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DESARROLLO Y APLICACIÓN DE SONDAS MOLECULARES
FOTOACTIVAS PARA ESTUDIOS DE LINAJE CELULAR
Tesis de Licenciatura en Ciencias Biológicas
Tesista: Josefina Inés del Mármol
Director: Dr.Roberto Etchenique
Laboratorio de Dispositivos Moleculares
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Buenos Aires, junio de 2009
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1. RESUMEN
En este trabajo se describe la síntesis y caracterización de una sonda fluorescente a base de un complejo polipiridínico de rutenio y su utilización como compuesto enjaulado en experimentos biológicos.
Se planteó como hipótesis la posibilidad de generar sondas con fluorescencia modulable a través de la coordinación a centros metálicos, y que tales sondas resultan de utilidad en ensayos biológicos. El objetivo consistió entonces en la síntesis de una sonda consistente en un centro de Rutenio-Bipiridina capaz de absorber luz en el rango visible y fotodisociar el ligando monodentado. El ligando monodentado es un derivado del pigmento comercial Rodamina B, derivatizado a través del agregado de un grupo nitrilo para su coordinación.
La funcionalidad del compuesto consiste en que el ligando fluorescente se halla quencheado mientras está coordinado al centro de rutenio (mostrando baja emisión fluorescente), y luego de la fotodisociación aumenta significativamente su emisión. Esto convierte al complejo en un switch de fluorescencia off-on, activable por pulsos de luz visible y de alta resolución espacial.
La caracterización química del complejo incluye el espectro de resonancia magnética nuclear y los espectros de emisión UV-visibles.
Para la caracterización biológica se eligieron dos modelos: microinyección en neuronas Retzius de sanguijuela mediante un micromanipulador y utilizando microscopía de fluorescencia; y tansporte vascular en plántulas de Arabidopsis thaliana utilizando microscopía confocal.
En ambos casos se investigó la toxicidad de la sonda: en el primer caso se evaluó el patrón de disparo y la morfología de las neuronas Retzius; y en el segundo, la morfología y crecimiento de las plántulas. Como resultado, ninguno de estos parámetros fue alterado significativamente luego del tratamiento, indicando que el compuesto es apto para ensayos biológicos. Se estudió también el comportamiento difusional, encontrándose en primer lugar que tanto el complejo sintetizado como el ligando fotoliberado son confinados al contenido intracelular en las neuronas Retzius luego de la microinyección. Por otra parte, ambos son incapaces de ingresar al contenido celular cuando son transportados de forma extracelular en la plántula. Ambas evidencias apuntan a que la membrana resulta impermeable al complejo y al ligando.
Por último, se evaluó el funcionamiento del compuesto en los modelos biológicos, encontrándose que el pigmento conserva las características químicas observadas cuando es sometido a un medio fisiológico.
Palabras clave: sondas fluorescentes-compuestos enjaulados-complejos de rutenio-
rodamina-quenching-neuronas Retzius de sanguijuela-Arabidopsis thaliana
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2. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el grado de avance de las investigaciones en fisiología y biología
celular requiere de un desarrollo paralelo de herramientas tecnológicas, diseñadas
específicamente según las necesidades de la investigación en curso. La tarea de diseñar
estas herramientas (que pueden ser sondas moleculares, dispositivos de evaluación celular,
diversas microscopías, etc) requiere del conocimiento tanto del problema que se quiere
investigar, como de las características de la muestra en estudio. Entre las precauciones con
las que se enfrenta el problema resulta fundamental garantizar la menor invasividad del
método (incluyendo una baja toxicidad, si se manipula células o tejidos vivos), la mayor
precisión en tiempo y espacio y la mayor versatilidad posible.
En el marco de este desarrollo se emplea desde hace algunos años (Barltrop1966;
Kaplan 1978) un tipo de compuestos que permite la liberación selectiva de moléculas de
interés sobre preparados biológicos, llamados “compuestos enjaulados” (Walker 1986).
2.1. Compuestos enjaulados
Los compuestos enjaulados son moléculas que se utilizan en preparaciones
biológicas para liberar concentraciones efectivas de una sustancia dada en regiones
submicrométricas y en intervalos de tiempo del orden de los microsegundos o menores
(Adams 1993; Eder 2002). En el caso más simple están formados por dos fragmentos, una
molécula biológicamente activa y una “jaula” o grupo protector, con la capacidad de unirse
reversiblemente. El funcionamiento esquemático del sistema consiste en que cuando ambas
partes se encuentran unidas la biomolécula pierde su actividad biológica. Mediante un
estímulo determinado, generalmente lumínico, la unión entre ambas moléculas se rompe y
la biomolécula se libera, recuperando su actividad.
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La historia de los compuestos enjaulados incluye ya una amplia y diversa gama de
moléculas que permite teóricamente el enjaulado de prácticamente cualquier biomolécula
de interés (Patchornik 1970, Wilcox 1990, Walker 1986). El desafío en los últimos años ha
sido explorar diferentes grupos protectores para afinar sus propiedades en cuanto a
precisión, toxicidad y eficiencia.
El primer experimento biológico que incluyó la utilización de un compuesto
enjaulado activado por luz corresponde al año 1978 (Kaplan 1978). El experimento en
cuestión se trataba de la estimulación de la función muscular usando el liberador de ATP
que se muestra en la figura 1, y hacía uso del enlace débil entre el tercer fosfato del
nucleótido y un carbonilo fotorremovible.
Figura 1. Esquema de la reacción de fotodisociación de ATP enjaulado.
Las siguientes versiones de la técnica aprovecharon la reactividad de los grupos
carboxilo (y su ubicuidad en las biomoléculas de interés) para su protección, utilizando
grupos 2-nitrobencilo y 2-nitrofenetilo como fragmentos fotolábiles (McCray 1989). A
partir de este modelo se enjauló una enorme variedad de moléculas de interés biológico
como neurotransmisores, aminoácidos y segundos mensajeros. Estos intentos datan de las
décadas del ochenta y noventa, y vinieron de la mano de los fuertes avances técnicos que se
desarrollaron en el campo de la neurobiología (Kiskin 2002, Fitzsimons 1998, Wessel
1999).
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Si bien estos compuestos mostraron la potencialidad de la técnica y fueron de gran
utilidad en una variedad de estudios, presentan algunas desventajas fundamentales que
limitan su uso en preparaciones biológicas. En primer lugar, los enlaces fotolábiles que
estos compuestos emplean absorben luz por debajo de los 350 nm. Esto implica la
irradiación de la muestra con luz ultravioleta para lograr la liberación, y resulta indeseable
por sus conocidos efectos citotóxicos (Kaplan 1978). Por otra parte, muchos de estos
grupos presentan baja estabilidad en solución acuosa, limitando el espacio temporal durante
el cual puede desarrollarse el experimento. Estas limitaciones motivaron la búsqueda de
nuevos grupos protectores, que permitieran la liberación con fotones menos energéticos
(usando longitudes de onda más largas) y resultaran más inertes en ausencia de luz, y por lo
tanto más estables. Esta búsqueda condujo a la utilización de compuestos de coordinación
como jaulas, un desarrollo que amplió las posibilidades funcionales de la técnica y la
capacidad de modulación de las características deseadas (Zayat 2006).
2.2. Compuestos de Coordinación
Los compuestos de coordinación son moléculas en las que un metal establece
interacciones electrostáticas con ligandos que se disponen a su alrededor. Uno de los
metales comunmente usados como centro de coordinación es el Rutenio en estado de
oxidación II. El Ru es un metal de transición del grupo del Fe que puede formar un
complejo hexacoordinado octaédrico. Esas seis posiciones pueden ser ocupadas por seis
ligandos iguales o distintos, o bien por ligandos en los que alguno de ellos esté coordinado
por más de un posición (ligando polidentado) (Cotton 1999). Los grupos que coordinan
bien al rutenio son grupos electrodonantes como aminas, nitrilos y heterociclos como la
piridina.
En la figura 2 se muestra el espectro de absorción de un típico complejo de esta
clase, el [Ru(bpy)2(Py)2]2+, en el que dos bipiridinas ocupan las posiciones 1-2 y 3-4
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(ligandos polidentados) y dos piridinas ocupan la 5ta y 6ta posición (ligandos
monodentados).
Figura 2. Espectro de absorción UV-visible del complejo [Ru(bpy)2(Py)2]2+.
La banda de absorción a 450 nm se debe a la transición MLCT (transferencia de
carga metal-ligando, por sus siglas en inglés), por la cual la carga electrónica se transfiere
parcialmente del metal al ligando. El nuevo estado excitado puede presentar diversas
relajaciones. Cuando su energia es suficiente se puede poblar otro estado excitado en el
cual la carga electronica está principalmente centrada en el metal central (MC o estado d-d)
que al ser no enlazante respecto de los ligandos conduce a la disociación de estos (Pinnick
1984). Los ligandos monodentados suelen ser los más fotolábiles; en el caso del complejo
mostrado, los ligandos monodentados son las piridinas.
Este fenómeno de disociación de ligandos monodentados luego de la absorción es el
que fue explotado en los últimos años para el diseño de compuestos enjaulados (Zayat
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2003, Rial Verde 2008). Un ejemplo es el complejo [Ru(bpy)2(Nicotina)2]2+ en donde las
posiciones 1-2 y 3-4 coordinan bipiridinas (ligandos bidentados), y la 5ta y 6ta coordinan
dos Nicotinas, que coordinan a través de nitrógenos aromáticos (Salierno 2009). Al ser
expuesto a una fuente de luz visible de alrededor de 450 nm este compuesto se fotoliza y
libera uno de sus ligandos monodentados, en este caso Nicotina. Esta molécula resulta así
un liberador ideal de Nicotina ya que en ausencia de luz el complejo es muy inerte. En el
producto de reacción, el lugar de la Nicotina saliente es ocupado por una molécula de
solvente (agua). El espectro de absorción UV-visible del compuesto sometido a fotólisis
durante 10 minutos, obteniéndose [Ru(bpy)2(Nicotina)(H2O)]2+ en el proceso, puede verse
en la figura 3 (Salierno 2009).
