tesis anael correcta 2013-abril
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Instituto Tecnológico de Los Mochis
OPCION DE TITULACION I
TESIS PROFESIONAL
Identificación y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam)
Que presenta:
Ruiz Guzmán Anael Guadalupe
Para obtener el título de:
LICENCIADO EN BIOLOGIA
Los Mochis, Sinaloa, Enero 2013
Instituto Tecnológico de Los Mochis
TEMA:
Identificación y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha
(Cucurbita moschata Dutch ex Lam) Los Mochis, Sinaloa 2012
REALIZADO EN:
Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle de Fuerte
Director de tesis
Dr. Rubén Félix Gastélum
Asesor interno
M.C. María Ochoa Hernández
DEDICATORIAS
AGRADECIMIENTOS
ÍNDICE
Pág.ÍNDICE DE TABLAS..................................................................................... VII
ÍNDICE DE FIGURAS....................................................................................... VIII
RESUMEN..............................................................................................................
IX
I. INTRODUCCION............................................................................................. 2
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………….. 3
III. JUSTIFICACION………………………………………………………….. 4
IV. OBJETIVOS............................................................................................... 5
4.1. Objetivo general.................................................................................... 5
4.2. Objetivos específicos........................................................................... 5
V. ANTECEDENTES.......................................................................................... 6
5.1. Generalidades de las Cucurbitáceas...................................................... 6
5.2. Origen……......................................................................................... 7
5.3. Importancia de las Cucurbitáceas.......................................................... 7
5.4. Métodos utilizados para controlar las enfermedades y daños por patógenos………………………………………………………………………
8
5.5. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades fúngicas y bacterianas………………………………………………………….
9
5.5.1. Reacción de Cadena Polimerasa (PCR)…………….............. 10
5.5.2. DNA Polimerasa...................................................................... 10
5.5.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio………………….... 11
5.5.4. Desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs)......................... 11
5.5.5. “Primers”………………………………………………........... 12
5.6. Pasos básicos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR)….... 13
5.6.1. Desnaturalización. ................................................................... 13
V
Pag.
5.6.2. Hibridación................................................................................ 13
5.6.3. Extensión.................................................................................. 13
5.7. Electroforesis…………………………………………………………... 14
5.8. Enfermedades de las Cucurbitáceas…………………………………. 14
5.8.1. Síntomas………………........................................................... 15
5.8.2. Comentarios sobre la enfermedad………………………….. 16
VI. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………… 17
6.1. Aislamiento de la batería a partir del gen infectado…………………... 17
6.2. Postulados de Koch…………………………………………………... 18
6.3. Pruebas fisiológicas y bioquímicas…………………………………….. 19
6.3.1. Producción de Levana………………………………………….. 19
6.3.2. Oxidasa………………………………………………………… 19
6.3.3. Pudrición en papa……………………………………………… 19
6.3.4. Dihidrolasa de arginina……………………………………….. 20
6.3.5. Reacción de hipersensibilidad………………………………… 20
6.3.6. Tinción Gram…………………………………………………. 20
6.3.7. Difusión de pigmentos……………………………………….. 21
6.3.8. Prueba de KOH al 3%............................................................... 21
6.3.9. Prueba de catalasa…………………………………………….. 21
6.3.10. Utilización de fuentes de carbono…………………………… 21
6.4. Identificación molecular de los aislados por medio de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)………………………………………………...
23
6.4.1. Cuantificación del DNA´S………………………………….. 24
6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados………………. 25
VI
Pag.
VII. RESULTADOS……………………………………………………………. 26
7.1. Patogenicidad………………………………………………………….. 26
7.2. Pruebas bioquímicas y fisiológicas…………………………………… 28
7.3. Pruebas moleculares para la identificación de la bacteria asociada a la enfermedad………………………………………………………………………. 31
VIII. DISCUSIÓN……………………………………………………………… 34
IX. CONCLUSIONES………………………………………………………….. 36
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….. 37
XI. ANEXOS……………………………………………………………………. 41
VII
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Porcentaje del área foliar dañada por seis aislados de
Pseudomonas syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino,
Calabaza zucchini………………………………………………………………26
Tabla 2a. Morfología colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans
agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el
Municipio de Ahome, Sinaloa, México………………………………………..27
Tabla 2b. Aplicación de las prueba LOPAT para la identificación de la
bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans, agente causal de la
mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome,
Sinaloa, México…………………………………………………………………28
Tabla 2c. Aplicación de las pruebas bioquímicas y fisiológicas para la
identificación de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans
agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el
Municipio de Ahome, Sinaloa, México………………………………………..29
Tabla 3. Pureza de los DNA´S a una absorbencia de A260/A280………..30
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitáceas tipificadas por un melón
honeydew (Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes
masculinas y femeninas y las flores estaminadas (S), que tienen
solamente partes masculinas, son portadas individualmente en
pedúnculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro que
lleva semillas después de una polinización y una fertilización
satisfactoria……………………………………………………………………... 3
Figura 2.- Bases nitrogenadas. Estos componentes de los nucleótidos
son la clave de la especificidad del apareo de las cadenas del ADN,
apareándose siempre una purina con una pirimidina………………………9
Figura 3.- Amplificación exponencial del DNA molde, a través de la
técnica de PCR…………………………………………………………………. 11
Figura 4.- Pasos básicos de un ciclo de PCR……………………………… 11
Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha…………………………. 14
Figura 6.- Ubicación de los oligonucleótidos F2C y C en la región 16S
del DNA ribosomal de procariotes. ISR= Región de secuencia
intergénica por sus siglas en inglés: intergenic sequence región………… 22
Figura 7.- Procedimiento para cargar cada muestra en el
espectrofotómetro NanoDrop ™………………………………………………
23
Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas después de 14 días de la
inoculación, a) calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d)
planta enferma de calabaza Kabocha. Similares a los observado en
campos comerciales de calabaza kabocha………………………………… 26
IX
Pag.
Figura 9.- a) prueba de levana positiva, b) prueba de oxidasa negativa,
c) pudrición en papa negativa, d) dihidrolasa de arginina tubo izquierdo
positivo tuvo derecho negativo, e) reacción de hipersensibilidad en
tabaco…………………………………………………………………………...30
Figura 10.- Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los
DNA´S carriles del 3 al 12……………………………………………………..32
Figura 11.- Amplificación del ADN ribosomal a partir del ADN genómico
de los aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb.
Carriles del 3-12 muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador
de peso molecular 1kb, carril 15 control positivo Pseudomona
aeruginosa……………………………………………………………………….33
X
RESUMEN.
La calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) es atacada por
enfermedades foliares de origen fungoso y bacteriano. En ciclos agrícolas
recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen bacteriano;
las plantas presentan una severa mancha angular limitada por las
nervaduras la cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol
disminuyendo su calidad en el mercado de exportación.
Las siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con
siembras de otras Cucurbitáceas y existe el temor de que esta enfermedad
pueda atacar a otros cultivos miembros de la familia de Cucurbitáceas. Por
lo anterior se desarrollaron los siguientes objetivos a) Identificar la bacteria
mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas. b) Identificar mediante la
secuenciación de ADN ribosomal. c) Determinar la patogenicidad de los
aislados. En el presente estudio se identificó la bacteria Pseudomonas
syringae pv. Lacrymans como el agente causal de mancha angular en
calabaza tipo Kabocha según pruebas fisiológicas, bioquímicas y
moleculares, donde se observaron sus características fenotípicas y
genotípicas de esta bacteria, las cuales se determino los rangos de
hospedante, en otras Cucurbitáceas tales como pepino, calabaza zucchini
y calabaza Kabocha.
Palabras claves: Identificación, Cucurbitáceas, Síntomas, Tizón foliar.
XI
1
I. INTRODUCCIÓN
En el estado de Sinaloa, México, se siembra un promedio de 7,055 has de
Cucurbitáceas anualmente (CAADES, 2004), que incluyen dos especies de calabaza
(Cucúrbita pepo L. y Cucúrbita moschata Duch.), pepino (Cucumis sativus L.),
melón (Cucumis melo L.) y sandía (Citrullus lanatus Thumb). Estos cultivos son
atacados por enfermedades foliares de origen fungoso y bacterial (Cebreros et al.,
1991; León, 1988; Ramírez, 1991); dentro de las primeras resaltan por su
importancia el mildiú (Pseudoperonospora cubensis Berk. y Curt.) Rost., la mancha
angular por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar inducida
por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a Erysiphe
cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como
Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta; sin embargo, en años recientes
se demostró que esta enfermedad es causada por Podosphaera xanthii (Félix-
Gastelum et al., 2005) este grupo de enfermedades se han visto ampliadas por la
presencia de una enfermedad cuyos síntomas eran desconocidos por productores y
técnicos de campo en el norte de Sinaloa. Del mismo modo, se desconoce el agente
etiológico de la enfermedad; así como su ecología, epidemiologia y medidas
adecuadas para su control en campo. Por lo anterior y por solicitud de los
productores de Cucurbitáceas en el norte de Sinaloa (en particular los productores
de calabaza Kabocha) se realizó el presente estudio con el propósito de identificar al
agente causal, lo cual servirá de base para estudios futuros relativos a la ecología,
epidemiologia y manejo de la enfermedad.
1
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En ciclos agrícolas recientes, los productores de calabaza Kabocha (Cucurbita
moschata) del Valle del Fuerte han observado un severa mancha angular en dicho
cultivo. El agente etiológico de esta enfermedad se desconoce y por lo tanto se
desconocen también las estrategias adecuadas para su control. En este sentido los
productores y técnicos de campo han expresado su interés para que se lleven a
cabo estudios relativos a la identificación y el rango de hospedantes del patógeno.
Los síntomas en plantas de calabaza Kabocha se manifiestan mediante un severa
mancha angular en las hojas, lo cual reduce el área foliar y expone los frutos al sol
reduciéndose así su calidad en el mercado de exportación. Los agricultores y
técnicos de campo mencionan que también se han ocurrido síntomas consistentes
en lecciones acuosas en los frutos, y lo relacionan con el mismo organismo que
causa el tizón foliar.
En vista de que en el Valle del Fuerte se produce un amplio grupo de cucurbitáceas
como sandias, melón, pepino, y varios tipos de calabazas, los productores no
descartan la posibilidad que el patógeno pueda atacar a estos cultivos además de la
calabaza Kabocha.
Estudios preliminares indican a las plantas sintomáticas se encuentra asociada una
bacteria en forma de bacilo Gram negativa. El presente estudio aportará
conocimiento para el control de la enfermedad en campo, esto se sustentará en la
cabal identificación del agente causal de la enfermedad y el rango de hospedantes
del patógeno, lo cual contribuirá en la implementación de estrategias de manejo en
calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas.
2
III. JUSTIFICACIÓN
La calabaza Kabocha es atacada por enfermedades foliares de origen fungoso y
bacteriano (Cebreros et al., 1991; León, 1988; Ramírez, 1991); dentro de las
primeras resaltan por su importancia el mildiú (Pseudoperonospora cubensis) el
tizón foliar por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar
inducida por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a
Erysiphe cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como
Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta. La Golovinomyces
cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta.
En ciclos agrícolas recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen
bacteriano. Las plantas presentan un severa mancha angular limitada por las
nervaduras el cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol disminuyendo
su calidad en el mercado de exportación. Esta enfermedad ha sido motivo de
preocupación por parte de los productores que desconocen con precisión el agente
etiológico y sus formas adecuadas de control; además, esta enfermedad viene a
ampliar el grupo de patógenos que atacan a esta cucurbitácea en la región. Las
siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con siembras de
otras cucurbitáceas y existe el temor de que esta enfermedad pueda atacar a otros
cultivos miembros de las familias Cucurbitáceas. Por lo anterior se desarrollo un
estudio que defina la causa de la enfermedad así como el rango de hospedante del
patógeno con el propósito de implementar medidas de control adecuadas en el
futuro.
3
IV. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general.
Identificar la bacteria asociada a síntomas de mancha angular en calabaza
Kabocha y determinar su patogenicidad en el cultivo y en otras
Cucurbitáceas.
4.2. Objetivos específicos
a) Determinar la patogenicidad en calabaza Kabocha de 6 aislados de la
bacteria en condiciones de invernadero.
b) Determinar la patogenicidad en Cucurbitáceas (Calabaza zucchini y Pepino)
de 6 aislados de la bacteria en invernadero.
c) Identificar la bacteria asociada a la mancha angular de calabaza Kabocha
mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas.
d) Identificar molecularmente los microorganismos asociados a la enfermedad
mediante la secuenciación de ADN ribosomal.
4
V. ANTECEDENTES
5.1. Generalidades de las Cucurbitáceas.
Las Cucurbitáceas (Cucurbitácea) son una familia de plantas oriundas en su mayor
parte del Nuevo Mundo, normalmente herbáceas, de las cuales muchas poseen gran
importancia etnobotánica; incluye calabazas (Cucurbita spp), el melón (Cucumis
melo), el pepino (Cucumis sativus), la sandía (Citrullus lanatus) y la calabaza bule
(Lagenaria siceraria)(Watson y Dallwitz, 1992).
Son característicamente hierbas rastreras o trepadoras mediante zarcillos en los
tallos (caulinares); muestran hojas alternas, en general simples, más o menos
lobadas, carnosas. Las flores son unisexuales, las masculinas con traza de gineceo,
generalmente monoicas (Figura 1) (Bryonia craetica excepcionalmente es dióica),
regulares, gamopétalas, pentámeras, con periantio doble y estambres atípicos:
filamento sigmoide rematado por una antera con una única teca, estambres libres o
soldados en tres grupos: (2)+ (2)+1. En las formas primitivas se muestran los pétalos
libres, y el ovario ínfero; algunas presentan inflorescencias. Los frutos son muy
variables; casi siempre son bayas (italicas) o bayas modificadas (pepónides), pero a
veces se presentan como cápsulas (italicas), a veces en elaterio (Watson y Dallwitz,
1992).
5
Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitáceas tipificadas por un melón honeydew
(Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes masculinas y femeninas
y las flores estaminadas (S), que tienen solamente partes masculinas, son portadas
individualmente en pedúnculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro
que lleva semillas después de una polinización y una fertilización satisfactoria.
5.2. Origen.
Existe suficiente evidencia arqueológica para considerar que las Cucurbitáceas
comenzaron a cultivarse por primera vez, de manera sistemática, en los estados de
Puebla, Oaxaca y el Estado de México. Su cultivo también se practicó en épocas
prehispánicas en prácticamente toda Mesoamérica, en la trilogía milpera, junto con
el maíz y el frijol. También se conoció y se cultivo en otras culturas americanas,
como en el caso del Perú, donde se ha encontrado cerámica Mochica con
representación del zapallo. Más tarde, a partir del siglo XVI, se llevó a Europa, Asia y
África (Zitter et al.,1996).
5.3. Importancia de las Cucurbitáceas.
Las Cucurbitáceas (familia Cucurbitácea) forman un grupo diverso de especies
cultivadas en todo el mundo en condiciones muy diferentes y para fines muy
distintos. Las principales tipos cultivados son el pepino, el melón (cantalupo o melón
bordado, honeydew Etc.), sandía, calabaza (Cucurbita spp). Los tipos menores
cultivados incluyen chayote, cidra, pepinillo, pepino cornudo y pepino silvestre (Zitter
et al.,1996).
Todas las Cucurbitáceas son sensibles a las heladas, pero difieren en su capacidad
para resistir el frío y el calor; Se cultivan en tierras bajas y en montañas, en campo
abierto y en invernaderos, así como en regiones tropicales, desérticas y templadas.
La mayoría son plantas trepadoras, pero algunos cultivares modernos de Cucurbita
spp. y de pepino producen plantas compactas y tipo mata (Zitter et al., 1996).
El fruto inmaduro o maduro se consume en fresco o cocinado. Como grupo, los
frutos son relativamente bajos en valor nutritivo; los componentes más notables son
las vitaminas y los minerales. Las semillas de muchas Cucurbitáceas son
importantes fuentes de aceite y proteínas en algunas partes de África, Asia y
6
América Latina. La calabaza búfalo produce una gran raíz con féculas y semillas con
alto contenido en proteínas y aceite. Los brotes, hojas y flores de algunas
Cucurbitáceas se comen y son fuentes ricas en vitaminas y minerales. A pesar de
las grandes diferencias entre las especies de Cucurbitáceas y dentro de ellas,
morfológicamente son muy similares en apariencia (Zitter et al., 1996).
