técnicas de transformación

7/26/2019 Tcnicas de Transformacin

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Tcnicas de transformacinen plantas

Integrantes:- Abigail Benavides- Josselyn Briceo- Sebastin Chile- Bryan Ibez

- Ana Noboa


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Objetivos

Definir el proceso de transformacin vegetal.

Determinar las tcnicas de transformacin vege

Identificar la aplicacin de estas tecnologas parainvestigacin en la actualidad.


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IntroduccinTransformacin vegetal

Daos por fitoen los cultivoalmacenadas

Prdidaseconmicas

ostos Peligro ambie resistencia an

de las especie

Pesticidas


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Transgnesis vegetal

digo gentico es universal

Informacin contenida en los genes es interpretada de la mismamanera en todos los seres vivos.

Incorpora una informacin definida desde un organismo vivo aun nuevo husped

!"udar a proveer soluciones a muchos problemas #ue afectan laproduccin vegetal


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$%perimento de &roglie et al. '()*+,

ambiar el fenotipo de un organismincorporacin de un !D- forneo e


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TcnicasAgrobacterium tumefaciens

apacidad de esta bacteria de

transferir informacin genticade un organismo a otro.

/istema de transferencia de !D-#ue ocurre naturalmente.

bacteria del suelo

transfiere !D- a travs factor

plasmdico inductor de tumores'Ti,

0odifica el genoma de lasplantas

!l ser e%cretados por la coronade las clulas de la agalla1 sonconsumidas como fuente de

carbn " nitrgeno


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/outhern

genes

introducidos"

en2imas de

restriccin

generan fragmentos dehibridi2acin

P3

!.tumefaciens 1

!.rhi2ogenes "

!. vitis

Patgenos reconocidos de lasplantas

Tienen la capacidad deintegrar establemente parte

de su material gentico dentrodel genoma de su hospedero


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&uenaIteracin

con

plantas

3econocimiento" adherencia

Identificacin deseales de la

planta

!ctivacin de losgenes 4ir

5eneracin delgen !D-6T

$%portacin del!D6

IT a la planta

Integracin del!D-6T al n7cleo

de la plantaIntegracin del

!D-6T en elgenoma delhospedero


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Transformacin de protoplastos

lula vegetal sinpared celular

/eparar clulasmediante mediosfsicos 8 luegoen2imas pectinasa


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perm

eabili2acin

m

embrana

$lectroporacin

Tratamiento conpolietilenglicol

liposomas

sonicacin


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Enzimas derestriccin

Secuenciacin

Clonacin enplsmidos

Electroforesis(DNA,

RNA,proteinas)

Reaccin en Cadenade la Polimerasa

(PCR)


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A C G T


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A C G T


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southern

estern


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$lectroporacin

Procesos de captacin de D-! e%geno inducidos

#umicamente. 9os protoplastos son suspendidos en un tampn

con gran conductividad #ue contiene el D-!.

Pulsos cortos de alto voltaje #ue pasa a travs dela solucin.

!paricin de poros de forma reversible en lamembrana1 #ue permiten la entrada de molculase%ternas


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Transformacin mediada por P$5

T3!-/:$T$3$-I! D$ D-! ! P3OTOP9!/TO/; 9a incorporacin " e%presin deD-! mediante protoplastos

/ustancia #umica #ue desestabili2a la membrana de las protoplasmas.

9a membrana de la clula es deformada por fuer2as de tensin superficial1causadas por las diferencias de densidades entre la solucin de P$5 " lasolucin #ue contiene los protoplastos a transformar " el D-! #ue se deseaintroducir.

$l tejido vegetal es cortado en pe#ueos peda2os. /umergido en una solucin conAgrobacterium

olocadas en medio radicular " apical de seleccin1 permitir #ue las plantastransformadas sobrevivan.

Desafortunadamente muchas plantas no son transformables por este mtodo


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9iposomas

/on vesculas lipdicas conformadas por varias bicapas de lpidos #ueencapsulan agua o gas1 con diferentes formas " tamaos.

$l material gentico es encapsulado " pasa a travs de la clula vegetal porendocitosis hasta el n7cleo


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/onicacin o =ltrasonido

/e emplea ultrasonido con frecuencias superiores a >? @A2

la formacin de burbujas1 con la consecuente generacin de elevada presin "temperatura.

5enera permeabilidad en las membranas1 mediante la induccin de porostransitorios.

$l D-! ingresar al interior de la clula vegetal.

