muestras de suelo

superficie (S), de alrededor de 500 gramos, en cada estación (verano, V, e invierno,

I), sumando un total de 40 muestras de suelo (10 MV, 10 SV, 10 MI, 10 SI)

3.2 Variables medidas en campo

3.2.1 Humedad sensor

Los valores de humedad medidos con el sensor LI-8100 para suelos de MV,

SV, MI y SI, fueron, respectivamente, 0.10 ± 0.01 (Media ± Desviación Estándar),

0.09 ± 0.01, 0.15 ± 0.07 y 0.15 ± 0.06 % (Figura 9).

A pesar de que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas

entre las diferentes muestras (Anexo 9) (P > 0.05), existió variación entre

estaciones. (Figura 10). En verano los valores oscilaron entre 0.02% hasta 0.12%,

mientras que en invierno, los valores oscilaron desde 0.02% hasta 0.3%.

46

Figura 9. Humedad medida con sensor LI-8100 en suelo. Las barras de error representan las desviaciones estándar. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

Figura 10. Variación espacial de la Humedad medida por sensor LI-8100 en suelo en VDP. (A) Verano y (B) Invierno. (M) Madriguera, (S) Superficie.

47

3.2.2 Temperatura sensor

Los valores de temperatura medidos con el sensor LI-8100 para suelos de

MV, SV, MI y SI, fueron, respectivamente, 36.810 ± 4.188 (Media ± Desviación

Estándar), 40.46 ± 4.60, 15.26 ± 3.29 y 14.88 ± 1.62 °C (Figura 11).

En congruencia con el ANOVA que indicó diferencias significativas entre las

muestras de verano contra las de invierno (Anexo 9; P < 0.05), existió variación

entre estaciones (Figura 12). Los valores de temperatura obtenidos durante el

verano (MV y SV, Figura 12-A) alcanzaron un valor máximo de hasta 49°C, mientras

que durante el invierno, alcanzaron un valor máximo de 22°C.

Figura 11. Temperatura medida por sensor LI-8100 en suelo. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

48

Figura 12. Variación espacial de la Temperatura medida por sensor en suelo en VDP. (A) Verano y (B) Invierno. (M) Madriguera, (S) Superficie.

3.3 Caracterización de suelo

3.3.1 Potencial de hidrógeno (pH)

Los valores de pH para suelos de MV, SV, MI y SI, fueron, respectivamente,

5.813 ± 0.295 (Media ± Desviación Estándar), 5.92 ± 0.17, 5.75 ± 0.61 y 5.82 ± 0.674

(Figura 13).

No se encontraron diferencias significativas entre las diferentes muestras

(Anexo 9) (P > 0.05).

Existe una variación del pH estacional y por puntos de muestreo (Figura 14).

En verano los valores oscilaron entre 5.3 hasta 6.1, mientras que en invierno, los

valores oscilaron desde 4.1 hasta 6.3.

49

Figura 13. pH de suelo en VDP. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

Figura 14. Variación espacial de pH en VDP en (A) Verano y (B) Invierno. (M) Madriguera, (S) Superficie.

50

3.3.2 Contenido de humedad

Los valores de humedad obtenidos por el método de gravimetría para suelos

de MV, SV, MI y SI, fueron, respectivamente, 0.71 ± 0.73 (Media ± Desviación

Estándar), 0.80 ± 0.38, 8.61 ± 2.62 y 7.68 ± 3.39 (Figura 15).

En congruencia con el ANOVA que indicó diferencias significativas de

humedad entre las muestras de verano contra las de invierno (Anexo 9; P < 0.05),

se encontraron diferencias estacionales (Figura 16). Los valores de humedad

durante el verano alcanzaron un valor máximo de hasta 6%, mientras que durante

el invierno fue de 15%.

Figura 15. Contenido promedio de Humedad en suelo determinada por el método de gravimetría. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

51

Figura 16. Variación espacial de la Humedad en VDP en (A) Verano y (B) Invierno. (M) Madriguera y (S) Superficie.

3.3.3 Contenido de materia orgánica

Los valores de materia orgánica para suelos de MV, SV, MI y SI, fueron,

respectivamente, 5.813 ± 0.295 (Media ± Desviación Estándar), 5.92 ± 0.178, 5.756

± 0.611 y 5.829 ± 0.674 (Figura 17).

A pesar de que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas

de materia orgánica entre las diferentes muestras (Anexo 9) (P > 0.05), se

encontraron variaciones estacionales (Figura 18). Los valores de materia orgánica

que se obtuvieron durante el verano alcanzaron un valor máximo de hasta 4.4%,

mientras que durante el invierno, fueron de 6.8%.

52

Figura 17. Contenido promedio de Materia Orgánica en suelo. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

Figura 18. Variación espacial de Materia orgánica en el sitio VDP en (A) Verano e (B) Invierno. (M) Madriguera y (S) Superficie.

53

3.3.4 Textura

La relación entre los porcentajes arena, arcilla y limo de los suelos MV, SV,

MI, SI (Tabla 7) indican que el suelo en la estación de invierno es Franco-Arenoso,

mientras que el suelo en la estación de verano es Franco-Arenoso-Arcilloso.

Tabla 7. Porcentaje de arena, arcilla y limo en cada muestra. (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

3.3.5 Determinación de salinidad por conductividad eléctrica

Los valores de conductividad eléctrica para suelos de MV, SV, MI y SI,

fueron, respectivamente, 0.72 ± 0.61 (Media ± Desviación Estándar), 0.39 ± 0.09,

1.24 ± 1.11 y 1.04 ± 0.97 (Figura 19).

En congruencia con el ANOVA (Anexo 9, P > 0.05), no hubo diferencias en

la variación estacional y de micro-hábitat de la conductividad eléctrica del suelo

entre las muestras, si no más bien entre los puntos de muestreo en la

correspondiente estación (Figura 20). Los valores de conductividad eléctrica que se

muestran durante el verano alcanzaron un valor máximo de hasta 2.3 dS m-1,

mientras que durante el invierno, alcanzaron un valor máximo de 2.9 dS m-1.

Muestra Arena (%) Arcilla (%) Limo (%)

MV 68.42 22.96 8.61

SV 56.24 23.08 20.68

MI 71.02 10.2 18.73

SI 70.57 15.12 14.13

54

Figura 19. Promedio de Conductividad eléctrica. Letras diferentes indican muestras estadísticamente diferentes (P<0.05). (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

Figura 20. Variación espacial de la Conductividad eléctrica en el sitio VDP en (A) Verano y (B) Invierno. (M) Madriguera, (S) Superficie.

55

3.4 Extracción, cuantificación y análisis de pureza del ADN genómico total de

muestras de suelo

Las muestras con mayor concentración de ADN fueron MV (23.51 ng/µl ±

5.12) y SV (24.31 ng/µl ± 5.10) con respecto a SI (19.16 ng/µl ± 7.56) y MI (19.11

ng/µl ± 5.30).

Las muestras individuales con mayor concentración de ADN (Tabla 8) fueron

1MV, 1SV, 4SV y 3SI, los cuales alcanzaron valores mayores a 30 ng/µl.

Las muestras individuales con valores de pureza más cercanos a 1.8, fueron

8MV, 5SV, 3SI, 6SI y 9SI (Tabla 8). Ninguna muestra alcanzó valores igual o

mayores a 1.8, pero si cercanos a éste, por lo que se infiere la presencia de

proteínas u otros contaminantes.

56

Tabla 8. Concentraciones y pureza de ADN genómico total extraído de muestras de suelo MV, SV, MI y SI.