5.4. Métodos utilizados para controlar las enfermedades y daños por
patógenos.
En la actualidad, se sabe que las plantas poseen un amplio rango de sofisticados
mecanismos de defensa. En general, las plantas contrarrestan el ataque de los
patógenos ya sea mediante características estructurales que actúan como barreras
físicas e impiden que el patógeno penetre y se propague en ellas; tales como las
ceras en la superficie de las hojas y frutos, el grosor de la cutícula, grosor y dureza
de la pared externa de las células epidérmicas. En su caso, cuando ya ha penetrado
el hongo, se forman estructuras como las capas de corcho, capas de abscisión,
formación de tílides, sustancias gomosas, cambios en las estructuras celulares,
reacciones de defensa citoplásmica, o la reacción de defensa necrótica también
llamada defensa mediante hipersensibilidad o bien por medio de reacciones
bioquímicas que tienen lugar en sus células y tejidos, las cuales producen
sustancias tóxicas para el patógeno o crean condiciones que inhiben su desarrollo
(Agrios, 2006).
En la agricultura moderna, se intenta lograr la sostenibilidad de la productividad
agrícola. El uso de agroquímicos ha permitido obtener incrementos substanciales en
la producción; no obstante, sus efectos adversos impactan significativamente la
sostenibilidad de la agricultura. La práctica del monocultivo y la contaminación por el
uso indiscriminado de agroquímicos han reducido la biodiversidad de los
agroecosistemas, causando la inestabilidad de los mismos, la cual se manifiesta,
entre otros efectos nocivos, en una mayor incidencia de plagas y enfermedades en
los cultivos. Esto y los problemas de seguridad y salud pública inherentes a la
fabricación y uso de agroquímicos han conducido a la búsqueda y establecimiento
de alternativas de manejo de plagas y enfermedades (Zavaleta, 1999).
7
Los métodos de lucha preventiva frente a las bacterias fitopatógenas son múltiples,
pero se basan esencialmente en: a) la aplicación de técnicas de diagnóstico
sensibles y específicas que permitan detectar las bacterias en el material vegetal; b)
el análisis de las características de las cepas de cada especie y su comparación
molecular con las de otros orígenes; c) el conocimiento de las fuentes de inóculo y
los reservorios de cada bacteriosis en nuestras condiciones; d) el estudio de las
estrategias de supervivencia de las bacterias fitopatógenas en distintos hábitats; y e)
el uso de tratamientos preventivos, entre los que destaca el control biológico
(Peñalver, et al.2009). Así como Programas de saneamiento, solarización, rotación
de cultivos y uso de cultivares resistentes, este último método de control ha sido muy
utilizado para el control de varios patógenos (Zitter et al., 1996).
5.5. Pruebas fisiológicas y bioquímicas para la identificación de bacterias
fitopatógenas.
Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente
utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación
dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas
y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la
clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende
principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.
A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una
cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):
1) Obtener un cultivo puro.
2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se
determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es
importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características
morfológicas de interés.
3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los
métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos,
fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.
4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan &
Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas,
8
denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género,
grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las
pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de
glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad.
5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.
Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos,
producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina
deaminasa, etc.)
5.5.1. Ensayos bioquímicos.
La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes
combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de
similitudes.
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un
grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un
valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son
totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado
para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como
presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un
estudio profundo del metabolismo bacteriano (Sosa-Moss et al., 1996).
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de
cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo
si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores
9
de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos
azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la
determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de
identificación, comerciales, etc.) (Sosa-Moss et al., 1996).
5.5.2. Método para la realización de pruebas fisiológicas y bioquímicas
Para la realización de de las pruebas fisiológicas y bioquímicas existen técnica ya
predeterminadas para la identificación de organismos bacterianos en base a su
composición bioquímica como los siguientes:
1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o
inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador
de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.
2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato
de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.
En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un
medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica,
atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de
medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes
controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa
para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas
con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan
más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su
nombre corriente. (Sosa-Moss et al., 1996)
1) Enzimas vinculadas con la respiración
a) oxidasa
b) catalasa
2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros
2.1) Requerimientos de oxígeno
OF (óxido-fermentación)
10
Crecimiento en caldo tioglicolato
2.2) Producción de ácido, o ácido y gas
Fermentación de carbohidratos
2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas
a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)
b) Gluconato
c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico)
d) Esculina
e) Hipurato
3) Fuente única de carbono
a) citrato
b) malonato
c) hipurato para coliformes
4) Utilización de compuestos nitrogenados
4.1) Reducción de nitrato
a) asimilación
b) denitrificación
4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros
a) indol
b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina
e) Urea
5) Ensayos combinados
a) TSI (Triple Azúcar Hierro)
b) LIA (Agar Hierro Lisina)
c) Bilis esculina
6) Detección de exoenzimas
a) lecitinasa
b) proteasas, coagulasa
c) amilasas
d) celulasas
e) desoxirribonucleasas
11
f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)
7) Misceláneos
a) KCN
b) Bilis
c) producción de pigmentos
8) Test de crecimiento o inhibición
a) Temperatura
b) NaCl
c) Antibióticos
(Sosa-Moss et al., 1996)
5.6. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades
bacterianas.
Dados los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificación
fenotípicos (no todas las cepas de una misma especie muestran características
homogéneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones en ensayos
repetidos y también las limitaciones en las bases de datos, entre otros), los métodos
moleculares se han erigido como procedimientos complementarios, alternativos o
incluso de referencia a los fenotípicos. En la década de los 80, comenzó la
búsqueda de candidatos que, siendo genes estables, permitieran establecer
relaciones filogenéticas entre las bacterias, como los genes que codifican para las
subunidades ribosómicas 5S, 16S, 23S y sus espacios intergénicos. En la taxonomía
bacteriana, el análisis de la secuencia génica del ARNr 16S es la herramienta más
ampliamente utilizada. Este marcador housekeeping está presente en todas las
bacterias. Se presenta como una familia de multigenes u operones cuya función no
se modifica con el tiempo y actúa como un marcador eficiente de evolución.
Además, tiene un tamaño adecuado para realizar el análisis. El ARNr 16S además
de ser útil para la detección de bacterias, proporciona información útil y rápida sobre
su identificación y filogenia mediante la comparación con bases de datos públicas
que contienen un amplio número de de secuencias bacterianas. Así pues, la
identificación mediante el ARNr 16S se fundamenta en su secuencia. (Bosshard et
al., 2003).
12
Posteriormente, y de forma simultánea a los avances tecnológicos en las técnicas de
secuenciación, se han utilizando genes cuya secuencia permite una mayor precisión
o una diferenciación intraespecie en grupos, biovariedades, genovaridades o similar.
Inicialmente, la identificación bacteriana basada en el análisis de las secuencias se
hallaba limitada a determinados centros o laboratorios. En la actualidad y como
consecuencia de la automatización, simplificación del proceso y de la reducción de
su costo, estas técnicas se han introducido en un mayor número de laboratorios.
Este avance ha supuesto que en agosto de 2010 en las listas aprobadas de
nomenclatura bacteriana el número de descripciones de nuevas especies alcance la
cifra de 10.000 (http://www.bacterio.cict.fr/number.html#total). Unas de las técnicas
más utilizadas en la identificación molecular de algún organismo es la Reacción en
Cadena de la Polimerasa conocida como PCR, por su nomenclatura en ingles
(Polymorase Chain Reaction).
5.6.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR, es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1983 por Kary Mullis (Bartlett & Stirling 2003), cuyo objetivo es
obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de
un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o
molde.
Esta técnica es considerada la más revolucionaria del último cuarto del siglo XX.
Con ésta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia
predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma
humano, donde la secuencia de interés representa tan solo una diez millonésima
parte (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).
5.6.2. DNA Polimerasa.
La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta
forma debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir
de la cual fue aislada en el año 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele
abreviarse como "Taq Pol" (o simplemente como "Taq"), y es frecuentemente
13
utilizada en las técnicas de PCR, un método que se utiliza para amplificar
secuencias cortas de ADN.
