tecnicas histol´ ogicas´ observacion · tambi en podemos jar las mol eculas de los tejidos por...

Atlas de Histologıa Vegetal y Animal

Tecnicas histologicas

OBSERVACION

Manuel Megıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Biologıa Funcional y Ciencias de la Salud.Fcacultad de Biologıa. Universidad de Vigo.

(Version: Julio 2018)

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Contenidos

1 Introduccion 1

2 El proceso histologico 2

3 Observacion 4

4 Microscopio optico 5

5 Microscopio electronico 8

Tecnicas histologicas. Observacion. 1

1 Introduccion

En estas paginas dedicadas a las tecnicas histologicasvamos a describir los procedimientos experimentalesnecesarios para obtener secciones tenidas y listas paraobservar al microscopio partiendo de tejidos vivos ex-traıdos de un animal o de una planta. Por tanto, dedi-caremos espacios a la obtencion, fijacion, inclusion,corte y tincion de los tejidos. Todos estos aparta-dos seguiran el mismo esquema que los capıtulos ded-icados a los tejidos o a la celula, partir de un es-quema basico y ampliar la informacion sucesivamenteen paginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto de vistaoperativo, pero sı a la conveniencia de su uso y asus capacidades. Ademas, se incluye un apartado deprotocolos y recetas donde se incorporan los tiempos,productos y manera de proceder para llevar a cabolas tinciones mas comunes y como preparar sus reac-tivos.Tambien se han anadido algunos vıdeos explica-tivos.

La mayorıa de las tecnicas histologicas van encam-inadas a preparar el tejido para su observacion con elmicroscopio, bien sea este optico o electronico. Ello

es debido a que la composicion de los tejidos, salvocontadas ocasiones, no tienen contraste ni colores per-mitan diferenciar sus estructuras de una manera claramediante la observacion directa con los microscopios.Por ello hay procesar las muestras, primero para queno se se deterioren y despues para resaltar sus estruc-turas y poder estudiarlas en detalle.

Existen procedimientos rapidos y simples para laobservacion de tejidos y celulas vivas que reciben elnombre de vitales. Por ejemplo, la observacion delflujo sanguıneo en capilares del sistema circulatorio.Otra forma de observar celulas o tejidos vivos es medi-ante las tecnicas histologicas supravitales, en los quelas celulas y los tejidos se mantienen o se hacen crecerfuera del organismo, como es el caso de los cultivosde celulas y de tejidos.

Las tecnicas histologicas postvitales son aquellas enlas que las celulas mueren durante el proceso, pero lascaracterısticas morfologicas y moleculares que poseıanen estado vivo se conservan lo mejor posible, lo quedepende del tipo de tecnica. Estas paginas estarandedicadas a este tipo de tecnicas, puesto que son lasmas comunmente usadas en los laboratorios de his-tologıa.

Atlas de la Universidad de Vigo


2 El proceso histologico

Denominamos proceso histologico a una serie demetodos y tecnicas utilizados para poder estudiarlas caracterısticas morfologicas y moleculares de lostejidos. Hay diversos caminos para estudiar los teji-dos, es decir, series de tecnicas que se utilizaran de-pendiendo de que caracterıstica deseemos observar.En el siguiente esquema se muestran los metodosy tecnicas comunmente empleados durante el proce-samiento de los tejidos para su observacion con losmicroscopios optico o electronico. Sin embargo, hayque tener en cuenta que existen muchas variantes a es-tos ”caminos” y su eleccion dependera del resultadofinal que queramos obtener.

El proceso histologico comienza con la obtenciondel tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidosvegetales directamente se toman muestras de los dis-tintos organos que componen el cuerpo de la planta,mientras que para los tejidos animales podemos op-tar por dos opciones: coger una porcion del tejidou organo y procesarla o procesar primero el animalcompleto y luego extraer la muestra que nos interese.En cualquier caso las muestras son habitualmente fi-jadas con unas soluciones lıquidas denominadas fi-jadores, las cuales se usan para mantener las estruc-turas celulares y moleculares inalterables durante elprocesamiento posterior y con una organizacion lomas parecida posible a como se encontraban en lamuestra viva. Tambien podemos fijar las moleculas delos tejidos por congelacion rapida. Fijar un tejido escomo hacer una fotografıa de dicho tejido, su estruc-tura se mantendra hasta su observacion. La fijacionpor congelacion se emplea cuando la fijacion quımicao los procesos histologicos posteriores alteran las car-acterısticas de la muestra que queremos estudiar, porejemplo una molecula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijacion se procede a incluir eltejido para posteriormente obtener secciones. Cuantomas delgada queramos que sea nuestra seccion mastenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se con-sigue embebiendo el tejido con sustancias lıquidas queposteriormente polimerizaran (resinas) o se volveran

consistentes (ceras). Tambien se puede conseguirel mismo efecto mediante congelacion rapida. Cortesmas gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesi-dad de inclusion usando el vibratomo. Los mediosde inclusion no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de los tejidospor solventes organicos liposolubles y posteriormentesustituirlos por el medio de inclusion.