Transferencia de plsmidos de D-! a protoplastos " clulas intactas.


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Trasduccin

/e empaca el material gentico deseado en un virus adecuado capa2 deinfectar vegetales1 " permitimos #ue ste virus modificado la infecte.

/i el material gentico es !D-1 puede recombinar con los cromosomas paraproducir clulas recombinantes.

9os genes insertados nunca llegan al n7cleo celular.


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Agrobacterium rhizogenes

$%iste otra familia de plsmidos de !grobacterium #ue podra servir devectores de genes para la obtencin de plantas sanas1 genticamentemodificadas.

Provocan una proliferacin de las races denominada Bra2 en cabelleraC1 enla plantas infectadas por !. rhi2ogenes " se llaman plsmidos 3i 'de rootinducing,.

9as races1 como el tejido de la agalla1 crecen rpidamente en un cultivolibre de bacterias.


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&O0&!3D$O O- 0I3OP3O$TI9$/ ; 9a tcnica consiste en baar partculasesfricas de oro o tungsteno con D-!1 el cual ha sido precipitado con al>1espermidina o polietilen glicol.

0I3OI-$IE-; Transferencia gnica ms utili2ado1 sobre todo enmamferos1 la transformacin estable va in"eccin de D-! en el n7cleocelular1 permite la transferencia gnica a una clula concreta.

0!3OI-$IE-; 9a trasformacin mediante la in"eccin de D-! en el

interior de cavidades #ue contienen meristemos u rganos se%uales de laplanta 1 ofrece la oportunidad de un ma"or " ms ntimo contacto entre elD-! " la lnea germinal1 ofrece la oportunidad de un ma"or " ms ntimocontacto entre el D-! " la lnea germinal.


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T3!-/:O30!IE- 5F-I! 0$DI!-T$ 9G/$3 ; se basa en llevar a travs delobjetivo pulsos de lu2 de alta energa a las regiones del tejido diana demenos de (m de dimetro1 agujeros de dimensiones definidas pueden sercreados en la pared " membrana celular1 permitiendo la entrada pasiva deD-! a travs de los al interior de la clula.

T3!-/:O30!IE- 0$DI!D! PO3 PO9$-; $l D-! sea transportado durante lafecundacin al interior de los vulos1 pues en este estado el D-! tiene msposibilidades de ser integrado. 'resultados generalmente negativos,

T3!-/:$3$-I! 5F-I! PO3 I0&I&IIE-; 9a introduccin de D-! durante laimbibicin de tejidos de plantas deshidratados es un mtodo #ue ha sidoestudiado desde los aos sesenta1 Durante la deshidratacin ocurren cambiosfsicos " #umicos como la e%pansin rpida de la clula1 la rotura de lapared1 los cambios estructurales en la membrana1 etc.1 #ue sugieren #ue enestas condiciones el D-! puede ser captado. 'solo a determinados rganos,


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&iobalistica

&ombardeo con micropartculas

Permite introducir !D- virtualmente a cual#uiertipo de clula.

Integracin 6 !D- 6medianteun proceso de recombinacin

al a2ar&alstica biolgica

$l !D- es introducido enlas clulas por medio de

partculas microscpicas

9as partculas se cubrenprimero con el !D- #ue

acarrea el gen de inters1aislado de la bacteria en la

cual fue clonado.


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0icrocan con partculas metlicas rodeadas de !D-.


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$l !D- para serclonado es incluidoen plsmidos #ueson transferidos

completos duranteel bombardeo a lasclulas

/e constitu" en elsegundo mtodo

de transformacingentica deplantas ms

empleado1 luegodel de

Agrobacterium.


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PlantasA!etoAcel"aAlfalfaAl"odnAlamoAra!idopsisArrozAr#e$aCamoteCa%a de azucarCe!adaCentenoCla#elCrisantemoEsprra"o 5

entica

mente

Eucal&ptus

'ram!uesa

'rutilla

(ii

)echu"a

)irio

*a+z*an+

*anzana

*ara#illa

,r-uidea

Papa

Papa&a

Petunia

Pera

0odificadasPinoPltano

Poroto

Poroto de so&a

Remolacha

Repollo

RosaSor"o

.a!aco

.omate

.ulipn

.ri"o

/ides

0anahoria

0apallo


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Aplicaciones:

9a transformacin tiene muchas aplicaciones1 como; 9a produccin de protenas

9a produccin de los mismos plsmidos

9a produccin de plantas resistentes

9a produccin de bacterias #ue consumen petrleo1 etc

$l proceso de transformacin se complementa con un conjunto de tecnologas de cultivoin vitro de tejidos vegetales1 #ue permiten regenerar plantas enteras frtiles a partir dedeterminados tejidos transformados cultivados.