T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes
hidrotermales, y la polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido caracterizada como
una extremoenzima capaz de soportar las condiciones de alta temperatura
requeridas durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse. Por esta razón ha
reemplazado a la ADN polimerasa proveniente de E. coli (Eco pol) que era la que
originalmente se utilizaba en esta técnica, pero que requería ser reemplazada luego
de cada ciclo de calentamiento aumentando las probabilidades de contaminación y
prolongando los tiempos. La temperatura óptima de funcionamiento de la Taq es de
75–80°C, con una semivida mayor a las dos horas a 92,5°C, 40 minutos a 95ºC y 9
minutos a 97,5ºC. Esta enzima puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de
bases en menos de 10 segundos funcionando a 72ºC de temperatura.
Habitualmente, se suele utilizar de 2 a 3 unidades de DNA polimerasa en una
reacción de volumen 100µl. (Invitrogen 2004).
5.6.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio.
Tanto el ión magnesio como el manganeso tienen una función crítica en la reacción,
requiriéndose a una concentración que oscila regularmente entre 0.5 y 2.5 mM. La
concentración de MgCl2 debe optimizarse para cada ensayo en particular, ya que
puede tener efecto tanto en la especificidad como en el rendimiento de la reacción.
En general, concentraciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo rendimiento,
mientras que en exceso se obtienen amplificaciones inespecíficas.
5.6.4. Desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs)
Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP; distinguibles por sus bases
nitrogenadas) son los ladrillos con los que se construyen las nuevas cadenas de
ADN (figura 2).
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Figura 2.- Nucleótidos. Estos componentes de los nucleótidos son la clave de la
especificidad del apareo de las cadenas del ADN, apareándose siempre una purina
con una pirimidina.
La variación en su concentración afecta la especificidad y fidelidad de la reacción.
Concentraciones altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la
polimerasa efectúa su trabajo, e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. También
afecta a la fidelidad de la reacción el uso de concentraciones desbalanceadas de
estos cuatro ingredientes, siendo las concentraciones usuales, en la mayoría de los
casos, entre 0.2 a 1 mM. Los dNTPs pueden captar iones de magnesio por lo que
las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma
relación, aconsejándose que la concentración de Mg+2 sea 0.5 a 1mM superior a la
concentración de los dNTPs (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).
5.6.5. “Primers”.
Los “Primers” o iniciadores son el componente más sensible que determina el éxito
de un ensayo de PCR. Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucleótidos, y su
contenido en G+C entre 40-75%. La concentración a la que suelen emplearse en
una PCR está en el intervalo de 0.1-0.5 µM. Los iniciadores normalmente se diseñan
15
para ser exactamente complementarios al molde de ADN (Rodríguez-Sánchez y
Barrera-Saldaña, 2004).
5.7. Pasos básicos de la Reacción en Cadena de la Polimerasaa(PCR).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se lleva a cabo en tres pasos en un
termociclador: desnaturalización, hibridación y extensión. A continuación se
describirán.
5.7.1. Desnaturalización.
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de cadena simple que actúa como
molde para la síntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un
calentamiento a 94°C, (figura 3) el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se
separen o desnaturalicen, esto se logra debido a que los puentes de hidrógeno se
rompen dejando al DNA en forma de cadena sencilla, permitiendo así exponer las
diferentes bases nitrogenadas para la hibridación con los “primers” o iniciadores
(Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).
Figura 3.- Amplificación exponencial del DNA molde, a través de la técnica de PCR.
5.7.2. Hibridación.
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El alineamiento específico de ambos iniciadores (cebadores) se produce a una
temperatura determinada por composición de bases y oscila entre 40 y 72°C. Ambas
cadenas originales del ADN sirven simultáneamente como moldes para sintetizar
sus respectivas cadenas complementarias nuevas. Un aumento de temperatura
favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores
con sitios apócrifos del ADN molde (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).
5.7.3. Extensión.
Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la
máxima actividad de la polimerasa (72°C) (figura 4) para evitar alineamientos
inespecíficos de los iniciadores. Con el DNA molde la cadena sencilla, excepto en
sitios donde los indicadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra,
incorporando desoxirribonucleósidos monofosfatos en dirección 3-5. El tiempo de
extensión depende del tamaño de la amplificación, debiendo estimar 1 min. para
alargar 1000 nucleótidos. Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un
último alargamiento de 5 min. a 72ºC, para asegurarse que todos los productos de
amplificación estén completamente terminados y tengan, exactamente la misma
longitud (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004).
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Figura 4.- Pasos básicos de un ciclo de PCR.
5.8. Electroforesis
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas
en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término
electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de
un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego
phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica
consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una
placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a
los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula
determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de
un medio gelatinoso.
Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los
péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas
eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga
neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por
ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos
fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo
(Westermeier, 1997).
5.9. Enfermedades de las Cucurbitáceas
Existen más de 200 enfermedades conocidas de las Cucurbitáceas de diversas
etiologías. El control eficaz de las enfermedades de las Cucurbitáceas requiere de
una identificación acertada de los agentes causales la cual conduce a una reducción
de riegos de pérdida en la producción. Las estrategias de control se basan en la
prevención de las enfermedades y en métodos que limiten la propagación de dichas
enfermedades. El uso de cultivares resistentes a enfermedades ha mejorado
considerablemente el control de las enfermedades en pepino, en melón, sandia y
más recientemente calabaza. La semilla libre de enfermedades está recibiendo
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mayor atención por parte de las empresas productoras de semilla. La práctica de la
rotación de cultivo para prevenir enfermedades se ha convertido en un pilar de la
producción sustentable de Cucurbitáceas.
Dentro de los agentes causales de enfermedades bacterianas se encuentra el
género "Pseudomonas" el cual se ha generalizado en un bacilo Gram negativo con
flagelación polar. En la familia Pseudomonadaceae se incluyen los bacilos rectos o
ligeramente curvados, incapaces de formar esporas y que crecen aeróbicamente. La
ganancia energética tiene lugar por respiración aeróbica, en algunas especies por
respiración anaeróbica (desnitrificación), pero no por fermentación. Desde el punto
de vista fisiológico y metabólico las Pseudomonas se caracterizan por el amplio
espectro de sustratos orgánicos utilizables. También utilizan un gran número de
compuestos heterocíclicos y aromáticos, que no son atacados por otras bacterias.
Algunas especies de Pseudomonas oxidan los azúcares de forma incompleta y
excretan los ácidos correspondientes (gluconato, 2-oxogluconato). (Frazier y
westhoff, 1978; Chen, 2010). Algunos miembros del género son psicrófilos, mientras
que otros sintetizan sideróforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran
valor taxonómico. Es común la presencia de plásmidos (Esnard, 1996; Michel,
2004).
Pseudomonas puede crecer a las temperaturas normales de refrigeración, pero la
temperatura óptima de crecimiento, está comprendida entre 25-30 C ⁰ (Frazier y
westhoff, 1978). Es tolerante a una amplia variedad de condiciones físicas,
incluyendo la temperatura. Es resistente a las altas concentraciones de sales y
colorantes, antisépticos débiles, y muchos antibióticos de uso común. Pseudomonas
tiene predilección por el crecimiento en ambientes húmedos, que es probablemente
un reflejo de su existencia natural en el suelo y el agua. Estas propiedades naturales
de la bacteria, sin duda, pueden contribuir a su éxito ecológico como un patógeno
oportunista (Todar, 2008).
Dentro del género Pseudomonas existe la especie Pseudomona syringae el cual es
un agente fitopatógeno que puede infectar un amplio rango de especies de plantas,
existiendo más de 50 diferentes patovares (Young et al., 1996). Muchos de estos
patovares fueron en su momento consideradas especies individuales dentro del
género Pseudomonas, pero las técnicas de biología molecular tales
19
como hibridación de ADN han mostrado que todos son parte de P. syringae (Kreig y
Holt, 1984).
