U.D: Mtodos y Tcnicas de Estudio Microbiolgico IAISLAMIENTO, INOCULACION Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

TCNICAS DE SIEMBRA

Una tcnica muy comn en el laboratorio de microbiologa es la transferencia de microbios de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos. Es necesario tomar las debidas precauciones para evitar la contaminacin de los cultivos.

Para el estudio e identificacin de microorganismos stos deben aislarse o separarse a partir de un cultivo mixto o de poblaciones que se encuentran en la naturaleza. Existen varias tcnicas para el aislamiento de microorganismos y la obtencin de cultivos puros, dentro de las ms utilizadas se encuentra:

a) Siembra por estras en caja de Petri o tubo de ensayo.b) Vaciado en placa donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en partes profundas del medio inoculado.c) Siembra por picadura en tubo recto o inclinado etc.

Los recuentos bacterianos van a permitir estimar el nmero de bacterias en un mm3. y en la actualidad se utilizan diferentes tcnicas.

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen: Que se efecten aspticamente Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

MANEJO DE LA MUESTRA EN LA SIEMBRA Y TOMA DEL INCULO1- Colocar el material al alcance y prximo al mechero.2- Flameado del asa de siembra y enfriado 10 segundos cerca de la llama antes y despus del contacto.3- Se coge la muestra con la mano no dominante. Si es un tubo se sujeta el tapn entre el meique dela mano dominante. Si es placa de petri se coloca boca abajo y se levanta cara a la llama.4- Toma del inculo, directo o diluido. Un inculo diluido sera una suspensin de grmenes en solucin estril, suero fisiolgico, agua destilada, o caldo nutritivo. Se suele hacer a partir de muestras de cultivo puro joven (en fase exponencial decrecimiento). Se diluye cuando est muy concentrado o muy viscoso. Lo que ms se utiliza es de 5 ml con valor 05 en la escala de McFarland. La toma de un inculo si es de un lquido se sumerge el asa y se remueve un poco y si es de placa rozando la colonia. A continuacin se cierra el tubo de la misma manera, flameando la boca del tubo al abrirlo y al cerrarlo.5- Transferir el inculo (siembra propiamente dicha)6- Flamear el asa.

Pauta general:

Coger el asa de platino como se indica. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo

.Toma de muestra. Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido). Agitar el tubo. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa

Flamear los bordes del tubo ligeramente. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por debajo de la superficie

Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada estar cargada de microorganismos. Volver a flamear el tubo.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar.

SIEMBRA EN MEDIO LQUIDO: El lquido va a estar en tubo, sumergimos el asa y movemos un poco para que se suelte del asa. Tambin existe otra forma: se inclina el tubo 30, metemos el asa y tocamos una zona que no contiene lquido y retiramos el asa. Al poner derecho el tubo el inculo quedasumergido. Se agita en aerobiosis pero no en anaerobiosis.

SIEMBRA EN MEDIO SEMISLIDO: Se hunde el asa en el medio y se retira por el mismo trayecto.

SIEMBRA EN MEDIO SLIDOA- En tubo con agar horizontal: se siembra igual que en medio semislido.

B- En tubo en Slant o pico de flauta: se siembra en 2 tiempos (igual a los medios semislidos) y despus sobre la superficie se hace un zig-zag.

C- Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar. Una colonia es visible a partir de 109clulas.Existen distintas tcnicas para la siembra en estras, el objeto es obtener colonias aisladas Siembra por agotamiento.El objetivo de esta tcnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificacin y sensibilidad a los antimicrobianos.1. Obtener la muestra con escobilln o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estras (lneas) de un extremo a otro (primer cuadrante)2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro.

Siembra en cuadrcula.El objetivo de esta tcnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)1. Obtener la muestra con asa calibrada que dispense una cantidad exacta (1 ul) y distribuirla con el asa en lnea recta por todo el centro2. Hacer estras de extremo a extremo en sentido contrario a la lnea de inculo3. Girar la placa y hacer estras de extremo a extremo, en sentido contrario a las anteriores

Siembra en agar en tubo recto.En este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo fundido y estril, se coloca el tubo en forma vertical y se deja enfriar. El inculo se siembra, con ayuda de asa, de la siguiente manera:

Se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce mediante puncin en el medio contenido en la parte inferior del tubo

En superficie y estra con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

D-Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inculo. Con ayuda de una esptula de Drigalsky se extiende el inculo hasta su absorcin total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

E- Tcnica de vertido en placa: consiste en mezclar la muestra en el agar y luego se hace la placa con el microorganismo por el medio de un agar.

F.-Siembra por inmersin: se coloca el inculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza para microorganismos aerobios

En estra primaria: es para recuento de colonias en placa a partir de una muestra lquida por ejemplo de orina. Consiste en el contaje de bacterias, es decir, de colonias resultantes de sembrar una determinada cantidad o volumen de inculo. Para hacer esto se utiliza un asa calibrada (es aquella que al coger el inculo siempre coger un volumen conocido) las asas son de 001 ml y de 0001 ml.

TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes.Se toma el inculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar.En el cuarto cuadrante, al menos, obtendramos colonias aisladas.

TCNICAS DE AISLAMIENTO Y RECUENTO BACTERIANOS

A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a travs de la obtencin de colonias aisladas. Cada colonia representa una poblacin de microorganismos procedentes de una sola clula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes tcnicas de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las clulas en glicerol (10-30%) a -70 C, en Nitrgeno lquido a -173 C, o mediante liofilizacin.

- Agotamiento. Para obtener colonias aisladas por la tcnica del agotamiento la muestra se extiende sobre la superficie segn se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra por agotamiento, la cantidad de inculo se espera sea lo suficientemente bajo como para que se depositen clulas aisladas y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras incubar, colonias aisladas.

AISLAMIENTO MEDIANTE DILUCIONES.Tcnica que consiste en obtener una suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estriles, flameando la boca de los tubos antes y despus de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.

Mediante una pipeta estril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar 1ml en el primer tubo con 9ml de suero fisiolgico (dilucin 10-1).

Agitar hasta conseguir una suspensin homognea. Tomar otra pipeta estril, y transferir de esta primera dilucin 0,1ml al siguiente tubo con 10ml de suero fisiolgico (10-2), y as sucesivamente.

A partir del tubo con dilucin 10-2 y 10-4, con una pipeta estril , inocular 0,1ml en placa Agar Nutritivo extendiendo la muestra sobre la superficie con el asa de vidrio, la cual se debe esterilizar mediante flameado..

Tras incubar se podrn obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitir conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original

3.3 OTRAS TECNICAS DE RECUENTOS BACTERIANOS.1. Recuento directo de bacterias al microscopioEs una tcnica para determinar el nmero total de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de recuento (cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de clulas de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.

2. Recuento directo con contadores electrnicosSe utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

3. Recuento en placa por siembra en profundidad. (VERTIDO EN PLACA)Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

4. Recuento en placa por siembra en superficie. (EXTENCION EN PLACA)Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias.