tÉcnicas de manipulaciÓn genÉtica
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TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA. Indice. 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN
GENÉTICA
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Obtención de genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
1. Introducción: la clonación molecular
- Amplificación de moléculas de ADN por clonación célular-Amplificación de moléculas de ADN por clonación acelular (PCR)
- Manipulación genética y clonación de organismos pluricelulares (animales y plantas)
La clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor.
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
1. Introducción: la clonación molecular
... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
1. Introducción: la clonación molecular
Estrategia general del proceso de clonación
Extraer elgen de interés
insulina
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Obtención de genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
.• Stanley Cohen (Universidad de Stanford)
Plásmidos bacterianos
• Herbert Boyer (Unversidad de Columbia)
Enzimas restricción
Aislamiento y digestión del ADN
Inserción en moléculas vectores
con capacidad autónoma de replicación en la célula hospedadora
1. Introducción: la clonación molecular
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas
Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la cadena nucleotídica
• exonucleasa a o 3’• exonucleasa b o 5’
Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotídica
Enzimas de restricción
Fosfodiesterasade veneno de
serpiente
2. Las enzimas de restricción
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
EcoRI actuando sobre una
secuencia de ADN
2. Las enzimas de restricción
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas
de restricción
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Tipo I y Tipo III
Actividad restricción y modificación Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina Reconocen una secuencia específica Recorren un cierto número de bases y cortan
Tipo II
Rompen por la secuencia de reconocimiento Precisan Mg 2+, pero no ATP
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
2. Las enzimas de restricción
Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Ejemplos de endonucleasa
G↓A A T T CC T T A A↑G
5’
5’
3’
3’
C C G G
G G C Cextremos romos
extremos cohesivos
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
EcoR 1 de E.coli
G A A T T C
C T T A A G
Secuencias Palindrómicas
A A G C T T Hind III de
T T C G A A Haemophilus influenza
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
EcoR 1 de E.coli
G A A T T C
C T T A A G
Secuencias Palindrómicas
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN
Extremos cohesivos
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
Métodos de aislamiento de ADN foráneo
(a) Cortes:
(b) Síntesis
• Endonucleasas de restricción (Tipos I, II, III)
• Fragmentación mecánica
• Síntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa
• Síntesis química directa
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa
ADNtranscripción
ARN
PROTEÍNAtraducción
La mayoría de las células
RNA
Transcriptasa reversa
cDNA
ARN polimerasa
Retrovirus
RNA
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas
Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas
de restricción
Vector declonación
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
Son vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo.
Características principales• Se replican de forma autónoma (origen de replicación)
• Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Tipos de vectores:Plásmidos• Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb).
• Contienen genes de resistencia a antibióticos.
Virus• Permiten insertar 15-20 kb.• El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli.
• Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis.
Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Tipos de vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
• Plásmidos (bacterianos)
• Virus
• Cósmidos (laboratorio)
• YACs (levaduras)
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
• Plásmidos
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
pBR322
-Control relajado-Fenotipo seleccionable-Cierto Nº de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos 10000bp es poco eficiente
ADN Plasmídico
ADN
ADN Plasmídico
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Tipos de vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
• Plásmidos (bacterianos)
• Virus
• Cósmidos (laboratorio)
• YACs (levaduras)
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
• Para bacterias: Fago y derivados, Fago M13• Para plantas: CaMV• Para mamíferos: SV40
Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
• Virus
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l).
-Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción
Fago
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Adsorción de particulas virales a una bacteria
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
SIDA
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Tipos de vectores de clonación
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
• Plásmidos (bacterianos)
• Virus
• Cósmidos (laboratorio)
Mezcla plásmido y virus
• YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas
V
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
![Page 32: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/32.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN
Enzimas de restricción
Vector ADN
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 34: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/34.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula
hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
![Page 35: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/35.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
4. Hospedadores. Introducción del ADN foráneo
• Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plásmidos < 20 Kb
• Infección: directa del virus empaquetado in vitro
• Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento)
• Microinyección: para células grandes (eucariotas) con micromanipulación.
• Pistola o Bombardeo de partículas: para transformar vegetales.
• Conjugación: celular del ADN de dos células
• Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared celular
Métodos de inserción del ADN-vector en célula huesped
W, Au
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 37: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/37.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
![Page 38: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/38.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
MÉTODOS DE SELECCIÓN
Resistencia a antibióticos
Genes marcadores (gen -galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
Hibridación de colonias
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
Resistencia a antibióticosLa resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina
PlásmidopBR322
El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Sin plásmidoSin inserto
5. Métodos de selección
Resistencia a antibióticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector
Con ampicilinay tetraciclina
Con plásmidoSin inserto
Con plásmidoCon inserto
Con tetraciclina
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
MÉTODOS DE SELECCIÓN
Resistencia a antibióticos
Genes marcadores (gen -galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
Hibridación de colonias
![Page 42: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/42.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
• Genes marcadores (ej: gen -galactosidasa)
5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido Br-Cl-indol + galactosa
(X-gal) (Azul)
Inactivación insercional
(introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)
Inserción génica positiva
(Unir el gen marcador al DNA foraneo)
Amp
Gal
Ori
pUC19
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
• Genes marcadores (gen -galactosidasa)
Plasmido pUC19
Amp
Gal
Ori
Plasmido pUC19
Amp
Gal + inserto
Ori
![Page 44: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/44.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección-galactosidasa -galactosidasa
+ ADN foráneopUC19 = plásmido
X
![Page 45: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/45.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
MÉTODOS DE SELECCIÓN
Resistencia a antibióticos
Genes marcadores (gen -galactosidasa)
GFP (green fluorescent protein)
Hibridación de colonias
![Page 46: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/46.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
GFP (green fluorescent protein)
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Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
510488TubulinaGFP-TUB
530515Retículo endoplásmicoYFP-ER
510488PeroxisomasGFP-PEROXI
530515NúcleoYFP-NUC
475420MitocondriaCFP-MITO
600550MitocondriaRFP-MITO
510488MembranaM-GFP
510488EndosomasGFP-ENDO
475420Ap. De GolgiCFP-GOLGI
510488ActinaGFP-ACTIN
Emisión (nm)
Excitación (nm)LocalizaciónVector
GFP (green fluorescent protein)
![Page 48: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/48.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Estrategia general del proceso de clonación
1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector
2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector
3.Introducción del vector-ADN foráneo en la célula hospedadora
4. Selección de los transformantes
5. Estabilidad de la información genética
![Page 49: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/49.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 50: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/50.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Genotecas
Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo.