Dentro de los hospedantes susceptibles a Pseudomona syringae se incluyen a las
Cucurbitáceas como la calabaza, Cucurbita pepo, la sandía, Citrullus lanatus; el
melón, Cucumis melo; y el pepinillo, Cucumis sativus en las cuales ocasiona una
disminución en la producción y calidad en los cultivos. En la incidencia y severidad
de la enfermedad influyen, la susceptibilidad de la planta y el medio ambiente
(Almodóvar, 2005). Dentro de las enfermedades causada por Pseudomona syringae
pv. Lachrymans está la Mancha angular que afecta gravemente a pepino, melón,
sandía, calabaza.
5.9.1. Síntomas de la mancha angular.
La Mancha angular de la hoja ocurre más comúnmente en el pepino, pero también
se le encuentra en melones. Las lesiones sobre el follaje empiezan como manchas
acuosas que cambian de color gris a marrón. Las manchas pueden inicialmente
desarrollar un halo de amarillo a verde pálido. Conforme el tejido afectado se seca,
el tejido interno puede desprenderse, dando a la hoja la apariencia hilachosa. Las
lesiones son delimitadas por las venas, dándole a ellas una forma angular, aunque
en condiciones altamente favorables para la enfermedad, las lesiones pueden
coalescer y formar una severa mancha angular (Figura 5). Las lesiones en los frutos
son generalmente superficiales, y se acompaña de un exudado lechoso claro que se
colecta en la parte más baja de la lesión como una lágrima. Al secarse forma una
delgada costra blanca sobre o adyacente a la lesión (Zitter, et al.1996).
20
Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha.
5.9.2. Métodos de dispersión de la enfermedad.
La bacteria que causa la mancha angular de la hoja sobrevive sobre residuos del
hospedante, en el suelo y dentro de la semilla. Durante las lluvias, las bacterias se
dispersan desde el suelo a los tallos, a las hojas y más tarde a los frutos. Una vez
que la infección toma lugar, el organismo se dispersa en el campo a través de las
manos de los trabajadores. Condiciones húmedas favorecen el desarrollo de la
enfermedad. La lluvia o el riego por aspersión conducen a una rápida dispersión de
la enfermedad. La enfermedad también es dispersada por la maquinaria que se
mueve a través de los campos. La mancha angular es más severa durante periodos
lluviosos prolongados con temperaturas que oscilen entre los 16 a 27ºC (Zitter et al.,
1996).
21
VI. MATERIALES Y MÉTODOS.
6.1. Aislamiento de la batería asociada a la mancha angular de la Calabaza
kabocha.
Se recolectaron hojas de calabaza Kabocha con síntomas de mancha angular en
diez lotes comerciales en el municipio de Ahome y se llevaron al Laboratorio de
Diagnóstico Fitosanitario de la Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte
(JLSVV). De cada muestra se realizaron preparaciones para ser observadas al
microscopio compuesto, de los tejidos adyacentes a las aéreas infectadas. Se
aislaron cepas de las bacterias mediante el método de inmersión del tejido en agua
deionizada esterilizada (Rodríguez-Mejia, 1994); para ello, se hicieron pequeños
cortes de material enfermo de 1-2 mm de longitud. Los trozos se lavaron con agua
destilada y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto.
Después se lavaron en tres ocasiones consecutivas con agua deionizada estéril.
Finalmente, con la ayuda de una aguja de disección esterilizada a la flama, los
trozos se introdujeron en tubos de ensayo con 5ml de agua deionizada estéril. El
material se dejó en reposo durante 5 minutos. Con una asa bacteriológica (100/1)
estéril, Se tomó parte de la suspensión y se sembró mediante estría cruzada en
cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) cortes de 0.5 de longitud
del margen de las lesiones y se colocaron en un tubo de ensayo con agua destilada
estéril. El tejido se agitó durante 25-30 segundos; conseguido se tomó una asada y
se deslizó en forma de estría en agar nutritivo (AN).
También se depositaron trozos de tejido enfermo en placas con PDA. Las siembras
se incubaron a 28 C durante 24 a 48 horas. Después de este tiempo y al detectar el⁰
desarrollo de las colonias bacterianas y de hongos a partir del material enfermo, se
procedió a obtener cultivos puros. Para ello, se observaron las colonias con la
ayuda del microscopio estereoscópico con luz oblicua (Olympus SZX7), procediendo
a separar las colonias basándose en sus características morfológicas. Se trasfirieron
a nuevas placas Petri con PDA. Finalmente las colonias puras de bacterias se
pasaron a tubos de ensayo con agua deionizada estéril. Los tubos se taparon
herméticamente, se etiquetaron y se conservaron a temperatura de 4 C.⁰
(Rodríguez-Mejía, 1994).
22
6.2. Determinación de la patogenicidad de seis aislados de la bacteria asociada
a la mancha angular de calabaza Kabocha.
La patogenicidad de la bacteria asociada a la mancha angular se determinó en
calabaza Kabocha; adicionalmente se incluyeron pepino y calabaza zucchini. Las
semillas de las Cucurbitáceas se trataron con hipoclorito de sodio 0.5%. Se sembró
en vasos de poliuretano de un litro y cuando las plantas tenían 40 días de edad se
inocularon en forma separada con los aislamientos de la bacteria. Los cultivos se
ajustaron 3x 108 ufc/ ml (unidades formadoras de colonias) de acuerdo con la escala
propuesta por McFarland citado por (Kiraly, et al. 1974). Se utilizaron cuatro plantas
de cada especie por aislamiento las plantas inoculadas y las plantas testigo sin
inocular se distribuyeron en un arreglo completamente al azar se cubrieron con
polietileno, previa colocación de papel periódico saturado con agua potable para
inducir un 100% de humedad. Las plantas se incubaron por 48 horas, la temperatura
varió de 8 a 21 C durante este periodo. Enseguida, las plantas se sometieron a⁰
humedad relativa del 100% sólo durante 12 horas (durante la noche) durante 5
noches consecutivas.
23
6.3. Pruebas fisiológicas y bioquímicas.
A diez aislados, incluyendo los seis que resultaron patogénicos se les realizó las
pruebas de (LOPAT), siglas que hacen alusión a: levana, oxidasa, pudrición en
papa, dihidrolasa de arginina, hipersensibilidad en tabaco. También se determinaron
características fisiológicas como tinción Gram, difusión de pigmentos fluorescentes,
crecimiento a 41°C, prueba de KOH y catalasa y por último la utilización de fuentes
de carbono tales como: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa,
D-Arabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa. Todas las pruebas se
realizaron a partir de aislados puros de 48 horas de edad siguiendo procedimientos
previamente descritos (Manovsky, 1982; Fahy y Persley, 1983; Schaad, 1980 y
Rodríguez-Mejía, 1994).
6.3.1. Producción de Levana.
Se utilizó el medio para producción de Levana (Anexo 1.4). La bacteria se sembró
en cuatro partes de la caja de petri con una asa bacteriológica y se mantuvo a 28°C
durante 24-48 hrs. con la caja sin invertirse. Las colonias pulvinadas y mucoides se
consideran positivas, y las colonias planas o ligeramente convexas y húmedas
negativas.
6.3.2. Prueba de Oxidasa.
Para la prueba de oxidasa se esterilizó papel filtro (Whatman # 1), sobre el papel se
colocó con un pica diente estéril una colonia del aislado y se le agregó una gota del
reactivo (Oxidase Reagent REF 55 635); después de un minuto en el papel filtro se
muestra con un color lila a azul significa positivo; sin color negativo.
6.3.3. Pudrición en papa
Tubérculos de papa sana variedad Fianna se sumergieron en una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5 % durante 4 minutos; enseguida se cortaron con un bisturí
rodajas de aproximadamente 5 mm de grosor y con el mismo bisturí se realizó una
24
incisión en el centro de las rodajas, cerca de mechero de bunsen, se tomó una
asada del aislamiento para pasarse por la incisión tres veces. Las rodajas así
inoculadas se pasaron a una cámara húmeda por 72 hrs. Se consideró positivo si en
la incisión se presentaba pudrición, negativo si no se observó síntoma.
6.3.4. Prueba de Dihidrolasa de arginina.
Se utilizó el medio de arginina (Anexo 1.5) el cual se preparó en tubos de ensayé de
16 x 150 mm con tapón de rosca. A partir del cultivo bacteriano se inocularon por
picadura dos tubos del medio con una asa bacteriológica previamente flameada y se
les adicionó 1 ml de aceite mineral estéril y se incubaron a 28°C durante 72 hr. La
prueba se consideró positiva cuando los tubos inoculados presentaron cambio de
color de rosa pálido a púrpura o violeta; La prueba es negativa cuando no hay
cambio de color en el medio de cultivo.
