TECNOLOGA RECOMBINANTEAislamiento y manipulacin de fragmentos de ADN de un organismo para introducirlo en otro (ADN recombinante)Enzimas de restriccin (tijeras moleculares) Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restriccin y su aplicacin en

LAS ETAPAS RN LA PRODUCCIN DE ADN SON LAS SIGUIENTES:1. Preparar cortes de ADN cortadas en pequeos fragmentos por enzimas de restriccin y obtener clones de ellos.2. Preparacin de un vector de clonacin3. Formacin del ADN recombinante4. Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona5. Propagacin del cultivo6. Deteccin y seleccin de clones recombinantes

5 PASOS PARA LA OBTENCIN DE ADN RECOMBINANTE.Corte del ADN en posiciones precisas (secuencias palndromes) con endonucleasas de restriccin..Unin de fragmentos por la ADN ligasa. .Insertar los vectores de clonacin a clulas especficas que contienen toda la maquinaria gentica para la expresin de la informacin contenida en el vector .Seleccin o identificacin de las clulas que contienen al ADN recombinante.

PREPARACIN DE LA SECUENCIA DEL ADN PARA SU CLONACIN*Partimos de clulas con ncleo, que deben ser lisadas (rotas)*Las protenas estructurales, enzimas, ARN, y restos moleculares deben separarse del ADN.*El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por accin de las enzimas de restriccin.Las enzimas de restriccin son enzimas muy especficas, que reconocen una secuencia de ADN dplex rompiendo las 2 hebras en los sitios de reconocimiento o de restriccin.

Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restriccin y su aplicacin en Gentica Molecular).

Preparacin de un vector de clonacin El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes caracteristicas:*Conocer distintos puntos de ataque a enzimas de restriccin y que sean conocidas.*Poder ser incluido en laclula anfitriona con facilidad.*Replicarse de forma independiente de ADN de la clula anfitriona.*Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las clulas clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a antibitico.

Manipulacin del ADN*Las 2 molculas de ADN son digeridas con la misma endonucleasa de restriccin,*La enzima corta extremos complementarios que se aparean.* La ligasa repara hebras cortadas de ADN y rehace las nuevas bicatenarias.

Formacin del ADN Recombinante*En esta etapa se produce la unin covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa.As se realiza el sellado de la llamada mella, muesca o nickIntroduccin del ADN recombinante en la clula anfitrionaPara la clonacin (replicacin de ADN recombinante) se necesita la mauqinaria celular. Por ello hay que introducir el ADN recombiannte en una clula anfitriona (=o clula receptora, o clula hospdadora) Clula en la que se introduce un vector qwue contiene ADN inserto.

Propagacin del cultivoSe introduce la divisin de clulas anfitrionas, d eforma que se producen copias de ADN recombinante y , por ello, la clonacin. Primero se efectua una siembra en placas petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer colonias. Cada una de ellas ser seleccionada y transferida a distintos medios lquidos, dodne seguirna aumentando el nmero de colonias.

Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

En los procesos de clonacin s eutiliza un gran nuemro de celulas. Al final del proceso se hace necesario separar las clulas que contienen ADN recombinante de las que no contienen.La deteccin y seleccin de colonias se realizan en los medios de cultivo. En los procesos de clonacin se obtienen celulas anfitrionas que no han incluido el vector y clulas recombinantes (= que han incluido el vector con el ADN para recombinar)Mtodo de hibridacin: se utilza sonda marcada (= hebra sencilla de ARN o ADN que buscar al gen determinado o una secuencia d ebases compelmentarias de la que se busca, a la que previamente se la ha marcado con isotopos radioactivos) que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de l.Mtodo Immunolgico: se detecta la proteina codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos especificos .Mtodos genticos: los vectores de clonacin deben llevar genes llamados marcadores, que sirven para identificar las clulas que contiene dicho vector. Puede ser