Muestra Concentración

(ng/µl)

Pureza (A260/ A280 )

Muestra Concentración

(ng/µl)

Pureza (A260/ A280 )

1MV 33 1.6 1MI 26 1.59

2MV 13.6 1.41 2MI 15.4 1.54

3MV 22.4 1.59 3MI 19.9 1.54

4MV 20.3 1.45 4MI 18.7 1.61

5MV 21.6 1.61 5MI 25.7 1.65

6MV 23.1 1.46 6MI 15.9 1.58

7MV 28.1 1.52 7MI 19.65 1.52

8MV 26.4 1.73 8MI 25.5 1.66

9MV 22.1 1.68 9MI 11.7 1.49

10MV 24.5 1.65 10MI 12.7 1.55

1SV 35.4 1.66 1SI 28 1.66

2SV 20.1 1.68 2SI 10.6 1.63

3SV 20.6 1.59 3SI 32 1.75

4SV 30.4 1.67 4SI 25 1.69

5SV 23.3 1.7 5SI 12.8 1.69

6SV 19.3 1.62 6SI 19.7 1.74

7SV 24.1 1.62 7SI 12.4 1.64

8SV 25.4 1.58 8SI 20.3 1.67

9SV 20.4 1.65 9SI 20.3 1.73

10SV 24.1 1.67 10SI 10.5 1.63

3.5 Pruebas de PCR para seleccionar oligoucleótidos

Se logró la amplificación de la región ITS y la región ITS1 con los

oligonucleótidos empleados. La mejor amplificación se logró para la región ITS1 con

el par de oligonucleótidos ITS1 (oligo sentido) e ITS2 (oligo anti-sentido) ya que en

comparación de los otros pares de oligonucleótidos, se observó una banda más

definida e intensa (Figura 21).

57

Figura 21. Prueba de oligonucleótidos para la amplificación de la región ITS del rADN de muestras ambientales obtenidas de VDP. (A) ITS1F ITS4 y (B) ITS1 ITS4: Marcador de Peso Molecular de 1 kb (MPM), Control negativo-H2O (-), Control positivo-Neurospora crassa (+), Muestra ambiental amplificada (VDP). (C) ITS1F ITS2 y (D) ITS1 ITS2: Marcador de Peso Molecular de 100 pb (MPM), Control negativo (-), Control positivo (+), Muestra ambiental amplificada (VDP).

3.6 Amplificación de la región ITS del rADN

En la mayoría de las muestras amplificadas de MI se obtuvieron bandas de

diferentes tamaños, de entre 200 pb hasta 300 pb, lo cual podría indicar la

variabilidad en la longitud de la región ITS1 (Figura 22-A). En la amplificación de las

muestras SI se obsevaron patrones similares a las muestras MI, solo que algunas

58

bandas ascienden desde 300 pb hasta 400 pb (Figura 22-B). En la amplificación de

la región ITS1 en muestras de MV se obtuvieron bandas de 200 hasta 350 pb (Figura

22-C), mientras que para las muestras de SV, bandas de 200 pb hasta 300 pb fueron

obtenidas (Figura 22-D).

Figura 22. Amplificación de la región ITS1 del rADN utilizando el par de oligonucleótidos ITS1F e ITS2. (A) Muestras MI (Madriguera-invierno). (B) Muestras SI (Superficie-invierno). (C) Muestras MV (Madriguera-verano). D: Muestras SV (Superficie-Verano). MPM (Marcador de Peso Molecular, 100 pb). (-) Control negativo-H2O. (+) Control positivo-ADN genómico de Neurospora crassa usado como templado.

59

3.7 Preparación de ADN genómico para su secuenciación

El ADN genómico total de la mayoría de las muestras, se logró normalizar en

alrededor de 20 ng/µL. Las muestras que no alcanzaron esa concentración porque

presentaron concentraciones de entre 10.5 ng/µL (10SI) hasta 15.9 ng/µL (6MI),

también fueron enviadas a secuenciar.

3.8 Análisis de secuencias

El análisis de las secuencias realizado en el presente trabajo, se hizo con

base en la (1) Región ITS completa (ver Figura 2, RC), la cual incluye parte de la

región 18S, la ITS1 (completa), 5.8S (completa), y la ITS2 (parcial); así como

también con base en la Región ITS1 completa y la Región ITS2 parcial.

3.8.1 Extracción de secuencias ITS1 e ITS2 del rADN

Utilizando el programa Fungal ITS Extractor (Nilsson et al., 2009), a partir del

archivo de secuencias (.fna), se logró la extracción de las regiones ITS1 e ITS2.

Este programa dio como resultado dos archivos: ITS1.fasta e ITS2.fasta. De un total

de 385,329 secuencias que contenía el archivo de entrada, se logró la extracción

de las regiones ITS1 e ITS2 de un total de 352,637 secuencias.

3.8.2 Revisión de archivo de secuencias

Del filtro realizado con el script Split Libraries en QIIME, un total de 235,861

secuencias para la región completa (RC) lograron pasar los requerimientos de

calidad especificados en el script (Anexo 10).

En el caso de las secuencias parciales de las regiones ITS1 e ITS2, 340,593

secuencias ITS1 y 146,488 ITS2 lograron pasar el filtro de calidad.

60

El número de secuencias por muestra fue variable; tanto para RC como para

ITS1, MV presentó un mayor número de secuencias que las demás muestras

(Figura 23; Anexo 10). El número de secuencias obtenidas con la región ITS2, fue

menor en todas las muestras (Figura 23; Anexo 10).

Figura 23. Número de secuencias obtenidas por muestra. Las barras representan el número total de secuencias por muestra. (RC) Región completa, (ITS1) Región ITS1, y (ITS2) Región ITS2. (MV) Madriguera-Verano, (SV) Superficie-Verano, (MI) Madriguera-Invierno, y (SI) Superficie-Invierno.

3.8.3 Unidad taxonómica operacional (OTU) y secuencias representativas

Tomando en cuenta RC, de un total de 235,861 secuencias, se obtuvieron

2,475 OTUs (umbral de agrupamiento: ≥ 97% de similitud en todos los casos). En

el caso de la región ITS1, de un total de 340,593 secuencias, se obtuvieron 2,725

OTUs y analizando la región ITS2, de un total de 146,488 secuencias, se

identificaron 4,448 OTUs (Tabla 9).

Independientemente de la región contemplada, las muestras de MV en

conjunto presentaron la mayor cantidad de OTUs (Tabla 9), mientras que la muestra

61

con menor cantidad de OTUs para la RC e ITS2 fue SV y para la región ITS1 fue SI

(Tabla9).

Tabla 9. Número total de OTUs por tipo de muestra. (MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno. (SI) Superficie-Invierno.

Total OTUs

Muestra Número de

OTUs

Región completa

2,475

MV 1,249

SV 748

MI 906

SI 919

Región ITS1

2,725

MV 1,368

SV 834

MI 1,137

SI 1,052

Región ITS2

4,448

MV 2,036

SV 1,348

MI 1,904

SI 1,686

3.8.4 Índice de Chao 1 y análisis de rarefacción

A un 97% de similitud y analizando la RC, el estimador no paramétrico Chao

1, predijo un rango de 1,455 (SV) hasta 3,735 OTUs (SI) (Tabla 10). En el caso de

la región ITS1 el rango de 1,688 (SV) hasta 4,062 (SI) OTUs, mientras que para la

región ITS2 fue de 1,833 (SV) hasta 4,549 (SI) (Tabla 10).

62

Tabla 10. Índice de Chao 1 calculado para cada muestra (MV) Madriguera-Verano, (SV) Superficie-Verano, (MI) Madriguera-Invierno, y (SI) Superficie-Invierno. (IC) Intervalo de confianza inferior y superior al 95%.

Muestra

Chao 1

Media IC inf. (95%)

IC sup. (95%)

Región completa

MV 2,363 2,210 2,553

SV 1,455 1,336 1,612

MI 3,092 2,915 3,307

SI 3,735 3,538 3,969

Región ITS1

MV 2,693 2,522 2,902

SV 1,688 1,553 1,862

MI 3,450 3,258 3,679

SI 4,062 3,859 4,303

Región ITS2

MV 2,923 2,716 3,175

SV 1,833 1,666 2,047

MI 3,776 3,540 4,055

SI 4,549 4,282 4,860

Las curvas de rarefacción permiten estimar el esfuerzo de muestreo en

relación con el número de secuencias y el número de OTUs para un tamaño

reducido de muestra. Así, en el caso de haber tenido una muestra con menor

número de secuencias, las demás muestras se rarifican a ésta, permitiendo la

comparación entre ellas.

Considerando RC (Figura 24-A), Chao 1 predijo que el tipo de muestra para

el cual se puede obtener un mayor número de OTUs es MI, seguido por MV y SV, y

el de menor número fue SI. Las curvas de rarefacción sugirieron que no existen

diferencias significativas entre tipos de muestra con intervalos de confianza al 95 %

(Figura 24).