Tras la inclusion o la congelacion se procede a cor-tar los tejidos, es decir, obtener secciones. Existendiferentes aparatos de corte que permiten conseguirsecciones ultrafinas (del orden de nanometros), semi-finas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm)y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las sec-ciones se procesan para poder observarlas y estudiar-las, aunque ciertos tipos de microscopıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las secciones setinen con colorantes que son hidrosolubles, por lo quehay que eliminar el medio de inclusion para que loscolorantes pueden unirse al tejido. Las secciones ul-trafinas (observadas con el microscopio electronico)o semifinas (observadas con el microscopio optico)se pueden contrastar con metales pesados o con col-orantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusion.

Los tejidos procesados se observan con los micro-scopios. Existen dos tipos basicos de microscopios:optico y electronico. Los primeros ofrecen una granversatilidad en cuanto a modos de observar los teji-dos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase,polarizacion o contraste de interferencia diferencial,mientras que los segundos permiten un gran poder deresolucion, pudiendose observar caracterısticas ultra-estructurales.

Como dijimos al comienzo existen multiples varia-ciones sobre este esquema general de procesamientohistologico. Por ejemplo, se pueden observar tejidoscon el microscopio electronico de barrido sin necesi-dad de incluir ni cortar, pero solo observaremos su-perficies. En las siguientes paginas veremos con ciertodetalle algunas de las tecnicas mas empleadas para laobservacion de los tejidos.



Figura 1. Esquema del proceso histologico.



3 Observacion

El ultimo paso de todo proceso histologico es la ob-servacion del resultado producido por la tecnica real-izada. El poder de resolucion del ojo humano es de 0,2mm (poder de resolucion: distancia mınima a la quese discriminan dos puntos), mientras que una celulaeucariota tıpica suele tener unas dimensiones que os-cilan entre 10 y 50 micrometros (µm. 1 µm=10-6mm). Ademas, si queremos estudiar la ultraestruc-tura celular hay que tener en cuenta que el grosorde una membrana celular es de unos 7 nanometros.Todo ello implica que necesitamos aparatos que nospermitan aumentar al imagen de las muestras paradiscriminar estructuras tisulares diminutas como sonlas celulas o sus compartimentos. Estos aparatos sellaman microscopios.

Hay dos tipos de microscopios: los opticos y loselectronicos.

Los microscopios opticos, o de campo claro, uti-lizan la luz visible y lentes de cristal que permiten unaumento de las muestras de unas 1000 veces, con unpoder de resolucion de unos 0,2 micrometros. Esta esla maxima resolucion que permite la luz visible porsus propiedades de onda. Los microscopios se usan

para observaciones generales, caracterısticas celularesy tisulares, y estan presentes en todos los laboratoriosde histologıa.

Los microscopios electronicos se basan en la altafrecuencia de los electrones para conseguir un poderde resolucion de 1 nanometro. Se usan para observarla ultraestructura de la celula y los tejidos, es de-cir, para estudiar el nivel subcelular, como organulos,membranas u organizaciones moleculares (por ejem-plo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tiposde microscopios electronicos: los de transmision, quese usan para estudiar la ultraestructura de la celulaen secciones muy finas, y el de barrido, que permiteestudiar superficies.

A los microscopios, sobre todo los opticos, se lespueden anadir dispositivos que permiten ampliar supotencialidad. Por ejemplo, al microscopio optico sele puede adaptar una fuente luminosa y una seriede filtros para observar moleculas fluorescentes, o fil-tros para destacar cambios de densidad en el tejido,etcetera. A las diferentes formas de utilizar los micro-scopios para la observacion de caracterısticas de lostejidos se les llama microscopıa. Ası podemos hablarde microscopıa optica de contraste de fase, de fluores-cencia, electronica, etcetera.