Figura 3. Espectros de absorción UV-visible del complejo [Ru(bpy)2(Nicotina)2]2+ (línea azul, previo a la
fotólisis) durante una irradiación de 10 minutos, dando como producto [Ru(bpy)2(Nicotina)(H2O)]2+
(línea rosa, luego de la fotólisis).
El espectro muestra la banda de absorción de transición metal-ligando (MLCT) del
complejo [Ru(bpy)2(Nicotina)2]2+ con máximo en 457 nm, mientras que la del producto de
fotólisis [Ru(bpy)2(Nicotina)(H2O)]2+ se encuentra desplazada hacia longitudes de onda
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menos energéticas (máximo en 473nm). Este corrimiento se debe a que ligando aceptor π
(nicotina) que estabiliza el estado formal Ru(II) es cambiado por un ligando dador sigma
(agua) que estabiliza el estado Ru(III), por lo tanto la transición MLCT ocurre ahora a
energías mas bajas.
Otros ligandos con nitrógenos básicos y/o sistemas π aceptores también pueden ser
coordinados y fotoliberados desde centros metálicos de Rutenio, lo que permite el uso de
estos complejos como fotoliberadores de cualquier molécular que contenga tales grupos
coordinantes.
2.3. Pigmentos Fluorescentes
La fluorescencia es la propiedad de ciertas moléculas de relajar un estado excitado
por vía de la emisión de luz.
Un esquema del proceso sería:
S0 + hν1 (excitacion) ------------- S1
S1 ---------------- S0 + hν2 (emision)
donde S0 y S1 corresponden a los estados basal y excitado del fluoróforo, y hν es el fotón de
longitud de onda apropiada. Nótese que los fotones de excitación y emisión se distinguen,
ya que la emisión se produce a longitudes de onda mayores que las de excitación, fenómeno
conocido como corrimiento de Stokes (Lakowicz 1999). Esta diferencia energética entre la
luz absorbida y emitida es convertida en calor a traves de rotaciones y vibraciones
moleculares.
Una forma de cuantificar el proceso de emisión fluorescente consiste en evaluar la
relación entre el número de fotones absorbidos respecto al número de fotones emitidos.
Esta relación se denomina Eficiencia Cuántica de Fluorescencia ( φ ) y oscila entre 0 (no se
emite ningún fotón en respuesta a la absorción) y 1 (el 100% de los fotones absorbidos
genera emisión).
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La emisión de luz por un fluoróforo puede ser modulada por la presencia cercana de
diversas especies, en un fenómeno que se denomina quenching (Lakowicz 1999). En estos
procesos, la intensidad de fluorescencia disminuye significativamente cuando el fluoróforo
se encuentra en la proximidad de la molécula que actúa como “quencher”, y es recuperada
rápidamente al alejarse o eliminarse el “quencher”. En particular, nos interesará un tipo de
quenching en el cual la disminución de fluorescencia ocurre por tranferencia de energía del
pigmento fluorescente luego de la excitación, hacia el quencher, reduciendo la emisión de
fluorescencia. Para que ocurra, es imprescindible que ocurra solapamiento espectral entre la
emisión del pigmento fluorescente y la absorción del “quencher” (Jovin 1989).
La facilidad de detección y la variedad de fluoróforos disponibles los ha convertido
en una herramienta de gran utilidad en varias ramas de la biología. Entre los fluoróforos
más empleados se encuentra una familia de moléculas de amplia disponibilidad comercial,
las rodaminas (figura 4).
Figura 4. Rodamina 6G y Rodamina B. En color se señalan los diversos
sustituyentes que las diferencian.
Las rodaminas están basadas en un sistema conjugado que contiene un anillo de
xanteno y otro de benceno, sustituidos. Los múltiples sustituyentes que modulan las
características de emisión y absorción se pueden encontrar en cualquiera de las dos
subunidades y permiten cubrir una amplia gama de longitudes de onda de emisión y
absorción, así como otras características fisicoquímicas, como ser lipo/hidrofilicidad,
estabilidad ante el fotobleaching, etc (Kubin 1996).
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2.4. Aplicación de Fluoróforos en Modelos Biológicos
En muchos modelos utilizados en fisiología es relevante conocer el origen
embrionario de diversas estructuras o tejidos celulares, es decir, el linaje celular. Para
realizar un seguimiento de dichos linajes es factible en algunos casos microinyectar un
pigmento fluorescente en alguna célula de interés en una etapa temprana del desarrollo,
cuando las células son aún de un tamaño relativamente grande en comparación con las
dimensiones de la pipeta de microinyección. Posteriormente, la localización espacial del
fluoróforo se puede determinar mediante microscopías de fluorescencia o confocal e
indicará el linaje celular de las estructuras que deriven de la región o célula inyectada. Estas
técnicas presentan la limitación fundamental que deriva del proceso de marcación celular: la
impalación de las células es altamente invasiva y técnicamente difícil en células pequeñas
(Steinbiss 1983). Una solución deseable sería contar con un sistema de marcación
fluorescente que sea posible “activar” mediante una vía distinta de la impalación.
El desarrollo de diverso tipo de pigmentos fluorescentes sensibles a diferentes
estímulos es el eje de investigaciones extensas desde hace ya varios años (Fölling 2007). Se
han desarrollado con éxito pigmentos sensibles al pH, a la concentración de diversos iones
como el calcio y al voltaje, por citar algunos. La modulación de la fluorescencia por
irradiación con luz visible permitiría lograr una alta precisión espacial y muy baja
invasividad, permitiendo entre otras aplicaciones el seguimiento de linajes partiendo de
células más pequeñas o bien en estados más tardíos del desarrollo.
Ganglios de sanguijuela
Un sistema interesante para evaluar el funcionamiento de tales pigmentos es el
sistema nervioso relativamente sencillo del invertebrado Hirudo medicinalis (sanguijuela)
(Nicholls 1974). Los somas de las neuronas que conforman su sistema nervioso se agrupan
en 21 ganglios metaméricos y 2 ganglios diferenciados, más grandes, en los extremos
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anterior y posterior. La distribución espacial de las aproximadamente 400 neuronas que
componen cada ganglio es prácticamente idéntica de ganglio en ganglio y de animal en
animal, exceptuando los ganglios de la zona reproductiva y aquellos de los extremos. En la
figura 5 se muestra un esquema del sistema nervioso y el detalle de un ganglio metamérico.
En particular, en este trabajo las aplicaciones se harán sobre las neuronas llamadas
Retzius (Lent 1977). Cada ganglio presenta dos neuronas Retzius (figura 5), que se ubican
centralmente y presentan un tamaño que ronda los 50 micrones (todo lo cual facilita la
identificación). En un ganglio aislado, estas neuronas desarrollan potenciales de acción sin
necesidad de que existan estímulos externos intencionales. Este patrón de disparo
espontáneo resulta característico de estas neuronas dentro del ganglio, y ofrece un sistema
relativamente sencillo de evaluación de toxicidad: la detección contínua de disparos
espontáneos en estas neuronas es un indicador de integridad celular.
Figura 5. Arriba: esquema de la anatomía del
sistema nervioso central de sanguijuela. Izquierda: esquema de vista ventral de un ganglio de sanguijuela. En negro se subraya la ubicación de las neuronas
“Retzius” (ver texto).
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Plántulas de Arabidopsis thaliana
Una de las características deseables de cualquier pigmento fluorescente es que sea
de aplicación versátil, abarcando modelos animales y vegetales. Una de las plantas
utilizadas con mayor difusión en estudios de Biología del Desarrollo es Arabidopsis
thaliana (Coelho 2007). Las razones de su amplia difusión son tanto históricas (cita) como
por las grandes ventajas comparativas que presenta. Es una planta herbácea con una altura
comprendida normalmente entre los 10 y 30 cm, cuyo genoma de pequeño tamaño ya
secuenciado facilita estudios genéticos diversos. Se dispone, además, comercialmente, de
multiplicidad de líneas mutantes caracterizadas que amplían las áreas de estudio. Por otra
parte, su tamaño reducido es conveniente para la cultivación in vitro y su ciclo de vida
relativamente corto (aproximadamente 6 semanas desde la germinación hasta la producción
de semillas maduras) suman otras ventajas importantes para las investigaciones de
laboratorio.
A lo anterior se suman varios beneficios en el área de la microscopía. Las plántulas
son relativamente translúcidas, lo que facilita los estudios de imaging usando tanto
microscopía de fluorescencia como confocal (Moreno ibid). Además, su fácil cultivo en
agar permite tomar registros de planta entera sin necesidad de seccionar ni fijar el
preparado (Shaw 2006).
Por otra parte, una primera evaluación de la toxicidad de una substancia
determinada que se agrega al medio consiste en evaluar el crecimiento y morfología de la
plántula en comparación a una plántula control. Este sencillo procedimiento facilita
también el uso de de este modelo como sistema de testeo.
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3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Si bien los compuestos enjaulados se utilizaron hasta ahora mayormente en estudios
de neurofisiología, presentan grandes posibilidades en otros campos. Por ejemplo, es
posible enjaular compuestos fluorescentes. Dado que las propiedades de fluorescencia de
muchos pigmentos pueden ser moduladas por la presencia cercana de especies moleculares
que actúen como quenchers, es posible diseñar un compuesto enjaulado en el que un
fluoróforo se halle coordinado al centro metálico y sea quencheado por el mismo. En este
caso, la propiedad que quedaría “enjaulada” no es la bioactividad sino la capacidad de
emisión fluorescente, que sólo aparecería al irradiar con luz y separar al fluoróforo del
grupo protector, que actuaría simultáneamente como protector y quencher.
La primera hipótesis planteada en el presente trabajo es que es posible modular la
fluorescencia de fluoróforos a través su coordinación a un complejo polipiridínico de
rutenio, obteniendo de esta manera un “switch” de fluorescencia sensible a la luz. La
segunda hipótesis consiste en que estos fluoróforos así modificados poseen las
características deseadas en cuanto a baja toxicidad, alta estabilidad en solución acuosa y
alto rendimiento de liberación como para poder ser utilizados en diversas preparaciones
biológicas como sondas moleculares con propiedades variables de fluorescencia.