En el caso de la Región ITS1 (Figura 24-B), Chao 1 predijo que el tipo de

para la cual se puede obtener un mayor número de OTUs fue MI, seguido por MV y

SI, y la muestra que presentó el menor número de OTUs fue SV. Las curvas de

rarefacción para la Región ITS1 sugieren que existen diferencias significativas entre

63

la muestra MI contra las muestras MV, SV y SI con intervalos de confianza al 95 %

(Figura 24).

En el caso de la Región ITS2 (Figura 24-C), Chao 1 predijo que el tipo de

muestra para el cual se puede obtener un mayor número de OTUs es MI, seguido

por SV y SI, y la muestra que tuvo el menor número de OTUs fue MV. Las curvas

de rarefacción para la Región ITS2 sugieren que existen diferencias significativas

entre las muestras MI y SI, MI y MV, así como también entre MV y SV, con intervalos

de confianza al 95 % (Figura 24).

A pesar del gran número de secuencias, las curvas de rarefacción de cada

muestra (MV, SV, MI y SI) no alcanzan una asíntota en ninguna de las regiones

analizadas (completa (Figura 24-A), ITS1 (Figura 24-B) e ITS2 (Figura 24-C)).

64

Figura 24. Curvas de rarefacción indicando el número de Unidades Taxonómicas Operacionales (OTUs) a una similitud del 97% en relación al número de secuencias pertenecientes a Región Completa (A), Región ITS1 (B) y Región ITS2 (C) y la muestra: MV (Madriguera-Verano), SV (Superficie-Verano), MI (Madriguera-Invierno), y SI (Superficie-Invierno).

65

3.8.5 Índices de diversidad ecológica

El índice de Shannon-Wienner fue mayor para muestras de invierno (MI y SI)

que para muestras de verano (MV y SV) (Tabla 11), independientemente de la

región ITS considerada. La estimación del índice de Simpson fue mayor en

muestras de invierno que en muestras de verano, cuando se tomó en cuenta la RC

e ITS1; mientras que al usar la región ITS2, el índice de Simpson fue mayor para S

que las de M (Tabla 11).

Con relación al índice de Shannon-Wienner, en invierno consistentemente

las muestras de S presentaron los valores más altos (Tabla 11). Por otro lado, en

verano las muestras M fueron las que presentaron los valores más altos. Las

estimaciones del índice de Simpson mostraron que en invierno las muestras M son

más diversas que las de S tomando en cuenta la RC e ITS1; mientras que al usar

la región ITS2 las muestras de S mostraron una mayor diversidad (Tabla 11). En

cambio, para las muestras de verano, las muestras de S consistentemente

mostraron una mayor diversidad que las de M para los tres tipos de región ITS

considerada (Tabla 11).

66

Tabla 11. Índices de diversidad ecológica calculados para cada muestra (MV) Madriguera-Verano, (SV) Superficie-Verano, (MI) Madriguera-Invierno, y (SI) Superficie-Invierno. (SD) Desviación estándar.

Muestra Simpson Shannon ± SD

Región completa

MV 0.866 3.98 ± 0.29

SV 0.923 3.79 ± 0.36

MI 0.965 4.12 ± 0.21

SI 0.937 4.17 ± 0

Región ITS1

MV 0.909 4.25 ± 0.24

SV 0.947 4.04 ± 0.31

MI 0.973 4.39 ± 0.16

SI 0.949 4.46 ± 0

Región ITS2

MV 0.834 4.9 ± 0.12

SV 0.963 4.54 ± 0.19

MI 0.951 5.08 ± 0.06

SI 0.976 5.18 ± 0

3.8.6 Análisis comparativo de composición

Para estimar la diversidad fúngica, así como las diferencias de cada una de

las muestras de acuerdo al análisis de la RC, región ITS1 y región ITS2, se

agruparon los OTUs de acuerdo al nivel taxonómico de clase (Figura 25).

En los análisis de la RC, se observó una predominancia del filo Ascomycota

con 89% en MV, 82.90% en SV, 85% en MI y un 73% en MI (Figura 25-A). Dentro

de este filo, predominó la clase Dothideomycetes con 69.40% en MV, 62% en SV,

41.10% en MI y un 38.10% en SI (Figura 25-A). Esto seguido por los

Sordariomycetes con 11.70% en MV, 8.10% en SV, 28% en MI y un 15.20% en SI

(Figura 25-A). La clase con menos abundancia fue la de los Saccharomycetes con

un 0.03% en MV, 0.02% en SV, 0.44% en MI y un 0.25% en SI (Figura 25-A). Cabe

resaltar la clase Agaricostilbomycetes del filo Basidiomycota que se encontró en

solo una muestra MI con un 0.01% (Figura 25-A), y la clase Monoblepharidomycetes

del filo Chytridiomycota que se encontró en la muestra SI con un 0.003% (Figura

67

25-A). El porcentaje de hongos no identificados fue de 1.91% en MV, 3.07% en SV,

4.27% en MI y 13.40% en SI (Figura 25-A).

En los análisis de la región ITS1, al igual que para la RC, el filo Ascomycota

fue el más predominante en todas las muestras con 88.60% en MV, 71.71% en SV,

80.50% en MI y 69.90% en SI (Figura 25-B). Dentro de este filo, destacó la

predominancia de la clase Dothideomycetes en tres muestras con 56.95% en MV,

47.18% en SV y 29.29% en SI (Figura 24-B). En la muestra MI, la clase de mayor

predominancia fue la de los Sordariomycetes con 36% (Figura 25-B), siendo

también esta clase una de las más abundantes en las otras muestras, 22.50% en

MV, 10.49% en SV y 16.49% en SI (Figura 25-B). El filo Chytridiomycota sólo estuvo

presente en MI con un 0.06%. El porcentaje de hongos no identificados fue de

4.77% en MV, 16.43% en SV, 11.35% en MI y 15.52% en SI (Figura 25-B).

En el análisis de la región ITS2, el filo Ascomycota también fue el

predominante con 86.50% en MV, 75.60% en SV, 83.90% en MI y 66.90% en SI

(Figura 25-C). Dentro de este filo, la clase Dothideomycetes fue la predominante

con 34.49% en SV (Figura 25-C), mientras que una clase no identificada

perteneciente al filo Ascomycota se presentó como dominante con 46.42% en MV,

32.12% en MI y 25.31% en SI (Figura 25-C). La clase Sordariomycetes, fue una de

las menos abundantes en todas las muestras con 12.40% en MV, 11.88% en SV,

23.47% en MI y 14.37% en SI (Figura 25-C). La clase Exobasidiomycetes solo se

encuentró presente en la muestra SI con 0.01%.

68

Figura 25. Composición taxonómica de las secuencias de rADN metagenómicas obtenidas por pirosecuenciación. Región Completa (A), Región ITS1 (B) y Región ITS2 (C). (MV) Madriguera-Verano, (SV) Superficie-Verano, (MI) Madriguera-Invierno, (SI) Superficie Invierno.

3.8.7 Análisis de agrupamiento y mapas de calor

Con el fin de determinar patrones de similitud entre las diferentes muestras

de acuerdo a la presencia y abundancia de las clases (nivel taxonómico) de hongos,

se llevó a cabo la construcción de mapas de calor para la RC, región ITS1 y región

ITS2.