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:redericH 5riffith ()(*

Dos cepas de /treptococcus pneumoniae1cepa virulenta '/, " cepa no virulenta '3,

=n componente #umico de las clulas /virulentas de alguna manera habantransformado las clulas 3 en la formavirulenta /.

Transforaci!n ediante co"c#ltivo deAgrobacterium


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tumefaciens y discos de ho$as de tabaco

%lantas transg&nicas obtenidas por bobardeo de icro part'c#


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%lantas transg&nicas obtenidas por bobardeo de icro part'c#


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9a produccin de plantas transgnicas lleva a la produccin de frmacos en plama"or inters son las protenas teraputicas.

$n la actualidad no ha" todava ninguna protena teraputica humana producida ese encuentre en el mercado1 pero "a ha" algunas en fases de pruebas clnicas.avan2ada sea un anticuerpo producido en la planta del tabaco #ue se pretende tratamiento " prevencin de las caries " enfermedades infecciosas de las encas.


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Ant'genos e(presados en plantas:


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Ant'genos e(presados en plantas:


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onclusiones

/e defini la transgnesis vegetal como el proceso de cambio del fenotipo de unorganismo a travs de la introduccin de !D- forneo al genoma.

/e determin las tcnicas de transformacin vegetal #ue inclu"en;Agrobacteriumtumefaciens1 una bacteria #ue infecta los tejidos vegetales1 modifica el genomade estas " provoca crecimientos tumorosos.

9a otra tcnica es el mtodo directo de transformacin biolstico #ue introduce!D- forneo en cual#uier clula o tejido vegetal " tiene el inters de proteger alvector de la degradacin mecnica " en2imtica.

$ntre otras tcnicas estn la de en2imas de restriccin1 clonacin de genes1secuenciacin1 electroforesis de protenas1 !3- " !D-8 hibridacin conanticuerpos " de cidos nucleicos1 " reaccin de la polimerasa.

/e identific la aplicacin de las tecnologas para la investigacin en la actualidadcomo una herramienta singular para el estudio de la e%presin de genes " de lafisiologa vegetal.


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Optimi2acin de la transformacin gentica de!rtemisia annua 9. =so de !grobacterium paraproduccin de artemisinina

%)A*+AC,-N,C. +A-A/IN0

0SC102A 3A*+AC01TICA 402 INSTIT1T, T0CN,25-IC, BAN41-6IN4,N0SIA

J1NI, 789 023)A+I S,N. S1)AN4,N,

3;I8


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cultivos de tejidos " clulas a travs$n2imas de la rutfarnesil difosfato


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de la manipulacin de las condicionesde cultivo1 medios de cultivo1 laalimentacin de precursor1 "elicitacin8 " la transformacin derganos o cultivo de !. annua va!grobacterium para aumentar el

rendimiento de la artemisinina no hantenido %ito todava.

farnesil difosfato 5enes #ue codificansintasa '!D/,1 monoo%igenasa1 " len2imas relevantbiosntesis de artcomo escualeno sin

han aislado " clona!. annua.

Por lo tanto1 puede mejorar la produccin deartemisinina por ingeniera gentica en la planta omicrobio usando estas en2imas. /e han reali2adonumerosos esfuer2os en la modificacin gentica

de !. annua para mejorar la produccin deartemisinina. $stos esfuer2os inclu"en lasobree%presin de :D/ " isopentenil transferasa1 "la inhibicin de la e%presin de //.

!dems de en las plantas1 eshan transformado " e%pmicrobios a travs de lagentica. Gcido artemi

precursor de la artemisinproducido utili2ando /acerevisiae1

Por lo tanto1 en este trabajo1 nos hemos centrado en la e%ploracin de los factores #ue influ"en en mediada por !grobacterium de !. annua para optimi2ar el sistema de transformacin. $l sistema deptima ser utili2ado en nuestro siguiente estudio para mejorar la e%presin de genes en !. annua

gentica de plantas.

INT*,41CCI5N

F


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0!T$3I!9$/ 0FTODO/

9os materiales vegetales " las condiciones de cultivo de tejidos/emillas de !. annua 9. fueron recogidos desde el cultivo deplantas medicinales 0anoHo 1 9embang 1 &andung 1 Indonesia.9as semillas se esterili2aron superficialmente por inmersin en JK -al durante >? min despus de la inmersin en etanol al L? Kdurante > min . 9as semillas se enjuagaron tres veces con aguadestilada estril " luego se germinaron en condiciones estrilesen (?? ml matra2 #ue contiene >? ml de germinacin de0urashige " /Hoog ' 0/,. $l pA se ajust a M1( con -aOA ( -antes de la adicin de agar. $l medio se someti a autoclave a(>( N durante >? min. 9a germinacin se inici dentro de > o das el uso de lmparas fluorescentes durante (M h " atemperatura de >J > N .

d ! b t i t d i d l t


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epas de !grobacterium " vectores de e%presin de plantas

4arios cepas de !. tumefaciens '9&!++?+1 54(?( " !59(," binario vector p!0&I! (1? fueron probados por sucompetencia para transformar !. annua 9. $l vectorbinario contiene el -PT II 'npt II, gen #ue confiereresistencia a la Hanamicina para bacterias " hpt II genpara la seleccin de higromicina planta. $stos genes

indicadores se colocaron bajo el control del promotora04 J/.

Transformacin de !grobacterium tumefaciens


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Transformacin de !grobacterium tumefaciens

4ector p!0&I! (? setransform en !.

tumefaciens utili2ando elmtodo de cho#ue trmico.

9os transformantes de !grobacteriumclulas #ue albergan el vector binario

p!0&I! fueron confirmados por reaccinde la polimerasa en bruto de la cadena

'P3, " la electroforesis.

$l cebador directo fue JQ6!5T55!5T5!!5555!!!5

T6 Q" revertirJQ!!T!!55TT!55!!5!!6Q1 diseado de

acuerdo a la secuencia del gengus.

9os >J ml de reacciones deP3 inclu" ?1J m0 de

cebador directo1 ?1J m0 decebador inverso1 >1J l (? R

tampn Ta# !D-polimerasa1 d-TPs ?1> m01( = de Ta# !D- polimerasa1" > m0 0gl> 'Promega,.

9a amplificacin se reali2 en un termocicladorcomo sigue; ( min a )+ N 8 ? ciclos de ? s a

)+ N 8 ? s a L> N 8 seguido de L min a L> N .9os fragmentos de amplificacin )*) pb fueronelectroforesis en un gel de agarosa al ?1*K #uecontiene bromuro de etidio " luego observado.

Transformacin de la !rtemisia annua9os monoclones serecogi

eron " se$l cepas de !.


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g "incubaron a >* N

durante M h1 acontinuacin1 ( ml

de suspensinbacteriana se

dilu" a J? ml demedio $. 9asuspensin

bacteriana se

centrifug a + N 1+.??? rpm durante(? min " luego se

resuspendieron conJ? ml de l#uido0/6infeccin.

ptumefaciens 9&!++?+1

54(?( " !59( #uealberga el vector

binario p!0&I! (.?mil se utili2aron para

la transformacin.$stas cepas se

cultivaron en e%tractode levadura de

peptona " rifampicinapara 9&!++?+ "54(?(1 "

carbenicilina Sampicilina para agl(.

$llos se incubaron durante h continuamente " luego

utili2ados comosuspensin bacteriana la

infeccin para infectar lashojas e%plantes de >

semanas de edad6plntulas " > meses de

edad6Planta de semilleropor (J min por infiltracin

al vaco. 9as hojasinfectadas se transfirieron

sobre papel de filtro

estril1 a continuacin1co6cultivaron en medio0/6cocultivo en la

oscuridad durante das.

Despus decocultivo1 las hojasse transfirieron a

agua destilada concefota%ima para

9&!++?+ " 54(?(1" !ugmentin para!59(1 para lavar "

destruir las clulasde !grobacterium.Despus de das decocultivo1 hojas de

e%plantes se lavaron conantibiticos para

eliminar las bacteriasresiduales. $ficiencia de

transformacin sedetermin mediante la

medicin de la 2ona a2ul'e%presin 5=/, en todo

el e%plante de hojautili2ando el softare

ImageU (1+.

Procedimiento detransformacin fue elmismo #ue el descritoanteriormente1 usandoe%plantes de hojas de(+ das de edad1 las

plntulas de !. annua.Tensioactivos conconcentracin de?1??>K 'v S v, se

aadi a la suspensin

bacteriana para la

3$/=9T!DO/ DI/=/IE-


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3$/=9T!DO/ DI/=/IE-

$l cultivo de !. annua en medio 0/ a partir desemillas frescas ha sido con %ito en ellaboratorio 1callo de !. annua tambin ha sidoinducida con %ito V ( :igura W " manteniendo encultivos en suspensin de clulas para la mejorade la artemisinina a travs de la alimentacin delos precursores " elicitacin .Por lo tanto 1 hemostratado de mejorar el contenido de artemisininapor ingeniera gentica de plantas a travs de !.transformacin de !. annua tumefaciens

mediada . $l primer paso 1 la optimi2acin delsistema de transformacin 1 se ha reali2ado paraencontrar las cepas ms eficaces de !.tumefaciens . 4arias cepas de !. tumefaciens sehan reportado con %ito para infectar el !. annuacon diversos vectores de e%presin de plantas ./in embargo1 la frecuencia de la infeccin " laregeneracin de !. annua es todava baja .

!rtemisia ' D " $, annua 9 .; meses de edadmeses de edad 1 '&, 1 semillas 1 'c, " ( 6 meseplntulas en un medio de 0urashige " /Hoog


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$n este trabajo1 hemos utili2ado tres cepas de !.tumefaciens1 es decir1 9&!++?+1 54(?( " !59(. -o hahabido informes sobre la capacidad de las dos 7ltimascepas de mediar transformacin de !. annua. $stas dos

cepas son conocidos por ser potentes para mediar latransformacin en las plantas. =tili2amos p!0&I! (1?como un vector binario #ue contiene el gen -PT II 'II T-P,#ue confiere la resistencia a la Hanamicina bacteriana " elgen hpt II para la seleccin de higromicina planta. $lvector binario p!0&I! (? fue transformado con %itoen clulas competentes de !. tumefaciens1 utili2ando elmtodo de cho#ue trmico. 9as clulas transformantes de

!grobacterium se anali2aron por P3 V:igura >W. $l cepasde !. tumefaciens 9&!++?+1 54(?( " !59( #ue alberga elvector binario p!0&I! (.? mil se utili2aron para latransformacin en las hojas de e%plantes de !. annua.Aemos utili2ado la e%presin transitoria del gen gus parasupervisar las hojas transformadas.

Polimerasa anlisis de reaccip!0&I! (? de transforma!grobacterium tumefaciens ; 9'!,1 54(?( '5,1 0arHer ( H(? como un control gus 6 pos

9os tensioactivos son conocidos por aumentar la eficiencia de


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ptransformacin de la planta utili2ando !grobacterium. $l usode varios tipos de tensioactivos por @im et al.1 '>??), mejorla e%presin transitoria en hojas de !rabidopsis. $n nuestroestudio1 hemos utili2ado tensioactivo de tipo orgnico desilicio. !dems de su funcin de disminuir la tensinsuperficial entre dos fases1 los tensioactivos tambin son

capaces de mejorar la penetracin en la cutcula1 aumentandoas el movimiento de material en una clula vegetal1 en estecaso el material gentico #ue se transfiere por !grobacterium.

/urfactantes orgnicos de silicio #ue son unos agentestensioactivos no inicos son menos t%icos para el crecimientovegetal. $l surfactante se aade en medio de infiltracin abajas concentraciones ?1??>K 'v S v, con el fin de ser capa2de facilitar la infeccin de los tejidos vegetales por clulas de!grobacterium sin daar el crecimiento de los e%plantes. 9as

hojas mostraron varios puntos a2ules causadas por lae%presin de 5=/ transitorio despus de das de cocultivo.

$nsa"os histo#umica X 6 glucuronidasa de la hojatransformada de !rtemisia annua ; /intensioactivos1 '!, 1 no transformada 1 'D:, " consurfactante ' 5U ,

O-9=/IE-


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O-9=/IE-

9a transferencia de p!0&I! (? a travs de !grobacteriue%presin del gen reportero gus en la hoja de !rtemisia a!grobacterium se reali2 con %ito .

9a cepa de !. tumefaciens !59( fue el ms efectivo paratransformado a esta planta #ue 54(?( " cepa 9&!++?+ .

$l surfactante /ilet /6 +?* produce la ms alta eficiencitransformacin.

*030*0NC0S

( 3 D@ P di $0 O ll t 0 :i h @U - @9 -d g U0 t l P d ti f th ti l i l


53/53

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técnicas de transformación

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