tema 13 métodos manuales y automatizados para la identificación

TEMA 13

Métodos manuales y automatizadospara la identificación microbiana

Tema 13. Métodos manuales y automatizados para la identificación microbiana

1. Esquema general de identificación microbiana2. Métodos convencionales

2.1. Pruebas bioquímicas3. Métodos rápidos

3.1. Sistemas manuales3.1.1. Enterotubo

3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados3.1.2. API

3.1.2.1. Lectura e interpretación de los resultados3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API3.1.2.3. Sistema ATB (API automatizado)

3.2. Sistemas automatizados3.2.1. Abac-Abactor II

3.2.1.1. Procedimiento 3.2.2. Vitek

3.2.2.1. Procedimiento

Microscopio (fresco/tinciones)

Identificación

1. Esquema general de identificación microbiana

Microscopio (fresco/tinciones)

Pruebas genéticasPruebas inmunológicas Muestra

Cultivo puro

Aislamiento(medios selectivos)

Pruebas genéticas

Pruebas inmunológicas

Pruebas bioquímicas

2. Métodos convencionales

2.1. Pruebas bioquímicas

Rápidas (algunas) catalasa, oxidasa

- enzimas preformadas

- inmediatas

Lentas (la mayoría)

- cultivo del microorganismo (18 a 24 horas)

- medios con sustrato a metabolizar

- reacción positiva cambios de color (pH, reactivos)

Cambios de color por pH

+−

Cambios de color por reactivos

3. Métodos rápidos

Pruebas bioquímicas convencionales

• Ayuda inestimable en identificación de bacterias

Sistemas comerciales de identificación

• Manuales

• Automatizados

Ventajas:

• Rapidez de manipulación

• Homogeneidad de resultados (comparación entre laboratorios)

• Disposición de bases de datos (interpretar resultados)

3.1. Sistemas manuales

1880: primeros cultivos de microorganismos en medio sólido (Robert Koch)

1914: comercialización de un medio deshidratado (Difco)

1960-1970: sistemas comerciales (Enterotubo y API 20E)

Primeros sistemas diseñados para enterobacterias

• Frecuencia en muestras clínicas

• Rápido crecimiento

• Buen conocimiento de identificación (pruebas bioquímicas)


Comercialización de pruebas metabólicas en paneles o galerías miniaturizados

• Gran adelanto en identificación de bacterias (principalmente)

Características:

• Pocillos de plástico

• Mínima cantidad de medio o de sustrato (liofilizado o desecado)

• Inoculación directa del medio (rehidratación del sustrato)

• Entre 10 y 50 pruebas

• Manipulación y lectura siguiendo instrucciones del fabricante

• Posibilidad de identificar enterobacterias, bacilos Gram negativos nofermentadores, estafilococos, estreptococos, neiserias, corineformes,bacterias anaerobias y levaduras


Ventajas

• Fiabilidad semejante a pruebas convencionales

• Iguales entre sí

• Ocupan poco espacio (incubación y almacenamiento)

• Larga duración (caducidad: 6-12 meses)

• Manejo sencillo

• Fácil inoculación

• Fácil interpretación de resultados

• Pruebas y medios uniformes

Becton Dickinson Diagnostics

Tubo de polipropileno (forma de lápiz)

12 compartimentos

12 medios de cultivo diferentes (pruebas bioquímicas)

15 resultados posibles

3.1.1. Enterotubo

Alambre para inoculación

Compartimentos

Centro del tuboatravesado por alambre

Alambre sobresale por losextremos (tapones de rosca)

No se necesita suspensiónbacteriana

Inoculación directa desdecolonias aisladas (alambre)

3.1.1. Enterotubo

Insertar alambre en los 4 primeros compartimentos (condiciones anaerobias)

Romper el resto (colocar tapones de rosca)

Agujerear 8 compartimentos restantes (condiciones aerobias)

Incubar horizontalmente 18 a 24 horas a 37ºC

Reactivos inyectados con aguja hipodérmica (a través del tubo de propileno)

3.1.1. Enterotubo

3.1.1.1. Lectura e interpretación de los resultados

Lectura de las pruebas: positivas (1), negativas (0)

Obtención de un número binario (100100111001010)

Agrupar las pruebas de tres en tres

- negativas (todas valen 0)

- positivas

primera del triplete vale 4

segunda vale 2

tercera vale 1

Obtención del número de biotipo (5 dígitos)

Comprobar identificación con ENCISE (Enterobacteriaceae Numerical Coding and Identification System) (registro de perfiles)

3.1.2. API

Suministradas en sobres de aluminio sellados

Bandeja de plástico y tapa transparentes

Biomerieux

3.1.2. API

Tiras de plástico con 20 minitubos

Orificio en parte superior (inoculación)

Contienen sustratos deshidratados de 20 pruebas bioquímicas

Los pocillos de la bandeja se llenan con agua de grifo (mantener la humedad)

Necesaria suspensión bacteriana

• A partir de colonias aisladas

• Agua destilada o solución salina estéril (NaCl al 0,85%)

3.1.2. API

Llenado de los tubos enla galería API 20E

Aceite de parafina

Nivel de llenado

estándarSuspensión bacteriana

Para evitar la formación de burbujas de aire al llenar los tubos, dejar resbalar la suspensión por la pared del tubo

Cúpula

Tubo

Aceite de parafina

Pruebas negativas

Pruebas positivas

API 20E


Pruebas de lectura directa e indirecta (necesitan adición de reactivos)