69

Junto con el mapa de calor se grafican dos dendogramas acoplados; en la

parte superior se encuentra el dendograma construido con valores de disimilitud

entre muestras de acuerdo a la abundancia de clases taxonómicas que la

conforman, mientras que en la parte derecha del mapa de calor, se encuentra el

dendograma construido con valores de disimilitud entre clases taxonómicas de

acuerdo a su abundancia en las muestras (matriz transpuesta a la anterior). Las

agrupaciones que se observan en ambos dendogramas fueron de acuerdo a la

matriz de distancia Bray & Curtis. En el caso del dendograma de disimilitud entre

muestras, se puede observar que se distinguen dos agrupamientos (clusters), uno

hacia la derecha del dendograma que agrupa mayormente muestras de invierno,

mientras que a la izquierda se agrupan las muestras de verano (Figura 26). En

relación a las clases, en los extremos del dendograma se pueden obsevar las

agrupaciones entre las clases raras o con menor abundancia en relación a las

muestras (filo Chytridiomycota, Glomeromycota, Ascomycetes/Lecanoromycetes,

Basidiomycota/Agariscotilbomycetes y Basidiomycota/Microbotriomycetes),

mientras que hacia el centro del dendograma se pueden observar las clases más

abundantes, las cuales se pueden definir en 2 grupos, uno dominado por hongos

del filo Ascomycota (Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Saccharomycetes, e

Incertae_sedis), y el segundo grupo presenta una mezcla de hongos del filo

Ascomycota (Other, Leoteomycetes, Sordariomycetes) y Basidiomycota

(Agaricomycetes, Other, Unidentified, Tremellomycetes), donde la clase

Sordariomycetes se exhibe como la más abundante en relación a las muestras. En

el grupo de muestras dominantes en verano (superior izquierda, dendograma

superior), se puede observar una mayor abundancia de la clase Dothideomycetes

(filo Ascomycota) y una menor abundancia en el grupo dominado por Ascomycota

y Basidiomycota, mientras que en el grupo dominado por las muestras de invierno,

hay una menor abundancia de la clase Dothideomycetes y una mayor abundancia

para el grupo dominado por Ascomycota y Basidiomycota (Figura 26).

70

Figura 26. Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada muestra analizando la región completa. MV(Madriguera-Verano). SV (Superficie-Verano). MI (Madriguera-Invierno). SI (Superficie-Invierno). Nivel taxonómico: clase. Dendograma superior: Disimilitud entre muestras. Dendograma derecha: Relación de disimilitud de acuerdo a abundancias, no filogenético

De forma similar a lo anterior, en el mapa de calor correspondiente a la región

ITS1 (Figura 27), se puede observar que se distinguen dos agrupamientos

(clusters), uno hacia la izquierda del dendograma que agrupa mayormente muestras

de invierno mientras que a la derecha se agrupan (de forma variable) muestras de

verano e invierno. En relación a las clases, en los extremos del dendograma se

71

pueden obsevar las agrupaciones entre las clases raras o con menor abundancia

en relación a las muestras (Ascomycota/Lecanoromycetes, Hongo sin clasificar,

Basidiomycota/Exobasidiomycetes, Chytridiomycota/Chytridiomycetes,

Ascomycota/Saccharomycetes, Ascomycota/Incertae_sedis y

Glomeromycota/Glomeromycetes), mientras que dentro del dendograma se pueden

observar las clases más abundantes, las cuales se pueden definir en 2 grupos, uno

dominado por hongos del filo Ascomycota (Dothideomycetes, Sordariomycetes,

Agaricomycetes, Other y Unidentified), mientras que el segundo grupo presenta una

mezcla de hongos del filo Ascomycota (Orbiliomycetes, Eurotiomycetes,

Leotiomycetes y Unidentified) y Basidiomycota (Other y Tremellomycetes), donde la

clase Eurotiomycetes se presenta como la más abundante en relación a las

muestras. Si se observa el grupo de muestras dominado por invierno, se puede

observar una mayor abundancia de la clase Sordariomycetes (filo Ascomycota) y

una menor abundancia del filo Basidiomycota, mientras que en el grupo de muestras

variables de verano e invierno, dominado por las muestras de invierno, hay una

mayor abundancia del filo Ascomcomycota con la clase Dothideomycetes y Other.

72

Figura 27. Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada muestra analizando la región ITS1. MV(Madriguera-Verano). SV (Superficie-Verano). MI (Madriguera-Invierno). SI (Superficie-Invierno). Nivel taxonómico: clase. Dendograma superior: Disimilitud entre muestras. Dendograma derecha: Relación de disimilitud de acuerdo a abundancias, no filogenético.

Finalmente, en el caso del dendograma de disimilitud entre muestras

correspondientes a la región ITS2 (Figura 28), se puede observar que no se

distinguen agrupaciones claras entre las muestras. En relación a las clases, en la

parte superior del dendograma se pueden obsevar las agrupaciones entre las clases

raras o con menor abundancia: del filo Chytridiomycota (Unidentified y

Chytridiomycetes), Ascomycota (Lecanoromycetes, Orbiliomycetes,

Saccharomycetes), Basidiomycota (Exobasidiomycetes y Microbotryomycetes) y

Glomeromycota (Glomeromycetes). En el centro del dendograma se pueden

73

observar las clases más abundantes dominadas por el filo Ascomycota

(Pezizomycetes, Dothideomycetes, Sordariomycetes, Unidentified y Other),

mientras que en el grupo de la parte inferior del dendograma se encuentra

representado por hongos del filo Ascomycota y Basidiomycota.

Figura 28. Mapa de calor de la abundancia relativa de clases de hongos en cada muestra analizando la región ITS2. MV (Madriguera-Verano). SV (Superficie-Verano). MI (Madriguera-Invierno). SI (Superficie-Invierno). Nivel taxonómico: clase. Dendograma superior: Disimilitud entre muestras. Dendograma derecha: Relación de disimilitud de acuerdo a abundancias, no filogenético.

74

3.8.8 Análisis de correlación canónica

El análisis de correspondencia canónica mostró que las variaciones en la

distribución fúngica están asociadas con ciertas características físico-químicas del

suelo. Se utilizó el primer par de variables canónicas debido a que explican una

mayor proporción de la varianza total en relación de las variables físico-químicas

del suelo contra la distribución fúngica. La varianza explicada por las variables

canónicas (CA1 y CA2 en Tabla 12) fue mayor para la región ITS1 (41.64%),

seguido por la RC (39.1%) y la región ITS2 (36.24%) (Tabla 12).

En el caso de la RC, la distribución fúngica mostró una relación

estadísticamente significativa con Humedad Gravimetría (HG) y Temperatura

(Temp) (P<0.05; Tabla 12). Todas las muestras tipo MI (excepto MI3) y MV, se

encontraron positivamente correlacionadas con Temp y negativamente

correlacionadas con HG (Figura 29). En el caso de las muestras tipo SV, SI y la

muestra MI3, todas excepto SI1 y SI7, estuvieron positivamente correlacionadas

con HG y negativamente correlacionadas con Temp (Figura 29); mientras que las

muestras SI1 y SI7 no estuvieron correlacionadas directamente con las variables.

En el análisis de la región ITS1, la distribución fúngica también mostró una

relación estadísticamente significativa con HG y Temp (P<0.05; Tabla 12). Todas

las muestras tipo MI (excepto MI3) y MV, se encuentraron positivamente

correlacionadas con Temp y negativamente correlacionadas con HG (Figura 30). En

el caso de las muestras tipo SV, SI y la muestra MI3, todas excepto SI1 y SI7,

estuvieron positivamente correlacionadas con HG y negativamente correlacionadas

con Temp (Figura 30), mientras que las muestras SI1 y SI7 no tuvieron una

correlación directa con las variables.

Por último en el análisis de la región ITS2, la distribución fúngica mostró una

relación estadísticamente significativa solamente con la Temp (P<0.05; Tabla 12).

Todas las muestras tipo MI y MV, se encuentraron negativamente correlacionadas

con Temp (Figura 31), mientras que en el caso de las muestras tipo SV y SI,

estuvieron positivamente correlacionadas con Temp (Figura 31).

75

Tabla 12. Vectores para cada variable de las propiedades físico-química del suelo para el análisis de correlación canónica. (HG) Humedad por gravimetría, (MO) Materia orgánica, (Sal) Salinidad, (HS) Humedad sensor, (Temp) Temperatura, (F) Fósforo, (N) Nitrógeno, (AR) Arena, (ARC) Arcilla, (LIM) Limo. (r2) Coeficiente de correlación. (Pr(>r)) Significancia estadística. (CA1, CA2) Coeficientes canónicos.

