tesis de maestría separación y evaluación de la actividad an
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SEPARACIÓN Y EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIINFLAMATORIO
Y ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES DE
Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A:
QFI. SAUDY SARET PABLO PÉREZ
Asesora: Dra. María Estela Meléndez Camargo
México, D.F. diciembre de 2011
A
l presente trabajo se realizó bajo la dirección y asesoría de la Dra. María Estela Meléndez
Camargo, en los laboratorios de Farmacología y Toxicología Renal y Hepática,
Fitoquímica del departamento de Farmacia y en el laboratorio de Embriología del
departamento de Morfología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional, como parte de los siguientes proyectos SIP: “Evaluación farmacológica y
toxicológica de principios activos de origen vegetal o por síntesis de interés farmacéutico III”
y “Estudio fitoquímico, farmacológico y toxicológico de principios activos de origen vegetal o
por síntesis de interés farmacéutico”, con claves 20100495 y 20110339, respectivamente.
Los resultados de este trabajo fueron presentados parcialmente en la modalidad de
póster en la XV Reunión Nacional de Estudiantes de Farmacia y XIX Congreso de Educación
Química Farmacéutica Biológica celebrada en Gómez Palacio, Durango del 21 al 23 de
octubre de 2010, y en el XX Congreso de Educación Química Farmacéutica Biológica y XVI
Reunión Nacional de Estudiantes de Farmacia realizada en el Distrito Federal, México del 7 al
9 de septiembre de 2011. También se presentaron en la modalidad de póster en el XLIV
Congreso Nacional de Ciencias Farmacéuticas celebrado en Ixtapa, Zihuatanejo del 23 al 26
de octubre de 2011.
E
B
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por haberme brindado la
oportunidad de contar con su apoyo en la realización de esta investigación.
Al Dr. Rafael Silva Torres por su confianza, por prestarme su espacio y por reconocer mi
trabajo.
A la M. en C. Hortensia Montellano Rosales por colaborar en la realización de este
trabajo, por abrirme las puertas de su espacio, por su confianza, paciencia y atenciones.
A mis sinodales por sus oportunas sugerencias para enriquecer este trabajo.
C
DEDICATORIAS
Principalmente a Jehová Dios, quien me ha cuidado y mantenido con vida hasta este día.
Hoy, con el logro de este nuevo paso, quiero dedicar este trabajo, que ha significado un
gran esfuerzo y sacrificio no solo de mi parte sino de muchas personas, a todos aquellos que
de alguna u otra forma con su amor, apoyo y comprensión me alentaron a culminar esta
etapa de mi vida, por lo que mantengo la promesa de seguir siempre adelante.
A mi hija Andrea, por robarle mucho tiempo de cuidados y atenciones, por ser la fuente
de mi inspiración y motivación para superarme cada día más a fin de que la vida nos depare
un mejor futuro.
A mi madre por su amor, paciencia, esfuerzo y por su apoyo incondicional en todos los
sentidos.
A mi padre por tenerme en alta estima, por confiar en mí.
A mis hermanas Ingrid y Daniela por aguantar todos mis malos ratos, por apoyarme con
Andrea, sin su ayuda realmente no hubiese podido culminar este eslabón profesional.
A mi asesora la Dra. María Estela Meléndez Camargo, que siempre ha confiado en mis
ideas y trabajo. Pero sobre todo, porque ha puesto en mí la mentalidad de que se puede ser
cada vez mejor.
D
CONTENIDO GENERAL
Página
LISTA DE ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………………….I
GLOSARIO DE TÉRMINOS……………………………………………………………………………………………………….III
RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………………………..V
ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………………………………VI
1. INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................1
2. ANTECEDENTES.........................................................................................................................3
2.1 Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.......................................................................................4
2.1.1 Descripción……………………………………………………………………………………………………………....4
2.1.2 Nombres comunes..........................................................................................................5
2.1.3 Distribución geográfica...................................................................................................5
2.1.4 Usos tradicionales...........................................................................................................6
2.1.5 Composición química......................................................................................................7
2.2 Flavonoides………………………..…………………………………..…………………..…………………………………...8
2.2.1 Distribución.....................................................................................................................8
2.2.2 Estructura química…………………………………………………………………………………………….………8
2.2.3 Clasificación…………………………………………………………………………………………………………….…9
E
2.2.4 Características físicas……………………………………………………………………………………………….10
2.2.5 Efectos farmacológicos…………………………………………………………………………………....……..11
2.2.6 Metabolismo……………………………………………………………………………………………………………11
2.2.7 Toxicidad……………………………………………………………………………………………………….…………12
2.2.8 Separación y aislamiento…………………………………………………………………………………………12
2.3 Cuantificación de compuestos fenólicos totales………………………………………………………………13
2.3.1 Técnica de Folin-Cioalteu……..………………………………………………………………..………………..14
2.4 Cuantificación de flavonoides totales………………………………………………………………………………15
2.4.1 Técnica de quelación con AlCl3…………………………………………………..………………..…….……16
2.5 Métodos para evaluar la actividad antioxidante………………………………..………………………..….17
2.5.1 Clasificación de los ensayos……………………………………………………………………………………..18
2.5.2 Método del DPPH•………………………………………………………………………..…………………….…..21
2.6 Inflamación…………………………………………………………………………………………….………………..…..…23
2.6.1 Signos clínicos locales de la inflamación…………………………….………………………….…........24
2.6.2 Respuestas sistémicas de la inflamación…………..………………………….…………………….……24
2.6.3 Componentes generales de la respuesta inflamatoria…………….……………………………….25
2.6.4 Mecanismos de la inflamación……………………………………………………………..…………………25
2.6.5 Tipos de inflamación de acuerdo con la persistencia del estímulo................................26
F
2.7 Papel de las especies reactivas en la inflamación……………………………………………..…………….…31
2.8 Fármacos antiinflamatorios.....................................................................................................33
2.8.1 Antiinflamatorios no esteroideos………….……………………………………..………………………....33
2.9 Indometacina........................................................................................................................40
2.9.1 Características y mecanismo de acción……………….…………………………..…………………..….40
2.9.2 Farmacocinética y farmacodinamia...............................................................................41
2.9.3 Efectos adversos..........................................................................................................42
2.10 Modelos farmacológicos preclínicos para evaluar la actividad antiinflamatoria…………..…43
3. JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................44
4. HIPÓTESIS...............................................................................................................................45
5. OBJETIVOS..............................................................................................................................45
5.1 Objetivo general....................................................................................................................45
5.2 Objetivos particulares...........................................................................................................45
6. METODOLOGÍA…………………………………………………………........................................................46
6.1 Recolección e identificación de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg..…………………………..46
6.2 Preparación del extracto etanólico………………………………………………...................................46
6.3 Análisis fitoquímico preliminar…..……………………………………………………………….……………….…46
6.4 Aislamiento de la fracción rica en flavonoides...................................................................46
G
6.5 Cuantificación de los fenoles totales…………………………………………….………………………………..48
6.6 Cuantificación de los flavonoides totales………………………………………………………………..………49
6.7 Determinación de la capacidad antioxidante in vitro…………………………………………..…………50
6.8 Evaluación farmacológica de la actividad antiinflamatoria……………………………………………..51
6.9 Evaluación de la actividad ulcerogastroduodenal…………………………………………………..........52
6.10 Análisis estadístico…………..…………………………………………………………...................................52
7. RESULTADOS……………………………………………………………………………………………….……………......53
7.1 Recolección, identificación y obtención del extracto etanólico………………………………….…..53
7.2 Análisis fitoquímico preliminar…..………………………………………………………………………….……….53
7.3 Aislamiento de los flavonoides……………………………………………………………………………………….54
7.4 Cuantificaciones de los extractos..………………………………………………………………………………….55
7.5 Evaluación farmacológica de la actividad antiinflamatoria……………………….…………………….57
7.6 Evaluación de la actividad ulcerogastroduodenal……………..……………………………………………59
7.6.1 Macroscópica……………………………………………………………………………………………………….59
7.6.2 Histológica…………………………….……………………………………………………….……….……………60
8. DISCUSIÓN………………………………………….……………………………………………………….……………..…..64
9. CONCLUSIONES………………………………………………………………………..…………………………………….79
10. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………………………………….80
H
11. REFERENCIAS…………………………..…………………………….………………………………………………………81
12. APÉNDICES…………………………………………………………………………………………………………………….91
APÉNDICE 1 Resultados del análisis fitoquímico preliminar…………..……………………………………..91
APÉNDICE 2 Validación estadística del método de cuantificación de fenoles totales……………95
APÉNDICE 3 Validación estadística del método de cuantificación de flavonoides totales….100
APÉNDICE 4 Validación del método de evaluación del potencial antioxidante in vitro
DPPH•………………………………………………………………………………………………………………………………..103
I
RELACIÓN DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructuras de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg………………………………..………………5
Figura 2. Esqueleto común de los flavonoides (fenilbenzopirano)………………………………………….9
Figura 3. Estructura básica de diversos flavonoides…………………………..…………………………………10
Figura 4. Bandas de absorción de la quercetina…………………………………………………………..……...16
Figura 5. Formación del complejo de coordinación de color amarillo debido a la quelación del
aluminio con el flavonol quercetina……………………………………………………………………………………..17
Figura 6. Estructura del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, DPPH•.………………………………………………..22
Figura 7. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo de los fosfolípidos de la
membrana y de la vía de la LOX del AA; fármacos que inhiben su formación……………..…….….36
Figura 8. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo del AA por la vía de la COX y
fármacos que inhiben su formación …………………………………………………………………………………….37
Figura 9. Mecanismos de daño del tracto gastrointestinal, causados por los AINE……………….39
Figura 10. Estructura de la indometacina…………………………………….……………………………………….40
Figura 11. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia
polystachya (Ort.) Sarg sobre el peso final de los granulomas…………..…………………………………59
Figura 12. Estómago y duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5% (testigo)………………….60
Figura 13. Estómago y duodeno de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.)…….......60
J
Figura 14. Estómago y duodeno de una rata tratada con la fracción rica en flavonoides F3. (11-
15) (25 mg/kg p.c.)………………………………………………………………………………………………………………..60
Figura 15. Estómago y duodeno de una rata tratada con la fracción rica en flavonoides F4. (16-
20) (25 mg/kg p.c.)……………………………………………………………………………………….……………………….60
Figura 16. Región fúndica del estómago de una rata tratada con NaHCO3 al 5%.............……….61
Figura 17. Región inicial de duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5%....…………………….73
Figura 18. Células fúndicas de la mucosa estomacal de una rata tratada con indometacina (5
mg/kg de p.c.)……………………………………………………………………………………………………………………….73
Figura 19. Túnica submucosa del estómago de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de
p.c.)……………………………………………………………………………………………………………………………………….73
Figura 20. Región inicial de duodeno de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg
p.c.)….……………………………………………………………………………………………………………………………………74
Figura 21. Mucosa duodenal de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg
p.c.)..............................................................................................................................................74
Figura 22. Región fúndica de estómago rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg de p.c.)…......74
Figura 23. Mucosa duodenal de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg de p.c.)…..................74
Figura 24. Estómago de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg de p.c.)…...............................74
Figura 25. Región inicial de duodeno de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg de p.c.)……...74
K
RELACIÓN DE TABLAS
Página
Tabla 1. Mediadores químicos implicados en la inflamación aguda y sus principales acciones…..28
Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibración de los fenoles totales…………………………49
Tabla 3. Diluciones para prepara la curva de calibración de los flavonoides totales……………………50
Tabla 4. Rendimientos de la separación de los metabolitos del extracto etanólico por DCC..…....55
Tabla 5. Contenido de los fenoles totales, los flavonoides totales y capacidad antirradical contra
el DPPH• de los extractos de E. polystachya……………………………………………………………….……….56
Tabla 6. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia
polystachya (Ort.) Sarg. sobre la inflamación crónica inducida mediante el modelo del granuloma
en la rata……………………………………………………………………………………………………….…………………………..58
LISTA DE ABREVIATURAS
I
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Ácido araquidónico
ABTS 6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina
ANOVA Análisis de varianza unifactorial
AINE Antiinflamatorios no esteroideos
CAT Catalasa
COX Enzima ciclooxigenasa
DCC Siglas en inglés de cromatografía en columna seca
DPPH• 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
FC Folin-Ciocalteu
GC Siglas en inglés de cromatografía de gases
GI Gastrointestinal
GSH Glutatión reducido
GSHPx Glutatión peroxidasa
H1 Protón
H-E Hematoxilina-eosina
HPLC Siglas en inglés de cromatografía de líquidos de alta resolución
iNOS Sintasa inducible del óxido nítrico
I.C. 95%, a Intervalo de confianza del 95% para la ordenada al origen
I.C. 95%,b Intervalo de confianza del 95% para la pendiente
L.C. Límite de cuantificación
L.d . Límite de decisión
L.D. Límite de detección
LOX Enzima lipooxigenasa
N Número de parejas de datos en una regresión lineal
NADPH Fosfato de nicotinamida adenina dinucléotido, forma reducida
nm Nanómetros
NO Óxido nítrico
LISTA DE ABREVIATURAS
II
PMN Polimorfonucleares
r Coeficiente de correlación
r2 Coeficiente de determinación
RMN Resonancia magnética nuclear
ROS Siglas en inglés de especies reactivas de oxígeno
RNS Siglas en inglés de especies reactivas de nitrógeno
S Sensibilidad del método, pendiente de una regresión lineal
Sa Error estándar de la ordenada al origen
Sb Error estándar de la pendiente
Sy/x Desviación estándar de la regresión
Syc* Límite superior de la curva de calibración en términos de absorbencia
SOD Superóxido dismutasa
TE Transferencia de electrones
TAH Transferencia de átomos de hidrógeno
TLC Siglas en inglés de cromatografía en capa fina
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa
TX Tromboxano
UV/Vis Ultravioleta/Visible
YB Cero estadístico, ordenada al origen de una regresión lineal
GLOSARIO DE TÉRMINOS
III
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Efecto hipercrómico: incremento en la intensidad de la absorción, es decir, un aumento
en la magnitud del coeficiente de absortividad molar para una longitud de onda dada, por
efecto del disolvente o de los sustituyentes.
Efecto o desplazamiento batocrómico: cuando la longitud de onda de la absorción de
una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda más grandes o de menor energía por
efecto del disolvente o por sustituyentes; también se conoce como corrimiento hacia el rojo.
Error de tipo I: error que se comete cuando se acepta la hipótesis nula cuando en
realidad es falsa.
Erro de tipo II: error que se comete cuando se rechaza la hipótesis nula cuando en
realidad es verdadera.
Isocrática: cuando en una separación cromatográfica se utiliza un solo disolvente o
mezcla de éstos como fase móvil.
Límite de cuantificación: señal en la cual hay un 95% de confianza de que no se está
cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 10 desviaciones estándar de la
regresión.
En términos de cantidad, es aquella concentración más baja del compuesto que puede
cuantificarse en un determinado método analítico.
Límite de decisión: señal en la cual hay un 95% de confianza de que no se está
cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 6 desviaciones estándar de la
regresión.
Límite de detección: señal en la cual hay un 95% de confianza de que no se está
cometiendo un error de tipo I o de tipo II; empleando 3 desviaciones estándar de la
GLOSARIO DE TÉRMINOS
IV
regresión.
En términos de cantidad, es aquella concentración mínima de sustancia que puede ser
detectada con fiabilidad por un método analítico determinado, aún cuando no se pueda
cuantificar.
RESUMEN
V
RESUMEN
os flavonoides exhiben una fuerte actividad antioxidante y entre otras propiedades son capaces de inhibir el proceso antiinflamatorio por diversos mecanismos de acción, in vitro
e in vivo. Investigaciones recientes, en nuestro laboratorio, demostraron la presencia de flavonoides en Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. (palo dulce), árbol ampliamente distribuido en México, así como la actividad antiinflamatoria de sus hojas y corteza después de la administración de la infusión y decocción a la dosis de 200 mg/kg de peso corporal (p.c.) y del extracto etanólico a las dosis de 50 y 100 mg/kg de p.c. en un modelo murino de inflamación crónica granulomatosa.
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue separar la fracción rica en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. y evaluar su efecto antiinflamatorio, así como su efecto antioxidante.
La especie vegetal se recolectó, se identificó, se secó y se molió la corteza. Se preparó un
extracto etanólico, a partir del cual se realizó una separación cromatográfica en columna seca. A la infusión y decocción de hojas y corteza, al extracto etanólico así como a las fracciones resultantes de la separación, se les realizó un estudio fitoquímico preliminar y se les cuantificaron los fenoles totales (método de FC), los flavonoides totales (método de quelación con AlCl3) y se les determinó su actividad antioxidante in vitro, al reducir al radical DPPH•. Para evaluar la actividad antiinflamatoria de las fracciones, se utilizaron ratas Wistar hembras adultas de 200 ± 20 g de p.c., a las cuales se les indujo la inflamación utilizando el modelo del granuloma. Se formaron cuatro grupos, el testigo (vehículo, solución de NaHCO3 al 5%, 1 µL/kg de p.c.), el testigo positivo tratado con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y los tratados con las fracciones F3. (16-20) y F4. (21-26) a la dosis de 25 mg/kg de p.c. Asimismo, se realizó la disección del estómago y duodeno de las ratas, con la finalidad de observar algún tipo de alteración presente en dichos órganos, posteriormente se les realizó un estudio histopatológico mediante la técnica de H-E.
En todos los extractos se detectaron alcaloides, azúcares reductores, cumarinas,
glucósidos cardiacos, quinonas, saponinas, taninos y flavonoides (flavonas y flavonoles), pero en el extracto etanólico, la proporción de metabolitos detectados fue mayor con respecto al resto de los extractos. Los pesos secos y finales de los granulomas obtenidos de las ratas tratadas con las fracciones ricas en flavonoides e indometacina disminuyeron con respecto al grupo testigo. Las fracciones no produjeron erosiones, úlceras ni alguna otra alteración en el estómago y el duodeno, en comparación con la que provoca la indometacina. La cantidad de fenoles totales y flavonoides no tuvieron una relación directa con la capacidad antirradical de los extractos, lo cual no quiere decir, que no sean potentes antioxidantes por otros mecanismos o en otros modelos in vitro.
Los resultados obtenidos de esta investigación, demuestran que las fracciones ricas en flavonoides inducen un efecto antiinflamatorio probablemente provocado por la inhibición selectiva de la COX-2.
L
ABSTRACT
VI
ABSTRACT
lavonoids exhibited strong antioxidant activity and other properties that are capable of inhibiting the inflammatory process by different mechanisms of action in vitro and in vivo.
Recent research in our laboratory demonstrated the presence of flavonoids in Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. (sweet wood) a tree widely distributed in Mexico, as well as anti-inflammatory activity of leaves and bark after the administration of infusion and decoction at a dose of 200 mg/kg (bw) and ethanol extract at doses of 50 and 100 mg/kg (bw) in a murine model of chronic granulomatous inflammation.
Therefore, the aim of this study was to separate the flavonoid-rich fraction of Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. and evaluate its anti-inflammatory and antioxidant effects.
The specie was collected, identified, dried and ground bark. Ethanolic extract was
prepared, from which there was a dry column chromatographic separation. The infusion and decoction of leaves and bark, the ethanol extract and the fractions resulting from the separation, were performed a preliminary phytochemical study and were quantified total phenols (FC method), total flavonoids (method of chelation with AlCl3) and their antioxidant activity were determined in vitro by reducing the radical DPPH•. To evaluate the anti-inflammatory activity of the fractions, adult female Wistar rats of 200 ± 20 g (bw) were used, in which inflammation was induced using the model of granuloma. Four groups were formed, the control (vehicle solution NaHCO3 5%, 1 mL/kg, bw), the positive control treated with indomethacin (5 mg/kg, bw) and those treated with fractions F3. (16-20) and F4. (21-26) at a dose of 25 mg/kg, bw. Furthermore, the dissection of the stomach and duodenum of rats was performed, in order to observe any alteration present in these organs, then underwent a histopathological study using the technique of H-E.
In all extracts were detected alkaloids, reducing sugars, coumarins, cardiac glycosides,
quinones, saponins, tannins and flavonoids (flavones and flavonols), but in the ethanol extract the ratio of metabolites detected was higher compared to the rest of the extracts. Final and dry weights of the granulomas obtained from rats treated with fractions rich in flavonoids and indomethacin significantly decreased as compared to the control group. Fractions did not produce erosions, ulcers or some other alterations in the stomach and duodenum compared with indomethacin. The amount of total phenols and flavonoids were not directly related to the antiradical capacity of extracts, this does not mean, it has not antioxidant activity produced by other mechanisms or detected by other in vitro models.
The results of this research show that the fractions rich in flavonoids induce an anti-
inflammatory effect in chronic inflammation, probably produced by its selective inhibition of COX-2
F
INTRODUCCIÓN
- 1 -
1. INTRODUCCIÓN
a naturaleza ha sido una fuente de agentes medicinales por miles de años y hasta hace
poco menos de un siglo, las plantas medicinales constituyeron el principal recurso
terapéutico. En la búsqueda de la salud, el hombre ha profundizado en el conocimiento de las
especies vegetales que poseen propiedades medicinales y ha ampliado su experiencia en el
empleo de los productos que de ellas se extraen. De hecho, una gran cantidad de los
fármacos actuales se han aislado de fuentes naturales.
