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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Variantes de PCR; detección de delecciones e inserciones
Dra. Mariana L. FerramolaCurso de Técnicas Moleculares Aplicadas a
Bioquímica Clínica.Área de Qca. Biológica
FQByF, UNSL2016
REACCIÓN DE PCR
Esta reacción permite obtener un gran número de
copias de una secuencia de ácido nucleico
determinada, ya sea ADN o ARN.
RT-PCR
Muestra de partida: ARN.
Pasos de reacción:
1) Transcripción reversa
para obtención de ADNc.
2) Amplificación de la
secuencia deseada
mediante PCR.
RT-PCR: Detección de virus de Influenza A.Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798.
Muestra: Hisopado nasal y faríngeo.
Transcripción Reversa: RNA total, usando random primer hexamers.
Identificación del virus de Influenza A mediante
amplificación por PCR del gen de matriz de dicho virus
(212bp).
RFLP-PCR
Esta técnica aprovecha la aparición o eliminación de un sitio de corte para una enzima de restricción, debido a una
mutación puntual.
La técnica consta de dos pasos sucesivos:
1) Amplificación de la secuencia de interés mediante PCR.
2) Restricción de la secuencia amplificada con una enzima
específica.
RFLP-PCR: Acción de las enzimas de restricción.
RFLP-PCR
RFLP-PCR: Detección de virus de Influenza A resistentes a Amantadina.
Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798.
Primeramente se realiza una
amplificación del gen de la
proteína M2. Luego se
detectan mutaciones
puntuales que dan resistencia
a amantadina, mediante el
uso de enzimas de
restricción.
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D).
La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT,
que da como resultado que la enzima presente actividad
disminuída.
La variante se debe a la mutación N314D, en la cual hay una
sustitución (c.940A˃G), que genera un cambio del
aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico
(Asp, D).
Este polimorfismo genera un cambio de bases que
determina un sitio de corte para la enzima de restricción
AvaII.
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D).
RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D).
Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas ylíneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal
GAP-PCR.
Puede usarse un único par de primers que flanqueen la zona
deleccionada, de modo tal que esta sea amplificada en la
reacción de PCR.
Para delecciones menores de 1Kb, el par de primers utilizados
generará dos productos de amplificación, el fragmento de
menor tamaño se producirá a partir del alelo que presenta la
delección.
Cuando la delección es mayor, la distancia entre los primers
en el alelo normal es demasiado grande como para ser
amplificada, y sólo se obtendrá producto a partir del alelo que
presenta la delección (alelo mutado). En estos casos, el alelo
normal es detectado usando un tercer primer, cuya zona de
hibridación se encuentre dentro de la región que se
encuentra delecionada en el alelo mutado
Se utiliza para detectar grandes delecciones en el ADN.
GAP-PCR: Detección prenatal de las delecciones α-SEA y β-FIL (causantes de α- y β-
talasemia, respectivamente).Kho y col., Sci Rep. 14;5:13937, Sept 2015.
Muestra: se utilizó ADN extraído de sangre y de vellosidades
coriónicas.
Posteriormente el ADN se amplificó mediante qPCR (en dos
reacciones separadas, una para cada mutación), y los amplicones
obtenidos fueron identificados a través de la realización de las
correspondientes curvas de disociación.
GAP-PCR: Detección prenatal de la delección α-SEA.
SEA-F: Primer Forward, común a los amplicones normal y mutado.
SEA-R1: Primer Reverse, que amplifica el alelo normal.
SEA-R2: Primer, Reverse que amplifica el alelo mutado.
El rectángulo negro indica la delección encontrada en la mutación
α-SEA; los rectángulos naranjas indican las zonas amplificadas por
PCR.
GAP-PCR: Detección prenatal de la delección α-SEA.
Curvas de disociación obtenidas a partir de amplicones de: un un sujeto
normal, sin la delección α-SEA (rojo); un portador de la mutación α-SEA
(verde); y un homicigota para la delección α-SEA (azul).
GAP-PCR: Detección prenatal de la delección β-FIL
FIL-F: Primer Forward, común a los amplicones normal y mutado.
FIL-R1: Primer Reverse, que amplifica el alelo normal.
FIL-R2: Primer Reverse, que amplifica el alelo mutado.
El rectángulo negro indica la delección encontrada en la mutación
β-FIL; los rectángulos naranjas indican las zonas amplificadas por
PCR.