REGIÓN COMPLETA

CA1 CA2 r2 Pr(>r)

HG* 0.985 -0.1723 0.4927 0.002

MO -0.105 -0.9945 0.0863 0.2198

pH 0.9912 0.1326 0.0948 0.2288

Sal 0.9984 0.0572 0.1354 0.2018

HS 0.9972 0.0743 0.2133 0.1219

Temp* -0.8142 0.5806 0.1959 0.034

AR 0.8714 -0.4907 0.01 0.9211

ARC -0.9237 0.3831 0.0269 0.9301

LIM 0.9776 -0.2105 0.0075 0.964

Varianza Explicada

22.84% 16.26%

ITS1

CA1 CA2 r2 Pr(>r)

HG* 0.0532 -0.9986 0.4526 0.001

MO 0.9958 -0.0918 0.0934 0.2138

pH -0.414 -0.9103 0.0633 0.2218

Sal -0.2983 -0.9545 0.0328 0.4655

HS -0.2274 -0.9738 0.1873 0.0869

Temp* -0.4586 0.8886 0.2251 0.002

AR 0.9245 0.3813 0.0021 0.97

ARC -0.2973 0.9548 0.0107 0.964

LIM -0.0354 -0.9994 0.0166 0.8641

Varianza Explicada

22.79 18.85

ITS2

CA1 CA2 r2 Pr(>r)

HG 0.9548 -0.2974 0.1397 0.0659

MO 0.4387 0.8987 0.004 0.8941

pH 0.9174 -0.3979 0.0236 0.5574

Sal -0.4932 0.8699 0.0158 0.7043

HS 0.8055 -0.5926 0.0553 0.3147

Temp* -0.9261 0.3773 0.1629 0.02

AR -0.278 -0.9606 0.0274 0.6084

ARC 0.1976 0.9803 0.0818 0.2847

LIM -0.1179 -0.993 0.0265 0.7652

Varianza Explicada

20.16 16.08

76

Figura 29. Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo (ilustrado por vectores) y sitios de muestreo en el análisis de la Región Completa. (Temp) Temperatura, (HG) Humedad por gravimetría.

77

Figura 30. Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo (ilustrado por vectores) y sitios de muestreo en el análisis de la Región ITS1. (Temp) Temperatura, (HG) Humedad por gravimetría.

78

Figura 31. Diagramas de ordenación de los análisis de correspondencia canónica de las variables de características de suelo (ilustrado por vectores) y sitios de muestreo en el análisis de la Región ITS2. (Temp) Temperatura. Región ITS2.

79

Capítulo 4. Discusión

Se realizó un análisis metagenómico de diversidad fúngica del suelo de VDP,

un ecosistema semi-árido con clima mediterráneo, por medio de la secuenciación

de la región ITS del rADN a través de la plataforma de pirosecuenciación Roche

454. Las muestras incluyeron dos micro-hábitats: uno influenciado por actividad de

roedores (madriguera) y otro sin tal perturbación (superficie) y se analizaron dos

estaciones del año (verano e invierno). Además se determinaron las características

edafológicas de las muestras.

De acuerdo a los resultados obtenidos, la hipótesis 1 la cual plantea

diferencias entre las características físico-químicas de suelo en dos micro-hábitats

(madriguera (M) y superficie (S)), se rechaza, esto debido a que no se encontraron

diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de micro-hábitats (M

y S).

La hipótesis 2 la cual plantea diferencias de las características fisicoquímicas

del suelo en dos estaciones (Verano (V) e invierno (I)), se acepta de forma parcial,

ya que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre muestras

de las dos estaciones, pero si para las variables de Temperatura (Temp) y Humedad

por Gravimetría (HG).

Por su parte, la hipótesis 3 la cual plantea diferencias en la diversidad y

composición de comunidades de hongos entre micro-hábitats (M y S) y la influencia

en estas diferencias de las características físico-químicas de suelo, se acepta ya

que se encontraron diferencias de diversidad y composición entre dos diferentes

micro-hábitats (M y S).

Finalmente, de acuerdo a la hipótesis 4 la cual enuncia diferencias entre la

diversidad y composición de hongos en el suelo en estaciones del año distintas y

las características físico-químicas de cada estación (V e I), se acepta, ya que se

encontraron diferencias de diversidad y composición entre estaciones (V e I).

80

4.1 Características de suelo

En cuanto a las características fisicoquímicas de las muestras, los resultados

indican que no hay diferencias estadísticamente significativas entre muestras de MI

(Madriguera-Invierno) y SI (Superficie-Invierno) y entre MV (Madriguera-Verano) y

SV (Superficie-Verano). Aun así, se encontraron diferencias estadísticamente

significativas (P<0.05) en Temp y HG, a nivel global entre las muestras de verano

en relación a las de invierno en ambos micro-hábitats. Estas variables están

influenciadas por las condiciones ambientales propias de la estacionalidad de un

ecosistema mediterráneo: en verano se registró la temperatura más elevada y la

humedad más baja, mientras que en invierno la temperatura fue menor y la

humedad en el suelo mayor. Estas diferencias en las condiciones ambientales han

sido relacionadas a diferencias de diversidad en otros estudios (e.g. Rajeev et al.,

2013).

A pesar de no haber encontrado diferencias estadísticamente significativas,

puede existir una heterogeneidad de las variables físico-químicas del suelo (i.e.

Figuras 10, 14, 18, 20). Esto está posiblemente influenciado por características

geomorfológicas y edáficas del sitio (Fierer & Jackson, 2006), ya que la presencia

de elevaciones del suelo puede ayudar a escorrentía de componentes del suelo,

siendo estos depositados a las orillas de dicha elevación; las propiedades físico-

químicas del suelo también pueden ser influenciadas por la vegetación (Butterfield

& Briggs, 2009). Esta heterogeneidad espacial en el sitio de estudio puede

influenciar tanto la diversidad como abundancia de los microorganismos en el suelo

(Daniel, 2005). Se ha encontrado que la diversidad de los microorganismos se ve

influenciada por el tipo de vegetación, así como por factores abióticos como la

temperatura (Belnap, 2013; Garcia-Pichel et al, 2013) y la humedad (McGuire et al.,

2012).

81

4.2 Diversidad, abundancia y distribución de hongos en Valle de las Palmas.

La plataforma de pirosecuenciación en nuestro estudio ha dado resultados

de diversidad y abundancia de hongos nunca antes obtenidos por métodos

tradicionales basados en clonación y secuenciación Sanger.

Estudios previos en Valle de las Palmas (VDP) (Romero-Olivares et al.,

2013), utilizando técnicas tradicionales, indicaron una alta diversidad de hongos

pertenecientes al subreino Dikarya, así como un alto número de OTUs (18 OTUs en

VDP, en comparación con los demás sitios que fueron parte del estudio) siendo la

mayoría asignados al filo Ascomicetos de los cuales se definieron 5 clases y 12

órdenes donde los Pleosporales fueron los más abundantes.

En el presente estudio, se obtuvo un número de OTUs dos órdenes de

magnitud mayor de 3,822 a 6,974 OTUs (Tabla 11), agrupando entre 148,488 y

340,593 secuencias con un umbral de similitud de 97% (Anexo 10).

Un número de secuencias cercanas a lo mostrado en el presente estudio se

han reportado para diferentes ecosistemas; por ejemplo, Buee y colaboradores

(2009), analizando sólo la región ITS1, de un total de 166,350 secuencias,

identificaron entre 600 a 1000 OTUs (a un 97% de similitud), esto en muestras de

suelo de bosques templados. En VDP, analizando la región ITS1, se obtuvo un total

de 340,593 secuencias de las cuales se identificaron 2,725 OTUs.

En el presente estudio se evaluó la diversidad fúngica a través del análisis

de la RC, así como las regiones ITS1 e ITS2, con el fin de determinar cuál región

tiene una mayor cobertura de la diversidad en dos tipos de suelo (madriguera y

superficie) en VDP y en dos estaciones del año distintas (verano e invierno).

Los resultados obtenidos de diversidad fúngica sugieren diferencias, tanto

espaciales (i.e., madriguera y superficie) como temporales (i.e., verano e invierno).

Para las muestras de verano, consistentemente las muestras madriguera

presentaron un mayor número de secuencias cuando se analizó la RC, región ITS1

e ITS2 (Figura 23); esto podría resultar en un mayor número de OTUs. Para las

muestras de invierno, de la misma manera, las muestras de madriguera tuvieron un

82

mayor número de secuencias en el análisis de la RC, región ITS1 e ITS2 (Figura

23). El alto número de secuencias dio lugar a que MV tuviera un mayor número de

OTUs, en comparación con las demás muestras (Tabla 10), siendo esto consistente

en los análisis de la RC, región ITS1 e ITS2.