4 Microscopio optico

El microscopio optico es un elemento esencial paralos estudios generales de histologıa puesto que es elque nos permite observar las diferentes caracterısticasmorfologicas de las celulas y los tejidos. Se basa enel uso de lentes para aumentar los rayos de luz queatraviesan una muestra de tejido. Su invencion seremonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido per-feccionando hasta llegar a los modernos microscopios.Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a per-feccion y calidad se ha producido en su principal el-emento, las lentes, las cuales aumentan la imagen delas secciones de tejido y permiten hacer visibles alojo humano detalles nıtidos que de otra manera serıaimposible observar.

Los microscopios opticos tienen un lımite maximode resolucion de 0,2 µm. El poder de resolucion es ladistancia mınima a la que se pueden discriminar dospuntos. Este lımite viene determinado por la longitudde onda de la fuente de iluminacion, en este caso laluz visible.

Contiene normalmente dos sistemas de lentes: elobjetivo y el ocular. El objetivo recoge la luz queatraviesa la seccion de tejido, mientras que el ocular esel que proyecta la imagen sobre la retina. El aumentototal que permite un microscopio optico se calculamultiplicando la magnificacion que produce el obje-tivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si es-tamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces)y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultadofinal sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumen-tada 400 veces. Usando microscopios opticos avanza-dos se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivode 100x junto con oculares de 10x o 15x). Algunosmicroscopios opticos tienen lentes internas que pro-ducen aumentos adicionales que tendremos que teneren cuenta para calcular la magnificacion de la imagenque se observa. No debemos confundir los aumentoscon el poder de resolucion. Por mas que consigamosaumentar una imagen tomada de un microscopio, in-cluso con metodologıa digital, no se puede aumentarla resolucion de la imagen.

PARTES del MICROSCOPIO

Un microscopio optico basico esta formado por lassiguientes partes:

Oculares. Son las lentes que forman la imagen queobservaremos con nuestros ojos. Todos los microsco-pios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo.Por eso a los microscopios actuales se les llama binoc-ulares. Los primeros microscopios eran monoculares,es decir, poseıan un solo ocular. Hay que tener encuenta que en los microscopios mas avanzados tantoel objetivo como el ocular suelen estar compuestospor varias lentes. Al menos uno de los oculares puederegularse para alejar o acercar la lente al objetivo,permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones devision, dioptrıas, de cada observador.

Figura 2. Partes de un microscopio simple.

Objetivos. Los objetivos son las lentes que recibenla lux directamente tras atravesar la seccion his-tologica y quiza sean los elementos mas importantesdel microscopio. Hoy en dıa los microscopios opticosposeen un tambor o revolver donde se encuentran var-ios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que per-miten diferentes aumentos. Las magnificaciones de losobjetivos mas usados suelen ser de 4x, 10x, 20x, 40xy 100x. Rotando el revolver se puede seleccionar elobjetivo y por tanto el aumento al que queremos ob-servar la preparacion. Aparte de los aumentos, los ob-jetivos tienen una serie de caracterısticas para mejo-rar la imagen. Ası, pueden ser acromaticos, de fluo-rita o apocromaticos, los cuales corrigen alteracionescromaticas, de campo plano que eliminan la curvatura



del campo de observacion, de contraste de interferen-cia, etcetera.

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x)es necesario emplear un lıquido denominado aceite deinmersion , que se anade entre el objetivo y la mues-tra. Esto es debido a que la refraccion de la luz esalta en el aire y provoca alteraciones en la imagenque se manifiestan cuando se usan objetivos con estacapacidad de aumento. El aceite de inmersion reduceenormente esta refraccion permitiendo imagenes mu-cho mas nıtidas.

Figura 3. Imagenes resultantes del uso de objetivos condiferentes aumentos (especificados en las imagenes) al ob-servar un epitelio estratificado plano queratinizado.

Platina. Es la plataforma donde se coloca el por-taobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivopara sujetar el portaobjetos, el cual se puede de-splazar en el plano de la platina, movimiento con-trolado manualmente.

Condensador. Es un dispositivo con una lente queconcentra y focaliza la luz proveniente de la fuentesobre la seccion de tejido.

Diafragma. Se situa entre la fuente luminosa y elcondensador. Permite aumentar el contraste de lamuestra y la profundidad de campo, es decir, el espe-sor de la muestra que esta enfocado.

Lampara luminosa. Es la que proporciona la luzque atraviesa la seccion de tejido. Inicialmente se us-aba la luz natural, la cual se podıa concentrar en laseccion de tejido mediante espejos concavos. Actual-mente se usa una lampara cuyo haz de luz atraviesael diafragma, el condensador, la muestra, y tras ellopenetra por el objetivo y atraviesa los oculares hastanuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa sepuede regular mediante un reostato.

Macrometrico y micrometrico. El enfoque de la

muestra se consigue variando la distancia de la mues-tra a la lente del objetivo. Esta distancia dependede los aumentos que produzca el objetivo, mayor dis-tancia cuanto menores aumentos, y del tipo de ob-jetivo. La distancia se controla mediante dos ruedasdenominadas macrometrico y micrometrico, respec-tivamente. La primera permite movimientos ascen-dentes y descendentes amplios de la platina y la se-gunda ajustes finos.

Figura 4. Recorrido de la luz desde la fuente, pasando atraves de los diferentes lentes de un microscopio basico,hasta el observador.

MODIFICACIONES

Contraste de fase. Esta modificacion del microsco-pio de campo claro necesita de objetivos especiales yse basa en el ligero retraso que sufre la luz cuandopasa por las estructuras tisulares en funcion de sudensidad. De esta manera se consiguen diferentes lu-minosidades para distintas estructuras tisulares. Seemplea para ver muestras sin tenir o acuosas, ası comocelulas vivas, por ejemplo en cultivos celulares.

Campo oscuro. La observacion en campo oscuro esun buen sustituto del contraste de fase para observarespecımenes sin tenir o medios acuosos. Consiste enla incorporacion de un objeto opaco bajo el conden-sador, entre la fuente luminosa y la seccion de tejido.Este objeto solo deja pasar la luz mas lateral que in-cidira sobre la muestra de forma oblicua y solo aquellaluz que sea reflejada por la muestra llegara a los ob-jetivos. Allı donde no haya tejido aparecera obscuroy distintas densidades o propiedades del tejido refle-jaran diferente cantidad de luz.

Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipode microscopıa aparece solo en los microscopios masavanzados y supone tener objetivos especiales. Estosmetodos dan a los tejidos un aspecto tridimensional,es decir, aumentan la profundidad de campo (espe-



sor de tejido que esta simultaneamente enfocado, esdecir, que se ve nıtidamente). Se basa en el uso defiltros que polarizan la luz, lo cual consiste en dejarpasar solo a la ondas electromagneticas que vibran enun determinado plano. Posteriormente pasan por unprisma que reagrupa esta luz en elementos separadospor una distancia que es similar al poder de resoluciondel objetivo que se esta usando. Existe un prismapara cada objetivo. Entonces la luz pasa por el mues-tra y las diferencias de densidad del tejido, como losbordes de las celulas o densidades del interior celular omatriz extracelular, provocaran alteraciones en la luzque se dirige hacia los objetivos, los cuales transfor-maran esas diferencias en cambios en la luminosidad.Todavıa existe una lente adicional entre el objetivoy los oculares que permiten modular la luminosidadaun mas.

FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia se usa para obser-var sustancias fluorescentes denominadas fluoroforos.Una molecula fluorescente es aquella que es capaz decaptar radiacion electromagnetica con una longitudde onda determinada y emitir otra radiacion electro-magnetica con otra longitud de onda diferente, nor-malmente dentro del espectro de la luz visible. Losfluoroforos se utilizan como marcadores para la de-teccion de otras moleculas tisulares, normalmente me-diante la tecnica de inmunofluorescencia. Los usadosen microscopıa absorben en el rango de la luz ultra-violeta, normalmente producida por una lampara demercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Paraseleccionar el rango de longitud de onda con que seraniluminados se utilizan filtros especıficos localizadosentre la fuente y la muestra que solo dejan pasar undeterminado rango de frecuencias. Con un tambor defiltros se consigue iluminar la muestra con diferentes

rangos de ondas electromagneticas y por tanto activarselectivamente a diferentes fluoroforos.

La microscopıa de fluorescencia nos permite usarmas de un fluoroforo para detectar varias moleculastisulares de forma simultanea siempre que los espec-tros de absorcion y emision de estos fluoroforos no sesolapen, puesto que entonces serıa imposible discrim-inarlos.

Figura 5. Imagenes de fluorescencia. A la izquierda, in-munocitoquımica para el neuropetido Y en cerebro de rata,utilizando el fluoroforo Texas-Red. A la derecha, motoneu-ronas en el encefalo de lamprea marcadas con el trazadorneuronal fluoresceına que es en sı mismo un fluoroforo.Cada uno de los fluoroforos se ha estimulado con frecuen-cias diferentes y lo que se observa es la emision en el es-pectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y verde,respectivamente.