Las especies vegetales constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países
en desarrollo, y aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global
de las plantas medicinales, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que cerca
del 65-80% de la población mundial de los países en desarrollo dependen de las plantas para su
atención primaria de la salud. Asimismo, se estima que la población mundial será de 7 500
millones de personas para el año 2020, de las cuales el 75% vivirá en los países en desarrollo y
consumirá sólo el 15% de los medicamentos totales del mercado. Debido a lo anterior, es
posible predecir que la mayoría de la población en un futuro dependerá aun más de las plantas
medicinales para aliviar sus males (Gilani y Atta-ur-Rahman, 2005; Calixto, 2005).
Actualmente, ya han sido identificadas un gran número de especies con actividad
terapéutica, y en México como en otros países, forman parte integral de la rica tradición de la
cultura popular.
Cabe destacar, que México por su localización geográfica, posee una gran biodiversidad
que no ha utilizado en beneficio de su propio desarrollo, a pesar de que hasta el año 2005,
era el segundo país en Latinoamérica con mayor número de publicaciones anuales en los
últimos 25 años sobre plantas farmacológicamente activas (Calixto, 2005).
Sin embargo, en México, muchas de las plantas medicinales a pesar de ser muy utilizadas
todavía no cuentan con el respaldo científico que avalen su uso desde una perspectiva
biomédica, careciendo en este sentido de información sobre su efectividad, toxicidad y
L
INTRODUCCIÓN
- 2 -
caracterización de metabolitos, entre otros (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos
Mexicanos, Anexo 2, 2001) y por lo tanto, no cumplen con las características necesarias para ser
consideradas como medicamentos y no obstante son comercializadas constituyendo riesgos a la
salud por sus posibles efectos adversos (Enríquez y col., 2005).
Son varias las especies que han mostrado científicamente actividad antiinflamatoria que se
ha atribuido a la presencia de flavonoides, utilizado varios modelos de la inducción de la
inflamación aguda o crónica in vivo. Al utilizar modelos in vitro, también se ha llegado a la
conclusión de que algunas especies poseen actividad antiinflamatoria y hasta se ha dilucidado
su mecanismo de acción, por ejemplo, Wang y col., (2008) demostraron la actividad
antiinflamatoria de los flavonoides aislados de Pogonatherum crinitum mediante el modelo de
macrófagos murinos activados con lipopolisacárido.
Park y col., (2007) reportaron la actividad antiinflamatoria y el mecanismo molecular de
tres isoflavonas y sus metabolitos transformados por la microflora intestinal humana, en células
microgliales estimuladas por lipopolisacárido.
ANTECEDENTES
- 3 -
2. ANTECEDENTES
os flavonoides constituyen una de las subfamilias de polifenoles naturales a las que la
comunidad científica ha dedicado más atención en los últimos años. Sus múltiples
propiedades biológicas observadas experimentalmente y su abundancia en la dieta, junto
con su presencia en numerosos remedios de la medicina tradicional, los convierten en
posibles candidatos para explicar la asociación encontrada entre el consumo de
determinados productos de origen vegetal y la disminución del riesgo de presentar
determinadas enfermedades crónicas (Álvarez y Orallo, 2003a).
Desde hace algunos años, tanto países altamente desarrollados como aquellos con escasos
recursos, han retomado y desarrollado el uso de las plantas medicinales con fines terapéuticos,
ya que disminuyen o eliminan síntomas de manera similar a cuando se utilizan medicamentos
alopáticos (García y col., 2002).
En la actualidad, en México, la medicina tradicional sigue satisfaciendo las necesidades de
alivio y curación que la población rural requiere, ya sea debido a la tradición o a la falta de
recursos económicos para tratarse con alopatía.
Se ha observado que compuestos químicamente relacionados, como los polifenoles,
pueden ofrecer mecanismos marcadamente diferentes y propiedades fisiológicas de distintos
grados. Por ende, es muy importante determinar la clase de metabolitos que son
responsables del efecto farmacológico de aquellas especies vegetales que ya son utilizadas
de forma tradicional para aliviar ciertos padecimientos, requiriendo para ello su
separación, aislamiento de la matriz, caracterización y su posterior evaluación biológica; tal
es el caso de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.
L
ANTECEDENTES
- 4 -
2.1 Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.
2.1.1 Descripción
Es un árbol peculiar pequeño de 2 hasta 8 m de altura que
posee ramas jóvenes que se recubren con pelos finos. Pertenece a
una de las tres especies de Eysenhardtia encontradas en
Norteamérica.
Es de la familia Fabaceae (antes Leguminosae).
Tiene hojas alternas, compuestas, pinnadas, de 3 a 5 cm de largo, folíolos de 10 a 15 pares
por hoja, elípticos, de 7 a 13 mm de largo por 3 a 5 mm de ancho, con glándulas resinosas
aromáticas presentes.
Sus tallos son ramificados de color café oscuro. La corteza externa es amarilla, de textura
ligeramente rugosa, escamosa, cuando se seca se desprende en placas irregulares de color
oscuro de 1 mm de grosor; la corteza interna es pardo rojiza. La madera puesta en el agua
desprende una sustancia que tiñe de color amarillo azuloso.
Posee inflorescencias blancas, olorosas, dispuestas en racimos apretados, espigados
terminales o subterminales, de 5 a 7 cm de largo; cáliz campanulado, de 2.5 a 3 mm de largo, 5-
lobulados; corola blanca, formada por 5 pétalos libres, de 5 mm de largo por 1.3 a 2 mm de
ancho, oblongos.
Los frutos son unas vainas ligeramente curvadas, atenuadas en el ápice, pubescentes o
subglabras de 7 a 9.5 mm de largo, con el estilo persistente, frágil e indehiscente, provistas con
glándulas; cada vaina contiene una semilla. La testa de las semillas es delgada y permeable al
agua (Argueta y col., 1994).
Este árbol florece de mayo a octubre y fructifica de noviembre a diciembre (Sargent, 1892).
ANTECEDENTES
- 5 -
Corteza
Hojas
Inflorescencias
Frutos
Figura 1. Estructuras de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.
2.1.2 Nombres comunes
Sus nombres varían de acuerdo a su localización geográfica, por ejemplo se le conoce
como cuate (Jal.); coatillo (Pue.); coatí (l. náhuatl); cohuatli, cuatle (Oax.); lanaé (l. chontalpa,
Oax.); palo cuate, rosilla (Sin.); palo dulce (Sin., Mex., Hgo., Pue., Mich.); taray (N.L., Dgo.);
tlapahuaxpatli; ursa (l. otomí, Hgo.); vara dulce, varaduz (Dgo.) (Sargent, 1892).
2.1.3 Distribución geográfica
Estos árboles, están ampliamente distribuidos en ambas vertientes y en la parte central
del país, en altitudes de entre 150 a 3 000 m. Su presencia es común en todo el país, tanto
ANTECEDENTES
- 6 -
en el bosque templado frío, mezclado con coníferas y encinares, como en el trópico seco y en
regiones semidesérticas; principalmente, en los estados de Colima, Chiapas, Chihuahua,
Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, México, Michoacán,
Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas
(Sargent, 1892).
2.1.4 Usos tradicionales
Debido a las características energéticas de la madera, se le utiliza como combustible
(leña); las hojas, vástagos, frutos y semillas se usan como forraje para el ganado bovino y
caprino. En las actividades artesanales se le utiliza para elaborar copas y vasijas (Sargent,
1892).
Los usos medicinales (fruto, semilla, hoja y corteza) que se le han atribuido desde el siglo
XVI son diversos, por ejemplo, con la madera se prepara una infusión a la que se le atribuyen
propiedades contra las enfermedades renales y de la vesícula, también se utiliza como
anticonceptivo. Las hojas y tallos en cocimiento se emplean para aliviar las molestias debidas a
los cálculos renales y contra el aborto, la flor se usa para la diarrea en niños. En el siglo XX, se
refiere su uso como planta antiespasmódica, antipirética, cicatricial regenerativa y para las
enfermedades de los ojos, entre otras (Argueta y col., 1994; Alvarez y col., 1998).
Sin embargo, cabe destacar que las únicas actividades terapéuticas que han sido evaluadas
científicamente son la antiinflamatoria inducida por el uso de los extractos acuosos (infusión y
decocción a la dosis de 200 mg/kg de p.c.) y etanólico (50 y 100 mg/kg de p.c.) de la corteza,
tronco y hojas de palo dulce (Pablo, 2009), en este mismo estudio se observó que el uso de
estos extractos para disminuir el proceso inflamatorio, no provoca alteraciones
gastroduodenales en contraste con la indometacina; la diurética demostrada por Salazar (2007);
y contra la urolitiasis, demostrando que las isoflavonas aisladas de la corteza actúan como
inhibidores en la formación y crecimiento de los cristales de oxalato y fosfato de calcio,
reduciendo el grado de agregación y el tamaño de la partícula precipitada (Pérez y col., 2002);
ANTECEDENTES
- 7 -
también, se han identificado isoflavanos de la corteza de palo dulce que en experimentos
demostraron tener actividad citotóxica y antimicrobiana (Alvarez y col., 1998).
2.1.5 Composición química
Eysenhardtia polystachya ha sido objeto de numerosos estudios fitoquímicos, lo cual se
debe en parte a que esta especie es ampliamente usada en la medicina tradicional.
Beltrami y col., (1982), reportaron el aislamiento de las dos primeras muestras de la
existencia natural de C-glucosil-α-hidroxidihidrochalconas y de los flavonoides coatlina A y B
de la madera del tronco. Burns y col., (1984) aislaron del duramen, la 7-hidroxi-2´,4´,5´-
trimetoxiisoflavona (1), que es el principal constituyente fenólico fluorescente de E. polystachya,
el cual tiene un interés histórico por ser el indicador ácido-base usado por Robert Boyle en
el siglo XVII; además, de la corteza aislaron el 9-metoxi-2,3-metilenedioxicoumestan. En el
tallo, se han detectado los flavonoides 3,4-dimetoxi-8,9-metilendioxipterocarpano (2) y
dihidrorotenona, el esterol β-sitosterol y un componente de estructura no determinada, el
agustlegorretoside. En la corteza del tallo, se han detectado los mismos componentes
además del triterpeno β-amirina y en la madera del tronco, la cumarina flemichaparina C
(Argueta y col., 1994). En 1998, Alvarez y col., aislaron de la corteza de los troncos, dos
isoflavanos citotóxicos, (3S)-7-hidroxi-2’,3’,4’,5’,8-pentametoxiisoflavano y (3S)-3’,7-
dihidroxi-2’,4’,5’,8-tetrametoxiisoflavano, junto con los conocidos constituyentes
estigmasterol, isoduartina, cuneatina, 1 y 2. Álvarez y Delgado, (1999) aislaron algunos
isoflavonoides de la corteza y reportaron la estructura de cuatro α-hidroxidihidrochalconas. En
2002, Pérez y col., aislaron de la corteza, la 7-hidroxi-4’-etoxiisoflavona y 1.
Recientemente, Salazar (2007) y Pablo (2009) detectaron la presencia de flavonoides,
alcaloides, azúcares reductores, quinonas, saponinas y taninos tanto en la infusión, la
decocción y el extracto etanólico de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg recolectada en el
municipio de Zempoala, Hidalgo.
ANTECEDENTES
- 8 -
2.2 Flavonoides
Los flavonoides fueron descubiertos por Albert Szent-György -ganador del premio Nobel
de Fisiología y Medicina en 1937- quien en 1930 aisló de la cáscara del limón a la citrina (una
mezcla de eriodictiol y hesperidina), capaz de regular la permeabilidad de los capilares. Los
flavonoides se denominaron en un principio vitamina P (por permeabilidad) y también
vitamina C2 (porque se comprobó que algunos flavonoides tenían propiedades similares a la
vitamina C). Sin embargo, el hecho de que los flavonoides fueran vitaminas no pudo ser
confirmado y ambas denominaciones se abandonaron alrededor de 1950 (Middleton y
Kandaswami, 1994; Martínez-Flores y col., 2002).
2.2.1 Distribución
Los flavonoides son metabolitos secundarios exclusivamente de origen vegetal, su
presencia en el reino animal se debe a la ingestión de las plantas. Están distribuidos
ubicuamente entre los vegetales superiores vasculares, siendo las rutáceas, poligonáceas,
compuestas y umbelíferas las principales familias que los contienen. Abundan, sobre todo, en las
partes aéreas jóvenes y más expuestas al sol, como las hojas, los frutos y las flores, ya que la luz
solar favorece su síntesis.
Se pueden encontrar como agliconas y/o en mayor proporción en forma de O-heterósidos o
C-heterósidos, unidos generalmente a la glucosa, aunque también pueden estar unidos a la
ramnosa y a veces a la galactosa. La mayor parte de los flavonoides son O-heterósidos (Gimeno,
2004; López, 2002; Pietta, 1999).
2.2.2 Estructura química
Todos los flavonoides se originan por una ruta biosintética mixta a través de la vía del
ácido shikímico y la de los policétidos. Se sintetizan a partir de flavononas derivadas a su vez de
chalconas provenientes de la vía fenilpropanoide. Su formación tiene lugar a partir de los
aminoácidos aromáticos fenilalanina y tirosina y también de unidades de acetato (Drago, 2007;
López, 2002; Paredes y Clemente, 2005; Seigler, 1998).
ANTECEDENTES
- 9 -
Químicamente, son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto
común de difenilpiranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilo (Ay B) ligados a
través de un anillo C de pirano (heterocíclico). Los átomos de carbono en los anillos C y A se
enumeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2' al 6' (Figura 2) (Martínez-Flores y col., 2002).
Se considera que su estructura deriva de la γ-cromona (o benzo-γ-pirona) con un fenilo en
posición 2. Así pues, son 2-fenil-γ-cromonas. De los tres anillos, el A se biosintetiza a través
de la ruta de los policétidos y el B y la unidad C, proceden de la ruta del ácido shikímico
(López, 2002; Paredes y Clemente, 2005).
Figura 2. Esqueleto común de los flavonoides (fenilbenzopirano)
2.2.3 Clasificación
Los flavonoides se clasifican a partir de sus variaciones estructurales. Al modificar el
esqueleto común de los flavonoides por glicosilación, oxidación, reducción o alquilación, el
núcleo fenilpropanoide genera un escaso número de estructuras básicas de las cuales se deriva la
amplia gama de flavonoides entre los que se incluyen: flavanonas, flavonoles, flavonas,
flavanoles, antocianinas, flavanonoles, isoflavonas, chalconas y neoflavonas (Geissman y Crout,
1969; Seigler, 1998; Brielmann y col., 2006) (Figura 3). Las diferentes clases de flavonoides
difieren en el nivel de oxidación y la sustitución de grupos en el anillo C, mientras los
componentes individuales dentro de una clase difieren en la sustitución en los anillos A y B
(Pietta, 1999; Seyoum y col., 2006).
O
A C
B8
7
6
5 4
6'
3'
4'
5'2
3
2'
ANTECEDENTES
- 10 -
Figura 3. Estructura básica de diversos flavonoides (Domínguez, 1979; Drago, 2002; López, 2002;
Martínez-Flores y col., 2002; Paredes y Clemente, 2005).
2.2.4 Características físicas
Los flavonoides son sustancias sólidas cristalizadas de color blanco o amarillento. Sus
heterósidos son solubles en agua caliente, alcohol y disolventes orgánicos polares, siendo
insolubles en los apolares. Sin embargo, cuando están en estado libre, son poco solubles en
agua, pero son solubles en disolventes orgánicos más o menos oxigenados, dependiendo de
su polaridad. Además, son sustancias que se oxidan más rápidamente que otro tipo de
sustancias, motivo por el cual se consideran como antioxidantes (López, 2002).
O
OH
Flavanol
O
OH
Antocianidina
O
O
Flavona
O
OH
O
Flavonol
O
OH
O
Flavanonol
O
OH O
Flavanona
O
O
Isof lavona
OH
O
Chalcona
O O
HO
Neoflavona
ANTECEDENTES
- 11 -
2.2.5 Efectos farmacológicos
Los flavonoides constituyen una de las familias de compuestos naturales más
interesantes, su amplia bioactividad y su elevada presencia en la dieta humana los hacen
merecedores de atención en la investigación farmacológica. Los efectos curativos de muchos
remedios de la medicina natural tradicional pueden ser atribuidos a la presencia de estas
moléculas y a partir de esto, los flavonoides han ido ganando interés como agentes
terapéuticos potenciales frente a una amplia variedad de enfermedades.
Desde su descubrimiento, los flavonoides se han descrito con propiedades pleiotrópicas,
tales como antioxidantes, antiinflamatorias, antiagregantes, antiateroescleróticas,
antihemorrágicas, vasodilatadoras, antineoplásicas, antivirales, antibacterianas, antialérgicas,
hepatoprotectoras, diuréticas, antihipertensivas, antiespasmódicas y antiulcerosas gástricas,
ejercidas por diversos mecanismos de acción (Middleton y Kandaswami, 1994). En
fitoterapia, los flavonoides se emplean principalmente en los casos de fragilidad capilar como
venotónicos, también se utilizan en proctología, metrorragias y retinopatías (Álvarez y Orallo,
2003a, b).
Actualmente, los campos en los que más estudios se realizan con los flavonoides son las
enfermedades cardiovasculares y el cáncer, dos de los principales problemas sanitarios del
mundo occidental. Los mecanismos de acción y las posibles moléculas diana de éstos
compuestos continúan siendo objeto de la investigación biomédica (Álvarez y Orallo, 2003a;
López, 2002).
Cabe destacar que el flavopiridol que inhibe ciclinas dependientes de cinasas, induce
apoptosis, suprime la inflamación y modula respuestas inmunológicas, es el primer flavonoide
con actividad biológica que ha entrado a la clínica como fármaco anticancerígeno (Rao y col.,
2005).
2.2.6 Metabolismo
El metabolismo de los flavonoides es intenso y una parte importante se excreta por la
ANTECEDENTES
- 12 -
orina. Su biotransformación tienen lugar en dos localizaciones: en el hígado, por medio de
reacciones de biotransformación de fase I en las que se introducen o exponen grupos
polares, en segundo lugar en el colon, mediante reacciones de biotransformación de fase II, en
las que los microorganismos degradan a los flavonoides no absorbidos produciendo
ácidos fenólicos que pueden ser reabsorbidos. Estos compuestos y sus metabolitos
procedentes del colon, se conjugan con el ácido glucurónico, los sulfatos, o la glicina. Los
conjugados, solubles en agua, se excretan por la orina (Pietta, 1999; Martínez-Flores y col.,
2002; Possemiers y col., 2011).
2.2.7 Toxicidad
Los científicos han calculado la ingesta promedio de los flavonoides en diversos países
del mundo y se ha encontrado que de acuerdo a las costumbres alimenticias, ésta varía
considerablemente. Asimismo, se han encontrado variaciones entre géneros (Manach y col.,
2004).
En general, a dosis normales que oscilan entre 25 mg a 1 g por día, los flavonoides son
seguros y sin efectos adversos, pero pueden ser tóxicos si su ingestión está entre el 1 y el 5%
del total de la dieta. Debido a su capacidad de eliminar radicales libres, existe la posibilidad
de que presenten propiedades prooxidantes y mutagénicas, determinadas por su
estabilidad/labilidad redox del compuesto radical formado a partir del flavonoide original, es
decir, el radical aroxilo puede autooxidarse o bien formar compuestos cuaternarios entre el
ADN o el cobre (Martínez-Flores y col., 2002; Gimeno, 2004).
2.2.8 Separación y aislamiento
En la actualidad existen diversas formas de separar y aislar a los flavonoides presentes en
las plantas (Markham, 1975; Pablo, 2009; Ajila y col., 2011).
ANTECEDENTES
- 13 -
2.3 Cuantificación de compuestos fenólicos totales
La cuantificación e identificación de los componentes fenólicos en la dieta ha despertado
un gran interés por su importancia nutricional, lo que ha hecho que cada día sean más los
datos que se pueden encontrar en la bibliografía científica sobre el perfil fenólico de los
alimentos y los remedios herbolarios. Además, la gran diversidad de los compuestos
fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así como sus diferentes estructuras químicas,
han traído consigo la necesidad de desarrollar un gran número de técnicas analíticas para su
identificación y cuantificación (Martínez y col., 2000).
Dentro de las técnicas analíticas para la cuantificación y/o identificación de estos
compuestos se encuentran las técnicas cromatográficas como son la TLC, la GC y HPLC
(Escarpa y Gonzalez, 2001), así como espectrofotométricas (Martínez y col., 2000).
a) Técnicas cromatográficas. Las técnicas cromatográficas han permitido la separación,
aislamiento, purificación e identificación de los compuestos fenólicos, así como el estudio de
su interacción con otros componentes de los alimentos. Hoy en día, las técnicas de HPLC son
las más empleadas para su separación y cuantificación.
Existen distintos soportes y fases móviles que permiten el análisis de un gran número de
polifenoles de interés nutricional, como los fenoles simples, ácidos fenólicos y sus derivados,
y los distintos flavonoides. Sin embargo, la principal desventaja de esta técnica, es que
requiere la utilización de métodos de extracción adecuados a cada uno de los compuestos a
analizar, lo que conduce a un tratamiento muy elaborado de las muestras (Martínez y col.,
2000).
b) Técnicas espectrofotométricas. Los métodos espectrofotométricos no son nuevos en
el campo de la química analítica y hasta hoy en día son usados frecuentemente para la
determinación de polifenoles (Escarpa y Gonzalez, 2001). Se han realizado numerosos
estudios para desarrollar técnicas rápidas de cuantificación de compuestos fenólicos
ANTECEDENTES
- 14 -
mediante ensayos ultravioletas. Cada grupo de compuestos fenólicos se caracteriza por tener
una o varias λ máximas a distintas longitudes de onda dentro del espectro ultravioleta. Así,
los fenoles simples tienen una λ máxima entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos
fenólicos relacionados presentan una amplia variación en la longitud de onda a la cual
presentan una absorbencia máxima. Una de las técnicas más empleadas dentro de este
grupo es la determinación del ácido clorogénico, el cual se cuantifica después de su
extracción con etanol y se lee su λ máxima a una longitud de onda de 325-328 nm (Martínez
y col., 2000).