Identificación de pruebas positivas y negativas por el color

API STAPH

API 20 STREP

Interpretación de resultados en función de tabla

Asignar el valor + ó – a cada prueba (positiva o negativa)



Agrupar las pruebas de tres en tres

• Negativas (todas valen 0)

• Positivas

Primera del triplete vale 1

Segunda vale 2

Tercera vale 4

Conversión del código binario (+ – +) en código octal (de 0 a 7)

… etc. Pruebas no incluidas en la galería

Klebsiella pneumoniaeo Serratia liquefaciensCódigo de la muestra: 5215773

Transformación de las 20 pruebas en código de 7 dígitos (número de biotipo)


Anotar resultados en tarjeta

Comprobar identificación en manual o en base de datos (ordenador)


3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API

API 20 NE (No fermentadores)

API 20 A (Anaerobios)

API NH

API LISTERIA

3.1.2.2. Diferentes tipos de galerías API

API CORYNE

API CANDIDA

API 50 CH

3.1.2.3. Sistema ATB (API automatizado)

3.2. Sistemas automatizados

3.2.1. Abac – Abactor II

Menarini Diagnostics

Conjunto de rotores (Abac)

Instrumento paradistribución del inóculo ylectura de las pruebas(Abactor)

3.2. Sistemas automatizados


Ssistema semi-automatizado e informatizado

Permite:

1. Identificación de bacterias Gram negativas

• Determinación simultánea de sensibilidad a 15 antibióticos

• Basado en técnicas de dilución en medio líquido

2. Determinación de sensibilidad bacteriana frente a 16 antibióticos

• Bacterias Gram negativas, Gram negativas urinarias, estafilococosy estreptococos

3. Determinación de la CMI


Abac

Rotores con medio de cultivo deshidratado

Identificación bacteriana

Estudio automatizado de la sensibilidad antimicrobiana

• Abac-Identibiograma II: rotores que incluyen 13 pruebas bioquímicas y 15antibióticos a una concentración única o doble

• Abac-Antibiograma: rotores que incluyen 16 antibióticos a dobleconcentración

• Abac-CMI: rotores que incluyen aminoglucósidos y beta-lactámicos

Suministrados en bolsas de aluminio al vacío

Conservación hasta 18 meses (temperatura ambiente)


Abactor II

Distribución automática del inóculo

• Inoculación: 8 mL de suspensión en cavidad central de rotor

Lectura de los rotores de forma automática

Interpretación de resultados e impresión en tarjeta

• Resultados de identificación bacteriana

o Interpretación

- Exacta

- Probable

- Imposible

• Pruebas de sensibilidad

Descripción de Abactor II

Sector destinado a la distribución automática del inóculo y la homogeneización del cultivo después de

la incubación (mediante breve centrifugación)

Sector que realiza la lectura de los rotores (fuente de luz enfocada por

una lente al centro del pocillo)

Teclado para introducción del número de identificación de las

muestras y teclas de función

1. Realizar suspensión bacterianaa partir de colonias aisladas

2. Verter 8 mL del inóculo enla cavidad central del Abac

3. Colocar el rotor en Abactor paraque la rotación del aparato durante

unos segundos transfiera 0,1 mLde inóculo a cada célula 4. Incubar el Abac en recipiente adecuado

en la estufa a 37ºC de 18 a 20 horas

5. Colocar el rotor de nuevo en Abactor, esperary retirar la tarjeta con los resultados impresos


Tarjeta de lectura

Mismo color que etiqueta colocada en los rotores

Formada por tres hojas autocopiables diferentes

Primera hoja para microbiólogo

• Resultados de pruebas bioquímicas

• Nombre (probable o exacto) de bacteria

• Posibles pruebas adicionales (confirmar identificaciones probables)

• Perfil de sensibilidad a antimicrobianos (resistente, intermedio, sensible)

Otras copias para médico

• Identificación definitiva

• Perfil de sensibilidad

Tarjeta de lectura

3.2.2. Vitek

Sistema automatizado e informatizado

Permite identificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas incluyendopatógenos de orina, patógenos entéricos, levaduras, anaerobios, Neisseria yHaemophilus

Módulo de llenado y selladoIncubador y lector

Tarjetas

Programa

Disco duroImpresora

Indica susceptibilidada antimicrobianos

Biomerieux

3.2.2. Vitek

Módulo de lectura admite 30, 60, 120ó 240 tarjetas

Solicitud de resultados en cualquiermomento del proceso

Identificación disponible en 4-6 horasde media (2 horas para bacterias de crecimiento rápido)

Tarjetas de plástico transparente

Llenado por succión al vacío (hasta 10a la vez)

Transferencia automática del inóculo

Pocillo consustrato

1. Marcar la tarjeta con número quesistema pueda leer directamente

2. Añadir diluyente al tubo quecontiene la muestra y colocar tarjetas

en soporte con el tubo de transferenciadentro del tubo de muestra

3. Colocar tarjetas en el módulo dellenado y sellado; la muestra se

introduce por succión al vacío en lospocillos, sellando después la tarjeta


4. Colocar tarjetas en bandejae introducir en módulode incubación y lectura

5. Posibilidad de solicitar informepreliminar una hora después

de cargar la muestra

6. Para cada tarjeta se imprimeautomáticamente al final del

ciclo un informe final


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