IBI. Fernando Acosta Gómez

Una célula contiene millones de proteínas distintas, separarlas y determinar su estructura es extremadamente difícil.

La purificación depende de lo que se va a determinar en una proteína:

o Peso Molecularo Punto isoeléctricoo numero de subunidadeso numero de aminoácidoso tipo de aminoácidoso secuencia de aminoácidos

Una vez determinados los Aminoácidos:

o Cromatografía según su polaridad.

Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un tipo.

Las técnicas de separación se concentran en el tamaño, la carga y la polaridad, que es donde residen las diferencias de las moléculas.

Se aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de interés.

El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha conservado en cada paso.

Para estudiar detalladamente las proteínas se necesita extraer las proteínas de la células y orgánulos subcelulares.

Homogeneización: Ruptura de la célula.

Moler el tejido en una licuadora homogeneizador Potter-elvejhem.

Después de la homogeneización, las células se someten a centrifugación diferencial, la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad (500 x g).

Si la proteína deseada no se consigue, entonces la velocidad aumenta, por ejemplo a 10 000 x g, para separar las mitocondrias y así hasta obtener las proteínas deseadas para su investigación.

Una vez solubilizadas, se someten a una purificación bruda, comúnmente hecha con el sulfato de amonio y a esto se le conoce como precipitación por sales.

Uso de centrifugación diferencial para separar los componentes de las células. Partiendo de un homogeneizador de células, una fuerza gravitacional (g) creciente hará que se sedimenten diferentes componentes de las células

Las proteínas se mantienen disueltas gracias a sus interacciones con el agua. Cuando se añade sulfato de amonio a una solución de proteína, una parte del agua forma enlaces ion-dipolo con la sal.

Al haber menos agua disponible para hidratar las proteínas, ´setas comienzan a interactuar hidrofóbicamente entre ellas. A una concentración definida de sulfato de amonio, se forma un precipitado que contiene las proteínas contaminantes.

Se separa por centrifugación y se desechan. Luego se añade más sal hasta que se precipita un grupo distinto de proteínas, donde se consigue la proteína de interés.

Esta técnica comenzó a usarse a principios del siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguían con facilidad, pero en la actualidad es posible separar compuestos incoloros; se basa en el hecho de que diferentes compuestos pueden distribuirse en distinto grado entre diferente fase, o porciones separables de materia, se compone de 2 fases, estacionaria y la móvil, que esta fluye sobre el material estacionario y se lleva consigo la muestra a separar.

El material que se constituye en la fase estacionaria se empaca en una columna, la fase móvil se pasa a través de la columna.

También llamada por excusión de tamaño, separa moléculas con base en su tamaño, es útil para ordenar proteínas con pesos moleculares variados.

En esta forma de cromatografía la fase estacionaria consiste en partículas de gel que forman enlaces cruzados, están en forma de granulado y consisten en uno o dos tipos de polímeros. Uno de carbohidrato como dextrano o agarosa y el segundo puede ser una poliacrilamida y la estructura creada con enlaces cruzados de estos polímeros crea poros en el material.

aprovecha las propiedades especificas de unión de muchas proteínas, también se usa un material polimérico como fase estacionaria, se distingue porque el polímero esta unido por enlaces covalentes con algún compuesto, llamado ligando, que se une específicamente a la proteína deseada.

Las demás ´proteínas de la muestra no se unen en la columnas y se eluyen con facilidad con amortiguador, mientras que la proteína unida permanece en la columna.

La electroforesis se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. La movilidad de las macromoléculas depende de su carga, forma y tamaño.

Aunque se han usado muchos medios de soporte para electroforesis, que incluyen papel y líquidos, el soporte más común es un polímero de agarosa o acrilamida similar a los empleados en cromatografía de columna.

Se aplica una muestra a depresiones moldeadas en el medio de soporte. Se hace pasar una corriente eléctrica por el medio, a un voltaje controlado, para lograr la separación deseada, una vez que las proteínas se separan en el gel se tiñe para revelar la ubicación de las proteínas.

Determinar la sucesión de aminoácidos de una proteína es una operación rutinaria, aunque no trivial, en bioquímica clásica. Las distintas partes se deben efectuar cuidadosamente para obtener resultados correctos. El primer paso es averiguar que aminoácidos están presentes y en que proporciones.Basta calentar una solución de la

proteína en ácido, por lo regular HCL 6 m a 100-110°C durante 12-36 horas para hidrolizar los enlaces pepiticos.