Entre este tipo de técnicas, los métodos usados comúnmente para determinar
polifenoles en especies vegetales destacan el ensayo de la vainillina para la determinación de
compuestos flavan-3-ol, dihidrochalconas y proantocianidinas que tienen una unión simple
en la posición 2,3 y poseen grupos hidroxilos en la posición meta del anillo B (Martínez y col.,
2000) y el ensayo de Folin-Ciocalteu (FC) para la cuantificación de polifenoles totales; esta
técnica llegó a ser la más utilizada para determinar de manera cuantitativa a los polifenoles y
es la más reportada actualmente (Faria y col., 2005).
A continuación se analiza el fundamento del método utilizado en el presente trabajo
para la determinación de compuestos fenólicos.
2.3.1 Técnica de Folin-Ciocalteu
El ensayo de FC cuantifica los fenoles totales de una muestra a través de su capacidad
reductora, aunque no está directamente relacionada con la medición de actividad
antioxidante, puede ser útil para tales estudios, en especial si se combina con otros métodos
que evalúen dicha capacidad (Heimler y col., 2010).
Es uno de los métodos más antiguos para determinar el contenido de fenoles totales.
Originalmente, el reactivo para determinar fenoles fue propuesto por Folin y Denis (1912),
quienes descubrieron que una mezcla de ácidos fosfotúngstico y fosfomolíbdico
ANTECEDENTES
- 15 -
reaccionaban con derivados fenólicos y al agregar un álcali, la reacción daba un color azul.
Aunque éste fue considerado un método oficial para detectar fenoles totales, la mezcla de
reacción producía ocasionalmente un precipitado blanco, que interfería con el método
colorimétrico. En 1927, Folin y Ciocalteu mejoraron el método al incrementar la proporción
de molibdato y prevenir la precipitación al agregar sulfato de litio al reactivo original, lo cual
brindó una mayor sensibilidad y reproducibilidad al método. Posteriormente, Singleton y
Rossi (1965), analizaron el método y reportaron que los sulfitos, los azúcares y las aminas
aromáticas interfieren con el método. Actualmente, considerando la heterogeneidad de los
fenoles naturales y la posibilidad de interferencias de otras sustancias fácilmente oxidables,
existen otros métodos que compiten con el de FC, por ejemplo la titulación con
permanganato, colorimetría con sales de hierro y absorbencia con luz UV, sin embargo
ninguno es perfecto (Singleton y col., 1999).
La técnica de FC, consiste en mezclar el reactivo comercial de FC en un medio altamente
básico (Na2CO3 al 5-10%, acuoso). Los polifenoles son fácilmente oxidables en medio básico
por el reactivo de FC, los fenoles en su pK (usualmente cerca de pH 10) se convierten en
iones fenolatos quienes al perder un electrón producen un radical libre semiquinona, si se
remueve otro electrón da una quinona o bien se produce la polimerización. La molécula que
acepta ese electrón se reduce, así pues, lo que cuantifica la reacción es la reducción del
fosfomolibdato de MoO4+ a MoO3+ que produce un color azul, este compuesto puede ser
identificado y cuantificado por espectroscopía de UV/Vis debido a que absorbe a una
longitud de 760 nm. El contenido de fenoles totales generalmente, se expresa en
equivalentes de ácido gálico (Singleton y col., 1999). Esta técnica, sólo se puede emplear en
muestras hidrofílicas, dado que el ensayo se lleva a cabo en una fase acuosa (Huang y col.,
2005).
2.4 Cuantificación de flavonoides totales
La espectroscopia UV ha llegado a ser la mejor técnica para el análisis estructural de los
flavonoides por dos principales razones: 1) requiere sólo una pequeña cantidad de sustancia
ANTECEDENTES
- 16 -
pura y 2) la información estructural obtenida de un espectro UV se incrementa por el uso de
reactivos específicos que reaccionan con uno o más grupos funcionales del núcleo de los
flavonoides. La adición de cada uno de esos reactivos por separado a una solución alcohólica
de los flavonoides induce cambios estructuralmente significativos en el espectro UV. Los
cambios de este tipo son comúnmente inducidos por la adición de metóxido de sodio
(NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), acetato de sodio/ácido bórico (NaOAc/H3BO3), cloruro
de aluminio (AlCl3) y cloruro de aluminio/ácido clorhídrico (AlCl3/HCl) (Markham y Mabry,
1975). Estudios más recientes emplean cloruro de aluminio/acetato de potasio (AlCl3/KOAc)
(Salamanca y col., 2007).
El espectro UV de muchos flavonoides consiste en dos máximos de absorción, uno de los
cuales ocurre en el intervalo de 240-285 nm (banda II) y la otra entre los 300-400 nm (banda
I). En términos generales, la banda de absorción II se considera que se origina del sistema
benzoilo del anillo A y la banda I del sistema cinamoilo del anillo B (Figura 4) (Markham y
Mabry, 1975).
Figura 4. Bandas de absorción de la quercetina (modificado de Markham y Mabry, 1975)
2.4.1 Técnica de quelación con AlCl3
Se basa en la formación de un complejo resultante de la quelación con Al de los grupos
5-hidroxi-4-ceto, 3-hidroxi-4-ceto y O-dihidroxi (Figura 5), que puede ser evidenciado y
cuantificado por desplazamientos batocrómicos de una o ambas bandas características de
los flavonoides en el espectro.
La estabilidad relativa de los complejos ocurre en el siguiente orden: 3-hidroxi (flavonol)
ANTECEDENTES
- 17 -
> 5-hidroxi (flavona) > 5-hidroxi (flavanona) > grupos O-dihidroxil > 3-hidroxil
(dihidroflavonol) (Markham y Mabry, 1975).
Figura 5. Formación del complejo de coordinación de color amarillo debido a la quelación del
aluminio con el flavonol quercetina (modificado de Markham y Mabry, 1975)
2.5 Métodos para evaluar la actividad antioxidante
En la actualidad, hay un interés creciente en los antioxidantes, particularmente en
aquellos que previenen los supuestos efectos deletéreos de los radicales libres en el ser
humano, el deterioro de las grasas y otros componentes de los alimentos. En ambos casos,
hay una preferencia por los antioxidantes de fuentes naturales sobre los de tipo sintético.
Asimismo, hay un incremento paralelo en el uso de métodos para estimar la eficiencia de
estas sustancias como antioxidantes (Molyneux, 2004).
La actividad antioxidante de un compuesto puede evaluarse in vitro por medio de
experimentos sencillos que examinan directamente dicha habilidad y que a la vez evalúan el
posible efecto prooxidante sobre diferentes moléculas. Cabe destacar que estos
experimentos miden la capacidad de captación de un radical (oxidante) y no la capacidad
antioxidante preventiva de una muestra (Huang y col., 2005). Estos métodos se enfocan en
diferentes mecanismos del sistema de defensa antioxidante, tales como la captación de
oxígeno y radicales hidroxilo, la reducción del radicales peroxilo lipídicos y la inhibición de la
peroxidación lipídica o quelación de iones metálicos (Faria y col., 2005).
O8
6
2
2'
6'3
A C
B
O
OH
OH
OH
OH
OH
5'
AlCl3
O8
6
2
2'
6'3
A C
B
O
OH
OH
O
O
O
5'
Al2+
Al1+
ANTECEDENTES
- 18 -
Estos métodos deben ser rápidos, reproducibles y requerir cantidades pequeñas de los
compuestos químicos por analizar, además de no estar influenciados por las propiedades
físicas de dichos compuestos (Marco, 1968).
Los resultados de los ensayos in vitro pueden usarse como un indicador directo de la
actividad antioxidante in vivo; un compuesto que es poco efectivo in vitro, no será mejor in
vivo (Aruoma y col., 1997). Estos ensayos también pueden alertar sobre posibles efectos
dañinos de los compuestos químicos. Algunos de los métodos para determinar la actividad
antioxidante consisten en acelerar la oxidación en un sistema lipídico, usualmente por
calentamiento, y monitoreando a continuación el consumo de oxígeno, la degradación de un
sustrato o bien la formación de un producto (hidroperóxidos) (Brand-Williams y col., 1995).
Debido a que muchos factores pueden afectar la oxidación, incluyendo la temperatura, la
presión de oxígeno y los catalizadores metálicos, los resultados pueden variar dependiendo
de las condiciones de oxidación empleadas. Incluso el riesgo de degradación de los
antioxidantes en estas condiciones es muy alto (Bondet y col., 1997). Los ensayos que miden
los sustratos o los productos, también pueden dar resultados variables, dependiendo de su
especificidad (Fukumoto y Mazza, 2000).
2.5.1 Clasificación de los ensayos
Dependiendo del tipo de reacción involucrada, los ensayos se pueden clasificar en dos
tipos: ensayos basados en reacciones en donde hay transferencia de átomos de hidrógeno
(TAH) y los basados en la transferencia de electrones (TE). También hay ensayos que miden la
captación de radicales libres del oxígeno y del nitrógeno en modelos in vitro (Huang y col.,
2005).
a) Ensayos basados en la TAH. Están generalmente contienen un generador sintético de
radicales libres, un componente molecular oxidable y un antioxidante. La mayoría de estos
ensayos tienen un esquema de reacción competitiva, en el cual el antioxidante y el sustrato
compiten para generar térmicamente radicales peroxilo a través de la descomposición de los
ANTECEDENTES
- 19 -
compuestos azo. Actualmente el generador sintético de radicales libres más empleado es el
2,2’-azobis (2-metilpropranimidamida) diclorohidrato (AAPH) (Huang y col., 2005).
Los siguientes son modelos in vitro más frecuentemente usados para la evaluación de la
actividad antioxidante basados en este mecanismo.
1) Método de IOU (inhibited oxygen uptake). No ha tenido un amplio uso debido a las
condiciones irreales de altas presiones de oxígenos empleadas (Hung y col., 2005).
2) Método de la inhibición de la oxidación de LDL. Este método induce artificialmente la
autoxidación del ácido linoleico o LDL por el Cu (II) o un iniciador azo y permite evaluar la
protección de un sustrato por un antioxidante en un modelo de membrana biológica o una
lipoproteína (Faria y col., 2005).
3) Método ORAC (oxygen radical absorbance capacity) (Cao y col., 1997). Es
ampliamente usado en investigación y en la industria de los alimentos. Se usa en muestras
hidrofílicas y lipofílicas.
4) Ensayo del blanqueamiento de crocina. Su aplicación industrial es limitada debido a su
gran variabilidad ante diferentes antioxidantes (Huang y col., 2005).
5) Método del TRAP (total radical trapping antioxidant parameter). El progreso de la
reacción se monitorea fluorométricamente (Huang y col., 2005).
6) Método del N, N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD•+). Es un método rápido, barato
que asegura sensibilidad y reproducibilidad en la medición de la actividad antioxidante de
compuestos hidrofílicos. Se reporta como TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity).
Tiene la ventaja sobre el método del ABTS•- de que el punto final de la reducción se detecta
por una aparición gradual de color y no por una decoloración (Fogliano y col., 1999).
ANTECEDENTES
- 20 -
b) Ensayos basados en la TE. Las reacciones basadas en este mecanismo miden la
capacidad antioxidante a través de la reducción de un antioxidante, que cambia de color
cuando se reduce. El grado de cambio de color se correlaciona con las concentraciones
antioxidantes de las muestras.
Los siguientes son los modelos in vitro más frecuentemente usados para la evaluación de
la actividad antioxidante basados en la TE.
1) Ensayo de fenoles totales por el reactivo de Folin-Ciocalteu (ver apartado 2.3.1)
2) Ensayo TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity). Este método fue reportado por
primera vez en 1993 y después se modificó y actualmente se conoce como el método del 6-
sulfonato-3-etilbenzotiazolina (ABTS•-). Cuando este anión radical se reduce hay una
decoloración, la concentración de antioxidantes da el mismo porcentaje de cambio de
absorbencia del ABTS•- que el trolox 1 mM y esto se conoce como TEAC. Es útil para
muestras hidrofílicas y lipofílicas (Re y col., 1999; Tsai y col., 2011). Otra modificación del
método se conoce como VCEAC (vitamin C equivalent antioxidant capacity) (Kim y col., 2003).
3) Ensayo FRAP (ferric ion reducing antioxidant parameter). El reactivo de FRAP contiene
al oxidante que es una sal férrica (TPTZ, 2, 4, 6-tripiridil-s-triazina) mezclada con FeCl3 en
medio ácido. Debido al Fe (III) libre del reactivo, pueden existir interferencias en las
determinaciones, ya si las muestran poseen componentes que actúan como queladores de
metales se pueden unir al Fe (III) y formar complejos capaces de reaccionar con los
antioxidantes (Benzie y Strain, 1996; Faria y col., 2005); Huang y col., 2005; Xu y col., 2010;
Tsai y col., 2011).
4) Capacidad de reducción de cobre (II). Se basa en la reducción del Cu (II) a Cu (I) por los
antioxidantes. Hay poca información publicada sobre este ensayo (Huang y col., 2005).
ANTECEDENTES
- 21 -
5) Método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) (ver apartado 2.5.1).
c) Ensayos que miden la capacidad de captación de ROS y NOS. Debido a que las
evidencias experimentales han sugerido directa o indirectamente que hay seis principales
especies reactivas que causan daño oxidativo en humanos, a saber, aniones superóxido
(O2•-) (Kim y col., 2003), peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales hidroxilo (HO•), singletes de
oxígeno (1O2) y peroxinitritos (ONOO-), se han desarrollado ensayos que miden la capacidad
de captación de estos radicales por los fitoquímicos. Sin embargo, no existe un ensayo que
mida la capacidad antioxidante de los radicales peroxilo (ROO•) (Huang y col., 2005).
d) Otros ensayos. Debido al equipo que requiere la realización de estas pruebas, son
poco comunes. Se han reportado, los ensayos de TOSC (total oxidant scavenging capacity), la
de la inhibición de la reacción de oscilación de Briggs-Rauscher, el de quimioluminiscencia y
el de electroquimioluminiscencia (Huang y col., 2005; Roginsky y Lissi, 2005; Erdemoglu y
col., 2009).
En homogeneizados de tejidos, se aplican técnicas basadas en la medición de los
productos secundarios de la lipoperoxidación, como el método del tiocianato, la
determinación de TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) (Fogliano y col., 1999).
También se cuantifica la actividad de diversas enzimas que pertenecen al sistema
antioxidante endógeno, tales como, la CAT, la SOD y la GSHPx (Narváez-Mastache y col.,
2007).
A continuación se describe el método utilizado en el presente trabajo:
2.5.2 Método del DPPH•
El 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH•) es un radical libre estable en virtud de su
deslocalización electrónica sobre toda la molécula (Figura 6). Esta resonancia, le provee un
profundo color violeta, además de que impide su dimerización (Molyneux, 2004).
ANTECEDENTES
- 22 -
Figura 6. Estructura del 2,2-difenil-1-picrilhidracilo, DPPH•
Brand-Williams y col., (1995) reportaron por primera vez el método, con el que
evaluaron la actividad antioxidante de diversos compuestos y extractos usando el DPPH• en
una solución metanólica.
En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm y cuando se reduce por acción
de un antioxidante (AH) o de un radical (R•), la absorción desaparece.
DPPH• + AH → DPPH-H + A•
DPPH• + R• → DPPH-R
En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la
capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la
actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuación:
DPPH• + AH → DPPH-H + A•
A• + A• → A-A
Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de
hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares estables que
detendrán la reacción en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A•)
NO2N
NO2
NO2
N
ANTECEDENTES
- 23 -
puede interactuar con otro radical para formar moléculas estables (DPPH-A, A-A) (Molyneux,
2004).
En este método, la eficiencia antioxidante se mide a temperatura ambiente, lo cual
elimina el riesgo de la degradación térmica de las moléculas que se analizan. El mecanismo
de reacción entre el DPPH• y un compuesto antioxidante depende de la conformación
estructural del mismo, algunos compuestos reaccionan muy rápidamente con el DPPH•
reduciendo un número de moléculas de DPPH• igual al número de grupos hidroxilo
disponibles, pero para la mayoría de los compuestos analizados, las reacciones son más
lentas y el mecanismo parece ser más complejo, por lo que las comparaciones cuantitativas
no son siempre apropiadas. Para algunos antioxidantes ya existen estudios sobre su
comportamiento cinético en la reacción con el DPPH• (Bondet y col., 1997), asimismo, se ha
determinado la relación estructura-actividad de captación de radicales libres de diversos
flavonoides. La reacción se lleva a cabo generalmente en medio metanólico, para muestras
insolubles se puede emplear el DMSO (Seyoum y col., 2006).
2.6 Inflamación
La inflamación es una reacción fisiopatológica del huésped a un estímulo nocivo, cuyo
objetivo es eliminarlo, por lo que la capacidad de desencadenar una reacción inflamatoria
resulta esencial para la supervivencia. Cualquier factor que induce daño tisular puede ser
descrito como la patogenia de la inflamación. Los estímulos nocivos que desencadenan los
procesos inflamatorios pueden ser de diversa índole, tales como las lesiones causadas por los
agentes químicos (ácidos, álcalis, alergenos, aceite mineral, etc.), los físicos (hematomas,
quemaduras, congelación, radiaciones, etc.), los bioquímicos (microorganismos, parásitos,
endotoxinas, toxinas de animales, etc.). Cada estímulo desencadena un tipo de respuesta
característica, que determina la magnitud e intensidad del proceso inflamatorio (Rang y col.,
2004; Hu y col., 2005; Burke y col., 2007).
La intensidad de la respuesta inflamatoria es crucial: si ésta es insuficiente puede conducir a
ANTECEDENTES
- 24 -
la inmunodeficiencia, lo que da lugar a las infecciones y cáncer. Por otro lado, un exceso de
respuesta causa morbilidad y mortalidad que acompañan a las enfermedades con un
importante componente inflamatorio, como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la
isquemia cerebral y del corazón, las enfermedades de Crohn y Alzheimer. En algunos casos, la
respuesta inflamatoria alcanza la circulación sistémica, como en la sepsis, meningitis y
muchos otros traumas (Lansky y col., 2007). En estos casos, la inflamación puede ser mucho
más dañina para el organismo que el estímulo original.
2.6.1 Signos clínicos locales de la inflamación
A nivel macroscópico, la inflamación generalmente se caracteriza por la presencia de calor,
dolor, rubor, tumefacción (hinchazón) y alteración o pérdida de la función en el área
afectada. Estos signos de la respuesta inflamatoria son inducidos por 1) cambios del flujo y
calibre vascular (denominados también cambios hemodinámicos), 2) cambios en la
permeabilidad vascular y 3) fenómenos celulares que corresponden a la exudación y emigración
leucocitaria desde la microcirculación hasta el foco inflamatorio.
A nivel local de los tejidos, los cambios pueden dividirse en fenómenos celulares y
vasculares. Los mediadores se generan a partir del plasma y las células, que a su vez, modifican y
regulan las reacciones vasculares y celulares (Crotan y col., 1990).
La respuestas inflamatorias surgen en tres fases cronológicas precisas, dependiendo de la
patogenicidad y persistencia del estímulo, cada fase parece ser mediada por mecanismos
diferentes: 1) una fase aguda que se caracteriza por vasodilatación local transitoria y mayor
permeabilidad capilar, 2) una fase subaguda tardía caracterizada por la infiltración de
leucocitos y las células fagocíticas, y 3) una fase proliferativa crónica en que hay degeneración y
fibrosis hísticas (Burke y col., 2007).
2.6.2 Respuestas sistémicas de la inflamación
Además de los cambios locales en la zona inflamada, con frecuencia surgen varias
respuestas generales, como signos extrafocales (como linfadenopatía dolorosa, fiebre y
ANTECEDENTES
- 25 -
astenia) y datos hematológicos (como leucocitosis, neutroflia, trombocitosis e incremento en
la velocidad de sedimentación globular) (Leyva y Quezada, 2008). Existe también un
incremento de determinadas proteínas plasmáticas denominadas “proteínas de fase aguda”.
Entre ellas figura la proteína C reactiva, la α2-macroglobulina, el fibrinógeno, la α1-
antitripsina y algunos componentes del complemento. La proteína C reactiva se une a
determinados microorganismos y los complejos resultantes activan al complemento (Rang y
col, 2004).
También, puede haber una pérdida de peso debido a un aumento en el gasto energético
así como astenia para reducir la demanda de energía. La mayoría de las manifestaciones
sistémicas de la inflamación son consecuencia de la acción de citocinas proinflamatoria,
como las interleucinas 1 y 6 (IL-1, 6) y el TNF-α (Leyva y Quezada, 2008).
2.6.3 Componentes generales de la respuesta inflamatoria
El terreno de la respuesta inflamatoria es el tejido conjuntivo vascularizado, incluyendo el
plasma, las células circulantes, los vasos sanguíneos y los componentes celulares y extracelulares
del tejido conjuntivo.