6.3.5. Reacción de hipersensibilidad.
Se utilizó una planta de tabaco var. Xanthi, con cada aislamiento se llenó una jeringa
de 3 ml esterilizada con una suspensión bacteriana de 107 células/ ml; Se tomó una
de las hojas del tabaco entre los dedos y se infiltró en el envés de la hoja, ejerciendo
una pequeña presión, sin traspasar la hoja y se empujó el embolo para infiltrar. Los
resultados se observaron a las 24 horas después de la infiltración. La prueba es
positiva si la zona infiltrada presenta necrosis o flacidez; La prueba es negativa
cuando se observó clorosis después de las 72hrs.
6.3.6. Tinción Gram.
Se marcó un portaobjetos con el nombre del aislamiento y se tomó una asada del
inoculo el cual se sembró en espiral en el centro del portaobjeto y se fijó en el
mechero bunsen, se le añadieron 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación,
hasta que se cubrió por completo 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, la
preparación se lavó con agua destilada utilizando una piseta; se agregaron 1 ó 2
gotas de solución lugol a la preparación por 1 minuto, transcurrido el tiempo, se
lavó, con cuidado se le añadió gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación
25
durante 10 segundos; Se añadió el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas)
durante 30 segundos y se lavó con la piseta; Se secó al aire y se observó bajo el
microscopio compuesto con el objetivo de inmersión.
6.3.7. Difusión de pigmentos
Se utilizó el medio de B de King (Anexo 1.2). Sobre el medio de cultivo en caja petri
se sembraron los asilamientos por estría cruzada. Los resultados se observaron a
las 24 hrs después de la siembra; para ello los cultivos se expusieron a luz
ultravioleta en obscuridad. Se considera prueba positiva si se observa fluorescencia,
la prueba es negativa cuando las colonias no fluorescen.
6.3.8. Prueba de KOH al 3%
En un portaobjetos se colocó una gota de KOH al 3% (Anexo 3); una asada del
cultivo bacteriano se mezcló con el KOH mediante movimientos giratorios durante un
minuto. Si al separar el asa del portaobjetos se forma una hebra viscosa, esto indica
que se trata de bacterias Gram negativas, si la hebra no se forma se trata de
bacterias Gram positivas.
6.3.9. Prueba de catalasa.
Con el asa estéril se tomó una colonia del asilamiento y se colocó en un
portaobjetos, con una pipeta Pasteur se adicionó una gota de H2O2 al 30% (Anexo
3). La prueba es positiva si de inmediato se observarón burbujas. La prueba se
considera negativa cuando no se observan burbujas.
6.3.10. Utilización de fuentes de carbono
Para esta prueba bioquímica se utilizó el medio base de Ayers (Anexo 1.3) el cual se
preparó en matraces erlenmeyer de 500 ml. a cada matraz se le agregó uno de los
siguientes azúcares: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, D-
Arabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980). Los medios de
cultivo se esterilizaron en autoclave a 118°C por 15 min. y se dispensaron en cajas
26
petri. Se utilizaron dos cajas de petri con cada fuente de carbono para cada aislado,
las cuales se sembraron por estría y se incubaron a 28ºC por 7 días. La prueba es
positiva si la bacteria utiliza la fuente de carbono y crece en el medio, y es negativa
si la bacteria no crece en el medio de cultivo.
27
6.4. Identificación molecular de los aislados mediante Reacción en Cadena de
la Polimerasaa(PCR).
Los aislados identificados mediante las pruebas bioquímicas y fisiológicas, se
crecieron en placas de LB (Luria Broth), por 24 horas a 37 °C; de las placas se
colectó una asada de cada aislado por separado y se depositó en un tubo Eppendorf
de 1.5 ml el cual contenía 2 ml de medio LB. Los cultivos se sometieron a agitación
de 200 revoluciones durante 16 horas a 37 °C. El ADN genómico fue empleado para
la identificación molecular posterior, mediante la técnica de la Reacción en Cadena
de la Polimerasaa(PCR). Para la identificación molecular de los posibles
microorganismos de origen procariótico, se tomó 1 μl del DNA eluído y se combinó
con 24 μl de la mezcla de reacción para PCR conteniendo H2O destilada estéril, 0.5
μM de cada uno de los oligonucleótidos; 1X de buffer para PCR; 1mM de MgCl2; 500
μM de cada uno de los dNTPs; 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Cat. No. 10966-030.
Lote TPKB1d, Invitrogen EUA). Se emplearon oligonucleótidos dirigidos a la
amplificación de la región 16S del ADN ribosomal (Figura 6). Para lograr este
objetivo, se utilizaron los oligonucleótidos F2C (5’- AGAGTTTGATCATGGCTC -3’) y
C (5’- ACGGGCGGTGTGTAC -3’) (Shi et al., 1997) los cuales se ubican
respectivamente en las posiciones 8 a 25 y 1392 a 1406 de la secuencia del 16S
rDNA de Escherichia coli (Brosius et al.,1987).
Figura 6.- Ubicación de los oligonucleótidos F2C y C en la región 16S del DNA
ribosomal de procariotes. Región de secuencia intergénica por sus siglas en inglés:
ISR= intergenic sequence región.
Las condiciones del programa de PCR para amplificar el ADNr de procariotes fueron
las siguientes: para la desnaturalización 4 min a 95 ºC, 1 min a 95 ºC; anillamiento 1
min a 55 ºC; elongación 2 min a 72 ºC, por 32 ciclos; y un paso final de elongación
de 5 min a 72 ºC. Una vez terminados los programas de amplificación, se procedió a
su visualización por medio de la técnica de electroforesis. Los tubos Eppendorff
28
16S 23S ISRISR
F2C
C
conteniendo las mezclas de reacción se colocaron en un termociclador (BioRad, Cat.
No. 580BR-2592, CA, EUA).
6.4.1. Cuantificación del DNA´S.
De los tubos Eppendorff conteniendo los productos de PCR se utilizó una fracción
mínima de la cantidad de muestra (0.5-2 µl). Este sistema de medición emplea la
tensión superficial para mantener la muestra estática entre dos fibras ópticas, lo que
permite la medición de muestras altamente concentradas sin la necesidad de utilizar
diluciones.
Antes de empezar se realizó la calibración del equipo: se limpió el pedestal (punto
de medición) con agua mili-q y papel secante suave. Se cargaron 2 µl de agua mili-q
en el pedestal y se inició la lectura.
Procedimiento:
1. Se cuantificó el blanco, es decir, el buffer donde se encuentra el ADN, para
identificar cualquier tipo de contaminación. Se cargaron 2 µl de buffer de elución y se
inicio la lectura.
2. Para medir cada muestra, se ingresó primero el código de cada muestra en la
ventana del software y se cargaron 2 µl de la misma en el pedestal del
espectrofotómetro. Se inició la lectura y se repitió el procedimiento para cada
muestra (Figura 7).
Figura 7.- Procedimiento para cargar cada muestra en el espectrofotómetro
NanoDrop ™
29
6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados.
Para la visualización de los productos de PCR se prepararon geles de agarosa al
1%. La agarosa se disolvió en 50 ml de TAE 0.5 X (40 mM Tris-HCl, ácido acético
pH 8.0, 1 mM EDTA) aplicando calor mediante un horno de microondas por un
período de 45 segundos, y se dejó enfriar a aproximadamente 50 °C y
posteriormente se agregó 1.5 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml) (Sambrook et al.,
1989); se vertió en la base de la cámara de electroforesis con un peine para formar
los pozos. Una vez que la agarosa gelificó, se colocó en la cámara buffer TAE 0.5 X
hasta cubrir el gel. En cada pozo se cargaron 2 µl de buffer de carga (glicerol 30%,
25 mM EDTA pH 8.0, 0.025% colorante azul de bromofenol y xilen-cianol) por cada
10 µl de muestra (producto de PCR). Se empleó como marcador de peso molecular
el marcador de 1 Kb ADN Ladder Plus (Invitrogen, EUA, Cat. No. 15628 019). El
proceso de electroforesis se realizó con un voltaje de 80 V por un tiempo de 40 min.