El objetivo del trabajo consiste, entonces, en sintetizar un compuesto de
coordinación de la forma [Ru(bpy)2(Fluoróforo)(X)] que fotolibere el fluoróforo luego de la
irradiación aumentando así significativamente la fluorescencia del mismo. En cuanto a la
selección del fluoróforo, se utiliza un pigmento fluorescente cuya longitud de onda de
excitación sea lo más lejana posible a la de fotodisociación de ligandos.
Dado que ninguna rodamina comercial presenta un nitrógeno electrodonador similar
al piridínico, no es factible su coordinación directa al centro de rutenio. Se plantea como
objetivo entonces una derivatización previa del pigmento fluorescente mediante el agregado
de un grupo coordinante (como el nitrilo o la piridina) cuidando en toda instancia de no
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modificar significativamente las propiedades de excitación y emisión del pigmento en el
proceso.
El último objetivo del trabajo es testear el desempeño del compuesto en diversos
ambientes fisiológico, analizando su funcionamiento en un modelo vegetal (Arabidopsis
thaliana) y otro animal (ganglios de sanguijuela Hirudo medicinalis). En el primero, se
analiza la localización del compuesto cuando es agregado al medio de cultivo y la
morfología y crecimiento de la plántula luego de la incorporación. En el segundo, la
respuesta y morfología de las neuronas frente a la microinyección. En ambos casos se
evalúa la toxicidad, la posible difusión a través de la membrana celular y la estabilidad en
un medio fisiológico.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Sustancias
Todos los reactivos y solventes fueron obtenidos comercialmente y usados sin
purificaciones adicionales. Todas las síntesis fueron hechas degaseando las soluciones con
N2 antes de calentar, para evitar la oxidación de las soluciones acuosas de los complejos de
Rutenio.
Los compuestos enjaulados fueron sintetizados a partir de precursores acuos o
cloruros, que fueron obtenidos de acuerdo a la literatura (Nazeeruddin 1999, Durham 1980,
Liska 1988, Salierno 2009). Los reactivos de partida fueron: RuCl3.3H2O y 2,2´-bipiridina
[bpy] (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwakee, WI., USA) y trimetilfosfina [PMe3]
(Fluka Chemie, Buchs, Switzerland).
Como fluoróforos se usaron Rodamina 6G [Rhod6G] Rodamina B [RhodB] y Fluoresceina.
4.2. Síntesis
Síntesis de Rodamina6G-aminopropio- nitrilo (Rhod6GAPN) (Adamczyk 2000)
480 mg (1 mmol) de Rodamina 6G .HCl y 3 equivalentes de Aminopropionitrilo se
suspendieron en 5 ml de DMF. Se calentó a 60C con agitanción durante 24 hs. Se agregó en
frío 50 ml de H2O, formándose inmediatamente un precipitado rosado palido. La
suspensión se filtró y lavó con abundante agua. El sólido obtenido se seco con sílica gel al
vacío.
Síntesis de RodaminaB-N-metilaminopropionitrilo (RhodBMAPN) (Fölling 2007)
A) Formación del cloruro de ácido: 550 mg de Rodamina B .HCl se disolvieron en 10 ml
de 1,2-dicloroetano seco. Se agregaron 0.3 ml de oxicloruro de fósforo (POCl3). Todo el
sistema fue cuidadosamente purgado con N2 para minimizar la presencia de agua. Se llevó
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a reflujo durante 5 horas. Se destiló el solvente bajo vacío y el sólido se disolvió
inmediatamente en 13 ml de acetonitrilo (MeCN) previamente destilado. La solución fue
guardada en frío y tapada hasta su utilización en el paso siguiente (no más de 48 hs
después).
B) Amidación: se agregó en frío a la solución anterior 500ul de trietilamina (TEA) y 108ul
de N-metilaminopropionitrilo (MAPN). Se reflujó durante 12 horas con agitación. Se detiló
el solvente en vacío y el sólido se llevó a seco en desecador.
Síntesis de [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) Cl] PF6
20mg de Ru(bpy)2Cl2 fueron disueltos en 2 ml de etanol 96%. La poca presencia de agua
favorece la formación de un complejo de la forma [Ru (bpy)2 (H20) Cl] + en lugar del
diacuo, debido a la baja constante dieléctrica de la solución. Luego de la formación del
acuo-cloro complejo (determinado por espectroscopía UV-visible, absorbancia maxima a
490 nm) se agregó 1 equivalente de RhodBMAPN y se calentó a 80ºC con agitación
durante 2 horas (hasta no registrar cambios en el seguimiento por TLC). Todos los pasos
subsiguientes se realizaron en rigurosa oscuridad. La solución se filtro, se llevó a seco en
ROTAVAP, obteniéndose un aceite que se disolvió en 4 ml de una mezcla acetona:metanol
3:1. Se agregó exceso de THF observándose la formación de un precipitado.
Este paso sirve para purificar la mezcla compuesta por tres fracciones: RhodBMAPN libre,
[Ru(bpy)2(RhodBMAPN) Cl]+ y el precursor [Ru(bpy)2(H2O) Cl)]+ ya que la el ligando
libre es soluble en THF, mientras que ninguno de los complejos lo es. Se filtró el
precipitado obtenido y se lavó con THF. Para purificar el complejo de interés, se redisolvió
el precipitado en 3 ml de agua y se agregó 2 equivalentes de KPF6. El precipitado formado
se separó por centrifugación y se llevó a seco en el desecador.
En caso de ser necesario, la sal de PF6, insoluble, fue disuelta en unas gotas de acetona y
mezclada con resina de intercambio aniónico DOWEX-Cl en 5 ml de agua. Se incubó en
agitación durante 2 horas y se obtuvo la sal de cloruro de la solución, la cual se liofilizo
para obtener el complejo como cloruro.
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Síntesis de [Ru (bpy)2 (VACN) Cl] PF6
20mg de Ru(bpy)2Cl2 fueron disueltos en 2 ml de etanol. Luego de la formación del
monoacuo seguido por espectroscopía UV-visible se agregó 1.5 equivalentes de
Vinilacetonitrilo (VACN) diluidos en 4 ml de etanol y se calentó a 80ºC con agitación
durante 2 horas. Todos los pasos subsiguientes se realizaron en rigurosa oscuridad. Una vez
determinado por UV-Vis que la reacción no continúa, se precipita el complejo con exceso
de KPF6, y se seca al vacío sobre silica gel.
Síntesis de [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) (PMe3)] (PF6)2
20mg de [Ru(bpy)2(PMe3) Cl] Cl fueron disueltos en 4 ml de agua y calentados a 70ºC con
agitación durante 20 minutos. Se agregó 2 equivalentes de nitrato de plata (AgNO3) y se
dejó en calor durante 1 hora. Se centrifugó y se retirlo el cloruro de plata formado. El
complejo en solución es ahora [Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+ . Se agregaron 2 equivalentes de
RhodBMAPN y se calentó a 80ºC con agitación durante 4 horas. El complejo formado se
llevó a seco, se purificó por extracción con THF, se disolvió en una mínima cantidad de
agua y se precipitó con exceso de KPF6.
4.3. Espectroscopía
Se utilizó un espectrofotómetro de matriz de diodos HP 5483 y un
espectrofotómetro de matriz de diodos a fibra óptica (PC2000-UV-Vis, OceanOptics,
Dunedin, FL., USA) para la espectroscopía de absorción UV-visible (entre 250 y 700 nm).
Los espectros se realizaron en solución acuosa o Agua:Etanol en el caso de compuestos
lipofílicos.
Para provocar la fotólisis de los compuestos se los iluminó con una cantidad
variable de pulsos de una lámpara de flash de Xe de aproximadamente 1-2 Joule / pulso, o
un LED azul de λ=450 nm a máxima emision (Luxeon Star III, Royal Blue).
Los espectros de emisión y absorción se obtuvieron con un espectrómetro de matriz
de diodos OceanOptics (Dunedin, FL., USA) y una celda construida ad-hoc en el
laboratorio.
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Los espectros de resonancia magnética nuclear [RMN] fueron realizados con un
equipo Bruker de 500MHz.
4.4. TLC
Se utilizaron placas de sílica gel sobre aluminio. Los compuestos fluorescentes
fueron separados utilizando como solvente de corrida una mezcla Butanol:Metanol:Agua
1:1:1.
4.5. Eficiencias Cuánticas
Para obtener la eficiencia cuántica de liberación con luz azul (450 nm) se tomaron
espectros de absorción entre 300 y 700nm cada 10 segundos mientras la muestra era
irradiada bajo agitación constante con el LED de λ=450 nm (20 nm de ancho de banda).
A partir de los espectros de absorcion completos, y conociendo los espectros de las
especies inicial y final, se obtuvo el grado de avance de la fotorreacción en cada tiempo de
irradiacion. La irradiancia de la fuente de luz se determinó mediante el mismo análisis con
un patron de [Ru(bpy)2Py2]2+, el cual se consideró de eficiencia cuantica de 0.26, según
referencia (Pinnick 1984).
Una vez determinada la irradiancia de la fuente, se determina la eficiencia cuántica
de fotoliberación de la muestra en forma similar.
Para obtener las eficiencias cuánticas de fluorescencia se obtuvieron los espectros
de absorción y emisión de las muestras de interés con la longitud de onda de excitación
adecuada. Se obtuvieron también ambos espectros de un patrón de eficiencia cuántica
conocida y coeficiente de absortividad molar conocida, en este caso Rodamina B (Magde
1999).
Se obtuvo la fracción de luz absorbida para cada especie como 1-10-Abs. Luego se
calculó la emisión de fotones como el área bajo la curva de emisión en unidades
proporcionales al numero de fotones correspondientes a cada longitud de onda..