Las células circulantes que tienen importancia en la inflamación son los neutrófilos, los
monocitos, los eosinófilos, los linfocitos, los basófilos y las plaquetas. Las células del tejido
conjuntivo son las células cebadas que están en íntima relación con los vasos sanguíneos, los
fibroblastos y en ocasiones los linfocitos y los macrófagos del mismo. Los componentes
extracelulares de mismo, son la membrana basal y los distintos tipos de colágeno, elastina y
proteoglicanos (sulfato heparán, sulfato de condroitin y ácido hialurónico) (Crotan y col., 1990).
2.6.4 Mecanismos de la inflamación
Innumerables mecanismos participan en el desencadenamiento y la resolución del proceso
inflamatorio, éstos son muy complejos, varían de un tejido a otro y dependen del agente
etiológico. Los mecanismos comunes incluyen la liberación de diversos mediadores, los
estímulos quimiotácticos, la fagocitosis y la liberación de enzimas lisosomales, así como la
ANTECEDENTES
- 26 -
activación de las vías de la coagulación, la fibrinolítica, de las cininas y del complemento.
Estudios anteriores, destacaron la promoción de la migración de células fuera de los vasos
muy finos, pero investigaciones recientes se han orientado hacia interacciones adhesivas que
incluyen las selectinas E, P y L, la molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1), la molécula de
adherencia de células vasculares 1 (vascular cell adhesión molecule-1, VCAM-1) y las integrinas
leucocitarias, en la adherencia de leucocitos y plaquetas al endotelio en los sitios de inflamación.
Las células endoteliales activadas intervienen decisivamente en la biodestinación de células
circulantes hacia los sitios de inflamación, así como en la producción de selectinas, integrinas y
en la superfamilia de inmunoglobulinas. La expresión de las moléculas de adherencia varía
según los tipos celulares que intervienen en la reacción inflamatoria.
Además de las moléculas de adherencia celular, el reclutamiento de las células de
inflamación hacia los sitios de la lesión incluye las interacciones concertadas de varios tipos de
mediadores solubles; entre ellos figuran el factor C5a del complemento, el factor activador
plaquetario y el leucotrieno B4 (LTB4). Todos ellos actúan como agonistas quimiotácticos.
Algunas citocinas también desempeñan funciones esenciales para concertar el proceso
inflamatorio, en particular la IL-1 y el TNF que son secretados por monocitos, macrófagos,
adipositos y otras células. Otras citocinas y factores del crecimiento (como son IL-2, IL-6, IL-8 y el
factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (granulocyte-macrophage colony
stimulating factor, GM-CSF) contribuyen a las manifestaciones de la reacción inflamatoria
(Burke y col., 2007).
2.6.5 Tipos de inflamación de acuerdo con la persistencia del estímulo
2.6.5.1 Inflamación aguda y subaguda tardía
Tienen una duración relativamente corta, desde unos minutos a varias horas o uno o dos
días, y sus principales características son la vasodilatación local transitoria, la mayor
permeabilidad capilar, la exudación de líquido y proteínas plasmáticas (edemas) y la emigración
leucocitaria, predominantemente de neutrófilos. Independientemente de la naturaleza del
ANTECEDENTES
- 27 -
agente lesivo, estos tipos de inflamación son bastante estereotipados.
La respuesta inflamatoria se produce en el tejido conjuntivo, hacia el cual filtran el plasma y
los elementos formes de la sangre desde los vasos sanguíneos lesionados por la agresión o
desde los vasos que se hacen más permeables en respuesta a la lesión.
Se produce así, el enrojecimiento (eritema) por la dilatación de los vasos, el hinchamiento
(edema) por el escape de líquido a los tejidos blandos y el endurecimiento por la
acumulación de los líquidos y las células. Estos fenómenos desembocan en la pérdida de la
capacidad normal de los vasos sanguíneos para retener en su interior las células y los líquidos;
pero estos cambios no significan obligatoriamente una alteración estructural del vaso.
Los neutrófilos son los componentes más numerosos en este tipo de inflamación y se
encargan de la fagocitosis de las bacterias y de otros microorganismos extraños, además de la
fagocitosis pasiva de las células del tipo conjuntivo, de los eritrocitos dañados y de la fibrina.
Los monocitos también penetran al tejido conjuntivo durante la inflamación y se
transforman en macrófagos que fagocitan las células y los restos titulares, la fibrina, las
bacterias remanentes e incluso los neutrófilos utilizados.
Los linfocitos, los eosinófilos y los basófilos se relacionan con los aspectos
inmunológicos del proceso inflamatorio.
Los mediadores químicos de la respuesta inflamatoria aguda pueden originarse en el
plasma, en las células y probablemente, en los tejidos lesionados. Estos pueden dividirse en los
siguientes grupos:
Aminas vasoactivas: histamina y serotonina
Proteasas plasmáticas:
1) el sistema de cininas (bradicinina y calicreína)
2) el sistema del complemento (C3a, C5a, C5b-C9)
ANTECEDENTES
- 28 -
3) el sistema fibrinolítico de la coagulación (fibrinopéptidos, productos de la
degradación de la fibrina)
Los metabolitos del ácido araquidónico (AA):
1) vía COX (endoperóxidos, prostaglandinas, TX)
2) vía LOX (leucotrienos; HPETE, HETE)
Constituyentes lisosómicos (proteasas)
Radicales libres derivados del oxígeno
Factores activadores de plaquetas, FAP
Citocinas
Factores de crecimiento
Las principales acciones que ejercen estos mediadores en la respuesta inflamatoria aguda y
subaguda tardía pueden resumirse en la Tabla 1.
Tabla 1. Mediadores químicos implicados en la inflamación aguda y sus principales acciones
Característica de la respuesta inflamatoria
Mediadores
Vasodilatación Prostaglandinas (PGI2, PGE1, PGE2, PGD2)
Vasoconstricción TXA2, HPETE, endoperóxidos, leucotrienos C4, D4, E4
Incremento de la permeabilidad vascular
Aminas vasoactivas, C3a y C5a (a través de la liberación de aminas), bradicinina, leucotrienos C4, D4, E4, FAP
Quimiotaxis C5a, leucotrieno B4, HHT, HPETE, HETE, D4, E4, otros lípidos qumiotácticos, productos bacterianos
Fiebre IL-1, TNF, prostaglandinas
Dolor Prostaglandinas, bradicinina
Lesión tisular Enzimas lisosómicas de los neutrófilos y macrófagos, metabolitos del oxígeno
(modificado de Crotan y col., 1990)
La evolución del foco inflamatorio puede seguir diferentes rutas. La ideal es la
resolución, que consiste en el restablecimiento de la normalidad tisular y funcional, por lo
ANTECEDENTES
- 29 -
que se requiere una organización y restablecimiento de la permeabilidad vascular, el cese de
la migración leucocitaria, la apoptosis de los leucocitos PMN extravasados y la eliminación
de los mediadores químicos; entonces el restablecimiento se logra por la acción del drenaje
linfático y la digestión macrofágica que conducen a la eliminación del edema, las células
inflamatorias y los restos necróticos.
Cuando la destrucción del tejido es amplia o las células no tienen la capacidad de
regeneración, la secuela será la cicatrización, que consiste en la curación mediante la
sustitución del tejido original por el tejido conjuntivo, conocido como fibrosis. Por último, si
el agente patógeno persiste, la respuesta inflamatoria aguda podría convertirse en una
respuesta inflamatoria crónica (Leyva y Quezada, 2008).
2.6.5.2 Inflamación crónica
Es una reacción lenta y latente que continua durante meses e incluso años y supone la
destrucción tisular, así como la proliferación local de las células y del tejido conjuntivo.
Puede desarrollarse por diferentes causas, como a) la progresión de una inflamación aguda,
b) episodios recurrentes de inflamación aguda y c) la inflamación crónica in novo. Se caracteriza
por la presencia constante de linfocitos, monocitos y células plasmáticas, debido a que el
estímulo nocivo ha sido persistente. La presencia de estas células inflamatorias puede dar lugar a
alteraciones funcionales del tejido, ya sea por la acción directa de los mediadores producidos
por las células linfoides o bien por el depósito continuo de colágeno por los fibroblastos debida
a la cicatrización.
Los principales tipos celulares que se encuentran en las zonas de inflamación crónica son las
células mononucleares y las células anormales derivadas de los macrófagos. En las zonas de la
cicatrización y la inflamación crónica están activos diversos factores de crecimiento; existe
angiogenia y también una mayor actividad de los fibroblastos, que se encuentran por debajo del
tejido fibroso.
ANTECEDENTES
- 30 -
Los mediadores más importantes en la cicatrización, en los procesos de reparación y las
reacciones inflamatorias crónicas son, entre otros, el factor de crecimiento derivado de las
plaquetas (PDGF), el de crecimiento del endotelio vascular, el de crecimiento transformador, el
de crecimiento tumoral-beta (TGF-β) y varios factores de crecimiento de fibroblastos (FGF).
2.6.5.3 Inflamación crónica granulomatosa
Es un tipo específico de reacción inflamatoria crónica, que se caracteriza por la
acumulación de macrófagos modificados que se denominan células epitelioides y que se
inicia por diversos agentes infecciosos y no infecciosos. Para la formación de granulomas es
necesaria la presencia de productos irritantes poco digeribles, de una reacción inmunitaria
mediada por células T (con producción de interferón-γ) frente al agente irritante, o de
ambos.
El monocito evoluciona a macrófago, que es más activo y tiene gránulos más potentes,
un citoplasma más amplio y con mayor capacidad de división. El macrófago se activa por la
respuesta a un estímulo y se convierte en una célula más grande, con un citoplasma más
amplio, más retículo endoplásmico rugoso, más mitocondrias y un núcleo alargado (célula
epitelioide). El macrófago es sensible a agentes inflamatorios que son irritantes y difíciles de
degradar, pero que son inertes.
Se llama granuloma a la zona local de la inflamación granulomatosa, que consiste en la
acumulación microscópica de macrófagos transformados en células epitelioides (0,5 a 2 mm),
rodeados de un collar de leucocitos mononucleares, principalmente linfocitos y en ocasiones
células plasmáticas. Los granulomas más evolucionados aparecen rodeados de fibroblastos.
Con frecuencia, las células epitelioides se fusionan y forman células gigantes en la periferia
de los granulomas. Están constituidas por una masa de citoplasma que contiene veinte o más
núcleos dispersos por el mismo (células gigantes de tipo cuerpo extraño), si se disponen en la
periferia se denominan células gigantes tipo Langhans y si son centrales, con citoplasma
vacuolado, se denominan células gigantes de tipo Touton. Estas células pueden tener
ANTECEDENTES
- 31 -
inclusiones citoplasmáticas denominadas cuerpos conchoides o de Schaumann (Crotan y col.,
1990).
2.7 Papel de las especies reactivas en la inflamación
Durante la inflamación existe una generación excesiva de radicales libres, provenientes
de diferentes fuentes, las cuales a su vez participan activamente en la evolución del proceso
inflamatorio y sus consecuencias. Los metabolitos reactivos del oxígeno elaborados en los
neutrófilos y macrófagos pueden ser liberados tras la exposición a los agentes
quimiotácticos, inmunocomplejos o ante la fagocitosis (Crotan y col., 1990). Por ejemplo,
cuando la NADPH oxidasa que reside en las células mono y PMN se activa, genera especies
reactivas del oxígeno (ROS). Además del rol defensivo de las ROS como microbicidas, éstas
son el estímulo más potente que incrementa la permeabilidad vascular, la producción de
citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-8, IL-1β) que a su vez estimulan más producción de
ROS, de factores quimiotácticos (LB4), activan las moléculas de adhesión leucocitaria
endotelial, inactivan antiproteasas como la α-1-antitripsina lo cual incrementa la
destrucción de los componentes tisulares como la elastina, provocan peroxidación lipídica
en las membranas plasmáticas y oxidación del DNA. De esta forma, las ROS desregulan las
funciones celulares e inducen daño tisular, lo cual incrementa en estado de inflamación (Kim
y col., 2008; Roome y col., 2008).
Las ROS promueven la actividad de los factores proinflamatorios nucleares sensibles a
cambios redox, incluyendo el factor de transcripción nuclear kappa B (NFκB) (Kim y col.,
2008). Este a su vez aumenta la expresión del gen codificante de la enzima óxido nítrico
sintasa inducida (iNOS), que promueve la síntesis de óxido nítrico (NO, gas considerado un
radical libre) por las células endoteliales, lo cual determina la vasodilatación. El NO tiene una
acción corta y local. También es producida por los macrófagos, ya que las interleucinas
activan las sintasas del NO; cuando éstas se liberan en cantidades incontroladas, se
producen vasodilatación periférica y necrosis tisular (Leyva y Quezada, 2008).
ANTECEDENTES
- 32 -
Los isoprostanos son isómeros de las prostaglandinas que se producen in vivo
independientemente de la COX, por peroxidación no enzimática del AA y del ácido
docosohexanoico (DHA) inducida por radicales libres. Durante su formación, se producen
varios intermediarios, entre los cuales están los isocetales o isolevuglandinas, celtoaldehídos
acíclicos altamente reactivos, que contribuyen y amplifican el daño celular debido a su
habilidad para modificar covalentemente biomoléculas críticas. Los isoprostanos son
marcadores del estrés oxidativo y se ha demostrado que tienen numerosos efectos
biológicos, lo cual sugiere que funcionan como mediadores patofisiológicos del estrés
oxidativo, por lo que se sugiere su importancia en la práctica médica (Montuschi, 2004). Los
isoprostanos, y en particular, los isocetales, son importantes agentes que contribuyen al
daño tisular, ya que su producción es retroalimentada, por los radicales libres generados en
exceso durante la inflamación.
Las fuentes potenciales de O2- (la producción de esta especie determina el balance
fisiológico de las ROS) incluyen la cadena de trasporte de electrones mitocondrial, el
citocromo P450, la xantina oxidasa, las sintasas del NO, pero las principales son las enzimas
COX´s, LOX’s y las NADPH oxidasas. Se ha observado que la actividad de la 5-LOX está
relacionada con la producción intracelular de ROS. El O2- se dismuta a H2O2 y se cree que
esta última ROS es la más importante en la modulación de los eventos proinflamatorios (Kim
y col., 2008).
La inflamación crónica es una de las principales causas de cáncer e investigaciones han
demostrado que el mecanismo de acción involucra la participación de agentes oxidantes
(Ames y col., 1993). La sobreproducción de oxidantes conduce también a una depleción de
los sistemas antioxidantes endógenos. Por lo tanto, la influencia de los radicales libres en
una determinada reacción inflamatoria depende del equilibrio entre la producción e
inactivación de estos metabolitos por las células y tejidos a través de sus mecanismos
protectores antioxidantes (Crotan y col., 1990).
Debido a que la tensión oxidativa es un factor desencadenante metabólico potente para
ANTECEDENTES
- 33 -
el proceso inflamatorio (Lansky y col., 2007), la regulación de las concentraciones de ROS
intracelulares y extracelulares, así como de las especies reactivas de nitrógeno durante la
inflamación tienen un rol crucial en el tratamiento de las enfermedades que presenten
eventos inflamatorios.
2.8 Fármacos antiinflamatorios
La inflamación aguda o fisiológica es una respuesta benéfica al daño tisular, pero cuando
se retrasa su resolución oportuna, puede dar lugar a enfermedades inmunoasociadas, tales
como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cáncer, entre otras
(Lansky y col., 2007), todas directa o indirectamente, a través de la introducción de las
células inflamatorias en el estroma circundante.
Es por esto que la industria farmacéutica ha creado fármacos que disminuyen el proceso
inflamatorio, las dos clases más importantes de agentes farmacológicos que inhiben la respuesta
inflamatoria aguda, subaguda o crónica son:
1) Fármacos antiinflamatorios esteroides o corticoesteroides (hormonas
glucocorticoideas suprarrenales, AIE), cuyo prototipo es la hidrocortisona.
2) Fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), cuyo prototipo es la aspirina (Rang
y col., 2004; Burke y col., 2007).
2.8.1 Antiinflamatorios no esteroideos
Son los medicamentos más recetados en casi todos los países del mundo. La denominación
antiinflamatorios no esteroideos hace referencia, además de a su estructura química, a su
mecanismo de acción independiente del efecto de los esteroides sobre la fosfolipasa A2.
Todos los AINE tienen una eficacia terapéutica similar y ninguno está exento de reacciones
adversas, por lo que en el momento de su prescripción debe considerarse el costo del
tratamiento de cada uno de ellos (Kravzov y Altagracia, 1997).
ANTECEDENTES
- 34 -
2.8.1.1 Mecanismo de acción
Los principales efectos terapéuticos de los AINE provienen de sus capacidad de inhibir la
biosíntesis y liberación de prostaglandinas como mediadores de la inflamación (al inhibir con
mayor o menor potencia y especificidad, las isoformas de la COX), así como la disminución
inespecífica de la permeabilidad, ya que las prostaglandinas actúan como factores inmediatos de
la inflamación y son las responsables del dolor, la vasodilatación, el aumento de la permeabilidad
vascular y la fiebre (Figura 8).
La vía 5-lipooxigenasa [5-LOX], que produce leucotrienos, no resulta afectada por los AINE.
Tampoco se ve afectado el metabolismo del ácido araquidónico (AA) que llevan a cabo las
enzimas que contienen al citocromo P-450 (Figura 7).
La primera enzima en la vía de síntesis de las prostaglandinas es la sintasa de
prostaglandina G/H, llamada también COX, enzima que transforma el AA (liberado de las
membranas celulares, debido a la presencia del estímulo nocivo) en los productos inestables
PGG2 y PGH2, y que culmina en la producción de TXA2 y diversas prostaglandinas.
Se conocen dos formas de COX, la forma 1 (COX-1) y la forma 2 (COX-2). Se han descrito
variantes de la COX-1 que conservan su actividad enzimática a pesar del corte y empalme,
una de las cuales se denomina "COX-3".
La COX-1 es predominantemente una isoforma constitutiva que aparece en casi todas las
células y tejidos normales, en tanto que las citocinas y los mediadores de inflamación que
acompañan a esta última inducen la producción de COX-2. Sin embargo, la COX-2 también se
expresa en forma constitutiva en algunas zonas de los riñones y del encéfalo, y su actividad es
inducida por células endoteliales.
Como dato importante, la isoforma constitutiva dominante en las células del epitelio
gástrico es COX-1, y constituye la principal fuente para la formación de prostaglandinas
citoprotectoras (Burke y col., 2007; Rang y col., 2007; Halter y col., 2001).
ANTECEDENTES
- 35 -
Los antiinflamatorios no esteroideos, en concentraciones altas, también aminoran la
producción de radicales superóxido, inducen la apoptosis, inhiben la expresión de moléculas de
adherencia, disminuyen la cantidad de citocinas proinflamatorias (como TNF-α, IL-1); modifican la
actividad de linfocitos y alteran otras funciones de la membrana celular. Sin embargo, difieren las
opiniones en cuanto a que las acciones mencionadas puedan contribuir a la actividad
antiinflamatoria de dicho grupo de fármacos en las concentraciones que se logran en el uso
clínico (Burke y col., 2007; Kravzov y Altagracia, 1997).
ANTECEDENTES
- 36 -
Figura 7. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo de los fosfolípidos de la
membrana y de la vía de la LOX del AA; fármacos que inhiben su formación (modificado de Crotan y
col., 1990)
-
-
- Fosfolipasa A2
Fosfolípidos de la
membrana celular
Ácido araquidónico
(AA)
12-lipooxigenasa
LTA4 12-HETE
(quimiotaxina)
5-lipooxigenasa 5-HPETE
Liso-gliceril-fosforilcolina
FAP (vasodilatador, aumenta
la permeabilidad vascular,
broncoconstrictor,
quimiotaxina)
LTB4
(quimiotaxina)
LTC4
LTB4
LTE4
(Broncoconstrictores;
aumentan la
permeabilidad
vascular)
Vía
lipooxigenasa
Vía
ciclooxigenasa
Lipoxinas A y B
15- lipooxigenasa
Glucocorticoides
Antagonistas del
FAP
Antagonistas
de los
receptores de
leucotrienos
Citocromo
P-450
ANTECEDENTES
- 37 -
Figura 8. Mediadores inflamatorios derivados del metabolismo del AA por la vía de la COX y
fármacos que inhiben su formación (modificado de Crotan y col., 1990)
-
-
-
Fosfolipasa A2
Fosfolípidos de la
membrana celular
AA
COOH
Vía ciclooxigenasa
Endoperóxidos
cíclicos
PGG2 y PGH2
PGI2
(vasodilatador;
hiperalgésico;
detiene la
agregación
plaquetaria)
TX2A (trombótico;
vasoconstrictor)
PGF2α
(broncoconstrictor;
contracción
miometrial)
PGD2 (inhibe la
agregación
plaquetaria,
vasodilatador)
PGE2 (vasodilatador,
hiperalgésico)
Antagonistas
de PG
Antagonistas de
TXA2 sintetasa
AINE
ANTECEDENTES
- 38 -
2.8.1.2 Efectos adversos
La reacción adversa más común de los AINE (con excepción de los COX-2 selectivos y de
los paraaminofenoles, que producen erosiones y úlceras mucosas con un riesgo 3 veces
menor que con los no selectivos) es lo que se ha denominados gastropatía por AINE, es decir
irritación ulcerogastroduodenal, cuando se consumen frecuentemente.