GAP-PCR: Detección prenatal de la delección β-FIL
Curvas de disociación de: un un sujeto normal, si la delección β-FIL (rojo);
un portador de la mutación β-FIL (verde); y un homicigota para la
delección β-FIL (azul).
Long range PCR.
Esta técnica ha sido utilizada para detectar delecciones e
inserciones.
Pueden obtenerse
amplicones de hasta
30Kb.
El protocolo de PCR es
modificado por la
introducción de una
polimerasa con actividad
correctora de pruebas (3’-
5’-exonucleasa) además
de la Taq polimerasa.
Long range PCR: Detección de inserciones
MAPH (múltiple hibridización de sondas amplificables) y MLPA (múltiple
amplificación de sondas dependiente de ligación)
Ambas son técnicas basadas en una amplificación cuantitativa
por PCR.
Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40
secuencias blanco simultáneamente.
Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y
duplicaciones del genoma.
Debido a la rapidez con que estas técnicas permiten escanear
hasta 40 blancos, pueden ser ampliamente usadas tanto para
investigación como para diagnóstico. Por ejemplo para la
caracterización/diferenciación de tumores.
MAPH: Síntesis de sondasCada secuencia blanco es detectada por una sonda específica.
Todas las sondas están flanqueadas por las mismas secuencias
(en sus extremos 5’ y 3’), lo que permite amplificarlas todas
con el mismo par de primers.
Todas las sondas deben tener tamaños diferentes, para ser
diferenciadas por el detector.
MAPH: Protocolo de ensayo..
Uno de los
primers usados
para la
amplificación
con PCR está
marcado con un
fluorocromo.
Los productos de
amplificación
son separados
por
electroforesis
capilar y
detectados .
MLPA.
Principales diferencias con el MAPH:
Utiliza dos sondas para reconocer cada secuencia blanco.
La hibridación de las sondas con el ADN blanco se realiza en
solución.
Luego de la hibridación de las sondas, se lleva a cabo una reacción
de ligación.
MLPA: Protocolo de ensayo..
Las sondas
hibridizan de
manera
inmediatamente
adyacente, de esta
manera solo
aquellos pares de
sondas que
encuentran sus
secuencias blanco
pueden ser ligadas
y amplificadas por
PCR.
MLPA: Protocolo de ensayo..
Las sondas que reconocieron
su secuencia blanco y
pudieron ser ligadas son
amplificadas por PCR, usando
un único par de primers.
Todos los amplicones
generados deben tener
diferente tamaño.
Los productos obtenidos son
separados por electroforesis
capilar y detectados debido a
su marcación fluorescente
(usualmente en uno de los
primers)
MAPH-MLPA: Resultados..
MAPH-MLPA: Resúmen..
SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única)..
La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN
(mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la
generación de diferencias en la movilidad electroforética.
Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN
asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia
de nucleótidos.
Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la
secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad
detectables.
La mayoría de los experimentos de SSCP son diseñados para
evaluar polimorfismos en un único locus, y comparar los
resultados entre individuos diferentes.
SSCP
1. Un par de primers específicos es
utilizado para amplificar el ADN
blanco.
2. La muestra se enriquece en ssADN
por medio de una PCR asimétrica,
debido a la presencia de uno de
los primers en mayor cantidad que
el otro.
3. Las movilidades de los fragmentos
simple cadena se comparan
mediante electroforesis en un gel
neutro de poliacrilamida.
4. Las bandas son detectadas.
SSCP: esquema de trabajo.
SSCP: Análisis de mutaciones en el gen de TNP1 en hombres infértiles con varicocele.
Heidari y col., Iran J Reprod Med Vol. 12. No. 4. pp: 257-262, abril 2014.
La correcta expresión de los genes de la Proteína de Transición Nuclear
(TNP) es necesaria para la espermatogénesis. En el citado trabajo se
intenta buscar si existe una relación entre la presencia de mutaciones en
esta proteína y la presencia de varicocele en hombres infértiles.
� Se trabajó con muestras de sangre de pacientes infértiles con
varicocele y de sujetos controles.
� Para el estudio, se seleccionaron tres regiones del gen TNP, dos exones
y un intrón, que fueron amplificados por PCR.
SSCP: Análisis de mutaciones en el gen de TNP1 en hombres infértiles con varicocele.
Heidari y col., Iran J Reprod Med Vol. 12. No. 4. pp: 257-262, abril 2014.
Identificación de una mutación en heterocigosis, en hombres
infértiles con varicocele (calles 4 y 5, mutación g.IVS1+75T>C). La
calle 1 pertenece al alelo wt.