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Finalmente, conociendo la fracción de luz absorbida y emitida, y la respuesta del
fluorometro con el patron se obtiene la eficiencia cuántica de la especie buscada, como:
φ= fotones emitidos/fotones absorbidos
4.6. Modelos animales y vegetales
Se utilizaron sanguijuelas Hirudo medicinalis de un peso de entre 2 y 5 gramos, que
fueron amablemente cedidas por el grupo de la Dra. Lidia Szczupak. Las sanguijuelas se
mantuvieron en solución marina artificial a 15ºC y fueron alimentadas con sangre vacuna
entre uno y tres meses ante de la disección. Antes de cada disección, los animales fueron
anestesiados colocándolos en hielo por media hora. Se extrajeron ganglios individuales y se
fijaron con alambres de acero inoxidable de diámetro capilar en una cápsula con fondo
revestido de un polímero inerte (Sylgard). La cápsula se cargó con solución salina (en mM
NaCl 115, KCl 4, CaCl2 1,8, MgCl 1, Tris base 5,4, pH=7,4 con H2SO4).
Las semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia WT, fueron amablemente
cedidas por el grupo de la Dra. Sara Maldonado. Se mantuvieron en oscuridad hasta el
momento de siembra. El medio de cultivo utilizado fue una solución de agar al 0.8% que
permite una rápida difusión del pigmento agregado en la superficie. Se utilizaron cápsulas
de petri de 2ml de capacidad. En los intentos de microinyección se utilizó una solución de
agar al 2.5% que permite mayor fijación de la muestra y por lo tanto resistencia al
movimiento. Las semillas se sembraron en una capa intermedia del agar en los ensayos de
microinyección y en la superficie del mismo en los ensayos de captación por vía
extracelular. En este último caso se descartaron las plántulas en las que se observó el
crecimiento de las partes aéreas en contacto con la superficie de agar. Se crecieron las
plántulas en luz para ensayos sin complejo o bien en oscuridad para ensayos con complejos
fotoactivos.
20
4.7. Fisiología
Los ensayos de microinyección se realizaron utilizando micropipetas hechas a partir
de capilares de vidrio de 1mm de diámetro inicial utilizadas para electrofisiologia y
estiradas con un puller de tipo vertical. El diámetro de la punta de la pipeta se estimó en 1-2
micrones, a partir de mediciones de la resistencia. Las soluciones a ser microinyectadas se
filtraron utilizando filtros de 0.2micrones. El posicionamiento de las micropipetas se logró
mediante un micromanipulador de perilla (You Ltd. U-3FC, Narishige Scientific Instrument
Lab., Tokyo, Japan). Como electrodo de referencia en las mediciones electrofisiológicas se
utilizó un alambre de plata clorurado.
La perfusión de las soluciones se realizó por inyección a presión (alrededor de 2-5
atm durante 10 segundos).
La iluminación de la preparación para la microscopía se realizó un LED infrarrojo
(940nm) a traves de una fibra optica de 1,5 mm de diametro. Para la visualización de
ganglio se utilizó un microscopio de fabricación propia equipado con camara de 30fps a
640x480 pixels (i-Fire).
Se utilizaron plantas de 3 a 7 días luego de la germinación para los estudios de
captación de pigmentos. A tiempos variables previo a la observación por microscopía
confocal se agregaron 200 µl de una solución diluída de RhodBMAPN (0.1mM) o del
complejo purificado [Ru(bpy)2(RhodBMAPN) Cl] Cl al medio de cultivo. Se incubó por
tiempos variables y se observó la distribución mediante microscopía confocal.
La irradiación se realizó con una lámpara de flashes de Xe durante tiempos
variables (baja irradiación, aproximadamente 10 flashes; alta irradiación, más de 50
flashes). Se irradió toda la muestra.
La microscopía de fluorescencia se realizó en el mismo setup, iluminando con un
laser verde DPSS de 532nm (obtenido de 1064nm con duplicador). La emisión se tomó a
traves de un filtro pasabajos de corte en 570 nm.
Las imagenes de microscopia confocal se obtuvieron con excitación en 532 nm y
filtro de emisión en 580 nm.
21
5. RESULTADOS 5.1. Derivatización de fluoróforos
Se sintetizaron diversos derivados fluorescentes con el fin de lograr un fluoróforo
que contenga un grupo fácilmente coordinable, y que además reuniera las características
deseadas de solubilidad y espectro de emisión. De los compuestos obtenidos, algunos
resultaron de particular importancia, ya sea por los buenos resultados que produjeron o por
la información que aportaron a la investigación. A continuación se detallan algunas de estas
síntesis.
5.1.1. Rodamina 6 G - Aminopropionitrilo (Rhod6GAPN)
Se seleccionó como primer reactivo la Rodamina 6G por su fácil disponibilidad y su
amplio uso en la biología. Como primera estrategia de derivatización, se llevó a cabo una
reacción de transamidación entre Rodamina 6G y Aminopropionitrilo (Adamczyk 2000).
En este proceso el grupo éster de la rodamina es reemplazado por una amida, que a su vez
posee en el otro extremo un grupo funcional nitrilo fácilmente coordinable al Rutenio
(Figura 6).
Figura 6. Esquema de la reacción de transamidación entre Rodamina 6G y Aminopropionitrilo. En
rojo el fragmento entrante, en azul el fragmento saliente.
En este proceso ocurren dos cambios importantes: por un lado la Rodamina
adquiere un grupo coordinable (el nitrilo), pero además es reemplazado el éster por una
amida. La selección de una amida en lugar de un éster como grupo de enlace entre el
22
pigmento y el fragmento coordinable responde a dos factores: la presencia ubicua de
esterasas intracelulares podría clivar el enlace una vez se introduzca el compuesto dentro de
la célula, lo que resultaría en una degradación indeseada del compuesto. Por otra parte, en
la reacción de coordinación al centro metálico (paso inmediatamente posterior) se requiere
una incubación en fase acuosa alcalina a temperaturas superiores a 70ºC, condiciones frente
a las cuales los ésteres no resultan suficientemente estables. Un enlace de tipo amida, sin
embargo evita ambos efectos indeseados.
En la figura 7 se muestra un espectro de resonancia magnética nuclear de protón
(1H RMN) del compuesto obtenido.
Figura 7. Espectro de 1H RMN del derivado de Rodamina 6G conteniendo Aminopropionitrilo como grupo de coordinación al rutenio.
23
Se observan las señales típicas del xanteno y el grupo benzoico (simbolizadas con
los números del 1 al 8) entre 8ppm y 6ppm, y en la region alifática se ven los etilos de la
rodamina (señales 10, 11) y los metilenos del Aminopropionitrilo (señales 12, 13). A su
vez, la integración de cada señal se corresponde con valores predichos (no se muestra). El
rendimiento de la reacción fue del 50%.
Si bien la reacción produjo el compuesto deseado, las características del mismo no
fueron las esperadas. El producto resultó ser totalmente insoluble en agua salvo a pH
moderadamente ácido (pH=3) y no mostró fluorescencia apreciable. Este efecto se debe
probablemente a que el hidrógeno de la amida cicla con el anillo de xanteno rompiendo la
conjugación de los anillos (Fölling 2007). Esta forma ciclada se denomina espirolactama
(figura 8) y se puede interconvertir con la forma abierta, soluble y fluorescente bajo
determinadas condiciones (pH extremo, pulsos de luz UV). Sin embargo, a pHs intermedios
(como los necesarios para la coordinación al Rutenio) el isómero ciclado está favorecido y
por lo tanto no resulta un producto útil para los pasos posteriores.
Figura 8. Esquema de la interconversión entre la forma abierta y la forma cerrada del compuesto obtenido (Rhod6G APN).
5.1.2. Rodamina B – N -metilaminopropionitrilo (RhodBMAPN)
Del resultado anterior se desprende la necesidad de buscar otra vía de derivatización
que no permita la formacion de la espirolactama. Se optó entonces por seleccionar otro
24
pigmento comercial de uso biológico difundido, la Rodamina B, que posee un ácido
carboxílico en el anillo de benceno (figura 9). A través de este ácido se formó una amida,
pero utilizando una amina secundaria tal que no tuviera posiciones disponibles para ciclar
el anillo de xanteno, evitando de esta forma el derivado ciclado y no fluorescente
indeseado.
El esquema de reacción es entonces (figura 9):
Figura 9. Esquema de la reacción de amidación de Rodamina B con N-metilaminopropionitrilo. Nótese que en el producto final, el nitrógeno de la amida no tiene hidrógenos unidos. De esta forma, no podría
ciclar con el anillo de xanteno.
Cabe destacar que para llevar a cabo esta síntesis es necesario utilizar otra vía de
reacción, ya que la transamidación que se empleó en la síntesis anterior requiere de la
formación de la espirolactama como intermediario de reacción para llevarse a cabo
(Adamczyk 2003). Por esta razón, resulta imposible partir de un éster (como la Rodamina
6G) y transamidar con una amina secundaria. La imposibilidad de formar la espirolactama
por bloquear las posiciones de la amina impediría a su vez la formación de la amida
deseada. Por esta razón se utilizó una vía de activación del ácido carboxílico a través de la
formación inicial del cloruro de ácido, y la amidación posterior con N-metilamino-
propionitrilo (Fölling 2007).
En la figura 10 se muestra un espectro de 1H RMN del ligando obtenido.
25
Se observan los tripletes de los metilenos del N-metilaminopropionitrilo a 2.35 ppm
y 3.5 ppm (señales 12 y 13), y el singulete del metilo a 3.15 ppm (señal 15). La región
aromática se observa entre 6.8 y 8 ppm (señales 1 al 10). Las señales no asignadas a 1.4 y
3.3 ppm corresponden probablemente a impurezas. Nuevamente, la integración de las
señales (no se muestra) resultó coherente con lo esperado.
Figura 10. Espectro de 1H RMN de Rodamina B – N-metilaminopropionitrilo.