Los mecanismos por los cuales los AINE provocan daño en la mucosa gastrointestinal son
diversos. La inhibición de la COX provoca un decremento en la secreción de moco y
bicarbonato, reduce el flujo sanguíneo y causa daño vascular, la acumulación de leucocitos,
la disminución en el número de células, factores que contribuyen al génesis del daño en la
mucosa. Además, debido a la inhibición de la formación de prostaglandinas, existe un
aumento del número de neutrófilos adheridos al endotelio vascular de las vénulas gástricas y
mesentéricas, lo cual causa estasis microvascular y daño a la mucosa por isquemia y el
incremento de radicales libres y proteasas.
Aunque la inhibición de la síntesis de prostaglandinas juega un rol importante en la
inducción del daño en la mucosa, no es el único mecanismo por el cual los AINE provocan
daño en la mucosa gastrointestinal, ya que estos fármacos también inducen daño local en el
sitio de contacto, al incrementar la permeabilidad gastrointestinal (GI), lo cual a su vez
permite que pasen factores agresivos de la luz a la mucosa (Halter y col., 2001). Los AINE
también afectan el tracto gastrointestinal por otros mecanismos (Figura 9).
ANTECEDENTES
- 39 -
Figura 9. Mecanismos de daño del tracto gastrointestinal, causados por los AINE (Halter y col.,
2001)
AINE
Inhibición de la producción de TX en plaquetas
Inhibición de la agregación plaquetaria
Incremento en el tiempo de sangrado
Efecto global: hemorragia digestiva
Propiedades irritantes tópicas
Incremento en la permeabilidad GI
Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa mitocondrial
Pérdida del control citoesquelético en las uniones tight junction
Decremento de la hidrofobicidad Efecto global: erosiones y úlceras GI
Inhibición de la síntesis de prostaglandinas
Decremento en la secreción de moco y bicarbonato
Vasoconstricción
Efecto global: deterioro de la defensa y reparación de la mucosa
Daño en los vasos sanguíneos
Incremento de las moléculas de adhesión
Acumulación de leucocitos
Daño en las células endoteliales
Efecto global: erosiones y úlceras GI
Inhibición de los mecanismos de reparación
Inhibición de la proliferación celular
Incremento en la apoptosis
Inhibición de la angiogénesis Efecto global: deterioro de la reparación GI
Otros efectos de los AINE:
Inhibición de otras enzimas incluyendo la fosfolipasa (ejemplo, sulindac)
Producción de especies reactivas de oxígeno
Interacciones con la sintasa inducible de óxido nitroso y óxido nítrico
Efectos directos sobre los genes (ejemplo, aspirina)
ANTECEDENTES
- 40 -
2.9 Indometacina
2.9.1 Características y mecanismo de acción
Indometacina, un derivado indólico metilado, es un potente antiinflamatorio no
esteroideo (AINE) no selectivo utilizado desde 1965. Se introdujo en 1963 para tratar la artritis
reumatoide y los trastornos afines. Su nombre químico es 1-(p-clorobenzoil)-5-metoxi-2-
metilindol-3 acético.
Figura 10. Estructura de la indometacina
Se considera que el grupo carbonilo en la posición 3 le confiere acidez a la molécula y por lo
tanto mayor potencia antirreumática, mientras que el grupo arilacilo en la posición 1, el metoxilo
en la posición 5 y la presencia del halógeno en la posición para del grupo 1-benzoilo, son en gran
parte los responsables de su actividad antiinflamatoria, ya que estos grupos pueden formar
puentes de hidrógeno que retardan su absorción y prolongan sus efectos (Salama y Avendaño,
2005).
La indometacina tiene un peso molecular de 357.8, pKa de 4.5, es un polvo blanco
amarillento pálido a amarillo tostado; inodoro o con olor suave; de sabor ligeramente amargo;
sensible a la luz; estable en el aire y estable al calor, en la condiciones habituales de temperatura
ambiente; una forma polimórfica se funde alrededor de 155 °C y la otra alrededor de 162 °C. Es
insoluble en agua, pero soluble en etanol, éter, acetona y aceite de ricino. Es estable en
soluciones neutras o ligeramente ácidas. Se descompone en bases fuertes. Tanto la forma
sólida como sus soluciones se deben proteger de la luz solar.
N
H3CO CH2COH
CH3
C
O
Cl
O
ANTECEDENTES
- 41 -
La dosis letal media (DL50) intraperitoneal (i.p.) en ratas, es de 13 mg/kg.
La sal sódica trihidratada, es un polvo cristalino amarillo pálido que en estado seco es
bastante estable, muy soluble en metanol, soluble en agua y etanol, muy ligeramente
soluble en cloroformo y acetona (Budavari, 2001).
La indometacina es un potente inhibidor de la vía de la COX, más afín por la COX-1, por lo
tanto inhibe la síntesis de prostaglandinas. Reduce la producción de renina por parte de las
células yuxtaglomerulares, lo cual puede dar como resultado importantes efectos sobre la
presión arterial, el agua y la sal, independientes de las prostaglandinas.
La indometacina también inhibe movilidad de los PMN y puede tener un efecto
vasoconstrictor directo independiente de la COX.
Asimismo, puede afectar las funciones del monofostafo de adenosina cíclico (AMPc) en
virtud de su efecto inhibidor sobre la fosfodiesterasa (Burke y col., 2007).
La actividad antiinflamatoria de la indometacina, fue demostrada por primera vez en
animales, al medir su capacidad para inhibir la formación del granuloma o el edema inducido
por la inyección subplantar de la carragenina en ratas.
2.9.2 Farmacocinética y farmacodinámia
La indometacina tiene una excelente biodisponibilidad por vía oral, pero también puede ser
absorbida en la mucosa rectal cuando se administra en supositorios.
Una vez absorbida, se alcanzan concentraciones máximas en 1 o 2 h y se une en un 90% a
las proteínas plasmáticas. La concentración del fármaco en el líquido cefalorraquídeo es
pequeña, pero la del líquido sinovial es igual a la del plasma, en cuestión de 5 h después de la
administración.
Entre 10 y 20% del producto se excreta sin cambios por la orina, en parte por la
secreción tubular. La mayor parte se transforma en metabolitos inactivos por las enzimas
ANTECEDENTES
- 42 -
microsomales hepáticas, como los que resultan de la O-desmetilación (aproximadamente la
mitad), la conjugación con ácido glucurónico (aproximadamente 10%) y la N-desacilación (Burke
y col., 2007).
Los metabolitos libres y conjugados se eliminan en la orina, la bilis y las heces. Se observa
reciclado enterohepático de los conjugados y probablemente de la propia indometacina. La
semivida en plasma es variable, pero dado el ciclo enterohepático, dura unas 2.5 h en humanos.
2.9.3 Efectos adversos
Los AINE, entre ellos la indometacina, son los medicamentos con mayor número de
reportes de efectos adversos, su administración provoca efectos tóxicos generales con
diferentes grados de severidad (Halter y col., 2001; Hanson, 2003). El más frecuente es una
propensión a inducir úlceras gástricas o intestinales, que se acompañan a veces por leucopenia,
trombocitopenia y en ocasiones anemia aplásica, resultante de la pérdida sanguínea (Kravzov
y Altagracia, 1997).
Un porcentaje muy alto de personas (35 a 50%) que reciben indometacina en las dosis
terapéuticas usuales, muestran síntomas adversos y cerca de 20% debe interrumpir su uso por
esa causa. Muchos de tales efectos son dependientes de la dosis.
Las molestias gastrointestinales son frecuentes y pueden ser graves. Surge a veces diarrea y
en ocasiones, conlleva lesiones ulcerosas en los intestinos. En un experimento utilizando un
modelo de úlcera gástrica, se observó que la indometacina redujo la velocidad de la curación
predominantemente, en la segunda semana después de la inducción de úlcera, mientras que
su acción fue marginal en la primera semana (Halter y col., 2001). El efecto más frecuente en
el SNC (y con ello el más frecuente en general) es la cefalalgia frontal intensa que aparece en el
25 a 50% de las personas que reciben el medicamento por largo tiempo. Se observan a veces
mareos, vértigos, obnubilación leve y confusión psíquica. También, se han señalado
convulsiones y en casos de depresión, pueden presentarse, psicosis, alucinaciones graves y
suicidios.
ANTECEDENTES
- 43 -
2.10 Modelos farmacológicos preclínicos para evaluar la actividad antiinflamatoria
Los modelos de inflamación permiten estimar el potencial de los candidatos a ser fármacos
antiinflamatorios de uso en humanos (Martínez y col., 2004). Existen diversos métodos in vivo e in
vitro que permiten estudiar el efecto antiinflamatorio a nivel sistémico, éstos se deben elegir de
acuerdo a la etapa de inflamación que se pretenda evaluar. Los métodos se describen
minuciosamente en Pablo, 2009.
JUSTIFICACIÓN
- 44 -
3. JUSTIFICACIÓN
os fármacos antiinflamatorios de uso actual, inducen efectos secundarios en la mayoría
de los pacientes, por ejemplo los AINE provocan irritación de la mucosa gástrica de
diversa severidad, por lo que es indispensable contar con nuevas alternativas terapéuticas
con efecto antiinflamatorio, menor toxicidad y costo.
Las propiedades antioxidantes de los flavonoides y sus posibles acciones fisiológicas, han
producido interés en estos compuestos en los últimos años. Diversos polifenoles con
potencial antioxidante han mostrado actividad antiinflamatoria al inhibir enzimas implicadas
en dicho proceso, por lo que se ha sugerido una relación entre el estrés oxidativo y las
enfermedades inflamatorias. Estudios previos reportaron la presencia de diversos
flavonoides en Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. por lo que resulta interesante evaluar si
su actividad antiinflamatoria se debe a estos metabolitos.
L
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
- 45 -
4. HIPÓTESIS
i las fracciones flavonoicas son las responsables de la actividad antiinflamatoria y
antioxidante de los extractos totales de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg., entonces el
proceso inflamatorio disminuirá en el modelo del granuloma en la rata.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
eparar la fracción rica en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. y evaluar
su efecto antiinflamatorio mediante el modelo del granuloma en la rata, así como su
efecto antioxidante in vitro.
5.2 Objetivos particulares
Separar los compuestos de naturaleza flavonoica presentes en el extracto etanólico de
la corteza de palo dulce
Cuantificar los fenoles totales y los flavonoides totales presentes en el extracto crudo y
las fracciones
Determinar el potencial antioxidante in vitro del extracto crudo y de las fracciones
Evaluar la actividad antiinflamatoria de las fracciones ricas en flavonoides
Evaluar la actividad ulcerogastroduodenal de los tratamientos a nivel macroscópico e
histológico
Integrar los resultados anteriores a través del establecimiento de inter-relaciones entre
la actividad biológica y la naturaleza química de los compuestos
S
S
METODOLOGÍA
- 46 -
6. METODOLOGÍA
6.1 Recolección e identificación de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg.
Se recolectaron trozos de tronco, corteza, tallos y hojas de la especie vegetal y se
identificaron por la Bióloga Laura Doval Ugalde, en el Departamento de Botánica de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, de acuerdo con las claves taxonómicas
correspondientes. Las partes de la especie se secaron al aire libre y a la sombra, una vez secas
se molieron, con excepción de las hojas, hasta obtener partículas de tamaño medio.
6.2 Preparación del extracto etanólico
La preparación del extracto etanólico, se realizó mediante el método de maceración,
que consistió en colocar las partes de la especie vegetal, excepto las hojas, (6.1 kg,
previamente secas y molidas) en un recipiente con 16.5 L de etanol y se dejaron reposar
aproximadamente 7 días a temperatura ambiente (Granda, y col., 1988; Farmacopea
Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, Anexo 5, 2001). Al término de este tiempo, para
concentrar el extracto, se evaporó el etanol a presión reducida.
6.3 Análisis fitoquímico preliminar
Se realizó un análisis fitoquímico preliminar de la infusión y decocción de las hojas y la
corteza del palo dulce, así como del extracto etanólico con el fin de corroborar la presencia
de compuestos fenólicos, en particular flavonoides, mediante reacciones colorimétricas y de
precipitación (Domínguez, 1979; Pablo, 2009).
6.4 Aislamiento de la fracción rica en flavonoides
a) Cromatografía por filtración en gel
Se pesaron 500 mg del extracto etanólico y se colocaron en una columna cromatográfica
de vidrio de 30 cm de largo y 2.5 cm de diámetro interno, previamente empacada con 50 g de
sephadex LH-20 (gel dextrano, donde las moléculas están unidas entre sí con enlaces
METODOLOGÍA
- 47 -
cruzados), el eluyente fue metanol (MeOH). La velocidad de flujo fue de 1.5 mL/min. El avance
del extracto por la columna se siguió por los diferentes colores en los que se separaba el
extracto.
A cada fracción (10 mL) se le comprobó la presencia de flavonoides mediante la reacción
colorimétrica con 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4 conc.) (Domínguez, 1979; Pablo,
2009). Las fracciones que resultaron tener intensidad de color similar se reunieron y a estas
mezclas de fracciones se les realizaron cromatografías de capa fina de sílica gel HF254 utilizando
como fase móvil una solución de AcEt/MeOH/H2O (80:15:5, v/v) para separar los metabolitos, ya
que los flavonoides poseen diferentes solubilidades (Domínguez, 1979) (y se desconocía si se
encontraban libres o como glicósidos). Los cromatogramas se revelaron utilizando luz UV de
onda larga de 366 nm, vainillina 1%-H2SO4, vapores de amoniaco (NH3) y/o yodo sublimado (I2)
(Erdemoglu y col., 2009). Nuevamente, las fracciones que tuvieron manchas, color y Rf
similares se juntaron y se concentraron.
b) Cromatografía de columna seca
Antes de realizar la separación del extracto etanólico por medio de la cromatografía en
columna seca (DCC), se obtuvo la fase móvil que mejor separaba los metabolitos presentes
en el extracto, para lo cual se emplearon placas cromatográficas de sílica gel HF254 con
soporte de aluminio y/o vidrio. Las fases móviles que se analizaron fueron a) isocráticas:
mezclas de hexano/AcEt (60:40, v/v), MeOH/acetona (60:40, v/v), AcEt:MeOH (60:40, v/v),
AcEt/MeOH/H2O con las siguientes proporciones 80:15:5, 70:25:5, 70:20:10, 70:15:5 y, v/v, y b)
por gradiente: hexano/CHCl3/AcEt (50:30:20, v/ v) y posteriormente AcEt/MeOH (90:10, v/v) al
hacer una cromatografía bidimensional.
La columna se empacó con 2 750 g de sílica gel, se pesaron aproximadamente 30 g del
extracto etanólico y se colocaron en una columna de 121 cm de largo por 15 cm de diámetro,
el eluyente fue una mezcla de AcEt/MeOH/H2O (70:15:15, v/v).
A las fracciones obtenidas se les realizaron reacciones colorimétricas y varios
cromatogramas en capa fina de sílica gel para comprobar la composición química, asimismo, se
METODOLOGÍA
- 48 -
cuantificaron los fenoles y los flavonoides totales presentes en dichas fracciones.
6.5 Cuantificación de los fenoles totales
Para la cuantificación de los fenoles totales se utilizó em método de FC. El día del análisis
se prepararon soluciones stock de 1 mg/mL de ácido gálico (se solubilizó en etanol y se aforó
con agua desionizada) y quercetina (disuelta en metanol). Las diluciones para obtener la
curva de calibración se muestran en la tabla 2. A 20 μL del extracto o estándar
correspondiente, por triplicado, se le agregaron 1.5 mL de agua destilada, posteriormente
100 μL de reactivo de FC, se mezclaron vigorosamente y después de 5 min (el tiempo no
excedió de 8 min) se agregaron 300 μL de solución de Na2CO3 al 20%, se dejó reposar por 2 h
a temperatura ambiente o 30 min a 40°C.
Para determinar la λ máxima de absorción de la mezcla de reacción se obtuvo el espectro
característico entre 400 y 800 nm. Posteriormente, se midió la absorbencia a 765 nm. Para la
referencia, el volumen de la solución stock se reemplazó por agua desionizada. La
concentración de los fenoles se calculó con base en la curva de calibración y se expresó como
mg equivalentes de ácido gálico/g de extracto y mg equivalentes de quercetina/g de extracto
(modificado de Waterhouse, 2002).
METODOLOGÍA
- 49 -
Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibración de los fenoles totales
Sol.
Stock (µL)
Agua desionizada
(µL)
Concentraciones finales (μg/mL)
0 1000 0
50 950 0.5208
100 900 1.0417
150 850 1.5625
200 800 2.0833
250 750 2.6042
300 700 3.125
350 650 3.6458
400 600 4.1667
450 550 4.6875
500 500 5.2083
550 450 5.7292
600 400 6.25
6.6 Cuantificación de los flavonoides totales
Para la cuantificación de los flavonoides totales se empleó la técnica de quelación con
AlCl3. Se preparó una solución stock de 50 μg/mL de quercetina en MeOH. Para realizar la
curva de calibración se tomaron alícuotas de la solución stock, por duplicado, se les agregó
MeOH para obtener un volumen final de 4 mL por cada punto de la curva (Tabla 3), se les
adicionaron 100 μL de reactivo de AlCl3 al 10% y se mezclaron vigorosamente. Para
determinar la λ máxima de absorción de la mezcla de reacción se obtuvo el espectro
característico entre 200 y 600 nm. Posteriormente, se midió la absorbencia a 440 nm. Para la
referencia, el volumen de la solución stock se reemplazó por más volumen de MeOH. La
concentración de flavonoides totales se calculó con base en la curva de calibración y se
expresó como mg equivalentes de quercetina/g de extracto (modificado de Lamaison y
Carnet, 1990; Chang y col., 2002).
METODOLOGÍA
- 50 -
Tabla 3. Diluciones para preparar la curva de calibración de los flavonoides totales
Sol. Stock
(mL) Metanol
(mL) Concentraciones finales
(μg/mL)
0 4.0 0
0.1 3.9 1.25
0.2 3.8 2.5
0.3 3.7 3.75
0.4 3.6 5.0
0.5 3.5 6.25
0.6 3.4 7.5
6.7 Determinación de la capacidad antioxidante in vitro
Para determinar la capacidad antioxidante se utilizó el método del DPPH•, reportado por
Brand-Williams (1995), con algunas modificaciones. El día del análisis se preparó una solución
de DPPH• a una concentración de 63.4 μM en metanol. Asimismo, se preparó una solución
stock de 500 μg/mL de quercetina en MeOH (control positivo). Todas las muestras se
prepararon a la misma concentración que la solución stock. En tubos de ensaye se colocaron
por duplicado 1 mL de las muestras a analizar y 1 mL del reactivo de DPPH•. Cada tubo se
agitó y se dejó reposar por 30 min a temperatura ambiente y en la oscuridad. Para
determinar la λ máxima del DPPH• se obtuvo el espectro característico entre 400 y 800 nm.
Posteriormente, se midió la absorbencia a 514 nm. Para la referencia, el volumen de la
solución stock se reemplazó por MeOH. La potencia o actividad antioxidante se calculó como
el porcentaje utilizando la siguiente fórmula:
Donde: A1 = absorbencia de la muestra
A0 = absorbencia del control
METODOLOGÍA
- 51 -
6.8 Evaluación farmacológica de la actividad antiinflamatoria
Se utilizaron ratas Wistar hembras adultas de 200 ± 20 g de peso corporal (p.c.), las cuales
se mantuvieron a las condiciones del bioterio (temperatura constante 22-24 °C; humedad
relativa 50-55%; ciclos de luz/oscuridad 12 x 12 h) para su adaptación, de 6 a 7 días. Los
animales fueron alimentados con dieta estándar de Rat Chow y agua a libre demanda. El
manejo y cuidado de los animales se realizó de acuerdo a los procedimientos aceptados
internacionalmente (NOM-062-ZOO-1999).
Después del periodo de adaptación, las ratas se pesaron, se colocaron en jaulas
individuales y se distribuyeron aleatoriamente en los grupos de tratamiento. La inducción de la
inflamación se realizó utilizando el modelo del granuloma, para lo cual se pesaron
aproximadamente 50 mg de algodón para elaborar los pellets, los cuales se esterilizaron en
una estufa a 60 °C, 24 h antes del inicio del experimento.
El séptimo día, las ratas se anestesiaron con éter etílico y se les realizó una incisión
subcutánea de aproximadamente 1 cm por debajo de la axila, en donde se introdujo el pellet de
algodón, según el modelo del granuloma (Márquez-Flores y col., 2009). La incisión se suturó
utilizando hilo de nylon calibre 4.0, realizando 3 puntadas.
Los grupos de tratamiento fueron: el testigo (vehículo, solución de bicarbonato de sodio
al 5%, 1 µL/g de p.c.), el testigo positivo tratado con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y los
tratados con las fracciones 11-15 y 16-20 obtenidas de la separación cromatográfica del
extracto etanólico (25 mg/kg de p.c.) por ser éstas las de mayor contenido flavonoico según
el análisis fitoquímico preliminar. La administración se realizó por vía oral durante siete días.
Los animales tuvieron alimento y agua ad libitum.
Al octavo día después del inicio del tratamiento, las ratas se sacrificaron utilizando
cloroformo, se retiraron los pellets y se pesaron para obtener el peso húmedo del granuloma,
posteriormente, se colocaron en una estufa a 60 °C hasta obtener el peso constante (peso
seco).
METODOLOGÍA
- 52 -
El peso final del granuloma se calculó por la diferencia entre el peso seco y el peso del pellet
de algodón antes de introducirlo al cuerpo de las ratas.
