term mol

TERMINOLOGA DE LOS

MTODOS MOLECULARES

Lic. TM Juan Cceres Torres

BIOLOGIA MOLECULAR

Su objetivo es el estudio de la

bases moleculares de la vida.

Estudia todos aquellos procesos

celulares que contribuyen a que la

informacin gentica se transmita

eficientemente en los nuevos

individuos.

Relaciona las estructuras de las

biomolculas con las funciones

especficas que desempean en la

clula y en el organismo.

HISTORIA DE LA BIOLOGA MOLECULAR

1865 Gregor Mendel Reglas bsicas de la herencia

1869 Johann Friedrich Miescher descubri el DNA (nuclena)

1902 - Emil Hermann Fischer postul propiedades protenas definidas por la composicin y disposicin de sus aminocidos

1911 Thomas Hunt Morgan descubre los genes en los cromosomas

1950 Edwin Chargaff Citosina se complementa con Guanina y

Adenina con Timina

1952-1953 James D. Watson y Francis H. C. Crick deducen la estructura de doble hlice del DNA

1961 Francois Jacob

Investig sobre la forma en que los genes trasmiten la informacin

1970 Howard Temin and David Baltimore independientemente aislan la primera enzima de restriccin (DNA puede cortarse en piezas reproducibles)

1996 secuenciacion del genoma

de Saccharomyces cerevisae

1997 secuenciado Escherichia coli cepa K-12

2000 Secuencia completa del genoma de Drosophila melanogaster

2003 Abril

Proyecto Genoma Humano Completado

APAREAMIENTO DE BASES : Proceso por el cual las

bases de purinas y pirimidinas se unen a travs de puentes

de hidrgeno. La adenina se une con la timina ( o el uracilo)

y la guanina con la citosina.

SECUENCIA DE BASES : Es el orden exacto de las bases

purnicas (G y A) y pirimdicas (C,T o U) hallado en los

cidos nucleicos. Este orden define la secuencia primaria

de aminocidos de los productos genticos, que son las

protenas.

DNA COMPLEMENTARIO (cDNA) : Es el DNA que

contiene una secuencia exacta de bases que se va a

emparejar a una hebra de DNA o RNA a travs del

apareamiento de bases. Este cDNA puede ser usado como

una sonda para detectar secuencias especficas.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN : Clase de nucleasas

(usualmente bacterianas) que actan sobre una hebra de DNA

a una secuencia especfica de bases para cortar el DNA.

POLIMERASAS : Clase de enzimas que sintetizan DNA de un

templado existente. Las polimerasas requieren de un cebador

para iniciar la sntesis, usando ribo o deoxiribonucletidos

trifosfatos como reactantes y magnesio como cofactor.

HIBRIDIZACIN : Proceso por el cual hebras simples de

cidos nucleicos complementarias forman complejos de doble

hebra a travs del apareamiento de bases.

CARACTERSTICAS GENERALES DEL

GENOMA

Genoma (gen, origen) es el conjunto total de

material gentico hereditario presente en una

clula tanto nuclear como extranuclear,

codificante o no.

Organismos Procariontes (eubacteria y

arqueobacterias) se reduce a un nico

cromosoma formado por una molcula circular de

ADN.

En Eucariontes son variadas

y complejas.

El genoma nuclear aparece

bajo dos formas:

a) Cromatina

b) Cromosomas

El genoma de los orgnulos

est organizado en

cromosomas circulares igual

que el de los procariotas.

EXONES

Secuencias que

codifican proteinas o

ARNs.

INTRONES

(ADN intragnico)

Secuencias que no

codifican.

MAGNITUD DEL GENOMA NUCLEAR

El material gentico contenido en el ncleo

supone ms del 90% del total de ADN.

La magnitud se puede expresar de varias

formas:

a) En nmero de cromosomas (n, 2n).

b) En masa de ADN (pg = picogramos).

c) Expresarlo en longitud: pb (en hebra sencilla).

Para molculas largas Kb o Mb.

El tamao del genoma

humano es de 3 x 109 pb.

En forma lineal, la longitud

total del ADN de una clula

humana somtica seria de

unos 2 metros.

GENOMA HUMANO

Las clulas de individuos de una misma especie poseen la misma cantidad de ADN y nmero de cromosomas.

El contenido total de ADN, expresado en pg o en pb, y el nmero de cromosomas varan ampliamente entre especies diferentes.

COMPLEJIDAD DEL GENOMA

No existe correlacin entre el tamao del genoma de distintas especies y el nmero de cromosomas que lo componen.

TAMAO DE ALGUNOS TIPOS DE

GENOMAS

Organismo Tamao

Genoma (pb.)

Fago 5104

Escherichia coli 4106

Levadura 2107

Caenorhabditis

elegans 8107

Drosophila

melanogaster 2108

Humano 3109

GENOMA HUMANO

GENOMA NUCLEAR GENOMA

MITOCONDRIAL

ARNt 22 genes

Codifican Protenas

13 genes

Codifican ARN 24 genes

ARNr 2 genes

CONDENSACIN DEL ADN

El ADN debe empaquetarse en un ncleo de aproximadamente 5 m.

Esto representa una condensacin de ms de 100 000 veces.

Esto se debe a dos aspectos teoricamente independientes pero funcionalmente relacionados.

1. El empaquetamiento del ADN debido a la

asociacin de protenas.

2. El superenrrollamiento (Supercoils) del ADN.

BIOLOGA MOLECULAR APLICADA AL

LABORATORIO CLNICO

Anlisis de material gentico de

diversos organismos

Muestra: cidos nucleicos (ADN,ARN)

Basadas en complementariedad

(especificidad)

PCR, reaccin en cadena de la

polimerasa (sensibilidad)

PATOLOGA MOLECULAR

Es una subespecialidad de la patologa que

utiliza las tcnicas de la biologa molecular

para:

Detectar estados de enfermedad

(diagnstico)

Predecir la progresin de la enfermedad

(pronstico)

SUBESPECIALIDADES DE LA PATOLOGA MOLECULAR

ENFERMEDADES HEREDITARIAS (GENTICAS)

Fibrosis qustica

Anemia Falciforme

Predisposiciones al cncer

ENFERMEDADES INFECCIOSAS Bacterianas

Viral

Fngicas


HEMATOPATOLOGA

Leucemias

Linfomas

TUMORES SLIDOS

Cncer de mama

Cncer de colon


FORENSE

PRUEBAS DE IDENTIFICACIN

HLA

Parentesco

Diagnstico y

seguimiento

Agente etiolgico Susceptibilidad

Pronstico Identificacin de especie

Estudio de brotes Factores de patogenicidad

MICROBIOLOGA

De crecimiento lento

No cultivables

Fastidiosos

No identificables por mtodos

convencionales

Mtodos serolgicos S y E

MICROORGANISMOS A

ANALIZAR

Mycobacterium tuberculosis

Virus Herpes 1 y 2

Virus Hepatitis C

Trypanosoma cruzi

HTLV 1 y 2

ENZIMAS DE RESTRICCIN

Endonucleasas especficas

Reconocen secuencias especficas cortas de DNA y

cortan al DNA en o cerca de la secuencia reconocida

Reconocimiento de secuencias: usualmente 4 o 6 bases

pero hay algunos que son de 5, 8, o mayores

Reconocimiento de secuencias es palindrmica

Palndromo: secuencia de DNA que es la misma cuando

una hebra es leda de izquierda a derecha o la otra hebra

es leda de derecha a izquierda consiste de repeticiones adyacentes invertidas

ENZIMAS DE RESTRICCIN

Ejemplo:

GAATTC

CTTAAG

Son aisladas de bacterias

Su nombre se deriva de la bacteria

Gnero- Primera letra en mayscula

Especie- segunda y tercera letras (minscula)

Letras adicionales a partir de las cepas

Nmeros romanos designan a diferentes enzimas de la misma cepa

bacteriana, en orden nmerico a su descubrimiento

Ejemplo: EcoRI

E Escherichia

Co coli

R cepa R

I 1era. enzima descubierta del Escherichia coli R

SONDAS

Es un cido nucleico que :

Puede ser etiquetado con un marcador que permitir su

identificacin y cuantificacin

Se hibridizar con otro cido nucleico debido la

complementaridad de sus bases

Tipos de marcadores

Radioactivos (32P, 35S, 14C, 3H)

Fluorescentes

FISH: fluorescent in situ hybridization

Cromosomas

Biotinilados (avidina-estreptavidina)

Hibridacin de cidos Nucleicos

Surge de la observacin del proceso de renaturalizacin de un ADN previamente desnaturalizado.