Tipos de genotecas:• Genómicas• Parciales• ADNc. Colección de ARNm
Tipos de vectores:• Plásmidos (Genotecas parciales)• Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc)• Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)
![Page 51: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/51.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
6. Obtención de genotecas
Utilizando un virus
Utilizando un plásmido
![Page 52: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/52.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
5. Métodos de selección
• Hibridación de colonias
Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridación “in situ” con sondas marcadas
• Obtención de la sonda marcada:
• marcaje radioactivo: (32P)
• marcaje desoxinucleótidos fluorescentes
![Page 53: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/53.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 54: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/54.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
![Page 55: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/55.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS
Se basan en la migración diferencial de las moléculas a separar en un campo eléctrico.
En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migración de las moléculas es el campo electrico, pero el gel actúa como filtro molecular, relentizando la migración su migración en función de su tamaño
Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)
![Page 56: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/56.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
![Page 57: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/57.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
ELECTROFORESIS. SOPORTES
CH2CH
O
CNHCH2NH
O
CCH2 CH
NH2
O
C
CH2 CH
Acrilamida N,N`-Metilenbisacrilamida
- Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN)
- Geles de agarosa (los más usuales para ADN)
Gelificación química
Gelificación térmica
![Page 58: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/58.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
ELECTROFORESIS DE ADN
Disolver la agarosa a la concentración deseada en una solución salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento
Dejar enfriar hasta unos 50ºC y añadir Bromuro de Etidio
N+
C2H5
Bromuro de Etidio
![Page 59: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/59.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa es el polímero usado para la separación.
![Page 60: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/60.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa se mezcla con un tampón.
![Page 61: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/61.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa se disuelve en el microondas.
![Page 62: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/62.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
Se preparan la cubeta y el peine.
![Page 63: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/63.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
Se añade el polímero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificación.
![Page 64: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/64.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE
Se procede a cargar los pocillos con las muestras
Se procede a conectar a una fuente de electroforesis
7. Electroforesis en geles de agarosa
![Page 65: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/65.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
Formados los “pocillos”, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.
![Page 66: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/66.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
Cada muestra forma una banda azul que “correrá” en la agarosa dependiendo de su tamaño.
![Page 67: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/67.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE
7. Electroforesis en geles de agarosa
![Page 68: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/68.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
7. Electroforesis en geles de agarosa
El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes.
Se coloca el gel en un transiluminador de luz UV
Se visualizan las bandas de ADN teñidas con el bromuro de etidio.
![Page 69: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/69.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
La movilidad electroforética del ADN en los geles de agarosa es inversa a su tamaño
2.02.01.61.6
1Kb1Kb AA
3.03.0
BB
1.01.0
0.50.5
BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis2.02.01.61.6
1Kb1Kb AA
3.03.0
BB
1.01.0
0.50.5
BKTBKT--O de O de H. H. pluvialispluvialis
7. Electroforesis en geles de agarosa
![Page 70: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/70.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 71: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/71.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
![Page 72: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/72.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 1993
Descrubrió la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp.
”Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an
afternoon”
![Page 73: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/73.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.
PCR
amplificación
DNA
(molécula sencilla)
Muchasmoleculasdel mismo
ADN
![Page 74: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/74.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.
DNA
(doble hélice)
Controlando la temperatura
![Page 75: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/75.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G-T
• Cortos primers de DNA específicos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada
• los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 76: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/76.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 77: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/77.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 78: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/78.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 79: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/79.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 80: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/80.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 81: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/81.jpg)
• Síntesis por DNA polimerasa
• • -A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T A5’ 3’
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
![Page 82: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/82.jpg)
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
Después del primer periodo de síntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensión de la cadena
Cadena original de DNA
¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?
![Page 83: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/83.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
• Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C)
![Page 84: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/84.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
• Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C)
• Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa
• Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1
2
1
• Ahora tenemos dos copias de la molécula original
![Page 85: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/85.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Fusión95°C
Hibridización50-60ºC
Extensión deLa cadena
75ºC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ºC
50 - 60ºC75ºC
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial de copias
![Page 86: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/86.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
ADN-polimerasa de Thermus aquaticus(Taq –polimerasa)
Hey, Boo Boo¿pescamos lasTappara amplificar los
sandwiches?
Ok
Yogy
Parque Nacional de Yellowstone
![Page 87: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/87.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
![Page 88: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/88.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pelo humano
![Page 89: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/89.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
Indice
1. Introducción: la clonación molecular
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN
4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo
5. Métodos de selección
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
![Page 90: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/90.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIÓN
DE DNA
8. Métodos de secuenciación del ADN
U
K
J
K
K
![Page 91: TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012404/56814a1a550346895db743a0/html5/thumbnails/91.jpg)
Tema 11
Licenciado en QuímicaCurso 1º
TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN
GENÉTICA