6.9 Evaluación de la actividad ulcerogastroduodenal
6.9.1 Macroscópica
Inmediatamente después de sacrificar a las ratas y retirar el granuloma, se abrió el
abdomen de las ratas y se realizó la disección del estómago y duodeno de cada animal,
exponiendo su interior, con la finalidad de observar la presencia o ausencia de erosiones,
úlceras, hemorragias o algún tipo de irritación presente en dichos órganos (caracterizada por
una coloración rojiza).
6.9.2 Histológica
Después de la observación de los tejidos, se les fijó en formol al 10% para realizarles un
estudio histopatológico mediante la técnica de hematoxilina-eosina (Pablo, 2009).
Se observaron todas las capas de los tejidos, poniendo énfasis en la mucosa, para detectar
cualquier alteración en ellas (discontinuidades, ausencia de alguna capa, erosiones o úlceras),
así como la presencia o ausencia de leucocitos y eritrocitos en la luz de los tejidos. Para
distinguir las características histológicas de los órganos normales y los irritados se tomaron
como referencia las observaciones de las laminillas correspondientes al grupo testigo, así como
las encontradas en la bibliografía e información sobre los cambios histológicos que ocurren
cuando hay lesiones en los órganos (Dayal y DeLellis, 1990; Di Fiore, 1981).
Por lo menos, 30 cortes histológicos de tejido de cada animal fueron analizados con un
mínimo de seis animales por cada tratamiento.
6.10 Análisis estadístico
Se realizó un ANOVA para determinar las diferencias significativas en los diferentes
ensayos. Para la comparación post-hoc se utilizó la prueba estadística Student-Newman-
Keuls. Se consideraron diferencias significativas cuando P<0.05.
RESULTADOS
- 53 -
7. RESULTADOS
7.1 Recolección, identificación y obtención del extracto etanólico
La especie vegetal se recolectó en la comunidad de San Pedro Tlaquilpan perteneciente al
municipio de Zempoala, Hidalgo en febrero de 2010. La identificación botánica indicó que las
partes recolectadas pertenecían a un ejemplar de la especie Eysenhardtia polystachya (Ort.)
Sarg.
A partir de 6 100 g de planta seca y utilizando 16.5 L de etanol, se obtuvieron 334.91 g
(rendimiento 5.5%) de extracto etanólico de color amarillo-verdoso y consistencia siruposa.
7.2 Análisis fitoquímico preliminar
Los resultados del estudio fitoquímico preliminar de los metabolitos secundarios de los
diferentes extractos de palo dulce se muestran en el apéndice 1.
En general, Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. posee alcaloides, azúcares
reductores, cumarinas, glucósidos cardiacos, flavonoides, quinonas, saponinas y taninos, los
cuales se encuentran en mayor o menor cantidad en sus hojas y/o corteza. La extracción
con los disolventes orgánicos, en este caso metanol, es capaz de extraer una mayor
proporción de metabolitos que el agua.
Los tipos de flavonoides detectados en todos los extractos al realizar todas las reacciones
correspondientes fueron: flavonas (reacción de Shinoda) y flavonoles (NaOH 10%). Estos
resultados fueron comparados con un extracto etanólico de palo dulce preparado en 2008 y un
liofilizado de la especie obtenido en 2007 (Pablo, 2009; Salazar, 2007), indicando que los
flavonoides son un grupo de metabolitos secundarios que se exhiben habitualmente en el palo
dulce.
RESULTADOS
- 54 -
7.3 Aislamiento de los flavonoides
a) Cromatografía por filtración en gel
Al realizar esta técnica se obtuvo una separación exitosa a través de la columna, ya que el
extracto se dividió en colores, de arriba abajo, café, amarillo, verde y amarillo muy tenue. Se
obtuvieron 75 fracciones de aproximadamente 10 mL cada una, de las cuales, al tomar alícuotas
de 0.5 mL y adicionarles 2 gotas de H2SO4 conc. se obtuvieron tonalidades amarillas, rojas,
guindas, rosas y rosas muy tenues, lo cual indicó una concentración relativa de flavonoides en las
fracciones, siendo las fracciones con tonalidad guinda las más ricas en estos metabolitos. Al
reunir las fracciones de acuerdo a su tonalidad se obtuvieron 5 fracciones, a las cuales se les
realizó una cromatografía en placa fina y al observar el comportamiento de los Rfs y los colores
de las manchas similares, se decidió utilizar sólo 4 fracciones reunidas de la siguiente manera: F1
(1-4), F2 (5-12), F3 (13-25) y F4 (26-75).
Una vez que se concentraron las fracciones a presión reducida, se eligió la fracción F2, por
ser ésta la fracción con mayor proporción de flavonoides según el análisis fitoquímico. Sin
embargo, debido a los bajos rendimientos encontrados, se optó por realizar la técnica
cromatográfica de columna seca para separar a los metabolitos.
b) Cromatografía de columna seca
La fase móvil que separó mejor los metabolitos presentes en el extracto fue la mezcla
isocrática AcEt/MeOH/H2O en la siguiente proporción 70:25:5, obteniéndose las siguientes
características de las manchas que corresponden a: amarilla con Rf de 0.175, amarilla con Rf de
0.75 y naranja con Rf de 0.975. Por lo anterior, esta fase móvil se empleó para la elución de los
metabolitos en la DCC.
Por esta técnica, se obtuvieron 26 fracciones, a las que después de realizarles pruebas
fitoquímicas preliminares para los flavonoides y varias cromatografías en placa fina, se decidió
reunir las fracciones para tener sólo 5, reunidas de la siguiente manera: F1 (1-5), F2 (6-10), F3
(11-15), F4 (16-20) y F5 (21-26), de acuerdo con el comportamiento de los Rfs y los colores de las
RESULTADOS
- 55 -
manchas.
Una vez que se concentraron las fracciones a presión reducida, el análisis fitoquímico mostró
una mayor cantidad de flavonoides en F3 y F4, por lo que éstas se eligieron para ser evaluadas
farmacológicamente como probables agentes antiinflamatorios en el modelo del granuloma. El
rendimiento de la separación y los resultados de las pruebas para flavonoides se muestran en la
tabla 4.
Tabla 4. Rendimientos de la separación de los metabolitos del extracto etanólico por DCC
Fracción Cantidad
obtenida (g) Rendimiento
(%)
Pruebas para flavonoides
Shinoda NaOH al 10%
1. 1-5 1.05 3.5 + -
2. 6-10 1.88 6.3 ++ +
3. 11-15 3.90 13 ++++ +++
4. 16-20 3.05 10.2 +++ ++
5. 21-26 11.2 37.3 + +
Total 21.08 70.3
De los 30 g de extracto etanólico colocados en la columna, sólo se recuperaron en total
21.08 g, que representan el 70.3%, que indica una pérdida por absorción del extracto a la
sílica gel de 8.92 g.
7.4 Cuantificaciones de los extractos
Todos los métodos analíticos empleados en esta investigación fueron previamente
valiadados, la información al respecto se encuentra en los apéndices 2-4.
Los resultados de las cuantificaciones realizadas a los diferentes extractos, así como las
fracciones obtendidas de la separación cromatográfica del palo dulce se resumen en la tabla
5.
RESULTADOS
- 56 -
Tabla 5. Contenido de los fenoles totales, los flavonoides totales y capacidad antirradical contra
el DPPH• de los extractos de E. polystachya
Muestra Fenoles totalesa
(mg de EAG/g de muestra)
Fenoles totalesb
(mg de EQ/g de muestra)
Flavonoides totalesc
(mg de EQ/g de muestra)
Actividad antirradicalar (%)
DPPH•d
Extracto etanólico de
corteza E. polystachya
287.31 ± 7.65 160.75 ± 4.52 3.72 ± 0.64 93.96 ± 1.00
Infusión corteza
69.96 ± 5.16 32.37 ± 3.05 0.01 ± 0.01 0 ± 0
Decocción corteza
59.72 ± 3.35 26.33 ± 1.98 0.97 ± 0.01 10.57 ± 0.21
Infusión hojas
52. 09 ± 1.30 21.81 ± 0.77 1.00 ± 0.06 25.98 ± 1.35
Decocción hojas
95.34 ± 21.95 47.35 ± 12.96 3.40 ± 0.07 0 ± 0
F1. (1-5)
87.18 ± 6.68 42.54 ± 3.95 2.91 ± 0.03 60.99 ± 7.32
F2. (6-10)
90.57 ± 5.20 44.54 ± 3.07 6.19 ± 0.10 88.90 ± 0.22
F3. (11-15)
72.90 ± 2.88 34.10 ± 1.70 3.28 ± 0.16 67.42 ± 2.30
F4. (16-20)
158.28 ± 11.81 84.54 ± 6.97 9.20 ±0.05 75.30 ± 1.44
F5. (21-26)
69.21 ± 2.84 31.92 ± 1.68 1.23 ± 0.11 90.12 ± 1.26
Quercetina
- - - 99.06 ± 0.55
Vitamina E
- - - 100 ± 0
Los datos representan la media ± el error estándar de tres réplicas. aEl contenido de fenoles
totales se expresa como mg equivalentes de ácido gálico (EAG/g de extracto) y bcomo mg
equivalentes de quercetina (EQ/g de extracto). cEl contenido de flavonoides totales se expresa como
mg equivalentes de quercetina (EQ/g de extracto). dEl potencial antioxidante contra el DPPH• se
midió a una concentración de 0.5 mg de extracto/mL de solución metanólica.
RESULTADOS
- 57 -
Los fenoles y los flavonoides, están presentes tanto en las hojas como en la corteza del
palo dulce. Las hojas, por ser las estructuras aéreas más jóvenes del árbol y más expuestas a
la luz poseen mayor cantidad de fenoles y flavonoides comparado con la corteza. En el caso
de las hojas, cuando se extraen sus metabolitos por decocción acuosa hay una mayor
cantidad de fenoles y flavonoides cuantificables por la técnica utilizada, que cuando se
extraen por infusión; lo contrario ocurre en el caso de la corteza.
El extracto etanólico exhibió una mayor cantidad de fenoles y flavonoides en
comparación con los extractos acuosos de corteza y hojas.
En el caso de las fracciones, la fracción F4. (16-20) exhibió la mayor cantidad de fenoles y
flavonoides seguida de las fracciones F2>F1>F3>F5. Estos resultados aclararon aquellos
encontrados en el análisis fitoquímico preliminar (Tabla 4).
El extracto etanólico de la corteza exhibió la mayor actividad de captación del radical
DPPH•, debido a la alta cantidad de compuestos fenólicos y en particular flavonoides con
respeto a los demás extractos analizados. Sin embargo, los demás extractos y fracciones no
tuvieron el comportamiento esperado, a saber, un alto potencial antirradical de acuerdo a su
contenido fenólico y flavonoico. La infusión de hojas y la decocción de corteza contienen
polifenoles capaces de estabilizar al DPPH•, pero la decocción de hojas y la infusión de
corteza no fueron capaces de causar este efecto a las mismas concentraciones. La actividad
contra el DPPH• de las fracciones fue F5>F2>F4>F3>F1.
7.8 Evaluación farmacológica de la actividad antiinflamatoria
Los resultados de peso húmedo del granuloma en el grupo tratado con
indometacina (5 mg/kg de p.c.) y el tratado con la fracción rica en flavonoides, F3. (11-
15) (25 mg/kg de p.c.), presentaron una disminución, con respecto al grupo testigo
(NaHCO3 al 5%); en tanto que no se presentó en el grupo tratado con la fracción F4. (16-
20), obtenida de la separación cromatográfica del extracto etanólico, a la dosis de 25
mg/kg de p.c. (Tabla 6).
RESULTADOS
- 58 -
Tabla 6. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya
(Ort.) Sarg. sobre la inflamación crónica inducida mediante el modelo del granuloma la rata
Tratamiento Peso húmedo (g) Peso seco(g) Peso final (mg)
Solución de NaHCO3 al 5%
1 µL/g
0.62 ± 0.05
(7)
0.17 ± 0.01
(7)
114.87 ± 11.04
(7)
Indometacina/NaHCO3 al 5%
5 mg/kg
0.36 ± 0.02*
(7)
0.10 ± 0.01*
(7)
45.20 ± 5.03*
(7)
F3. (11-15)
25 mg/kg
0.47 ± 0.05
(7)
0.12 ± 0.01*
(7)
67.64 ± 10.99*
(7)
F4. (16-20)
25 mg/kg
0.54 ± 0.03*
(8)
0.13 ± 0.01*
(8)
84.06 ± 5.46*
(8)
Los valores mostrados representan la media ± error estándar. *P<0.05. El valor entre paréntesis
indica el número de ratas utilizadas en cada grupo.
En el peso seco de los granulomas, los grupos tratados con indometacina (5 mg/kg de
p.c.) y ambas fracciones ricas en flavonoides (25 mg/kg de p.c.) mostraron un decremento
con respecto al grupo testigo (NaHCO3 al 5%) (Tabla 6).
Con respecto al peso final de los granulomas (Figura 11), se observó una disminución en los
grupos tratados con indometacina (5 mg/kg de p.c.) y las fracciones (25 mg/kg de p.c.) con
respecto al grupo testigo (NaHCO3 al 5%).
RESULTADOS
- 59 -
Figura 11. Efecto antiinflamatorio de las fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia
polystachya (Ort.) Sarg sobre el peso final de los granulomas. Las barras representan la media y las
líneas verticales el error estándar de la media. *P<0.05
Además, se observaron diferencias en el grosor de la cápsula formada en los diferentes
grupos de experimentación. En el grupo tratado con indometacina (5 mg/kg) se observó una
cápsula muy delgada y en ocasiones fuertemente adherida al granuloma, a diferencia del
tratado con solución de bicarbonato de sodio al 5% en el que se observó la cápsula muy
gruesa. En los tratados con las fracciones, el grosor de la cápsula fue mayor comparado con el
de la indometacina, sin embargo, no llegaron a ser del tamaño observado en el grupo tratado
con solución de bicarbonato de sodio al 5%, además hubo un aumento en la exudación de
líquido.
7.6 Evaluación de la actividad ulcerogastroduodenal
7.6.1 Macroscópica
En el estómago y duodeno de las ratas tratadas con la solución de NaHCO3 5%, no se
Tratamiento
Peso f
inal del gra
nulo
ma (
mg)
0
20
40
60
80
100
120
140
Bicarbonato de sodio, 5%
Indometacina, 5mg/kg
F3. (11-15), 25 mg/kg
F4. (16-20), 25 mg/kg
*
*
*
RESULTADOS
- 60 -
observó ningún tipo de irritación, ni la presencia de úlceras (Figura 12), a diferencia de las
ratas tratadas con indometacina, en las que se observaron zonas de enrojecimiento en la
mucosa gástrica, presencia de erosiones en el duodeno y en algunos casos, se observó que los
intestinos estaban sumamente adelgazados, al grado de romperse con facilidad al ser
removidos de los cuerpos, por lo que resultaba inútil emplearlos para el estudio
histopatológico (Figura 13).
En los grupos tratados con las fracciones no se observó ningún signo de irritación o
ulceración en el tracto gastrointestinal, de hecho el comportamiento fue similar al grupo
testigo (Figuras 14 y 15).
Figura 12. Estómago y duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5% (testigo). No se observa irritación. A. Fondo, B. Cuerpo, C. Región pilórica, D. Duodeno.
Figura 13. Estómago y duodeno de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se observa enrojecimiento y presencia de úlceras.
Figura 14. Estómago y duodeno de una rata tratada con la fracción rica en flavonoides F3. (11-15) (25 mg/kg p.c.). No se observa irritación.
Figura 15. Estómago y duodeno de una rata tratada con la fracción rica en flavonoides F4. (16-20) (25 mg/kg p.c.). No se observa irritación.
7.6.2 Histología
El análisis histológico evidenció que los tejidos de los animales tratados con NaHCO3 no
presentaron alteraciones, ya que las cuatro capas histológicas concéntricas, mucosa,
submucosa, muscular y serosa del estómago (Figura 16) y duodeno en todas sus regiones se
mantuvieron intactas (Figura 17). En cuanto a los cortes de los tejidos de animales tratados
B
A
C D
RESULTADOS
- 61 -
con indometacina se observaron alteraciones de las capas que conforman el estómago y el
duodeno, manifestadas por disminución en el número de células, desprendimiento de éstas,
que se observan como discontinuidades en los tejidos, además de la presencia de leucocitos y
eritrocitos (Figuras 18-21). Los tejidos de los animales tratados con las fracciones ricas en
flavonoides (25 mg/kg de p.c.), mostraron comportamientos similares al tratamiento de
NaHCO3 (Figuras 22-25).
Figura 16. Región fúndica del estómago de una rata tratada con NaHCO3 al 5%. No hay alteración de las capas. Técnica H-E, 10x. T1. Túnica mucosa, M. Muscular de la mucosa, T2. Túnica submucosa, T3. Túnica muscular, T4. Túnica serosa.
Figura 17. Región inicial del duodeno de una rata tratada con NaHCO3 al 5%. No se observa ninguna alteración. Técnica H-E, 10x. V. Vellosidades intestinales, L. Lámina propia con glándulas de Lieberkühn, T3. Túnica muscular.
Figura 18. Células fúndicas de la mucosa estomacal de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.). Se observan eritrocitos característicos del daño provocado por el AINE. Técnica H-E, 40x. E. Eritrocitos.
Figura 19. Túnica submucosa del estómago de una rata tratada con indometacina (5 mg/kg de p.c.). Se observan neutrófilos. Técnica H-E, 40x. N. Neutrófilos.
E
A
T1
M T2
T3
T4
L
T3
V
N
RESULTADOS
- 62 -
Figura 20. Región inicial de duodeno de rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se observan discontinuidades y desprendimiento de células. Técnica H-E, 10x. V. Vellosidades, L. Lámina propia con glándulas de Lieberkühn, T3. Túnica muscular.
Figura 21. Mucosa duodenal de rata tratada con indometacina (5 mg/kg p.c.). Se observan monocitos dentro y fuera de las glándulas de Lieberkühn. Técnica H-E, 40x. M. Monocitos.
Figura 22. Región fúndica de estómago de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg p.c.). No hay alteración de las capas. Técnica H-E, 10x. T1. Túnica mucosa, M. Muscular de la mucosa, T2. Túnica submucosa.
Figura 23. Mucosa duodenal de rata tratada con F3. (11-15) (25 mg/kg p.c.). No se observa alteración de las capas. Técnica H-E, 10x. V. Vellosidades intestinales, L. Lámina propia con glándulas de Lieberkühn, M. Muscular de la mucosa, Tc. Túnica celular con glándulas de Brunner, T3. Túnica muscular.
Figura 24. Estómago de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg p.c.). No hay alteración en las capas. Técnica H-E, 10x. T1. Túnica mucosa, M.
Figura 25. Región inicial de duodeno de rata tratada con F4. (16-20) (25 mg/kg p.c.). No se observan alteraciones. Técnica H-E, 10x. V.
L
V
M
T2
T1
M
Tc
T3
V
T3
L
B
M
T1
M T2
T3
V
L T3
V
L
T3
RESULTADOS
- 63 -
Muscular de la mucosa, T2. Túnica submucosa con arteriolas, T3. Túnica muscular.
Vellosidades, L. Lámina propia con glándulas de Lieberkühn, T3. Túnica muscular.
DISCUSIÓN
- 64 -
8. DISCUSIÓN
l estudio de las plantas medicinales tiene como objetivo contribuir al conocimiento
químico, farmacológico y toxicológico de las especies vegetales, propiciar su uso como
alternativa terapéutica, además, de conducir al descubrimiento de nuevos fármacos,
candidatos para evitar o disminuir los síntomas de una variedad de enfermedades que
amenazan la salud humana.
Con el avance en el conocimiento sobre la etiología y mecanismos de las diferentes
condiciones fisiopatológicas, particularmente de la inflamación, se ha visto que las ROS y las
RNS contribuyen y potencian dicha condición (Faria y col., 2005; Kim y col., 2003; Montuschi
y col., 2004; Tsai y col., 2011), y aunque los mecanismos endógenos de defensa, han
evolucionado para ofrecer protección, se ha visto que algunos agentes de origen vegetal,
aumentan las reservas de antioxidantes del organismo para disminuir el estrés oxidativo.
Asimismo, investigaciones clínicas y estudios epidemiológicos han establecido una
correlación inversa entre la ingesta de frutas y vegetales y la incidencia de enfermedades del
corazón, el cáncer, la inflamación y los desórdenes relacionados con el envejecimiento.
Además, se ha observado que una administración continua de fuentes antioxidantes
exógenas incrementa la producción y función de las endógenas, lo cual resulta útil en el caso
de los tratamientos de enfermedades crónicas (Pietta, 1999).
Debido a estos hechos, una revisión en la literatura reveló que el número de
publicaciones sobre antioxidantes y el estrés oxidativo se cuadriplicó en la última década; lo
cual se debe al gran interés del público en general, médicos y expertos en nutrición,
investigadores en las ciencias de los alimentos y la salud, por conocer la capacidad
antioxidante de las terapias basadas en la medicina tradicional así como de los alimentos que
consumimos (Huang y col., 2005).