El gel de agarosa fue visualizado mediante la aplicación de luz ultravioleta en un
fotodocumentador (CHEMIDOC Universal Hood II de Biorad, Cat. No. 765/07032,
CA, EUA).
30
VII. RESULTADOS.
7.1. Patogenicidad de los seis aislados de Pseudomonas syringae pv.
Lachrymans en Calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas.
Sesenta y dos horas después de la inoculación se observaron los primeros síntomas
en la hojas de calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) así como en
pepino, calabaza zucchini variedad (gray), en las hojas se presentaron lesiones
irregulares de color pardo oscuro; Las lesiones se incrementaron en tamaño hasta
cubrir gran área foliar, llegando a causar el atizonamiento; El cual estuvo delimitado
por la nervadura principal en las hojas (figura 8).
Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas después de 14 días de la inoculación, a)
calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d) planta enferma de calabaza
Kabocha. Similares a los observado en campos comerciales de calabaza kabocha.
31
Tabla 1. Porcentaje del área foliar dañada por seis aislados de Pseudomonas
syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino, Calabaza zucchini.
32
Hospedante Daño en porcentaje por planta
Pepino Calabaza zuchini Calabaza Kabocha
Aislamientos
Ps 3 30 80 80
30 80 75
40 80 80
40 80 75
Ps 4 15 12 35
15 12 35
15 12 40
15 13 35
Ps 6 15 35 40
15 35 40
15 35 40
15 35 40
Ps 8 75 80 80
75 80 80
75 80 80
75 80 80
Ps 9 35 50 30
35 50 30
35 50 30
35 50 30
Ps 12 15 50 15
15 50 12
15 70 15
15 70 15
Testigo sin
inocular
0 0 0
7.2. Pruebas bioquímicas y fisiológicas.
Los aislados bacterianos asociados a la mancha angular de calabaza Kabocha
(Cucurbita moschata Dutch ex Lam) caracterizadas fuerón Gram negativo, las
colonias fueron circulares, puntiformes, convexas, suaves y de un color blanco a
crema (Tabla 2a). Todos los aislamientos indujeron a reacción de hipersensiblilidad
en tabaco. También produjeron pigmento fluorescente en el medio B de King.
Fueron positivas para las pruebas de catalasa y levana, pero fueron negativas en
caso de oxidasa y Dehydrolasa arginina (figura 9). Los aislamientos no utilizaron
Celobiosa, Trehalosa, D-arabinosa, L-ramnosa, Lactosa, Sacarosa, Adonitol,
Maltosa, pero utilizarón Manitol, Sorbitol, Inositol. Ningún aislamiento creció a 41°C
(Tablas 2b y 2c).
Los resultados arriba indicados sugieren que los díez aislamientos en el municipio
de Ahome, Sinaloa corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans lo cual
concuerda con estudios previos (Schaad., 1980; Rodríguez-Mejía 1994).
Tabla 2a. Morfología colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente
causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome,
Sinaloa, México.
Esperado
según
(Schaad.,
1980)
Resultado
Morfología
colonial
Forma
Circular,
Puntiforme
Circular,
Puntiforme
Bordes Uniforme Uniforme
Elevación Convexa Convexa
Color
Blanco a
Crema
Blanco a
Crema
Superficie Lisa Lisa
33
Tabla 2b. Aplicación de las prueba LOPAT para la identificación de la bacteria
Pseudomonas syringae pv. Lacrymans, agente causal de la mancha angular de
calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, México.
Aislamientos
Prueba
bioquímica y
fisiológica
(Schaad.,
1980)
PS
3
PS
4
PS
5
PS
6
PS
7
PS
8
PS
9
PS
10
PS
11
PS
12
Levana + + + + + + + + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - -
Pudrición en
papa - - - - - - - - - - -
Dihidrolasa de
arginina - - - - - - - - - - -
Reacción de
hipersensibilidad + + + + + + + + + + +
Figura 9.- a) prueba de Levana positiva, b) prueba de Oxidasa negativa, c)
pudrición en papa negativa, d) Dihidrolasa de arginina tubo izquierdo positivo tubo
derecho negativo, e) reacción de hipersensibilidad en tabaco.
Tabla 2c. Aplicación de las pruebas bioquímicas y fisiológicas para la identificación
de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha
angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, México.
34
Aislamientos
Prueba bioquímica
y fisiológica*
(Schaad.,
1980) Ps
3
Ps
4
Ps
5
Ps
6
Ps
7
Ps
8
Ps
9
Ps
10
Ps
11
Ps
12
Caracteristicas
fisiologícas
Tinción Gram - - - - - - - - - - -
Difusión de
pigmentos
fluorescente + + + + + + + + + + +
Crecimiento a 41˚C - - - - - - - - - - -
Prueba de KOH + + + + + + + + + + +
Catalasa + + + + + + + + + + +
Utilización de
fuentes de
carbono
Maltosa - - - - - - - - - - -
Adonitol - - - - - - - - - - -
Sacarosa - - - - - - - - - - -
Lactosa - - - - - - - - - - -
Inositol + + + + + + + + + + +
Ramnosa - - - - - - - - - - -
Arabinosa - - - - - - - - - - -
Sorbitol + + + + + + + + + + +
Trehalosa - - - - - - - - - - -
Celobiosa - - - - - - - - - - -
Manitol + + + + + + + + + + +
*Los resultados se registraron de 4-5 días después de la siembra de los 10 aislamientos de la bacteria en los medios de cultivos respectivos.
5.3. Pruebas moleculares para la idenficiación de la bacteria asociada a la
enfermedad.
35
Para llevar a cabo las pruebas moleculares se realizó la extracción y cuantificación
de ADN; y enseguida se corrió en electroforesis para su estabilidad antes de ser
sometida a la reacción de PCR (Figura 10).
Figura 10.- Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los DNA´S
carriles del 3 al 12.
En el protocolo del espectrofotómetro NanoDrop ™ a una relación de A260/280 la
pureza de los DNA debe estar entre 1.8 y 2.1, ocho de las muestras tiene pureza
absoluta y solo dos tiene residuos de proteínas, polisacáridos, polifenoles, entre
otros elementos considerados como contaminantes en el proceso de extracción
(Tabla 3).
Tabla 3. Pureza de los DNA´S a una absorbencia de A260/A280
36
Muestras
Concentración de Ácidos
nucleídos Unidad A260 A280 A260/A280
3 18.8 ng/µl 0.375 0.166 2.26
4 3.3 ng/µl 0.066 0.03 2.2
5 18.6 ng/µl 0.372 0.188 1.98
6 77.7 ng/µl 1.555 0.78 1.99
7 30.5 ng/µl 0.61 0.298 2.05
8 95.4 ng/µl 1.908 0.914 2.09
9 41.7 ng/µl 0.833 0.405 2.06
10 25 ng/µl 0.5 0.244 2.05
11 26.5 ng/µl 0.53 0.269 1.97
12 72.2 ng/µl 1.445 0.703 2.06
El análisis molecular de ADN obtenido de diez asilados de Pseudomonas syringae
pv. Lacrymans causante de la mancha angular de calabaza Kabocha, y sometido a
PCR, permitió la amplificación para lograr un producto de 1400 a 1500 pares de
bases (pb), los cuales fueron iguales en tamaño al control positivo Pseudomona
aeruginosa (figura 11).
Figura 11.- Amplificación del ADN ribosomal a partir del ADN genómico de los
aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb. Carriles del 3-12
muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador de peso molecular 1kb, carril
15 control positivo Pseudomona aeruginosa.
37
A continuación, la secuencia consenso se introdujo en bases de datos de acceso
público (NCBI), con el objetivo de identificar los 10 aislados mediante la comparación
con las otras secuencias depositadas, en estas bases. Actualmente, la base de
datos que presenta mayor número de consultas por su mayor versatilidad en
organismos, orígenes, genes, y tipo y número de secuencias depositadas es la base
pública GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con programas como BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para el alineamiento de secuencias. Además,
GenBank contiene una sección de taxonomía (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
que incluye información y secuencias sobre más de 160.000 organismos.
En esta base de datos se identifico de los diez aislado un solo género Pseudomonas
syringae pv. Lacrymans.