26
En la figura 11 se muestran las propiedades espectroscópicas de emisión en el rango
UV-visible del compuesto obtenido y del reactivo de partida, la Rodamina B, a diferentes
pHs. Se observa claramente que la absorbancia de la Rodamina B varía en función del pH,
no sólo en intensidad si no también en cuando a un corrimiento hacia longitudes de onda
menos energéticas a pH básico, evidencia del efecto de la protonación-deprotonación del
ácido carboxílico presente en el anillo de benzeno (máximo en 580nm a pH básico y 585nm
a pH ácido). A su vez, se observa también que el compuesto formado es insensible al pH
tanto en intensidad de emisión como en máximo de emisión (máximo en 591nm a ambos
pH´s). Este comportamiento es el esperado luego del cambio del grupo ácido por una
amida.
Emisión RhodB y RhodBMAPN - pH básico y ácido
0
1000
2000
350 400 450 500 550 600 650 700 750
longitud de onda (nm)
fluore
scencia
(u.a
.)
Figura 11. Espectro de emisión de Rodamina B a pH básico (verde), ácido (violeta) y Rodamina B- N-
metilaminopropionitrilo a pH básico (azul) y ácido (rosa), casi totalmente superpuestos. Nota: la concentración de las soluciones utilizadas no es la misma
Para completar la caracterización del fluoróforo obtenido, se calculó su eficiencia
cuántica de fuorescencia. El valor obtenido es de 0.27, ligeramente menor al de la
Rodamina B, que es de 0.31 en las mismas condiciones.
27
5.2. Formación del complejo [Ru (bpy)2(RhodBMAPN) Cl]+
Como fue detallado en la introducción, el objetivo del trabajo es obtener un
complejo de Rutenio unido a un fluoróforo, cuya fluorescencia se vea aumentada
notablemente luego de la fotoliberación del ligando. Como primera reacción se intentó
entonces la coordinación del fluoróforo obtenido al centro metálico, para analizar las
condiciones de coordinación y evaluar el espectro de emisión luego de la coordinación. Se
obtuvo un complejo de la forma [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) Cl]+. Interesantemente, este
complejo presentó ya la característica deseada, dado que al poco tiempo de reacción con el
centro de rutenio-bipiridinas se observó una disminución de la fluorescencia, que se
recuperó rápidamente luego de pocos flashes de luz blanca. En la figura 12 se observa el
espectro de emisión del crudo de la reacción, luego de 1 hora de incubación.
Emisión [Ru(bpy)2(RhodBMAPN)(Cl)]2+ - mezcla de reacción
0
300
600
450 500 550 600 650 700 750
longitud de onda (nm)
fluorescencia (u.a.)
Figura 12. Espectro de emisión del crudo antes (verde) y después (rosa) de irradiación con luz blanca.
El espectro muestra un aumento de la fluorescencia luego de la irradiación,
indicando la formación de un complejo de las características deseadas. Por supuesto, el
28
crudo contiene aún una mezcla de especies (tales como ligando libre y precursor del
complejo), que es necesario individualizar y analizar. Para identificar el número de especies
presentes en el crudo y diseñar una estrategia de purificación para el análisis, se corrió una
placa cromatográfica en sílica. Cada mancha separada en la placa fue irradiada para evaluar
posibles cambios en la fluorescencia, usando luz azul (LASER λ = 473nm). Las imágenes
de la secuencia se muestran en la figura 13 (fotografía con cámara digital interponiendo un
filtro pasabajos naranja de corte en λ = 580 nm al lente, usando un LED de excitación con
máximo en λ = 525 nm).
Figura 13. Placa cromatográfica en sílica del crudo de reacción. Las tres calles son triplicados del crudo, cada placa consiste en la misma placa que la anterior, agregándole la irradiación de una calle
entera para evaluar cambios en la fluorescencia.
Se observan claramente tres bandas: una de mayor movilidad, cuya fluorescencia es
alta y constante (el Rf corresponde al patrón de RhodBMAPN, no se muestra en la placa)
La siguiente no presenta fluorescencia apreciable a ojo desnudo antes de la irradiación, pero
aumenta notablemente la fluorescencia luego de la misma, y corresponde al complejo
deseado. Una tercera banda de poca movilidad presenta fluorescencia baja y constante. Esta
tercera señal corresponde posiblemente a impurezas conteniendo complejos de Rutenio que
presentan fluorescencia por sí mismos.
Se purificó entonces la fracción de interés como se detalla en la sección Materiales y
Métodos, luego de lo cual se obtuvo el complejo que se caracteriza a continuación.
29
CARACTERIZACIÓN DEL COMPLEJO OBTENIDO:
En la figura 14 se muestra la parte arómatica del espectro de 1H RMN del complejo
[Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) Cl]+, antes (arriba) y después (centro) de la irradiación con
flashes de luz blanca. Las señales muestran la presencia de los dobletes y tripletes
caracteristicos de las bipiridinas entre 7.5 y 10 ppm, junto con las señales de la
RhodBMAPN unida al complejo. Luego de la irradiación, aparecen nuevas señales. Aunque
muchas se superponen, se observa claramente la aparición del doblete a 7.8 ppm
característico de la RhodBMAPN libre, señal que no se ve en el espectro del complejo sin
irradiar. Se observan también la separación de las señales a 7.15 y 7.35 ppm luego de la
irradiación, correspondientes al ligando libre. Se muestra también el RMN de la
RhodBMAPN libre (abajo), para evidenciar la poca proporción de ligando libre presente en
el complejo antes de la irradiación, y el aumento significativo de esas señales en el espectro
del complejo irradiado.
Figura 14: espectro de 1H RMN (parte aromática) del complejo [Ru (bpy)2(RhodBMAPN) Cl]
purificado antes de la irradiación (arriba), luego de irradiar 5 minutos con luz blanca (medio) y del ligando libre, RhodBMAPN (abajo).
30
En la figura 15 se muestra el espectro de emisión del complejo purificado, antes y
después de la irradiación con luz blanca (lámpara de Xe, pulsado). Se utilizó un LED verde
para la excitación, cuyo máximo se observa en la figura. Se observa un aumento de la
fluorescencia, en unidades arbitrarias, de un 650% (de 85u.a. antes de irradiar, a 555u.a.
luego de la irradiación). La forma de la banda se conserva, por lo que la relacion de areas
corresponde a la misma proporcion.
Se observa también que el máximo de emisión no cambia con la fotoliberación.
Emisión [Ru(bpy)2(RhodBMAPN)(Cl)] 2+, purificado
0
200
400
600
450 500 550 600 650 700 750
longitud de onda (nm)
fluorescencia (u.a.)
Figura 15. Espectro de emisión del complejo [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) Cl]+ antes (fucsia) y después
(azul) de la irradiación con luz blanca.
Para analizar cuantitativamente la eficiencia del complejo en cuanto a la
fotoliberación con luz de 455 nm, se calculó la eficiencia cuántica de liberación,
obteniéndose un valor de 0.32.
Se calculó también la eficiencia cuántica de fluorescencia del complejo, antes y
después de irradiar con luz de 455 nm. Se obtuvo un valor de 0.04 antes de la irradiación y
de 0.24 después de la irradiación (la eficiencia cuántica de la Rodamina B es del 0.31).
31
5.3. Estudio de la liberación con luz verde.
En el curso de la caracterización del complejo se observó un resultado imprevisto:
durante la observación de fluorescencia (es decir, la excitación del complejo utilizando un
LED verde para evaluar fluorescencia) se produce un aumento paulatino de la
fluorescencia, aún en ausencia de luz azul. Esto no debería ocurrir, en el marco teórico del
complejo diseñado, ya que la longitud de onda necesaria para la liberación es cercana a los
450 nm, o sea, con LED de color azul, pero con luz de longitud de onda menos energética,
como la verde, el complejo no debería llegar al estado disociativo y por lo tanto no debería
fotoliberar un ligando. El hecho de observar aumento de fluorescencia siendo excitado el
complejo con luz verde podría deberse a alguna de las siguientes razones:
a) Que el ligando por sí mismo aumente su fluorescencia durante la excitación.
b) Que el complejo sintetizado esté efectivamente fotoliberando ligando con luz verde,
además de la liberación observada y esperada con luz azul.
A fin de descartar la primera hipótesis se verificó que no se produce aumento de
fluorescencia durante a la excitación con LED verde, utilizando una solución de
RodaminaB-N-metilaminopropionitrilo. Se observó que el espectro de emisión del
compuesto RodBMAPN permanece constante cuando es irradiado en forma continua con
luz verde (no se muestra).
El resultado anterior indica entonces que el complejo sintetizado fotolibera el
ligando RodaminaB-N-metilaminopropionitrilo al ser excitado con luz verde. Se observó
que esta liberación es de menor eficiencia que la liberación con luz azul (observación
cualitativa), pero aún así significativa.
Ahora bien, la fotoliberación con luz verde puede deberse a alguna de las siguientes
razones:
a) que el complejo sintetizado presente en efecto alta absorción en la región del verde,
que no es posible observar en el espectro de absorción UV-visible por quedar enmascarada
por la gran banda de absorción que presenta la Rodamina en esa franja.
32
b) que se produzca un efecto denominado “antena”, que consiste en que el fluoróforo,
al ser excitado con luz verde, toma la energía de la excitación y la transfiere al centro
metálico, llegando éste así al estado disociativo por otra vía distinta de la excitación directa.
Este estado disociativo es indistinguible al estado disociativo al que llega por excitación
directa. El efecto final observable consiste en que el complejo, al ser irradiado con luz
verde, libera un ligando monodentado, tal como ocurre cuando es excitado con luz azul.
Para analizar estas dos variantes se optó por sintetizar un complejo de la forma
[Ru(bpy)2 (VACN) Cl]+, utilizando como ligando Viniacetonitrilo (VACN). Este complejo
posee un enlace Ru-CN similar al que existe en el complejo fluorescente, pero carece del
fluoróforo, anulando así la posibilidad de presentar el efecto antena mencionado y el
ocultamiento parcial de la banda MLCT. Analizando el espectro de absorción de este
complejo se puede estudiar por consiguiente la posible existencia de absorción en verde,
responsable de la liberación a esa longitud de onda.
En la figura 16 se muestra el espectro 1H RMN del complejo formado.
Figura 16: Espectro RMN de [Ru (bpy)2 (VACN) Cl] PF6
33
Se observan los dobletes y tripletes característicos de la región aromática del
complejo entre 10.2 y 7.2 ppm, y las señales alifáticas del ligando Vinilacetonitrilo entre
5.8 y 2.8 ppm.