E
DISCUSIÓN
- 65 -
En la literatura, se informa el empleo de preparaciones galénicas obtenidas de plantas
que tienen efecto antiinflamatorio y especialmente, se enfatizan dentro de éstas a las que
tienen flavonoides en su composición química, los cuales al ser grupos polifenólicos,
presentan una gran capacidad antioxidante, dirigida fundamentalmente contra los radicales
hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de
peroxidación lipídica (Tsai y col., 2011). Tal es el caso de la tintura de salvia de playa
(Pluchea carolinensis Jacq) que ha mostrado propiedades antiinflamatorias en procesos
agudos y crónicos y en estudios fitoquímicos se aportó la presencia de glucósidos,
triterpenos, aceites esenciales, taninos y flavonoides (García y col., 2002).
La mayoría de las enfermedades presentan etapas inflamatorias y tanto la inflamación
como la reparación pueden ser potencialmente perjudiciales ya que subyacen en la génesis
de enfermedades crónicas que provocan morbilidad y/o mortalidad; numerosos
investigadores han buscado nuevos agentes antiinflamatorios derivados de la síntesis
química o del metabolismo de las plantas. Los AINE se encuentran entre los más utilizados,
en el año 2002 existían más de 50 fármacos diferentes de este tipo en el mercado y
continuamente surgen nuevas preparaciones. Todo esto hace suponer que ninguno de ellos
es ideal para el control o la modificación de los signos y los síntomas de la inflamación. Un
problema adicional es que prácticamente todos tienen efectos significativos no deseados,
sobre todo en pacientes de la tercera edad. Por lo que, un tratamiento ideal sería aquel que
disminuyera los signos de la inflamación, controlando sus secuelas perjudiciales (Pérez,
2002; Crotan y col., 1990).
Los flavonoides de numerosas especies de plantas han mostrado actividad
antiinflamatoria in vitro e in vivo, se ha visto que no son tan potentes en desórdenes agudos
pero son agentes terapéuticos potenciales en el tratamiento de la inflamación crónica y
producen menos efectos adversos que los tratamientos alopáticos. En cambio, los fármacos
esteroidales inhiben las manifestaciones inflamatorias agudas de enfermedades como la
fiebre reumática y la artritis reumatoide, sin embargo, tienen una utilidad limitada en la
DISCUSIÓN
- 66 -
prevención y curación de las inflamaciones crónicas como la artritis deformante,
valvulopatías crónicas y la dermatitis atópica (Kim y col., 2004).
Diversos mecanismos de acción han sido propuestos para explicar la acción
antiinflamatoria in vivo de los flavonoides aunque estos no se han comprendido
exactamente. Uno de sus importantes mecanismos de acción es la inhibición de las enzimas
que generan a los eicosanoides y están relacionadas con la funcionalidad de los vasos, tales
como la fosfolipasa A2, las COX’s y LOX’s, lo cual reduce las concentraciones de prostanoides
y leucotrienos, que están involucrados en variadas respuestas inmunológicas (Middleton y
Kandaswami, 1994; Nijveldt y col., 2001; Kim y col., 2004; Silva y col., 2005).
Estudios recientes también han mostrado que ciertos flavonoides, especialmente los
derivados de flavonas, expresan su actividad antiinflamatoria al menos en parte por la
modulación en la expresión de genes proinflamatorios como la COX-2, la iNOS y numerosas
citocinas (Kim y col., 2004). Estos compuestos, también inhiben a la cinasa de la tirosina
citosólica y membranal. Las proteínas integrales de membrana, como la cinasa de la tirosina
3-monooxigenasa, están involucrados en una variedad de funciones, tales como la catálisis
enzimática, de transporte a través de membranas, la transducción de señales que funcionan
como receptores de hormonas y factores de crecimiento, y la transferencia de energía en la
síntesis de ATP. La inhibición de estas proteínas resulta en la inhibición del crecimiento y la
proliferación celular descontrolada. Los sustratos de la cinasa de la tirosina parecen jugar un
papel clave en la ruta de transducción de señales que regula la proliferación celular (Nijveldt
y col., 2001).
Otra de las propiedades antiinflamatorias de los flavonoides, es su capacidad para inhibir
la desgranulación de los neutrófilos. Los neutrófilos que contienen LOX producen
compuestos quimiotácticos a partir del ácido araquidónico. Estas enzimas también provocan
la liberación de citocinas. Esta es una manera directa para disminuir la liberación de ácido
araquidónico por los neutrófilos y otras células del sistema inmune (Nijveldt y col., 2001).
DISCUSIÓN
- 67 -
Debido a los mecanismos de acción mencionados anteriormente y a la actividad
antiinflamatoria que han mostrado in vivo, los flavonoides se consideran como candidatos
potenciales para ser nuevos fármacos antiinflamatorios. Sin embargo, para establecer
claramente el valor terapéutico de los flavonoides en desórdenes inflamatorios y sus diversos
mecanismos de acción, estos metabolitos necesitan ser elucidados químicamente (Kim y col.,
2004).
Como parte de la investigación continua de nuevos derivados de las plantas como
agentes antiinflamatorios, se eligió a Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. árbol pequeño,
ampliamente distribuido a través de México, del cual existen estudios previos que
demuestran que el palo dulce tiene actividad citotóxica, antimicrobiana e insecticida,
antiurolitiásica, diurética y antiinflamatoria (Alvarez y col., 1998; Pérez y col., 2002; Salazar,
2007; Pablo, 2009). En dichos estudios, se resaltó su composición química, y se detectaron
diversos flavonoides, entre otros metabolitos secundarios. Por ende, se consideró
importante separar la fracción del extracto etanólico más rica en estos metabolitos por
considerarlos responsables del efecto antiinflamatorio.
El empleo de las plantas medicinales como materia prima, presenta grandes
inconvenientes, tales como el bajo rendimiento, la baja reproducibilidad de su actividad y el
riego potencial del impacto ambiental que puede causar su escasez. Adicionalmente, la
homogeneidad y características de los productos derivados de las plantas, pueden afectarse
debido a las variaciones que ocurren cada año e incluso en cada estación anual (Drago,
2007), por lo que en esta investigación, estos aspectos se consideraron desde la colecta de
la planta, y se tomaron en cuenta la estación, el lugar y las estructuras del árbol a estudiar
siguiendo los estudios realizados por Salazar (2007) y Pablo (2009).
La posibilidad de la acción enzimática que ocurre durante la maceración, que provoca la
hidrólisis de los glucósidos, se puede evitar sumergiendo el material vegetal en un disolvente
en ebullición o por un rápido secado antes de la extracción. El pre-secado del material
vegetal en general, parece aumentar el rendimiento de los extractos, posiblemente debido a
DISCUSIÓN
- 68 -
la ruptura de la estructura celular y como consecuencia un mejor acceso del disolvente
(Markham, 1975). Por esta razón, se realizó la metodología descrita previamente para la
preparación del extracto etanólico, además de ser la misma reportada por Pablo (2009).
Antes de la separación de los metabolitos a partir del extracto etanólico, se llevaron a
cabo pruebas las preliminares sencillas y rápidas que permitieron detectar cualitativamente,
la presencia de determinados grupos de compuestos. Esto se logró mediante las técnicas de
tamizaje, que se ayudan de la química para evidenciar estos grupos de constituyentes
mediante formación de precipitados, coloraciones, etc. Estas reacciones se caracterizan por
ser selectivas para las clases o grupos de compuestos que se investigan, son simples y
rápidas, detectan la mínima cantidad posible y utilizan un mínimo de equipo de laboratorio.
Los resultados negativos en estas pruebas, se pudo deber a la ausencia de los flavonoides, a
la selección errónea del disolvente para extraer o a la presencia de sustancias extrañas que
interfirieron a una concentración en el orden de trazas del compuesto ensayado (Domínguez,
1979).
A pesar de las diversas bioactividades de las plantas medicinales contra varias
enfermedades, los componentes activos de muchos extractos de plantas no han sido
extraídos de sus matrices naturales, analizados ni caracterizados a fondo debido a sus
complejas mezclas que contienen hasta cientos de diferentes ingredientes (Ajila y col.,
2011).
La técnica cromatográfica por filtración en gel sobre sephadex es un método que ha
sido utilizado por otros autores para la separación de los flavonoides y alcaloides (Moscatelli
y col., 2006; Wang y col., 2008; Orhan y col., 2007), debido a su alta reproducibilidad a micro
escala y a escala técnica, baja pérdida de sustancias, el relativo poco tiempo involucrado en
el proceso, además de que no requiere de equipo costoso. La filtración en gel es un método
flexible y por lo tanto, permite que sustancias muy inestables sean aisladas. La separación
ideal es en base al tamaño molecular, sin embargo, también ocurre el proceso de adsorción,
exclusivamente con los grupos hidroxilos libres de las agliconas (Markham, 1975).
DISCUSIÓN
- 69 -
Al emplear esta técnica, en la presente investigación, se logró separar una mezcla de
flavonoides, de bajo peso molecular. Sin embargo, debido a la poca cantidad obtenida de
cada una de las fracciones, se decidió utilizar una cromatografía en columna seca y así
obtener una mayor cantidad de las fracciones para ser evaluadas farmacológicamente. Lo
anterior, sugiere que el método de separación con sephadex se debe reproducir a fin de
analizar la actividad antiinflamatoria de estas fracciones y elucidar a fondo sus componentes
activos.
La DCC, tiene el mismo principio que una TLC, pero a gran escala. Es una técnica segura,
potente y más fácil que otras cromatografías. Se ha demostrado su utilidad en la
investigación, ya que ofrece un poder de separación comparable al de las técnicas más
modernas, pero es menos costosa al utilizar poco material, los disolventes y adsorbente
utilizados son baratos y seguros y no requiere de peligrosas columnas presurizadas
(Shusterman y col., 1997). Las desventajas encontradas fueron, el tiempo requerido para
remover la sílica gel de las fracciones, lo cual causó problemas en los microanálisis, y las
pérdidas por evaporación en el volumen de fase móvil y el lavado de las fracciones.
El modelo farmacológico que se empleó para evaluar la actividad antiinflamatoria de
Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. fue el modelo del granuloma (Márquez-Flores y col.,
2009) ya que éste permite la evaluación de la inflamación de tipo subcrónico o crónico,
caracterizada por la formación de un granuloma (Okoli y col., 2007).
Se considera que al introducir un agente extraño insoluble lo suficientemente grande
(pellet de algodón) en la axila de la rata, no se permitirá la fagocitosis, por lo tanto, habrá un
acumulo de células epitelioides y células gigantes que se superpondrán en la superficie y
rodearán al agente extraño, provocando un aumento del peso del pellet por la formación de
lo que se conoce como granuloma.
Se ha establecido que hay una correlación entre el peso en seco de los pellets y el tejido
granulomatoso. La respuesta de la implantación subcutánea del pellet de algodón en rata se
DISCUSIÓN
- 70 -
divide en tres fases: 1) una fase trasudativa (escape de líquido con un bajo contenido
proteico de densidad <1.02, glucosa similar a la glucemia, baja concentración de
deshidrogenasa láctica (LDH), con células sanguíneas del sistema vascular hacia el tejido
intersticial o cavidades corporales), se evidencia por el incremento en el peso húmedo del
granuloma y ocurre durante las primeras tres horas después de la inserción del pellet, 2) una
fase exudativa (escape de líquido con alta concentración proteica y de LDH, poca cantidad de
glucosa y abundantes detritus celulares, con una densidad superior a 1.02), que ocurre entre
las 3 y 72 horas después de la implantación (Leyva y Quezada, 2008). Durante esta, las cininas
son los principales mediadores del granuloma, ya que causan vasodilatación e incrementan la
permeabilidad vascular en etapas tempranas de la inflamación (Mujumdar y Misar, 2004). Y
3) la fase proliferativa que se evidencia por el aumento del peso seco del granuloma y ocurre
entre los 3 y 6 días después de la implantación del pellet (Pérez, y col., 2005; Intahphuak y
col., 2004; Crotan y col., 1990; Swingle y Shideman, 1972).
En el presente estudio sólo se evaluó la actividad antiinflamatoria de palo dulce en la
fase proliferativa de la inflamación. Este modelo, ha sido utilizado por otros autores
(Panthong y col., 2003; Intahphuak y col., 2004; Mujumdar y Misar, 2004; Pérez y col.,
2005; Okoli y col., 2007), para evaluar plantas con propiedades similares, debido a que el
modelo es práctico, económico, sencillo y sobretodo menos agresivo para los animales de
experimentación, comparado con otros modelos como es el caso de la inyección
subplantar de carragenina y ácido araquidónico utilizadas en estudios como los realizados
por Panthong y col., (2003), para evaluar la actividad antiinflamatoria de Clerodendrum
petasites S. Moore; el modelo del edema en la oreja de ratón inducida con TPA (12-O-
tetradecanoilforbol-13-acetato), en donde el efecto antiinflamatorio se evalúa utilizando un
micrómetro con el cual se mide el incremento en el tamaño de la oreja tras la administración
de la sustancia (Mujumdar y Misar, 2004); así como los métodos utilizados por Hu y col., (2005)
a saber, la inducción de la pleuresía de tórax en ratas con carragenina y el posterior
degollamiento de los animales para las tomas de muestra de la extravasación de fluidos, la
inducción del edema plantar y la artritis en ratas con carragenina.
DISCUSIÓN
- 71 -
La indometacina es un AINE que actúa sobre la cascada del ácido araquidónico
inhibiendo no selectivamente a la COX, lo cual suprime la formación de prostaglandinas y
TXA2, también inhibe la marginación, adhesión y migración de leucocitos, por lo que se
considera un potente agente antiinflamatorio con buena biodisponibilidad, motivo por el cual
se empleó como fármaco de referencia para evaluar la actividad antiinflamatoria del palo
dulce, tal como se hizo en otros estudios (Pérez y col., 2005; Paulino y col., 2006).
En un estudio reciente (Pablo, 2009), se demostró la actividad antiinflamatoria inducida
por el uso de los extractos acuosos (infusión y decocción a la dosis de 200 mg/kg de p.c.) y
etanólico (50 y 100 mg/kg de p.c.) de la corteza, tronco y hojas de palo dulce en el modelo del
granuloma, partiendo de este antecedente, se obtiene que aún reduciendo la dosis de 50 mg/kg
de p.c. del extracto etanólico, a 25 mg/kg de p.c. de las fracciones ricas en flavonoides se logra
el efecto antiinflamatorio, lo cual es importante debido a que hay un ahorro en la cantidad de
agente terapéutico necesario para llevar a cabo el mismo efecto que cuando se ocupa mayor
cantidad pero de extracto crudo. De acuerdo con los resultados, se puede sugerir que los
extractos poseen la capacidad de actuar en eventos proliferativos de formación de tejido
granulomatoso (Swingle y Shideman, 1972) y que además los flavonoides juegan un papel
muy importante en la disminución del proceso inflamatorio.
El efecto ulcerativo que presentan los AINE se debe a que su acción no es selectiva, ya
que además de inhibir a la enzima COX-2 presente únicamente cuando hay tejidos dañados o
inflamados, inhiben a la COX-1 de acción citoprotectora en las vías gastrointestinales (Smyth y
col., 2007). Al inhibir su producción, se impide la formación de moco gástrico, haciendo
susceptible al tracto gastrointestinal a los efectos del jugo gástrico.
La mucosa es una de las capas gástricas que está en contacto directo con la luz y por lo
tanto previene del daño que causan el ácido luminal, bacterias y otros agentes nocivos
(Baggio y col., 2007; Dayal y DeLellis, 1990), por lo que al realizar el análisis histológico se
enfocó la atención en esta capa.
DISCUSIÓN
- 72 -
El estudio histológico corroboró las observaciones obtenidas al inspeccionar los tejidos a
nivel macroscópico, ya que los tejidos de los animales tratados con indometacina, presentaron
discontinuidades en las capas gástricas y duodenales debidas probablemente a las propiedades
irritantes tópicas de los AINE que provocan la pérdida del control citoesquelético en las
uniones tight junction (Halter y col., 2001).
A nivel de estómago, además se observaron eritrocitos en las células fúndicas de la
mucosa, probablemente, debido a una hemorragia digestiva causada por la inhibición de la
producción de TX en plaquetas, asimismo, se observaron neutrófilos en la submucosa del
estómago, que es una capa de tejido conjuntivo laxo y elástico, que contiene numerosos vasos
sanguíneos. Se sabe, que debido a la inhibición de la formación de prostaglandinas por la
indometacina, existe un rápido y significante incremento en el número de neutrófilos
adheridos al endotelio vascular de las vénulas gástricas y mesentéricas, lo cual causa estasis
microvascular y daño a la mucosa por isquemia e incremento de radicales libres y proteasas
lo cual a su vez contribuye a la formación de erosiones y úlceras en el tracto GI (Halter y col.,
2001). A nivel de duodeno se observaron discontinuidades en el epitelio y/o ausencia de él,
además de la presencia de monocitos.
Estos resultados corroboran lo que informa la literatura sobre los efectos adversos de los
AINE, que al inhibir no selectivamente a la COX se impide la producción de todas las
prostaglandinas, inclusive las que actúan como citoprotectoras de la mucosa gástrica, a saber
PGI2 y PGE2 (lo cual explica los efectos adversos en la vías gastrointestinales aunque no de
manera exclusiva, como ya se comentó anteriormente), también se sabe que debido a la
irritación local que produce el fármaco puede haber una difusión retrógrada del ácido al
interior de la mucosa gástrica, que también induce el daño tisular (Burke y col., 2007). Cabe
destacar, que cuando se utilizaron las fracciones ricas en flavonoides a la dosis de 25 mg/kg de
p.c. no se observaron alteraciones en ninguna región de los tejidos gástricos ni duodenales.
Considerando que las fracciones ricas en flavonoides (25 mg/kg de p.c.) de
Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. inducen un efecto antiinflamatorio sin producir
DISCUSIÓN
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gastropatías, se puede sugerir que el probable mecanismo de acción sea la inhibición
selectiva de la COX-2, sin conducir a la inhibición de las prostaglandinas gastroprotectoras
(en particular PGI2 y PGE2), que inhiben la secreción ácida, mejoran la corriente sanguínea
en la mucosa, y estimulan la secreción de moco protector y la apoptosis. Además de que al
inhibir selectivamente la vía de la COX, no se desactivaría la ruta bioquímica a la vía de la
LOX, que al inhibirse parece también contribuir a la ulcerogenicidad, y probablemente, a
una mayor susceptibilidad a la infección por Helycobacter pylori (Leza y Lizasoain, 2004).
Otro factor que pudo haber contribuido a la protección de los epitelios gástricos, es la
producción de NO que aunque ejerce acciones fundamentalmente proinflamatorias: es un
potente vasodilatador, aumenta la permeabilidad vascular e incrementa la síntesis de
prostaglandinas proinflamatorias en respuesta a la estimulación por citocinas; también tiene
acciones antiinflamatorias, ya que si se libera de las células endoteliales, inhibe la
adherencia de neutrófilos y la agregación plaquetaria y además posee acciones
gastroprotectoras al aumentar el flujo sanguíneo de la mucosa, regula la motilidad gástrica,
la secreción de moco y ácido e inhibe las actividades de los neutrófilos (aunque no se sabe
claramente como ocurre) (Rang y col., 2004).
Asimismo, los propios flavonoides de la corteza de palo dulce pudieron haber
contribuido a la protección del epitelio gástrico ya que existen estudios que indican que
dichos metabolitos poseen la capacidad de inhibir con alta potencia la actividad de las
bombas de H+ y K+ - ATPasa presentes, responsables de la producción de la secreciones
ácidas del estómago (Baggio y col., 2007). Los flavonoides de las fracciones, probablemente,
también mostraron su primer defensa antioxidante en el tracto gastroduodenal, al limitar la
formación de las ROS y neutralizarlas para evitar más daño (Pietta, 1999).
Estudios previos señalan que los terpenoides tienen actividad gastroprotectora, debido a
que refuerzan los factores defensivos de la mucosa gástrica, como la regulación del flujo
sanguíneo, que de no ser adecuado contribuye al desarrollo de hemorragias y lesiones
necróticas (Ishikawa y col., 2008). Los taninos y triterpenos también han mostrado potente
DISCUSIÓN
- 74 -
actividad antiulcerogénica. Cabe destacar que en el análisis fitoquímico del extracto
etanólico, a partir del cual se obtuvieron las fracciones, se detectaron saponinas
triterpenoides y taninos que pueden contribuir al efecto antiulcerogénico.
La distribución de los polifenoles en las plantas varía en gran medida entre las especies
dentro de un mismo género, por las prácticas de cultivo, las condiciones climáticas y las
edáficas, las condiciones de colecta, el almacenamiento y las preparación de los extractos
(Kim y col., 2003; Heimler y col., 2010), por ende, es necesaria la información sobre la
composición de los polifenoles y la actividad antioxidante de la variedad recolectada de palo
dulce.
Es por este motivo, que parte de los objetivos de este trabajo fue profundizar en el
análisis cuali-cuantitativo de los polifenoles: obtener sus perfiles cromatográficos, cuantificar
a los fenoles y flavonoides totales, y evaluar su potencial antioxidante in vitro, lo cual
constituye el punto de partida para posteriores estudios de citotoxicidad y actividad
antioxidante mediada por flavonoides y para relacionar estos resultados con las actividades
farmacológicas que han sido demostradas previamente.
En una revisión de los diversos métodos espectrofotométricos para la determinación de
los fenoles totales, se recomendó el ensayo de FC, como el más conveniente (Escarpa y
Gonzalez, 2001). Por esta razón, se decidió usarlo en la determinación de los fenoles
presentes en los extractos de E. polystachya.