Pese al gran número de secuencias (Figura 23, Anexo 10) y OTUs (Tabla

11), el estimador no paramétrico Chao 1 (Tabla 10), predice más del doble del

número de OTUs para cada muestra, indicando que el esfuerzo de muestreo no fue

suficiente para llegar a un estimado asíntotico de la diversidad total del ecosistema

analizado. Esto se refleja en las curvas de rarefacción obtenidas (Figura 24), en las

que no se alcanzó la asíntota en ninguno de los análisis de las distintas regiones

(RC, ITS1 e ITS2). Esto sugiere que si hay un aumento en el número de muestras,

el número de OTUs incrementará (Mohamed & Martiny, 2011). Este tipo de

resultados concuerdan con otros estudios, donde a pesar de obtener un número

relativamente alto de OTUs, no resultaron suficientes para alcanzar la asíntota en

las curvas de rarefacción, así como también que el índice de Chao 1 fue

consistentemente mayor que el número de OTUs (Buee et al., 2009; Lentendu et

al., 2011; Lim et al., 2010; Mohamed & Martiny, 2011).

Los índices de Simpson y Shannon indican una alta abudancia y una alta

diversidad respectivamente (Tabla 11). En el caso del índice de Simpson, la muestra

con mayor abundancia es MI (Tabla 11), seguido de SI, SV y MV, esto analizando

la región completa y la región ITS1, en cuanto al índice de Shannon en los análisis

de estas dos regiones, no hay diferencias significativas entre muestras. En el caso

de la región ITS2, la muestra con mayor abundancia fue SI (Tabla 11), seguido de

SV, MI y MV, cabe destacar, que según indica el índice de Shannon, la muestra SI

posee la mayor diversidad, seguido de SV, las muestras MV y MI son

estadísticamente iguales en diversidad (Tabla 11). El índice de Shannon en el

presente trabajo es comparable con estudios de diversidad fúngica en suelos de

bosque, donde valores de hasta 4.51 son obtenidos para este índice (Voříšková et

al., 2013).

83

El análisis comparativo de composición indica la dominancia de los filos

Ascomycota y Basidiomycota en todas las muestras (Figura 25), analizando tanto la

RC, como las regiones ITS1 o ITS2. Esto es consistente con otro estudio realizado

por Orgiazzi y colaboradores (2012) en diferentes tipos de suelo de ecosistemas

con clima mediterráneo en donde, analizando las regiones ITS1 e ITS2, obtuvieron

64.5% y 68% del filo Ascomycota, respectivamente, mientras que para

Basidiomycota, obtuvieron un 30.3% en la región ITS1 y un 25.4% en la región ITS2.

La clase Dothideomycetes, en el caso de las muestras MV y SV fue más

abundante que en las muestras MI y SI, sugiriendo que su abundancia tiende a

disminuir durante el invierno (Figura 25-A, B), mientras que para un grupo de hongos

sin identificar se encuentra en menor abundancia durante el verano (MV y SV) y

aumenta durante el invierno (MI y SI). Se considera común encontrar la clase

Dothideomycetes en análisis de diversidad y abundancia de hongos en muestras

ambientales, dado que esta representa la clase más grande y diversa del filo

Ascomycota con más de 1300 géneros y más de 19,000 especies conocidas, dentro

de las cuales se encuentran hongos saprobios, líquenes, así como patógenos de

plantas (Rouxel & De Wit, 2012).

En el análisis comparativo de composición de la región ITS2 (Figura 25-C)

se observan cambios en la abundancia de Dothideomycetes, que tiende a ser menor

en las muestras MV y MI; el cambio más notable en abundancia de la clase

Dothideomycetes es en la muestra S, la cual la abundancia de esta clase es mayor

durante el verano (SV) y menor en el invierno (SI) (Figura 25-C). Por otro lado, la

clase Sordariomycetes se refleja como una de las más abundantes en las muestras,

aumentando su abundancia durante el invierno (muestras MI y SI, Figura 25-C). La

clase Sordariomycetes es otra de las clases más diversas del filo Ascomycota; ésta

incluye poco más de 600 géneros y 3000 especies conocidas, e incluye a la mayoría

de los Ascomycota no liquenizados (Ning & Sung, 2008).

Un gran porcentaje de hongos no están identificados (Figura 25); esto puede

deberse a la falta de anotación taxonómica y errores de asignaciones taxonómicas

84

que se encuentran depositadas en la base de datos, siendo esto la mayor limitación

en el reconocimiento de especies (Buee et al., 2009).

Romero-olivares y colaboradores (2013), en el estudio de diversidad fúngica

de VDP, determinaron la presencia de las clases de hongos Dikarya:

Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Pezizomycetes, Leotiomycetes,

Agaricomycetes (pertenecientes al filo Ascomycota) y Agaricomycetes (filo

Basidiomycota). En el presente estudio, se detectó la presencia de esas mismas

clases, además de las clases Saccharomycetes, Orbiliomycetes, Lecanoromycetes

y Sordariomycetes (filo Ascomycota), Agaricostilbomycetes, Exobasidiomycetes,

Tremellomycetes y Microbotryomycetes (filo Basidiomycota). Lo anterior indica que

el acercamiento metagenómico usando NGS permitió ampliar la información sobre

la diversidad de hongos en VDP.

Los análisis de correspondencia canónica (CCA) (Figura 29, 30, 31), para la

RC, ITS1 e ITS2, mostraron una relación de las muestras (MV, SV, MI, SI) con

Temp, sugiriendo una relación de cambios de la distribución fúngica en con respecto

a los micro-hábitats. La RC y la región ITS1 mostraron además una relación con la

HG, sugiriendo una relación de cambios de la distribución fúngica de las muestras

(MV, SV, MI, SI) con respecto a los micro-hábitats. Estas relaciones están ligadas a

los cambios de abundancia en las clases (Figura 25) y pueden deberse a las

diferencias de disponibilidad hídrica en invierno, así como por cambios de

temperatura entre las estaciones, siendo más extremas en verano que en invierno.

Las muestras SV y SI pueden estar mayormente influenciadas a los cambios

hídricos y menos a los cambios de temperatura, debido a su exposición a la

radiación solar, mientras que las muestras MI y MV, pueden llegar a ser más

sensibles a cambios en la temperatura, esto podría explicar los cambios en la

abundancia específicamente entre un mismo micro-hábitat en diferentes estaciones

(Figura 25).

En los mapas de calor y dendogramas de la RC (Figura 26) e ITS1 (Figura

27) se pueden apreciar agrupaciones en relación al verano e invierno, concordando

con el CCA (Figura 29, 30), y sugiriendo que la abundancia y distribución fúngica se

85

encuentra relacionada a los cambios de temperatura y humedad (cambios

estacionales entre verano e invierno). En relación a la región ITS2 (Figura 28), en

congruencia con el CCA (Figura 31), se encontró un menor agrupamiento de las

muestras. A pesar de que se pueden apreciar diferencias de abundancia entre

estaciones (Figura 25-C), no se aprecian cambios sustanciales en la diversidad en

relación a los micro-hábitats.

La presencia de hongos Ascomycota en este tipo de ecosistemas no es rara

ya que las especies que se encuentran dentro de este filo son muy diversas, desde

algunos líquenes, los cuales podrían indicar la interacción con BSC (Biological Soil

Crust), patógenos de plantas y saprófitos (Schoch et al., 2006). La gran abundancia

de este filo durante el verano puede deberse a la naturaleza saprófita de algunas

de sus especies, las cuales tienen una actividad mayor a partir de la asimilación de

materia orgánica muerta.

La presencia de hongos Lecanoromycetes (filo Ascomycota) no cambia de

acuerdo a las estaciones así como entre las muestras, esta clase de hongos es

también llamada “hongos liquenizados”, ya que incluye en su mayoría a especies

de líquenes (Pöggeler & Wöstemeyer, 2011), su presencia podría indicar

homogeneidad en el sitio de esta clase de hongos.

