tÉcnicas moleculares utilizadas en el diagnÓstico genÉtico i. mapas de restricción. marcadores...
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TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN
EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de
restricción. Marcadores moleculares: RFLP,
SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites),
SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención
de sondas. Transferencia Northern y
Southern. ADNc. PCR. Microarray.
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• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
• CLONACIÓN
• AMPLIFICACIÓN DEL ADN
• SECUENCIACIÓN DEL ADN
• HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR
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FRAGMENTACIÓN DEL ADN
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CLONACIÓN EN PROCARIOTAS
Aislar y multiplicar en tubo de ensayo un
determinado gen o, en general, un trozo de
ADN
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CLONACIÓN DEL ADN
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ADN donante
Vector recombinante con el inserto 1 o 2
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RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la
proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un
antibiótico
BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta
en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce
color azul
IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTES
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ELECTROFORESIS
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ELECTROFORESIS
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ELECTROFORESIS
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TIPOS DE GELES
•POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN
menores de 500 nucleótidos
•AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores
de 500 nucleótidos
•CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos
grandes de ADN, incluso cromosomas
completos
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MAPAS DE RESTRICCIÓN
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MAPAS DE RESTRICCIÓN
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PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
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* Método Químico de Maxam y Gilbert
* Método Enzimático de Sanger
SECUENCIACIÓN DE UN
FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN
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MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER
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Secuenciador
Automático (+700 nt)
A C G T
Autorradiografía
(300 nt)
ACGT
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER
• Síntesis in vitro de ADN en presencia de
nucleótidos trifosfato terminadores de cadena
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CROMATOGRAMA DE SECUENCIA
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MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT
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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La hibridación se produce
sólomente entre cadenas
complementarias
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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
SONDA: secuencia conocida de ADN o de
ARN que es complementaria a la secuencia
de interés y que se apareará con ella; se
utiliza para localizar secuencias específicas
de ADN
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• Marcaje de fragmentos de ADN:
• sondas altamente marcadas
• sondas marcadas en 5´
• Tipo de marcaje:
• radiactivo: p32
• químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.
SONDAS
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Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):
Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.
Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):
Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.
Altamente Marcadas Marcadas en 5´Altamente Marcadas Marcadas en 5´SONDAS
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ADNc
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Hibridación “in situ”En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos
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Hibridación “in situ” con fluorescenciaFISH
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SOUTHERN BLOT
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Microarrays
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MARCADOR MOLECULAR
SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro
SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción
VNRT (número variable de repeticiones en tándem):
Minisatétiles (centrómeros y telómeros)
Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)
Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular
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LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS
(dos alelos por individuo)
RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos
de restricción):
Método para la detección de los distintos
polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de
restricción
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DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP
ER ER
ER ERER
2, 21, 21, 1
SNP
1
2
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DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP
ER ERER
ERER ERERERER ER
SNP
2, 21, 21, 11
2
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PADRE MADRE
HIJO
Padre Madre Hijo
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DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP
11
22
11 22ER ER
ER ER
ER ER
ER ER
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VNTR-microsatélites (2-5 pb)