El ensayo de FC tiene ventajas notables sobre otros ensayos basados en la TE, como son:
que el reactivo de FC está disponible comercialmente y el procedimiento está estandarizado,
la λ de absorción del cromóforo a 730 nm minimiza las interferencias de la matriz de las
muestras, ya que frecuentemente poseen color, el ensayo es comúnmente aceptado y se
realiza rutinariamente en laboratorios de todo el mundo, es sencillo, requieren de poco
equipo y ha producido una gran cantidad de datos que se pueden comparar, reportados
DISCUSIÓN
- 75 -
como contenido de fenoles totales en lugar de la capacidad de reducción del reactivo de FC
(Huang y col., 2005).
Bajo condiciones adecuadas, el ensayo incluye a los monofenoles y da reacciones
predecibles con los tipos de fenoles encontrados en la naturaleza. Debido a que los fenoles
son diversos y reaccionan en diferente grado, la expresión de los resultados como un único
número como equivalentes de un estándar es arbitraria. Debido a que la reacción es
independiente, cuantitativa y predecible, el análisis de una mezcla de fenoles se puede
recalcular en términos de cualquier otro estándar, razón por la cual, en esta investigación se
utilizaron el ácido gálico y la quercetina como estándares (Singleton y col., 1999).
Numerosas publicaciones sobre antioxidantes, reportaron excelentes correlaciones entre
el contenido de fenoles totales (cuantificados por el reactivo de FC) y la actividad
antioxidante (medida por los ensayos de FRAP, TEAC, VCEAC o DPPH•) (Kim y col., 2003; Tsai
y col., 2011). Sin embargo, debido a que estos ensayos están basados en reacciones redox
similares, es redundante realizar una multitud de ensayos que cuantifiquen la capacidad de
reducción de un antioxidante o mezcla de estos, pero es importante emplear ensayos que
sean comúnmente aceptados y validados (Huang y col., 2005). Por tal motivo, es este trabajo
se realizaron sólo dos ensayos que evaluaron la capacidad antioxidante de los extractos
analizados, el de FC y el de DPPH•, ya que estos se basan en el mecanismo de TE.
La necesidad de cuantificar a los flavonoides en productos naturales, es cada vez más
frecuente, ya que estos datos permiten correlacionarlos con su alto potencial farmacológico.
La cuantificación de flavonoides se ha realizado mediante ensayos de TLC, análisis
colorimétricos, GC, GC acoplada a masas y HPLC. Aunque, los métodos por GC y HPLC
aportan información definitiva en la caracterización de las muestras presentan limitaciones
importantes debido a los costos del equipamiento y la participación de personal con
formación específica en el área instrumental (Salamanca y col., 2007). En cambio, los
DISCUSIÓN
- 76 -
métodos espectrofotométricos permiten cuantificar flavonoides con estructuras similares,
aunque presentan limitaciones en la sensibilidad y especificidad.
Las flavonas y flavonoles (3,5-hidroxiflavonas y 3,5-hidroxiflavonoles), desde el punto de
vista reactivo, forman complejos amarillos estables con el AlCl3 y son susceptibles de
analizarse mediante espectrofotometría de UV/Vis; entre tanto, los grupos hidroxilo en la
posición C5 de las flavanonas y flavanonoles reaccionan mejor con la 2,4-dinitrofenilhidrazina
(Chang y col., 2002). En este estudio se utilizó la técnica de quelación con AlCl3 porque
además de cuantificar a los flavonoides, aporta la evidencia de que los extractos del palo
dulce también actúan como antioxidantes al quelar metales; y se utilizó al flavonol
quercetina como estándar, porque la presencia del grupo catecol tiene una gran contribución
en la quelación de metales, que se evidencia por la producción de un mayor efecto
batocrómico que cuando no existe ese grupo (Pietta, 1999).
Estudios previos de extractos de plantas de la familia Fabaceae y en particular tres
especies del género Eysenhardtia (no se estudió la especie polystachya), disminuyen el estrés
oxidativo e incrementan la actividad de diversos componentes del sistema antioxidante
endógeno, en particular la GSH, las vitaminas C y E, la SOD, la GSHPx y la CAT (Narváez-
Mastache y col., 2007).
En el presente estudio se evaluó la capacidad antioxidante de la infusión y decocción de
las hojas y corteza, el extracto etanólico y las fracciones ricas en flavonoides del palo dulce,
ya resulta interesante conocer si el retraso o la inhibición de la oxidación ejercida por los
polifenoles y en particular por los flavonoides y sus metabolitos, es un mecanismo por el cual
estos extractos coadyuven en la disminución de la inflamación in vivo y en el daño tisular en
la zona de inflamación, así como, que protejan el tracto GI.
Para evaluar la actividad antioxidante in vitro, se usó el método del DPPH• por ser
comúnmente usado para evaluar la habilidad captadora de radicales libres de tratamientos
DISCUSIÓN
- 77 -
herbales, por su exactitud y reproducibilidad, además de que el reactivo está disponible
comercialmente en su forma de radical y no se forma in situ como en otros ensayos, lo que
hace al ensayo simple y estable en las condiciones trabajadas (Tsai y col., 2011).
Los resultados de las cuantificaciones, no mostraron inter-relaciones entre el incremento
de fenoles y flavonoides totales con la actividad antioxidante al reducir al DPPH•, lo cual se
debe a la presencia o ausencia de grupos hidroxilo de los fenoles y en particular de los
flavonoides, en los diferentes extractos analizados, en la posición adecuada para ser capaces
de donar electrones o quelar aluminio (Xu y col., 2010).
En el caso de la capacidad de reducción del reactivo de FC o llamada también
cuantificación de fenoles, hay que considerar que los fenoles simples o monofenoles también
reaccionan con el reactivo de FC aunque estos no son antioxidantes al captar a los radicales
libres y por lo tanto, no se esperaba necesariamente una correlación entre el contenido de
fenoles totales y la capacidad antioxidante de las muestras por el mecanismo de captar
radicales libres. Por lo anterior y para evitar confusiones en la interpretación de resultados
bajo el nombre de “contenido de fenoles totales”, se sugiere usar el término de capacidad de
reducción del reactivo de FC (Huang y col., 2005; Heimler y col., 2010).
Con respecto a la cuantificación de los flavonoides y la actividad antioxidante al reducir
al DPPH•, se sabe que en general, la presencia del grupo catecol en el anillo B y el grupo 3-y
5-hidroxilo en el anillo heterocíclico de los flavonoides incrementa su actividad como
captadores de radicales libres mientras que la glicosilación la reduce notablemente
(Martínez-Flores y col., 2002; Pietta, 1999).
En el caso de la ausencia de la actividad antirradicalar de algunos extractos, no quiere
decir que estos no sean antioxidantes por otros mecanismos, como la quelación de iones
metálicos para prevenir la iniciación de la formación de los radicales libres, la inhibición de la
oxidación lipídica, la inhibición de las enzimas que forman a los radicales libres y la extinción
DISCUSIÓN
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de estos (Kim y col., 2003). Asimismo, el hecho de que se haya detectado una alta actividad
antirradical con un contenido bajo de fenoles y flavonoides, conduce a especular que la
actividad antirradicalar está mediada por otras sustancias que no fueron detectadas en las
pruebas de cuantificación.
Por varias razones, es conveniente utilizar un ensayo que mida a la vez más de un
parámetro de la actividad antiinflamatoria. En primer lugar, hay confusión sobre lo que se
entiende por el término "antiinflamatorio" ya que hay que recordar que existen cinco signos
locales de la inflamación y un agente terapéutico puede actuar disminuyendo uno o más de
ellos. Además, una evaluación simultánea de un fármaco o extracto vegetal contra la
inflamación aguda y proliferativa proveería más información para predecir qué tipos de
enfermedades se pueden tratar con el agente terapéutico en cuestión. También, es
importante considerar que el conocimiento del efecto de un agente farmacológico o la falta
de efecto en más de un parámetro de actividad antiinflamatoria podrían dar pistas sobre su
mecanismo de acción.
Puesto que en la actualidad, ningún ensayo que evalúe la actividad antiinflamatoria es
totalmente satisfactorio para predecir si el agente terapéutico en cuestión es potencialmente
útil, para la evaluación de la eficacia del medicamento es deseable la inclusión de más
parámetros ya sea en el mismo o en ensayos adicionales (Swingle y Shideman, 1972). Por lo
que queda abierta la necesidad de continuar con la investigación de esta especie.
De acuerdo a los resultados obtenidos, el presente estudio avala el uso de las fracciones
ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. en el tratamiento de la
inflamación crónica granulomatosa, según el modelo del granuloma, sin producir efectos
ulcerogénicos, característica clínica deseable en los fármacos antiinflamatorios, además de
que su empleo es inocuo a nivel sistémico con un margen de seguridad amplio (la DL50 del
extracto etanólico fue mayor de 32 g/kg de p.c.) (Pablo, 2009). Además, el palo dulce, es una
fuente rica de compuestos antioxidantes naturales con capacidad para quelar metales y
reducir a los radicales libres in vitro.
CONCLUSIONES
- 79 -
9. CONCLUSIONES
as fracciones ricas en flavonoides de Eysenhardtia polystachya (Ort.) Sarg. indujeron
actividad antiinflamatoria y no provocaron alteraciones morfológicas ni histológicas.
Se obtuvieron y cuantificaron a los fenoles y flavonoides totales en los extractos y
fracciones analizadas de Eysenhradtia polystachya (Ort.) Sarg., asimismo, se demostró la
capacidad antioxidante de los extractos.
La cantidad de fenoles y flavonoides totales no tuvieron una relación directa con la
capacidad antioxidante de los extractos.
Se sugiere que el probable mecanismo de acción de los flavonoides presentes en las
fracciones evaluadas farmacológicamente en el modelo del granuloma sea la inhibición
selectiva de la COX-2.
L
PERSPECTIVAS
- 80 -
10. PERSPECTIVAS
or lo anterior, este estudio es un antecedente para que se continúe con la investigación
de esta planta medicinal en otros modelos de inflamación, así como aquellos que
midan la capacidad antioxidante in vivo, para establecer sus mecanismos de acción y en un
futuro, se considere como materia prima en la creación de un fitofármaco con propiedades
antiinflamatoria, diurética, antiurolitiásica y antioxidante.
Asimismo, una vez que se haya demostrado la eficacia de los flavonoides, se produzcan
estos metabolitos mediante ingeniería genética para incrementar el rendimiento y se cree
un medicamento.
P
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11. REFERENCIAS
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APÉNDICES
- 91 -
12. APÉNDICES
APÉNDICE 1 Resultados del análisis fitoquímico preliminar (Domínguez, 1979) A. Alcaloides
Reactivo Precipitado
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Dragendorff Naranja - - - - +
De Mayer Blanco o
amarillento - - - - -
De ácido silicotúngstico
Blanco amarillento
- - - - -
De Sonnenschain
Amarillo o azul verde
(grupo amino reductor)
- - - - -
De Wagner Café naranja - - - - -
B. Azúcares reductores
Reactivo Precipitado
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Fehling Naranja a rojo
ladrillo + +++
- (blanco)
- ++++
De Benedict Naranja a rojo
ladrillo ++ ++++ - - +++
C. Cumarinas
Reactivo Coloración teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Erlich Naranja + + + + +++
Con NH4OH conc.
Fluorescencia azul - violeta
- - - - +
APÉNDICES
- 92 -
D. Flavonoides
Reacción Coloración
teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
1. De Shinoda (HCl conc.)
auronas o chalconas
Roja - - - - -
adición de Mg0
flavonas Naranja a rojo + + + + +
Flavonoles Roja - - - - -
Flavononas Magenta - - - - -
2. Con NaOH al 10%
Xantonas y Flavonas
Amarillo- rojo -
Flavonoles Café - naranja + + + + +
Chalconas Púrpura- rojizo - - - - -
Antocianinas Azul - - - - -
E. Glucósidos cardiacos
Prueba Coloración
teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Kedde De azul a
violeta - - - - -
De Legal Roja poco
estable + + + + +++
De Baljet Varía del
naranja a rojo oscuro
+ + + + +++
F. Glucósidos cianogenéticos
Reacción Color teórico de la mancha
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Gignard Rosa a rojo - - - - -
APÉNDICES
- 93 -
G. Saponinas
Reacción Coloración
teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
De Liebermann Buchard
Saponinas esteroidales
Azul o verde en la interfase
- - - - -
Saponinas triterpenoides
Rosa, roja, magenta o
violeta - - - -
+ (rojo)
De Rosenthaler (saponinas
triterpenoides) Violeta + +
- (amarillo)
- (amarillo)
++
H. Sesquiterpenlactonas
Reacción Coloración
teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
Con hidroximato
férrico
Roja, violeta o rosa
- - - - -
I. Taninos
Reactivo Precipitado o color teórico
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
1. Reactivo de gelatina
Precipitado blanco
- - +++ +++ +
2. Reactivo de FeCl3 al 1%
Derivados del ácido gálico
Coloración azul a negro
+ + ++ ++ +++
Derivados del catecol
Coloración verde
- - - - -
Adición de K4[Fe(CN)6] al 1%
(compuestos fenólicos)
Coloración azul
+ + + + +
APÉNDICES
- 94 -
J. Quinonas
Reacción Coloración
teórica
RESULTADO
Infusión corteza
Decocción corteza
Infusión hojas
Decocción hojas
Extracto etanólico
1. Con NH4OH conc.
(antraquinonas)
Roja que aparece en los
primeros 2 minutos
+ + + + +++
2. Con H2SO4 conc.
(antraquinonas) Roja - - - - ++
3. De Börntraguer
Benzoquinonas Roja - - - - +
Con H2O2 al 6% (derivados de
antraquinonas) Roja - - - - +
APÉNDICES
- 95 -
APÉNDICE 2
Validación estadística del método de cuantificación de fenoles totales
La mezcla de reacción, es decir, la reducción de los óxidos de molibdeno presentes en
el reactivo de FC por la quercetina y el ácido gálico, generó una meseta cuando absorbió la
luz visible (Chun y Kim, 2004) y mostró su λ máxima en 760± 5 nm, motivo por el cual se
empleó esta λ para la cuantificación de los fenoles totales de las muestras (Figura 26).
Figura 26. Espectro de UV/Vis de la reducción de MoO4+ a MoO3+ del reactivo de FC en medio
básico.
La curva tipo que se obtuvo usando ácido gálico como estándar se muestra en la figura
27 y como se puede observar la recta tiende a la linealidad hasta una concentracción de
6.25 μg/mL ya que después de este punto de la curva de calibración se genera una meseta
(no mostrada). Como se puede apreciar en la figura 27, existe una ligera depleción de las
absorbencias en las concentraciones 1.56 y 2.08 μg/mL, sin embargo, aún considerando
estas concentraciones, la r2 es significativa. Los parámetros de desempeño de la correlación
entre la concentración del ácido gálico como estándar y la absorbencia del MoO3+ se
muestran en la tabla 7.
APÉNDICES
- 96 -
Figura 27. Curva de calibración de los fenoles totales usando al ácido gálico como estándar
El método es lineal, pero poco sensible ya que el ángulo de inclinación de la pendiente
(S) es de 17.4°, y el I.C. 95%, b no incluye el cero por lo tanto si hay una correlación entre las
concentraciones trabajadas y la absorbencia obtenida, el I.C. 95%, a tampoco incluye el cero lo
cual es razón suficiente para realizar el método de las adiciones para corroborar si hay o no
efecto de la matriz, pero debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho
propósito se optó por utilizar el método que se describió anteriormente.
De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en términos de
absorbencias es de 0.0750 a 0.5776 (Tabla 7).
Concentración de ácido gálico (ug/mL)
0 1 2 3 4 5 6 7
Absorb
ancia
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
APÉNDICES
- 97 -
Tabla 7. Parámetros de desempeño del método para cuantificar los fenoles totales usando al
ácido gálico como estándar
Parámetro Valor
YB -0.0516
S 0.0981
r2 0.9888
N 26
ángulo de la pendiente 17.4 °
Sy/x 0.0211
Sa 0.0078
Sb 0.0021
I.C. 95%, a -0.0677<-0.0516<-0.0355
I.C. 95%,b 0.0938<0.0981<0.102
L.D. 0.0117
L.C. 0.1594
L.d. 0.0750
Syc* 0.5454<0.5615<0.5776
La curva tipo que se obtuvo usando a la quercetina se muestra en la figura 28 y como se
puede observar la recta tiende a la linealidad hasta una concentracción de 6.25 μg/mL ya
que después de este punto de la curva de calibración se genera una meseta (no mostrada).
Los parámetros de desempeño de la correlación entre la concentración de la quercetina y la
absorbencia del MoO3+ se muestran en la tabla 8.
APÉNDICES
- 98 -
Gráfica 28. Curva de calibración de los fenoles totales usando a la quercetina como estándar
El método para la cuantificación de fenoles totales es lineal independientemente del
estánadr utilizado, pero es más sensible cuando se utiliza quercetina ya que el ángulo de
inclinación de S es de 22.2° mientras que cuando se utiliza ácido gálico es de 17.4°, el I.C. 95%,
b no incluye el cero, por lo tanto, hay una correlación entre las concentraciones trabajadas y
la absorbencia obtenida, el I.C. 95%, a no incluyó al cero, lo cual es razón suficiente para
realizar el método de las adiciones para corroborar si hay o no efecto de la matriz, pero
debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho propósito se optó por
utilizar el método que se describió anteriormente.
De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en términos de
absorbencias es de 0.1469 a 1.0253, lo cual se tomó en cuenta para que las absorbencias de
las muestras cayeran en ese intervalo y los resultados fueran confiables (Tabla 8). Cabe
destacar que el intervalo de trabajo en términos de absorbencias, en más amplio cuando se
emplea a la quercetina como estándar, sin embargo, la mayoría de las publicaciones
reportan la cantidad de fenoles totales en base a equivalentes de ácido gálico.
Concentración de quercetina (ug/mL)
0 1 2 3 4 5 6 7
Absorb
ancia
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
APÉNDICES
- 99 -
Tabla 8. Parámetros de desempeño del método para cuantificar los fenoles totales usando a la quercetina como estándar
Parámetro Valor
YB -0.0361
S 0.1661
r2 0.9919
N 26
ángulo de la pendiente 22.2°
Sy/x 0.0305
Sa 0.0113
Sb 0.0031
I.C. 95%, a -0.0594<-0.0361<-0.0128
I.C. 95%,b 0.1597<0.1661<0.1725
L.D. 0.0554
L.C. 0.2689
L.d. 0.1469
Syc* 0.9787<1.0020<1.0253
APÉNDICES
- 100 -
APÉNDICE 3
Validación estadística del método de cuantificación de flavonoides totales
La quercetina (flavonol) a una concentración de 10 μg/mL exhibió su máximo pico de
absorción en los 255 nm, y desniveles en los 269, 301 y 371.8 nm, tal como lo indica la
literatura. En tanto que la mezcla de reacción, es decir, el complejo de coordinación
formado por la quercetina y el aluminio, mostró su pico máximo en los 440.4 nm, motivo
por el cual se empleó esta λ para la cuantificación de los flavonoides totales de las muestras
(Figura 29).
Figura 29. Efecto de la quelación del alumnio sobre el espectro de UV/Vis de la quercetina. En
rojo se observa el desplazameinto batocrómico y el efecto hipercrómico de los máximos de
absorción comparados con el espectro de la quercetina
La curva tipo que se obtuvo usando quercetina como estándar se muestra en la gráfica
30 y como se puede observar, la recta es lineal en el intervalo de concentraciones
trabajadas Los parámetros de desempeño de la correlación entre en la concentración del
quercetina como estándar y la absorbencia del complejo formado se muestran en la tabla 9.
APÉNDICES
- 101 -
Gráfica 30. Curva de calibración de los flavonoides totales
El método es lineal, pero poco sensible ya que el ángulo de inclinación de S es de 20.9° y
el I.C. 95%, b no incluyó al cero, por lo tanto, hay una correlación entre las concetraciones
trabajadas y la absorbencia obtenida, el I.C. 95%, a no incluyó al cero, lo cual es razón
suficiente para realizar el método de las adiciones para corroborar si hay o no efecto de la
matriz, pero debido a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo dicho propósito se
optó por utilizar el método que se describió anteriormente.
De acuerdo a los valores de L.D., L.C. y L.d., el intervalo de trabajo en términos de
absorbencias es de 0.0911 a 1.0767.
Concentración de quercetina (ug/mL)
0 2 4 6 8
Absorb
ancia
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
APÉNDICES
- 102 -
Tabla 9. Parámetros de desempeño del método de cuantificación de los flavonoides totales
Parámetro Valor
YB -0.0451
S 0.1464
r2 0.9967
N 14
ángulo de la pendiente 20.9°
Sy/x 0.0227
Sa 0.0109
Sb 0.0024
I.C. 95%, a -0.0689<-0.0451<-0.0213
I.C. 95%,b 0.1412<0.1464<0.1516
L.D. 0.0230
L.C. 0.1819
L.d. 0.0911
Syc* 1.0291<1.0529<1.0767
APÉNDICES
- 103 -
APÉNDICE 4
Validación del método de evaluación del potencial antioxidante in vitro DPPH•
Al realizar el espectro de absorción de luz visible del DPPH• se obtuvo que el pico
máximo, bajo nuestras condiciones de análisis se encuentra en 514 nm, el cual está dentro
de lo que reporta la literatura (Molyneux, 2004) (Figura 31).
Figura 31. Máximo de absorción del radical estable DPPH• a 514 nm.