En el presente trabajo se pudieron observar las diferencias y similitudes en

el análisis de la RC, ITS1 e ITS2. Usualmente, la RC no se emplea para este tipo

de análisis, porque puede haber sesgos al momento de la formación de los OTUs,

ya que al contener de forma parcial la región 18S y de forma completa la región

5.8S, las cuales son conservadas (sin gran variabilidad en su secuencia entre

grupos taxonómicos), podría provocar que se agruparan secuencias pertenecientes

a distintos OTUs, siendo esto causado por a baja resolución de dichas regiones

para discriminar especies cercanas (O’Brien et al., 2005); esto se observó en

nuestros resultados, en los cuales se obtuvo un menor número de OTUs para la RC

en comparación con la región ITS1 e ITS2 (Tabla 9).

Se ha propuesto que los resultados taxonómicos de la región ITS1 e ITS2

son complementarios (Bazzicalupo et al., 2013: Orgiazzi et al., 2012) y que las

86

diferencias entre la taxonomía que proporciona cada región incrementa conforme a

la resolución taxonómica, es decir, hasta nivel de especie (Bazzicalupo et al., 2013).

Bazzicalupo y colaboradores (2013), encontraron que la región ITS2 proporcionó un

mayor número de OTUs que la región ITS1, siendo esto congruente con nuestros

resultados. Además sugirieron que la región ITS2 puede ser más adecuada para

revelar la riqueza taxonómica de las comunidades fúngicas, aunque indican que

ambas regiones pueden ayudar a responder a preguntas sobre factores que

estructuran la comunidad fúngica.

87

Conclusiones

Las características de suelo, en relación a humedad sensor, pH, materia

orgánica y conductividad eléctrica, no fueron estadísticamente diferentes entre

micro-hábitats (madriguera y superficie), así como tampoco entre estaciones

(verano e invierno), mientras que la humedad por gravimetría (HG) y temperatura,

no son estadísticamente diferentes entre micro-hábitats (madriguera y superficie),

pero si fueron estadísticamente diferentes entre estaciones (verano e invierno) y

son estas las características que denotan las diferencias entre la diversidad y

composición fúngica de cada muestra (MV, SV, MI, SI).

Durante el verano, predominó la clase Dothideomycetes (filo Ascomycota) en

muestras de suelo madriguera y superficie, aunque la dominancia de clases de

hongos Ascomycota durante el verano podría deberse a la disminución de hongos

Basidiomycota cuyo desarrollo no es favorable en condiciones de altas

temperaturas y poca humedad, pero durante el invierno, cuando ocurre un aumento

en la humedad y una disminución en la temperatura, su abundancia aumenta hasta

alrededor de un 20%. La abundancia de Basidiomycetes fue mayor en muestras de

superficie que en muestras de madriguera, en las dos estaciones del año, aunque

sus diferencias tan pequeñas entre muestras podrían indicar homogeneidad de este

filo.

Las características estacionales y edafológicas de Valle de las Palmas

podrían favorecer el desarrollo de hongos tanto en abundancia como en diversidad.

Los resultados claramente indicaron diferencias entre muestras, pero estas

diferencias se presentaron de forma estacional (verano e invierno).

El estudio de las diferentes regiones del rADN para la identificación fúngica

en el presente estudio indicaron que la RC y la región ITS1 dieron resultados

parecidos, aunque se requiere de una mejor resolución (a nivel de especie), es

mejor la utilización de la región ITS1 ya que se obtiene mayor variabilidad y existe

mayor información en la base de datos.

88

Referencias bibliográficas

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White, J. R., Maddox, C., White, O., Angiuoli, S. V., & Fricke, W. F. (2013). CloVR-ITS: Automated internal transcribed spacer amplicon sequence analysis pipeline for the characterization of fungal microbiota. Microbiome, 1(1), 1-11.

Whitford, W. G. (1996) The importance of the biodiversity of soil biota in arid ecosystems. Biodiversity & Conservation, 5, 185-195.

Xu, J. (2006). Invited review: microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular Ecology, 15(7), 1713-1731.

Young, I. M. (2008) Microbial ecology and clay minerals. In: Chesworth, W. (ed.), Encyclopedia of Soil Science (pp. 450). Dordrecht, Springer.

100

Anexos

Anexo 1. Revisión de archivo de mapeo

El script utiliza los siguientes archivos:

- Mapping_File.txt

El script se introdujo de la siguiente forma:

check_id_map.py –m Mapping_File.txt –o Analisis/check_id_map_output

-m Archivo de mapeo tipo .txt

-o Dirección del folder en que se situó el archivo de salida, o archivo producto del

script que se utilizó.

Los archivos resultantes de este Script fueron los siguientes:

a) Mapping_File.html y Mapping_File.log. Archivos de informe sobre los cambios

generados en el archivo Mapping File.

b) Mapping_File_c.txt. Archivo corregido, el cual se usará en análisis posteriores.

101

Anexo 2. Revisión de archivo de secuencias.

Este script utiliza los siguientes archivos:

- Vargas_2456F.fna (secuencias completas), ITS1.fna (secuencias de la

región ITS1) o ITS2.fna (secuencias de la región ITS2).

- Vargas_2456.qual

- Mapping_File_c.txt archivo corregido proveniente del script:

check_id_map.py

El script se introdujo de la siguiente manera (ejemplo de archivo con secuencias

completas):

split_libraries.py –m Mapping_File_c.txt –f Vargas_2456F.fna –q

Vargas_2456F.qual –b 8 –H 8 –max-ambig 0 -l 510 –L 550 –o

Analisis/Split_Library_Output/

-m Archivo de mapeo tipo .txt

-f Archivo de secuencias tipo .fasta o .fna

-q Archivo de calidad tipo .qual

-b Especificación del tipo de secuencia de identificación que se está utilizando:

hamming_8, golay_12, variable_length.

-H Especificación de la máxima longitud de homopolímeros en las secuencias.

En este caso, se utilizó 8 (White et al., 2013).

--max-ambig Número de bases ambiguas que se permitieron en las secuencias.

En este caso se utilizó 0 (J. R. White et al., 2013).

-l y -L Mínimo y máximo de longitud de secuencias:

a) Secuencias completas: 510 pb – 550 pb

b) Secuencias ITS1: 160 pb (Orgiazzi et al., 2012) – 250 pb (Buee et al., 2009).

c) Secuencias ITS2: 110 pb (Orgiazzi et al., 2012) – 170 pb (Nilsson et al., 2010).

102

-o Dirección del folder en que se situó el archivo de salida, o archivo producto del

script que se utilizó.

Los archivos resultantes de este script son los siguientes:

a) Folder nombrado Split_Library_Output, el cual contiene los siguientes archivos:

- seqs.fna (secuencias completas), seqs_ITS1.fna (secuencias región

ITS1) o seqs_ITS2.fna (secuencias región ITS2). Estos archivos se

utilizaron para su análisis en siguientes scripts.

- split_library_log.txt. Detalles del análisis realizado a las secuencias.

103

Anexo 3. Agrupamiento de secuencias en OTUs.

Este script utilizó los siguientes archivos de entrada:

- seqs.fna (secuencias completas), seqs_ITS1.fna (secuencias región

ITS1) o seqs_ITS2.fna (secuencias región ITS2) Archivos

resultantes del script split_libraries.py

El comando se introdujo de la siguiente manera:

pick_otus.py –i Analisis/Split_Library_Output/seqs.fna –m uclust –s 0.97 –o

Analisis/uclust_VDP

-i Archivo de secuencias tipo .fasta o .fna (seqs.fna, seqs_ITS1.fna,

seqs_ITS2.fna).

-m método de agrupamiento (uclust)

-s porcentaje de similitud entre las secuencias (0.97 = 97%)

-o indicación de folder donde se situó el archivo de salida.

Los archivos resultantes de este script son:

a) Folder nombrado uclust, el cual contiene los siguientes archivos:

- seqs_otus.txt (secuencias completas), seqs_ITS1_otus.txt (secuencias

región ITS1) o seqs_ITS2_otus.txt (secuencias región ITS2).

104

Anexo 4. Selección de secuencias representativas.


- seqs_otus.txt, seqs_ITS1_otus.txt o seqs_ITS2_otus.txt archivos que

contienen los OTUs provenientes del script pick_otus.py.

- seqs.fna, seqs_ITS1.fna o seqs_ITS2.fna archivos de secuencias

provenientes del script split_libraries.py.