VIII. DISCUSIÓN
38
La mancha angular de la calabaza Kabocha se ha presentado en condiciones
epidémicas en sitios agrícolas recientes en el Municipio de Ahome; estudios previos
mencionan a esta enfermedad de las Cucurbitáceas causando pérdidas
considerables en otras zonas productoras en este tipo de hortalizas (Zitter et al.,
1996) los síntomas observados en calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome se
asemeja a los previamente reportados (Zitter et al., 1996). Sin embargo, en esta
región se manifiestan como lesiones pequeñas y acuosas a partir de los bordes de
las hojas, éstas se incrementan en tamaño e invaden hasta una tercera parte de la
lámina foliar sin delimitarse su avance por las nervaduras. En la inducción de la
mancha angular de las Cucurbitáceas se ha implicado a la bacteria Pseudomonas
syringae pv. lacrymans (Young, 1996; Kritzman y Zutra, 1983a).
Pruebas en condiciones de invernadero en el presente estudio, demostraron la
patogenicidad de seis aislados bacterianos obtenidos de calabaza Kabocha con
síntomas de mancha angular en campo en el municipio de Ahome. Estos aislados
resultaron patogénicos en la propia calabaza Kabocha así como en calabaza
zucchini y pepino. La severidad de la enfermedad en hojas inoculadas coincide con
estudios previos (Elwakil et al., 2001) donde se ha demostrado que en inoculaciones
artificiales la bacteria en más severa en estos órganos que en yemas y tallos. La
susceptibilidad de estas dos últimas especies ha sido consignada en trabajos en
otras partes del mundo (Fatmi et al., 2008). Los resultados indican que bajo las
condiciones del norte de Sinaloa, la mancha angular puede diseminarse hacia
plantaciones comerciales de pepino y calabaza zucchini los cuales cubren una
superficie de 3,066.98 y 5217.90 ha, respectivamente, en el norte de Sinaloa durante
el otoño e invierno (SIAP, 2012).
Las pruebas fisiológicas y bioquímicas indicaron que la bacteria asociada a la
mancha angular en calabaza Kabocha y cuya patogenicidad se demostró en el
mismo cultivo así como en pepino y calabaza zucchini es P. syringae pv. lacrymans
(Smith y Bryan) Yong et al. Dichas pruebas levana, oxidasa, pudrición en papa,
deshidrolasa de arginina e hipersensibilidad en tabaco (LOPAT), así como la
capacidad de los aislados para la asimilación de fuentes de carbono como son: D-
manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, D-Arabinosa, L-
Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980).
39
Las pruebas moleculares ubicaron a diez de los aislados como P. syringae, pero
sólo uno de ellos se identificó como P. syringae pv. lacrymans. Estudios adicionales
deberá desarrollarse para la cabal identificación de todos los aislados obtenidos en
el ciclo agrícola 2011-2012, así como los obtenidos del ciclo 2012-2013. Enseguida
se deberán desarrollar investigación sobre el estudio de la diversidad genética del
patógeno donde se aborden técnicas moleculares de Reacción en Cadena de la
Polimerasaaen combinación con Polimorfismos de Pongitud de Fragmentos de
Restricción (PCR-RFLP, por sus siglas en inglés) tal como se ha realizado en
algunos países Europeos (Olczak-Woltman et al., 2007).
Estudios adicionales sobre P. syringae pv. lacrymans deberán considerar la
sobrevivencia de este patógeno en residuos de la cosecha incorporados al suelo en
de norte de Sinaloa; en este sentido, aún cuando este tema ha sido abordado en
otras partes del mundo (Kritzman y Zutra, 1983a), los resultados no son aplicables a
esta región, pues las Cucurbitáceas se siembran durante la temporada de otoño-
invierno y el patógeno debe sobrevivir el verano, lo cual contrasta con otros estudios
donde las Cucurbitáceas se cultivan en verano y el patógeno sobrevive durante el
invierno.
Estudios previos también indican que P. syringae pv. lacrymans se transmite a
través de semilla de Cucurbitáceas (Kritzman y Zutra, 1983b; Gomah,1997;
Gustafson y Gustafson, 1980); este tema deberá considerarse en futuras
investigaciones con el fin de eliminar el patógeno de la simiente, pues esto
contribuirá de manera significativa al manejo de la enfermedad.
Finalmente, el presente estudio contribuye al conocimiento de una enfermedad de
origen bacteria en calabaza Kabocha y establece las bases para estudios futuros.
Dichos estudios tendrán aplicación práctica en el manejo de la enfermedad y de esta
forma se minimizará el impacto de la enfermedad en la producción de Cucurbitáceas
en el norte de Sinaloa.
IX. CONCLUSIONES
40
Seis aislados de la bacteria asociada la mancha angular de calabaza Kabocha
indujeron síntomas similares observados en campo al realizar pruebas de
patogenicidad en condiciones de invernadero. Los mismos aislados causaron
enfermedades en otras Cucurbitáceas tales como pepino y calabaza zucchini.
Las pruebas fisiológicas y bioquímicas indican que 10 aislamientos de la bacteria
causante de la mancha angular de calabaza kabocha en el municipio de Ahome
corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans.
Pruebas moleculares de los 10 aislados indican que la bacteria causante de la
mancha angular de la calabaza Kabocha y otras Cucurbitáceas en el municipio de
Ahome corresponde a Pseudomonas syringae. Estudios moleculares adicionales
son necesarios para determinar la identidad a nivel patovar.
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XI. ANEXOS
FÓRMULAS DE MEDIOS DE CULTIVO
I. MEDIOS DE AISAMIENTO
45
I.1 MEDIO PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)
Infusión de Papa 200.0 g
Dextrosa 20.0 g
Agar Bacteriológico 15.0
Agua 1000.0 ml
pH 5.6 ± 0.2
Método:
Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación
suave hasta su completadisolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en
autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15minutos. Enfriar a una
temperatura entre 45-50 °C y vaciar en placas de Petri estériles.
I.2 MEDIO B DE KING (B. K.)
Tripteína 10.0 g
Peptona de carne 10.0 g
Fosfato dipotásico 1.5 g
Sulfato de magnesio* 7H2O 1.5 g
Agar 15.0
Agua 1000.0 ml
pH final: 7.2 ± 0.2
Método:
Suspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de
glicerina. Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar
a ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos
a 121 ºC.
II. MEDIOS PARA CARACTERIZACIÓN
1.3 MEDIO AYERS UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO
46
Fosfato monobásico de Amonio 1.0 g
Cloruro de potasio 0.2 g
Sulfato de magnesio * 7 H2O 0.2 g
Azul de bromotimol 0.03 g
Agar 12 g
Agua 1000.0 ml
pH final: 7.2 ± 0.2
Método:
Se le agrega a la concentración final 0.1 % (w/v) de la fuente de carbono y se
esteriliza en autoclave por 15 min. a 15 lb de presión.
1.4 MEDIO PARA PRODUCCIÓN DE LEVANA
Extracto de carne 3 g
Peptona 10 g
Sacarosa 50g
Agar 20g
Agua 1000.0 ml
Método:
Calentar con agitación constante para homogeneizar el producto. Llevar a
ebullición para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a
121 ºC.
1.5 MEDIO DE ARGININA
Peptona 1 g
Cloruro de sodio 5g
Difosfato de potasio 0.3 g
Agar 3 g
Rojo de fenol 1.0 mg
L (+) hidrocloruro de arginina 10 g
Agua 1000.0 ml
Método:
47
Disolver los ingredientes en agua destilada y ajustar el pH a 7.2; distribuir en
tubos y esterilizar a 121 ºC. durante 15 min.
III. REACTIVOS
3.1. KOH
Hidróxido de potasio químicamente puro.......................... 40 g
Creatina............................................................................. 0.3 g
Agua destilada........................................................... cbp 100 mL
Preparación:
- Agregar el hidróxido de potasio a 75 ml de agua destilada, agitando y enfriando
constantemente.
- Cuando la solución está más ó menos a temperatura ambiente (25 °C) agregar
la creatina y suficiente agua destilada para obtener un volumen final de 100 ml.
3.2. REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA CATALASA.
Solución acuosa de Peróxido de Hidrógeno de 10 volúmenes %
48