En la figura 17 se muestra el espectro de absorción UV-visible de este complejo,
antes y después de la irradiación con luz verde. Se observa el corrimiento de la banda
MCTL que cae inicialmente en 461 nm y se desplaza hacia 497 nm luego de la irradiación,
indicando liberación del ligando.
Figura 17. Espectro de absorción UV-visible del complejo [Ru (bpy)2 (Vinilacetonitrilo) Cl] antes (azul) y después (violeta) de la irradiación con luz verde (530nm).
Puede verse en este espectro que la absorbancia en 530nm es aproximadamente la
tercera parte de la absorbancia en 461nm. Esto es peculiar, dado que en general la
absorbancia de los complejos de rutenio-bipiridinas es mucho menor en 530nm (la banda
MLCT es en general mucho más angosta). Concluimos entonces que la fotoliberación
observada con luz verde corresponde a la absorción directa a traves de la banda MLCT del
complejo, y no a la presencia de un efecto antena generado por la rodamina.
(VACN)
34
5.4. Estudio del fenómeno de quenching del complejo formado
Como fue mencionado en la introducción, el complejo diseñado presenta un
fenómeno de quenching: esto es, la fluorescencia del ligando es quencheada mientras se
una al complejo, por alguno de los procesos físicos asociados al fenómeno.
Para analizar el origen del fenómeno de quenching, es relevante tomar en
consideración el resultado anterior: la banda MLCT en este complejo es relativamente
ancha, presentando absorbancia en 530nm, lo que sugiere que esta misma absorbancia
podría ser responsable del quenching de fluorescencia. Para analizar esta posibilidad, se
sintetizó un complejo de la forma [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) (PMe3)]2+. Este complejo
presenta una trimetilfosfina como sexto ligando en lugar de un cloruro, lo que
previsiblemente genere que la banda MLCT caiga alrededor de 400 nm, sin absorción
alguna a 532 nm. Si este complejo continuara mostrando un efecto de quenching, podría
entonces pensarse que el fenómeno es dependiente de la cercanía con la subunidad
Ru(bpy)2, o bien es un quenching por algún efecto de transferencia electrónica. Sin
embargo, si el fluoróforo no se ve quencheado en este complejo, es probable que entonces
el quenching del complejo anterior se deba en efecto a la alta absorbancia en 530nm. En la
figura 18 se muestra el espectro de emisión del complejo formado, antes y después de
irradiar.
Figura 18. Espectro de emisión del complejo [Ru(bpy)2(RhodBMAPN)(PMe3)]
2+ antes de la irradiación con luz blanca (azul) y después (rosa)
Emisión del complejo [Ru(bpy)2(PMe3)(RhodBMAPN)]2+
0
400
800
1200
450 500 550 600 650 700 750
longitud de onda (nm)
fluorescencia u.a.
35
Se observa que el complejo muestra fluorescencia alta y similar antes y después de
la irradiación, es decir, ausencia de quenching. Esto apunta a que en efecto es la anchura de
la banda MLCT en el compuesto con cloruro en lugar de trimetilfosfina la responsable del
quenching observado.
5.5. Estudio del desempeño del complejo formado en diversos modelos
biológicos.
Tal como fue mencionado anteriormente, el destino final de este trabajo es el diseño
de una sonda para uso en biología. La última etapa consiste entonces en la caracterización
de su comportamiento biológico respecto a toxicidad, estabilidad en medios fisiológicos y
facilidad de uso. Además, es necesario verificar que las propiedades observadas se
conservan y analizar si resultan funcionales; tanto en modelos animales como vegetales.
5.5.1. En ganglios de sanguijuela
Estos experimentos fueron realizados en conjunto con Oscar Filevich.
Como primer análisis se evaluó el comportamiento del ligando libre (N-metilamino
propionitrilo) al ser introducido en somas de neuronas de ganglio de sanguijuela. Para esto,
se microinyectó una solución del ligando RhodBMAPN en una diversas neuronas. Se
analizó su difusión a través de la membrana evaluando la localización tiempo después de la
microinyección. En la figura 19 se muestra una imagen obtenida durante el proceso en
donde se ve que el pigmento se mantuvo confinado a los límites celulares. Se muestra una
imagen obtenida iluminando con luz IR, una imagen obtenida excitando únicamente con
luz verde, y a continuación la superposición de ambas.
36
Figura 19. Microinyección del ligando RhodBMAPN en una neuronas de ganglio de
sanguijuela. Las imágenes superiores consisten en la iluminación con IR (izq.), con luz verde (der.), y la
superposición de ambas (abajo). La emisión adicional que se observa se debe a autofluorescencia.
No se observó difusión apreciable durante el tiempo que duró el experimento
(aproximadamente 20 minutos).
A continuación, se microinyectó una solución del complejo [Ru (bpy)2
(RhodBMAPN) Cl]+ en oscuridad a una neurona Retzius de un ganglio fresco. Luego de la
microinyección se procedió a iluminar la muestra con luz azul ténue de forma constante
37
para producir fotoliberación. Se evaluó la fluorescencia a intervalos regulares con un LED
verde, tomando fotografías con una cámara digital anteponiendo un filtro verde. Se evaluó
de esta manera el aumento en la fluorescencia provocado por la fotoliberación. Por otra
parte, se evaluó la toxicidad verificando la existencia de disparos espontáneos de la célula
luego de la microinyección (patrón característico de las neuronas Retzius). En la figura 20
se muestra una de las imágenes obtenidas, donde se señala el área utilizada para cuantificar
la emisión fluorescente (izq.); junto a un segmento del registro de disparos de la neurona
durante el experimento (der.).
Figura 20. Derecha: se observa una imagen de la fluorescencia emitida por una célula conteniendo al
complejo. El círculo alrededor es la delimitación gráfica del área seleccionada par cuantificar la
fluorescencia. Izquierda: un fragmento del registro de los disparos de la neurona de la derecha.
Se observó un aumento de la fluorescencia a lo largo de la irradiación, y un disparo
contínuo de la neurona que duró todo el tiempo de exposición a luz azul, y continuó varios
minutos más (hasta fin del registro). Se cuantificó la fluorescencia en cada fotografía
utilizando el software de uso publico ImageJ como la intensidad integrada en los píxeles de
un área circular fija que corresponde aproximadamente al área del soma de la neurona (área
circular delimitada en la imagen anterior). En la figura 21 se observa el resultado.
38
Figura 21. Cuantificación de la fluorescencia durante 30 segundos de exposición a luz azul.
Se observa que la fluorescencia aumenta de 8 a 10 veces, y que el aumento es poco
gradual, ya que el 80 por ciento del aumento total ocurre durante los primeros segundos de
la exposición.
5.5.2. En Arabidopsis thaliana
Estos experimentos fueron realizados con la colaboración de la Dra. Sara Maldonado
Se intentó la microinyección tanto de ligando como de complejo en células de la
radícula de un estadío temprano de la plántula. El proceso presentó muchas dificultades
técnicas, debido probablemente a la presencia de pared celular que obstruía el pasaje de la
pipeta, aún en células jóvenes. Se intentó también la microinyección en células
meristemáticas de estadíos más avanzados, ya que este tejido relativamente blando y
plástico presenta células más flexibles. Tampoco fue posible con el set-up que disponemos,
ya que las células del meristema resultaron demasiado pequeñas en comparación con el
grosor de la pipeta de microinyección.
Se optó entonces por evaluar la captación espontánea de los compuestos,
agregándolos al medio de cultivo durante el crecimiento de la planta. Para esto, se
agregaron gotas de una solución diluída del ligando RhodBMAPN al medio donde estaban
Cuantificación fluorescencia
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25 30
tiempo de irradiación (s)
fluorescencia (u.a.)
39
sembradas las plántulas, 3 días luego de la germinación. Se evaluó la captación y
localización del pigmento a distintos tiempo luego del agregado, mediante microscopía
confocal.
En la figura 22 se muestran las imágenes obtenidas. Se observa en primer lugar que
el pigmento es absorbido por la raíz ya que se lo encuentra dentro de la plántula cuando la
observación se realiza 1 hora después del agregado de la solución coloreada al medio. El
ingreso del colorante proviene necesariamente de la raíz, ya que se tomó la precaución de
crecer las semillas en la superficie del agar, dejando las partes aéreas fuera del contacto
directo con el pigmento y el medio. Por lo tanto, la detección del pigmento en tallo y hojas
puede deberse únicamente al ingreso por vía de la raíz, o difusional por la cutícula y capa
epidérmica.
40
Figura 22 (página anterior). Localización de RodaminaB-N-metilaminopropionitrilo agregado al medio de crecimiento en plántulas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia, microscopía confocal. a) Extremo apical del tallo, mostrando el ápice meristemático y la base de los dos cotiledones. Se observa la localización periférica del pigmento cuando se enfoca un plano de poca profundidad. Se observa también una mayor fluorescencia en meristema apical. b) Se observa aquí en detalle la localización en la vena media de los cotiledones, donde el pigmento se localiza en los elementos de conducción del xilema (elementos de vaso). c) En el eje raíz-hipocótilo, se observa el pigmento en el cilindro vascular, específicamente en los elementos conductores del xilema. Estas imágenes fueron capturadas a menos de una hora de colocar el pigmento en el agar, razón por la cual se observa una mayor concentración del mismo en la parte cercana a la zona de los pili absorbentes (extremo superior). La alta fluorescencia de los bordes la atribuimos al movimiento difusional del pigmento a través de la pared de las células de la capa epidérmica colocado en el medio en contacto directo con la raíz. Las imágenes a, b y c resultan de combinar transmisión con fluorescencia. La imagen d es únicamente de fluorescencia.
En las imágenes se observa que el pigmento se distribuye fundamentalmente por vía
de los vasos centrales del xilema y también por las paredes externas de las células
epidérmicas.