El comando se introduce de la siguiente manera:

pick_rep_set.py –i Analisis/ucust_VDP/seqs_otus.txt –f

Analisis/Split_Library_Output/seqs.fna –m first –o Analisis/rep_set_VDP

-i Archivo de secuencias .txt (seqs_otus.txt, seqs_ITS1_otus.txt o

seqs_ITS2_otus.txt)

-f archivo fasta de las secuencias, este se requiere cuando se realiza un

agrupamiento donde no se usan secuencias de referencia.

-m método de selección de secuencias representativa (first)

-o indicación de folder donde se situará el archivo de salida.


a) rep_set.fna, rep_set_ITS1.fna y rep_set_ITS2.fna. Archivos .fasta que

contienen las secuencias representativas de cada OTU.

105

Anexo 5. Asignación de taxonómica.


- rep_set_VDP.fna, rep_set_ITS1.fna y rep_set_ITS2.fna. Archivos fasta

producto del script pick_rep_set.py.

- Base de referencia UNITE (http://unite.ut.ee/index.php):

Archivo de secuencias representativas: 97_otus.fasta

Archivo de taxonomía: 97_otu_taxonomy.txt


assign_taxonomy.py –i Analisis/rep_set_VDP.fna –r

its_12_11/rep_set/97_otus.fasta –t its_12_11/taxonomy/97_otus_taxonomy.txt –o

Analisis/assign_taxnomy_rdp/ - -rdp_max_memory 8000

-i Archivo de secuencias tipo .fasta o .fna (rep_set_VDP.fna, rep_set_ITS1.fna y

rep_set_ITS2.fna).

-r archivo de secuencias de referencia. Base de datos UNITE.

-t archivo de taxonomía. Base de datos UNITE.

- -rdp_max_memory asignación de memoria en MB.



a) Folder assign_taxonomy_rdp. Contiene el siguiente archivo:

- rep_set_VDP_tax_assignments.txt, rep_set_ITS1_tax_assignments.txt o

rep_set_ITS2_tax_assignments.txt. Archivos que contienen la taxonomía

de las secuencias representativas.

http://unite.ut.ee/index.php

106

Anexo 6. Construcción de tabla de OTUs

Este script utilizó los siguientes archivos:

- seqs_otus.txt. Archivo proveniente del script pick_otus.py

- rep_set_VDP_tax_assignments.txt. Archivo proveniente de script

assign_taxonomy.py


make_otu_table.py –i Analisis/uclust_VDP/seqs_otus.txt –t

Analisis/assign_taxnomy_rdp/rep_set_VDP_tax_assignments.txt. –o

Analisis/otu_table.biom

-i Archivo producto del script split_libraries.py

-t Archivo de asignación de taxonomía producto del script assign_taxonomy.py


Los archivos resultantes del script son:

a) otu_table.biom. Tabla de frecuencias de OTUs por muestra y su respectiva

taxonomía.

Para convertir el archive .biom en un archive .txt (texto) se utiliza el siguiente

comando:

convert_biom.py –i Analisis/otu_table.biom - -biom_to_classic_table --header_key

taxonomy–o Analisis/otu_table.txt

-i Archivo de entrada.

- -biom_to_classic_table indicación de la conversión del formato .biom a formato

.txt


107

El archivo resultante:

a) otu_table.txt. Tabla de frecuencias de OTUs por muestra y su respectiva

taxonomía.

108

Anexo 7. Separación de OTUs por tratamiento (QIIME)

Archivos que se necesitan:

- otu_table.biom. Archivo resultante del script make_otu_table.py.

- Mapping_File.txt


summarize_otu_by_cat.py -c Analisis/otu_table.biom –i Mapping_File_c.txt –

m Treatment –o Analisis/otu_table_by_treatment.biom

-c y –i Archivos de entrada.

-m indicación para la separación de muestras de acuerdo al tratamiento que

pertenecen.


Archivos de salida:

a) otu_table_by_treatment.biom. Tabla de OTUs dividida por tratamiento.

109

Anexo 8. Análisis comparativo de composición

Grupos taxonómicos por muestra (QIIME).

Archivos que se necesitan:

- otu_table_by_treatment.biom. Archivo producto del script

summarize_otu_table_by_cat.py


summarize_taxa.py –i Analisis/otu_table_by_treatment.biom –L 3 –o

Analisis/tax_mapping

-i Archivo de entrada

-L opciones de nivel taxonómico: 2 = Domain 3 = Phylum, 4 = Class, 5 = Order,

6 = Family, and 7 = Genus.


Archivo de salida:

a) otu_table_by_treatment_L3.txt

Gráfica de análisis comparativo de composición (QIIME). Construcción de

gráficas de barra mostrando la abundancia de la taxonomía a diferentes niveles

por tratamiento o muestra.

(Liga: http://qiime.org/scripts/plot_taxa_summary.html).

Archivos necesarios:

- otu_table_by_treatment_L3.txt. Archivo producto del script summarize_taxa.py

El comando se introduce de la siguiente forma:

http://qiime.org/scripts/plot_taxa_summary.html

110

plot_taxa_summary.py –i Analisis/otu_table_by_treatment_L3.txt –x 4 –y 100

–l phylum –o Analysis/charts

-i Archivo de entrada.

-x Ancho del eje X

-y Altura del eje Y

-o Indicación de folder donde se situará el archivo de salida.

Archivos de salida:

a) taxonomy_summary_chart.html. Versión html del gráfico de barras

b) taxonomy_summary_chart.pdf. Versión pdf del gráfico de barras

c) taxonomy_summary_chart.jpg. Versión jpg del gráfico de barras

111

Anexo 9. Análisis de varianza de dos vías aplicado a variables ambientales.

(MV) Madriguera-Verano. (SV) Superficie-Verano. (MI) Madriguera-Invierno.

(SI) Superficie-Invierno.

MV SV MI SI

Humedad sensor

MV 0.977 0.216 0.177

SV 0.977 0.154 0.124

MI 0.216 0.154 0.999

SI 0.177 0.124 0.999

Temperatura

MV 0.125 0.001 0.001

SV 0.125 0.001 0.001

MI 0.001 0.001 0.995

SI 0.001 0.001 0.995

pH

MV 0.96 0.993 0.999

SV 0.96 0.874 0.975

MI 0.993 0.874 0.986

SI 0.999 0.975 0.986

Humedad

MV 0.999 0.001 0.001

SV 0.999 0.001 0.001

MI 0.001 0.001 0.777

SI 0.001 0.001 0.777

Materia orgánica

MV 0.995 0.994 0.09

SV 0.995 0.999 0.145

MI 0.994 0.999 0.149

SI 0.09 0.145 0.149

Conductividad

MV 0.794 0.484 0.804

SV 0.794 0.103 0.28

MI 0.484 0.103 0.949

SI 0.804 0.28 0.949

112

Anexo 10. Número de secuencias por muestras y totales de acuerdo a las

regiones analizadas (Región completa, Región ITS1 y Región ITS2).

Muestra Región

completa Región

ITS1 Región

ITS2 Muestra

Región completa

Región ITS1

Región ITS2

1MV 41757 55573 25875 1MI 3518 4921 2978

2MV 6526 11102 4282 2MI 1864 3766 660

3MV 2761 3506 921 3MI 2544 1159 1516

4MV 7144 9362 3963 4MI 17225 24347 12859

5MV 16978 21796 9085 5MI 2737 4009 1732

6MV 8519 12449 3297 6MI 7470 10997 5803

7MV 3227 7979 1906 7MI 3589 6416 2765

8MV 4898 6951 1549 8MI 4836 5778 3303

9MV 1994 3135 3057 9MI 1614 2248 1330

10MV 2944 3778 84 10MI 5330 8558 3750

1SV 1036 1992 1003 1SI 1951 6509 946

2SV 1053 2990 1288 2SI 9768 7344 2378

3SV 4842 7032 2593 3SI 7326 10009 4784

4SV 3852 4905 1765 4SI 10208 13395 3001

5SV 3151 4317 1718 5SI 3009 5968 3934

6SV 4510 6254 3194 6SI 3443 7195 3433

7SV 3220 4202 2339 7SI 7166 12676 4999

8SV 2590 3503 1704 8SI 2133 3025 1488

9SV 4339 7105 3306 9SI 3090 4076 2093

10SV 2923 5042 2265 10SI 8776 15224 7542

tesis defendida por lluvia beatriz vargas gastélum y

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