Una aplicacion mas avanzada de la fluorescencia seda en los microscopios confocales, los cuales permiteneliminar la luz difusa procedente de fluoroforos queestan en el tejido fuera del plano de enfoque. Estaluz difusa, que aparece en los microscopios de fluo-rescencia convencionales, provoca una difuminacion yperdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el mi-croscopio confocal se consiguen imagenes mucho masnıtidas y mediante la digitalizacion y solapamiento deplanos de foco sucesivos se pueden conseguir imagenestridimensionales.



5 Microscopio electronico

Cuando se quieren observar estructuras celulares queestan por debajo del lımite de resolucion del micro-scopio optico, como algunos organulos, membranas,estructuras citosolicas, complejos moleculares de lamatriz extracelular o virus, se recurre al microsco-pio electronico. Se invento en la primera mitad delsiglo XX y su aplicacion a la histologıa desvelo las es-tructuras celulares mas pequenas denominadas en suconjunto ultraestructura celular. Por tanto, observarultraestructuralmente a la celula significa observarlacon el microscopio electronico. Este tipo de microsco-pio tiene un lımite de resolucion mas pequeno que 1nanometro gracias a que no usa la radiacion electro-magnetica de la luz visible sino la alta frecuencia deun haz de electrones que incide sobre la muestra, ypermite aumentos de varios millones de veces.

El microscopio electronico no usa lentes sino imanesque concentran los haces de electrones emitidos por unfilamento. Normalmente son aparatos grandes puestoque el viaje de los electrones tiene que ocurrir en vacıo.Por eso, son grandes tubos dentro de los cuales se creay manipula el haz de electrones.

En histologıa se usan dos tipos de microscopioselectronicos: de transmision y de barrido.

Microscopio electronico de transmision

En este tipo de microscopio electronico se produceel haz de electrones en un filamento de tungstenoque funciona como catodo. Los electrones se conden-san mediante electroimanes y se focalizan sobre unaseccion de tejido. Las secciones de tejido deben sermuy finas, se denominan ultrafinas (de unas decenasde nanometros), para permitir que sean atravesadaspor los electrones y para conseguir imagenes nıtidas.Previamente las secciones deben ser tratadas con met-ales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. Lafuncion de estos metales es similar a las tinciones us-adas en el microscopio optico, dar color a las estruc-turas celulares, pero solo en tonalidades de grises. Es-tos metales se concentran fundamentalmente en mem-branas y en los complejos macromoleculares. Los elec-trones que chocan con estos metales rebotaran y nocruzaran el tejido. Aquellos que consigan atravesar el

tejido chocaran contra una pantalla fluorescente queemitira un destello luminoso tras cada choque. Esaimagen emitida por la pantalla fluorescente es la quepodemos observar nosotros. Por ello las imagenes ob-servadas con el microscopio electronico son siempreen blanco y negro, aunque posteriormente se puedencolorear con un ordenador.

Figura 6. Comparativa de la composicion basica de unmicroscopio optico (izquierda), electronico de transmision(centro) y electronico de barrido (derecha).

Figura 7. Imagenes tomadas en con microscopioelectronico de transmision. Se puede ver la capacidad deestos microscopios observando el incremento de resolucionde las imagenes de izquierda a derecha. Las lıneas negrasde la imagen de la derecha corresponden a las membranascelulares

Microscopio electronico de barrido

Los microscopios electronicos de barrido sirven paraobservar superficies tisulares. Ello es posible porquelos electrones no atraviesan la muestra sino que inter-accionan con su superficie y rebotan. Para que estoocurra hay que cubrir a la muestra con una mascarade metales que se adapta perfectamente al relieve dela muestra. La muestra se barre con el haz de elec-trones y los electrones reflejados por un punto de lasuperficie son captados por una pantalla receptora quecreara una imagen en una pantalla digital. La ima-



gen completa se formara cuando el haz recorra todala superficie de la muestra y se consiga informacion decada uno de los puntos. Es decir, se escanea la mues-tra, y de ahı el nombre de microscopio de barrido, oen ingles ”scannig”.

Por supuesto, las muestras que se observan no sonsecciones, sino porciones de organos con superficies deinteres. Se pueden observar superficies de seccioneshechas con un vibratomo o con un microtomo de con-gelacion, pero no aquellas que han sido incluidas enresina o parafina.

Figura 8. Imagenes obtenidas con un microscopioelectronico de barrido. Muestran el interior del canal cen-tral de una medula espinal de lamprea. Se pueden observarnumerosos cilios (con mas detalle en B) y pequenas mi-crovellosidades en los dominios apicales de las celulas queforman las paredes de dicho canal. (Ver imagen de barridode estomas de una hoja).


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