Se realizó el mismo experimento entonces utilizando el complejo sintetizado
[Ru(bpy)2 (RhodBMAPN) Cl]+. Se agregó un pequeño volumen de una solución diluida del
compuesto al medio de cultivo de plántulas de 7 días de edad y se evaluó su localización 8
horas después (habiéndolas mantenido en oscuridad durante la incubación). La prueba
funcional del complejo consistió en la toma de imágenes inmediatamente después de la
incubación en oscuridad con el complejo, y luego de una fuerte irradiación con luz blanca.
En la figura 23 se muestra algunas de las imágenes obtenidas. Se observa la
localización, en concordancia con el experimento anterior, en los vasos centrales y en la
pared externa. Se observa también un marcado aumento de la fluorescencia luego de la
irradiación.
41
Figura 23: localización y aumento de la fluorescencia por fotoliberación del
complejo diseñado, aplicado al medio de cultivo de Arabidopsis thaliana jóvenes. Las imágenes superiores corresponden a la fluorescencia, las inferiores combinan transmisión y fluorescencia. A su vez, las imágenes de la izquierda corresponden a una hojuela antes de ser irradiada con luz blanca, y
las de la derecha al momento inmediatamente posterior a la liberación. Se observa un notable aumento de la fluorescencia luego del proceso.
Se realizó luego otro experimento donde se irradió el complejo en etapas, primero
con pocos flashes (irradiación baja) y luego llegando a liberación total (irradiación alta, más
de 50 flashes) para evaluar cualitativamente las posibilidades de liberación con distintas
intensidades de luz. Las imágenes se muestran en la figura 24. Se observa el paulatino
aumento de la fluorescencia, si bien la diferencia entre la irradiación baja y alta es más
ténue (cualitativamente) que aquella entre oscuridad e irradiación.
42
Figura 23: localización y aumento de la fluorescencia por fotoliberación del complejo diseñado, aplicado al medio de cultivo de Arabidopsis thaliana jóvenes. Las imágenes superiores corresponden a
la fluorescencia, las inferiores combinan transmición y fluorescencia. En este experimento se irradió en dos etapas, en una primera instancia se utilizaron 5 flashes de luz blanca (condición de baja
irradiación) y en una segunda instancia se aplicaron cerca de 50 flashes más.
43
6. DISCUSIÓN
En este trabajo se abordó el desarrollo y prueba de una sonda fluorescente de
características particulares, cuya síntesis y aplicación dieron lugar a numerosos compuestos
y resultados secundarios que es útil analizar individualmente.
6.1. Derivatización de fluoróforos
De los diversos pigmentos sintetizados se desprende en primera instancia que las
posibilidades de derivatización de unos pocos fluoróforos disponibles amplía enormemente
la gama de espectros de absorbancia, emisión, solubilidad y demás características
particulares. Esto sugiere que, ampliando la línea de investigación que se inicia en este
trabajo, la correcta selección del pigmento y su derivatización podría afinar mucho las
propiedades de la sonda enjaulada, logrando compuestos para usos más específicos o bien
más versátiles.
El compuesto que llamamos Rhod6G-APN presenta características de alguna
manera similares a las que buscamos en el trabajo, en la medida en que su fluorescencia se
ve notablemente aumentada luego de pulsos de luz, en esta caso UV. Dado que esta
conversión es transitoria y ocurre con luz de longitud de onda que resulta tóxica para los
preparados celulares, no se lo consideró conveniente para continuar en la línea de
investigación. Sin embargo la creciente utilización de ese tipo de espirolactamas en
microscopías en las cuales se rompe el límite de difraccion le otorga utilidad a su síntesis.
La derivatización de Rodamina B a través del ácido carboxílico presenta también
otras posibilidades (Adamczyk 2003). En el presente trabajo se eligió para la derivatización
una estructura lineal con un grupo amino para formar la amida y un grupo nitrilo para la
coordinación al rutenio, pero variando este último se pueden lograr enlaces al metal de
mayor o menor fuerza (Cotton 1999). De esta forma puede por ejemplo formarse un
complejo que contenga al pigmento como ligando estable que no fotodisocie. Se puede
pensar entonces en la síntesis de diversos complejos con el pigmento y otro ligando de
44
interés (un neurotransmisor, un aminoácido, u otras biomoléculas) que presenten también
una fluorescencia sensible a la fotodisociación y funcionen así como un marcador de
liberación.
6.2. Síntesis y caracterización del complejo [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN) Cl]+
Para la síntesis de un complejo de Rutenio-RhodBMAPN que presentara quenching
se intentaron diversas estrategias. Una de las primeras ideas consistió en sintetizar un
complejo de la forma [Ru (bpy)2 (RhodBMAPN)2 ]2+, es decir, un complejo en el que la
quinta y sexta posición libre fueran ocupadas por RodaminaB-N-metilaminopropionitrilo.
En tal compuesto podría llegar a observarse un fenómeno de autoquenching en que la
estrecha proximidad de dos moléculas del mismo fluoróforo podria eliminar la
fluorescencia, en foma semejante a la formación de un dimero. Sin embargo, tal compuesto
nunca fue logrado, obteniéndose siempre un complejo de la forma
[Ru(bpy)2(RhodBMAPN) Cl]+. Posiblemente la imposibilidad de formar el complejo bis-
Rodamina se deba a que se utilizó el isómero cis del fragmento Ru(bpy)2XY porque se
consideró que la cercanía de ambos fluoróforos era condición fundamental para el
quenching. Es posible que se impidiera la formación del complejo
cis[Ru(bpy)2(RodBMAPN)2]2+ por impedimento estérico.
Sin embargo, el complejo monosustituido obtenido presentó un fenómeno de
quenching, aún a pesar de no haberse agregado un quencher específico. Los resultados
obtenidos indican que tal complejo presenta una fluorescencia muy baja mientras el ligando
se mantiene unido al centro metálico, y aumenta alrededor de 7 veces su fluorescencia
luego de la fotodisociación. El espectro 1H RMN del mismo muestra señales bajas
correspondientes a ligando libre antes de la irradiación, indicando un alto grado de pureza.
Estas impurezas de todas formas no son significativas, especialmente considerando que la
fluorescencia del complejo antes de la irradiación es suficientemente baja como para que el
cambio se detecte fácilmente. Es decir, la eficiencia cuántica de fluorescencia antes y
después de la irradiación difiere suficientemente como para que la detección sea
significativa.
45
6.3. Liberación con luz verde, origen del quenching
El fenómeno de liberación con longitudes de onda más largas es sin duda la
principal desventaja del compuesto sintetizado. Idealmente, la observación de fluorescencia
no debería modificar el compuesto, de modo tal que en un ensayo biológico sea posible la
observación continua de emisión sin provocar la fotodisociación en el proceso. Esta
limitación obliga a manejar el compuesto con mayor cuidado, y minimizar la cantidad de
imágenes de fluorescencia obtenidas durante el experimento.
Respecto al origen del fenómeno, el resultado obtenido con el compuesto
[Ru(bpy)2(VACN) Cl]+ apunta a que la liberación ocurre porque el complejo de nitrilo-
cloruro posee una banda MLCT relativamente ancha y con máximo en longitudes de onda
menos energéticas, presentando alta absorbancia a 532nm, la longitud de onda de la
excitación del pigmento. Por otra parte, el resultado obtenido con el complejo conteniendo
trimetilfosfina en lugar de cloruro indica que la menor energia de la banda MLCT de los
complejos con cloruro es la responsable del quenching observado. Integrando ambos
resultados, surge que para obtener un complejo estable frente a irradiación con luz de
λ=530nm y que a su vez presente quenching de fluorescencia, debe diseñarse un complejo
en el que: 1) el quenching provenga de la adición de un ligando adicional con solapamiento
espectral, y 2) que el complejo no presente absorcion de la banda MLCT en 530nm. De esta
manera se obtendría un complejo insensible a la luz verde y que a la vez quenchea al
fluoróforo.
En resumen, los resultados indican que en el complejo sintetizado el mismo
sistema que quenchea al fluoróforo y que es responsable de la disminución de la
fluorescencia observada, es el responsable de la fotoliberación con luz verde.
6.4. Ensayos biológicos
En primer lugar cabe destacar que la selección de los modelos biológicos se debió a
razones de disponibilidad de ejemplares y posibilidades técnicas tanto de los equipos
disponibles como del entrenamiento previo de los operadores. En principio, el uso de estos
46
compuestos no está limitado a ningún modelo en particular, y es la deseable que su uso sea
lo más versátil posible. Fue sin embargo intencionado el hecho de que pudiese observarse
el funcionamiento tanto en aplicaciones extracelulares (como tráfico en plantas) como en
ensayos de microinyección. De esta manera pudo observarse la toxicidad al ser aplicado
durante el desarrollo y los posibles efectos de difusión hacia el exterior, ya sea del ligando
como del complejo.
6.4.1. Ganglio de sanguijuela
El uso en neuronas condujo a dos resultados positivos: en primer lugar el pigmento
y el complejo son confinados al interior celular luego de la inyección. Esto no es trivial, ya
que es ampliamente difundido en la bibliografía el uso de Rodamina 6G (un fluoróforo
comercial) como pigmento que ingresa a las células por difusión desde el extrerior. Tal
fenómeno sería claramente perjudicial en un complejo de nuestras características, ya que
implicaría la imposibilidad de marcar una célula con fluorescencia fotoliberando el
pigmento en su interior, ya que esta fluorescencia se comunicaría a las vecinas por difusión.
Sin embargo, el ligando sintetizado no presenta difusión apreciable, ya que varios minutos
después de la microinyección se encuentra aún recluido al contenido celular, sin evidencias
del pigmento en el exterior. Lo mismo ocurre para el complejo sintetizado: luego de su
microinyección a una neurona determinada no se observa difusión hacia el espacio
extracelular o las células vecinas.