TECNOLOGIAS DE HIBRIDACIN

HIBRIDACIN: SONDAS DE ADN

Sonda de Hibridacin

El principio de la tcnica se basa en los enlaces

de hidrgeno entre GC y AT

Doble hebra DNA

Denaturacin

Hebra simple DNA

Apareo de bases

inicial

Denaturacin - Renaturacin

DNA Renaturado

Renaturacin

Hibridacin In Situ

Mary Lou Pardue y Joseph Gall (1960):

cromosomas gigantes presentes en las

glndulas salivales de Drosophila para mapeo

de transcritos.

Se aplica en muestras en su ubicacin natural,

generalmente aquellas preparadas para

microscopia.

Actualmente se utiliza bajo la forma de FISH

para identificar y mapear regiones

cromosmicas complementarias a cDNAs

SOUTHERN BLOT

Desarrollada por E.M. Southern.

Implica cinco etapas bien diferenciadas:

Separacin electrofortica

Desnaturalizacin

Transferencia

Hibridacin

Deteccin

TRANSFERENCIA DE BANDAS

SOUTHERN BLOT

NORTHERN BLOT

El procedimiento es identico, pero el acido

nucleico analizado es ARN.

Por su menor tamao no es necesario su

fragmentacin con endonucleasas.

Se emplea principalmente para obtener

informacin sobre el tamao de ARNs y

sobre el modelo de expresin de genes

especificos.

WESTERN BLOT

Se emplea para detectar las proteinas presentes en una muestra.

La muestra es sometida en Gel de Poliacrilamida en presencia de SDS y transferida a una membrana.

La deteccin de las bandas proteicas en la membrana o filtro se realiza gracias a la unin especifica de un anticuerpo contra la protena o regin proteica que se quiere estudiar.

TRANSFERENCIAS

TRANSFERENCIA MATERIAL

TRANSFERIDO SONDA REFERENCIA

Southern ADN ADN, ARN Southern (1975)

Northern ARN ADN Alwine (1977)

Western Proteinas Anticuerpos Burnette (1981)

MICROARRAYS

(MICROARREGLOS) (DNA Chip)

La tcnica de microarreglos se basa en la hibridizacin de

las molculas de DNA o RNA para la realizacin de

estudios a gran escala. Su "ancestro tcnico" es el

Northern blot.

Un DNA microarray (DNA Chip) es un biosensor que

analiza informacin gentica de humanos y bacterias.

Una sonda DNA es colocada en lminas de vidrio en la

forma de micropuntos de algunos micrmetros de

dimetro dispuestos en filas mltiples.

Los genes son extrados de muestras como la sangre,

amplificados y luego reflejados en el DNA chip,

permitiendo investigar caractersticas tales como la

presencia y mutacin de genes.

COMO SE CONSTRUYEN LOS DNA CHIPS

PASO 1: CONSTRUIR SONDAS DNA

Usando tcnicas convencionales tales como PCR y sntesis bioqumica, se construyen y purifican hebras de DNA identificado. Existen una variedad de sondas disponibles en el mercado.

PASO 2: FABRICACIN DE LA

LMINA SUSTRATO

Se emplean la fotolitografa y otras tcnicas de nanomanufactura para convertir al vidrio y a lminas de plstico en receptculos para las sondas DNA.

PASO 3: DEPSITO DE

SECUENCIAS GENTICAS

Se usan una variedad de procesos como la disposicin por medio de la robtica para adherir el material gentico al sustrato. Se deben observar condiciones higinicas y estndar para lograr el control sobre grado de contaminacin mximo permitido durante el proceso.

Preparacin de Microarreglo Sondas de cDNA

LECTURA

Tecnologa del Microarreglo

Se combinan cantidades iguales

Las sondas se hibridizan en el microarreglo

Se marcan con reactivos fluorescentes

PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION)

Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un termociclador.

El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.

Se realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:

2. Apareamiento o anneling:

Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares

especficos por complementariedad de bases. Para esto, se

baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn

sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin.

Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio

comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos

trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De

estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las

hebras de DNA molde

Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea

necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

Sntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * * A C G -T

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

Cortos primers de DNA especficos hibridizan con la

cadena que tiene que ser copiada

5 3

Sntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T -T A C G T A


5 3

Despues del primer periodo de sntesis de

DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?


Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta

temperatura (~100C)


Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva

cadena con la DNA polimerasa

Al mismo tiempo, la cadena original se copia

nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1

2

1

Ahora tenemos dos copias de la molcula original


Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias


Fusin

95C

Hibridizacin

50-60C

Extensin de

La cadena

75C

Primer Ciclo

2do Ciclo

95C

50 - 60C

75C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en

el nmero de copias

En el PCR hay una amplificacin exponencial

COMPONENTES ESENCIALES EN

EL PROCESO ESTNDAR DEL PCR

1) ADN molde (Templado) : DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud. El mnimo va de 10-100 ng y el mximo entre 400-500 ng.

2) ADN polimerasa termoestable (Taq ADN polimerasa, Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis)

3) Oligonucleotidos iniciadores (primers) (secuencia conocida, presencia en exceso)

4) Dinucletidos trifosfatados (dNTPs) dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

5) Tampn de reaccin

1) Cationes divalentes (Mg ++)

2) Cationes monovalentes (Na +)

3) Buffer (para mantener el pH)

ANLISIS DE LA MUESTRA

La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico.

Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

ANLISIS DE LA MUESTRA

La posterior visualizacin se puede realizar con

bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de

plata, fluorescencia, radioactividad

Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas

(primers inespecficos se

pegan a varios sitios)

UTILIDAD DEL PCR

MADRE PADRE NIO 1 NIO 2 NIO 3 NIO 4

IDENTIFICACIN DE PATERNIDAD

CRIMINALSTICA

Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.

Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)

VENTAJAS DEL PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener

una cantidad considerable para el estudio que se vaya a

realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y

anlisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o

muerto.

Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,

diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

DESVENTAJAS DEL PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde

se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40

pares de bases.

Se necesitan primers especficos que sean

complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo

investigador o de cualquier otro)

AMPLIFICACIN MEDIADA POR

TRANSCRIPCIN (TMA)

LaTMA es un sistema de amplificacin de la transcripcin del RNA que usa dos enzimas para llevar a cabo la reaccin : RNA polimerasa y la reversa transcriptasa.

La TMA es isotermal; la reaccin entera es realizada a la misma temperatura en un bao de agua o en un bloque trmico. Esto contrasta con el PCR que requiere un termociclador para cambiar rpidamente la temperatura para la reaccin.

La TMA puede amplificar tanto DNA como RNA y produce tambin amplicones * de RNA.

La TMA posee una rpida cintica que resulta en una amplificacin de un billn de veces dentro de 15 a 30 minutos.

* Amplicn : Conjunto de molculas de DNA idnticas resultado de una

reaccin de PCR. Esencialmente, se trata de un clon molecular.

CLULAS MADRE

CARACTERSTICAS

Son clulas no especializadas

Capaces de dividirse y renovarse a s

mismas por largos perodos de tiempo

(proliferacin)

Poseen el potencial de dar lugar a tipos

celulares especializados(diferenciacin)

La esperanza con las clulas madre es que se puedan emplear para terapia celular y trasplantes de tejidos, evitando los problemas de falta de donantes y problemas de rechazo del paciente.

CLULAS MADRE

FUNCIONES TERAPUTICAS

Clulas Madre

Clulas Madre

Totipotentes

Embrinicas

Clulas Madre

Adultas

Clulas Embrinicas

Clulas Madre

Teratomas y

Teratocarcinomas

Clulas Madre

Germinales

TIPOS DE CLULAS MADRE

Las clulas totipotentes son capaces de

generar uno o ms tipos de clulas

diferenciadas y es capaz de auto

regenerarse, dando lugar a otras clulas

totipotentes.

CLULAS TOTIPOTENTES

Se dan en la masa interna del embrin a los 7-14 das. A partir de ellas, despus de divisiones celulares se forma el tejido especializado. Pero las diferencia de las clulas madre como tal, porque se van diferenciando a medida que

avanza el perodo de gestacin.

CLULAS MADRE

EMBRINICAS

Estn en la cresta germinal del feto y ah

comienzan su diferenciacin, tambin son

totipotentes.

CLULAS MADRE

GERMINALES

Se sitan en las gnadas en forma de tumor a partir de clulas madre pluripotentes que a su vez derivan de clulas madre germinales. Son tumores con gran diversidad de tipos celulares.

CLULAS MADRE

TERATOMAS Y TERATOCARCIOMAS

Poseen siempre su capacidad multipotencial (pueden originar clulas especializadas de un rgano concreto en el embrin y en el adulto)

Ejemplo: Las clulas de la mdula sea que son capaces de originar los tipos celulares de la sangre y el sistema inmune.

CLULAS MADRE

ORGANO - ESPECFICAS

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