El segundo resultado deseado es que ni el complejo ni el ligando resultan tóxicos al
ser aplicados intracelularmente. Si bien no hay evidencias para suponer toxicidad de estos
complejos de rutenio, el ensayo no había sido realizado previamente en nuestro grupo pues
no surgió la necesidad aún de testear compuestos intracelularmente. El hecho de que le
neurona presente el característico disparo espontáneo a lo largo de todo el experimento y
por varios minutos posteriores al experimento (todo el tiempo que duró el registro, de
hecho) indica que la técnica no es significativamente tóxica ni modifica sustancialmente las
47
propiedades funcionales de la célula. Claro está que para afirmar cabalmente que el
compuesto no es tóxico es necesario llevar a cabo un estudio quizás más exhaustivo. En
este sentido, se completaría la información analizando de forma estadística el patrón de
disparo antes y después de la microinyección y la respuesta de la neurona a diversos
fármacos, agonistas excitatorios e inhibitorios, en busca de alguna propiedad que se vea
afectada. De ese modo se podría analizar la toxicidad del compuesto y completarse la
caracterización.
Como primer resultado positivo que se desprende de los ensayos de fotoliberación
se observa que la sonda conserva sus propiedades funcionales en el ambiente fisiológico. Es
decir, las características observadas de aumento de la fluorescencia luego de la irradiación
se observan también cuando el experimento se realiza intracelularmente. Sin embargo, las
dificultades que se desprenden de la inesperada fotoliberación con luz verde también
resultan evidentes y perjudiciales: el hecho de que la fluorescencia se modifique durante la
toma de imágenes (al irradiar con luz verde para observar fluorescencia) genera que no sea
posible realizar time lapse microscopy, ya que en todo momento que se observa el
desarrollo de la fluorescencia se cambia la intensidad de la misma. Esto genera a su vez
dificultades técnicas, ya que el experimento de microinyección debe realizarse “a ciegas”
(dado que si se realiza bajo luz verde para seguir el ingreso del complejo a la célula, se
pierden paulatinamente las propiedades de la sonda).
Del experimento de la cuantificación de la fluorescencia en un ganglio
microinyectado y bajo irradiación se desprende que el aumento de fluorescencia se observa
de forma abrupta con baja irradiación, obteniéndose casi el 80% de la fluorescencia final a
los pocos segundos de irradiación. Se concluye que si se deseara obtener una liberación
más graduada, debiera realizarse el experimento con luz más ténue, ya que la eficiencia de
fotoliberación resulta ser demasiado alta para obtener aumentos paulatinos con la
intensidad utilizada.
48
6.4.2. Arabidopsis thaliana
Previo a la utilización directa del compuesto sintetizado resultó útil analizar el
comportamiento del ligando una vez aplicado al medio de cultivo. En esta serie de
experimentos podemos observar dos elementos claros: la aplicación de RodaminaB–N-
metilaminopropinitrilo al medio conduce a su localización posterior en: 1) los vasos
centrales de conducción; y 2) la capa de células epidérmicas. Es necesario insistir en que las
plantas fueron crecidas con sus partes aéreas fuera del medio de cultivo. De ello se
desprende que la localización en la parte externa de las células epidérmicas en las partes
aéreas proviene probablemente de difusión desde el medio, por las paredes de las células.
Es improbable que la difusión se realice por vía de la capa de cutícula, ya que el pigmento
es altamente hidrofílico; pero un discernimiento más profundo del fenómeno requiere más
análisis. En cualquier caso, el resultado obtenido del ingreso del pigmento por vía de los
vasos conductores del xilema fue fundamental para realizar los experimentos posteriores
evitando la microinyección, técnica mucho más compleja en plantas por la presencia de
pared celular.
Otro resultado interesante es la observación de que, en concordancia con lo que
ocurre en ganglios, ni el ligando ni el complejo difunden hacia el interior de las células en
forma apreciable, y permanece confinado al tráfico vascular o bien la pared celular de la
capa de células epidérmicas. En los experimentos realizados con el complejo, sin embargo,
es necesario aclarar que el fenómeno de fotoliberación con luz verde también trajo
dificultades técnicas, por ejemplo, la dificultad de seleccionar con el microscopio confocal
un plano conveniente (profundidad en el eje z) para tomar las fotografías. Esto es así ya que
en todo momento que se evalúa la fluorescencia se destruye la propiedad funcional de la
sonda, por lo que la selección del plano de profundidad debió realizarse relativamente “a
ciegas”. De todas formas, se observó también en este modelo la propiedad funcional de la
sonda sintetizada: una irradiación con luz blanca generó un notable aumento de la
fluorescencia de la planta. Los experimentos realizados, sin embargo, no son los ideales.
Conceptualmente mejor sería lograr la fotoliberación en alguna región selectiva de la planta
mientras se mantiene otra región en oscuridad, ambas en el mismo campo de la fotografía.
49
Esto conduciría a obtener dos regiones: una “oscura” (no irradiada, y por lo tanto menos
fluorescente) y otra “fluorescente” (irradiada), en la misma fotografía, funcionando así
como control interno. Esto no fue posible por razones de set-up: resultó imposible acoplar
el microscopio confocal a un LED que irradiara selectivamente una región. Sin embargo, en
un dispositivo de tales características sería posible por ejemplo estudiar los patrones de
circulación por los vasos en diferentes partes de la hoja, asociados a la utilización por
parches de grupos de estomas.
Por último, es también interesante destacar del experimento de fotoliberación en
etapas, que se observa también en este caso un fuerte aumento de la fuorescencia en la
primera irradiación, y un cambio no tan llamativo en la segunda. Al igual que lo que ocurre
con el ganglio, la sonda resulta demasiado sensible como para notar un cambio en
irradiaciones posteriores, casi el 80 % de la fluorescencia final se obtiene con unos pocos
flashes de irradiación.
Finalmente, uno de los experimentos más interesantes a llevar a cabo una vez se
afinen las características del complejo consiste en la aplicación para el estudio de linajes
celulares. La microinyección en estadíos embrionarios y la fotoliberación en células durante
el desarrollo permitirían revelar todo el conjunto de células hijas. Esto sería posible dada la
baja toxicidad del complejo (que permitiría seguir un ejemplar microinyectado durante el
desarrollo) y la no difusión del pigmento y el complejo hacia fuera de la célula. De esta
manera, se evita la microinyección en los estadíos del desarrollo (donde las células son más
pequeñas y su impalación presenta complicaciones), sustituyéndose por la fotoliberación,
mucho menos invasiva.
50
7. CONCLUSIONES FINALES Y PERSPECTIVAS
El trabajo que se presenta constituye el inicio de una línea de investigación que
reúne dos campos en gran desarrollo en el marco del diseño de herramientas para estudios
en biología: los compuestos enjaulados y el uso de pigmentos fluorescentes. El compuesto
sintetizado constituye el primer fluorescente enjaulado activable con luz visible, resultando
de utilidad como sonda biológica, pero fundamentalmente en cuanto al nivel de la
información que aportó a la investigación. Las características espectroscópicas emergentes
(como la liberación en longitudes de onda inesperadas), si bien no resultan ventajosas en
este primer complejo sintetizado, tampoco son una traba insondable, ya que no impiden la
utilización en modelos biológicos. Por otra parte, tampoco ponen fin a la investigación, ya
que es posible contemplar la síntesis de una sonda que posea un quencher como ligando
adicional, y presente entonces las características deseadas (baja fluorescencia del complejo
enjaulado, aumento de la fluorescencia luego de la fotoliberación).
Tal síntesis es entonces el paso próximo: se mantendrá la RodaminaB-N-
metilaminopropionitrilo como pigmento fluorescente y se derivatizará un pigmento
coloreado, no fluorescente, que presente un solapamiento espectral con la Rodamina, para
ser usado como quencher. Ambos pigmentos (la Rodamina y el quencher) se coordinarán a
un complejo de Rutenio-bipiridinas. Si resulta un complejo funcional, y presenta las
características deseadas, es previsible que se extienda la síntesis a diversos fluorescentes y
quenchers, para obtener así una familia de compuestos enjaulados fluorescentes con una
amplia gama de espectros de absorción y emisión.
51
8. REFERENCIAS
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54
ÍNDICE
1. Resumen …………………………………………………………………. 2
2. Introducción……………………………………………………………… 3
2.1 Compuestos Enjaulados………………………………………….. 3
2.2 Compuestos de Coordinación……………………………………. 5
2.3. Pigmentos Fluorescentes………………………………………… 8
2.4. Aplicación de Fluoróforos en Modelos Biológicos……………… 10
3. Hipótesis y Objetivos ……………………………………………………. 13
4. Materiales y Métodos……………………………………………………. 15
4.1. Sustancias……………………………………………………….. 15
4.2. Síntesis………………………………………………………….. 15
4.3. Espectroscopía………………………………………………….. 17
4.4. TLC…………………………………………………………….. 18
4.5. Eficiencias Cuánticas…………………………………………… 18
4.6. Modelos animales y vegetales………………………………….. 19
4.7. Fisiología……………………………………………………….. 20
5. Resultados……………………………………………………………….. 21
5.1. Derivatización de Fluoróforos………………………………….. 21
5.1.1. Rodamina 6 G – Aminopropionitrilo ………………… 21
5.1.2. Rodamina B – N-metilaminopropionitrilo .................... 23
5.2. Formación del complejo [Rubpy2(RhodBMAPN) Cl ]+………. 27
5.3. Estudio de la liberación con luz verde…………………………. 31
5.4. Estudio del fenómeno de quenching del complejo formado ….. 34
5.5. Estudio del desempeño del complejo formado en diversos
modelos biológicos…………………………………………………... 35
5.5.1 En ganglios de sanguijuela…………………………….. 35
55
5.5.2. En Arabidopsis thaliana…...………………………….. 38
6. Discusión…………………………………………………………………. 43
6.1. Derivatización de fluoróforos…………………………………… 43
6.2. Síntesis y caracterización del complejo [Ru(Bpy)2(RhodB
MAPN) Cl]+…………………………………………………. 44
6.3. Liberación con luz verde……………………………………….. 45
6.4. Ensayos biológicos……………………………………………… 45
6.4.1. Ganglio de sanguijuela……………………………….. 46
6.4.2. Arabidopsis thaliana ………………………………..... 48
7. Conclusiones Finales y Perspectivas……………………………………. 50
8. Referencias ……………………………………………………………… 51