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Técnicas de Biología Molecular
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I. Enzimas de restricción
Análisis
DNA
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Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño
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II. Separación electroforética de moléculas de DNA
(A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia)
(B) Electroforesis para RFLP (sepración entre 100 a 10000 nt)
(C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal)
+
– –
–
+
+
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III. Secuenciación de DNA por el método de Sanger
No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa
• dsDNA molde (¿secuencia?) • 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)
• cebador de DNA
• DNA polimerasa
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5’
5’
3’
3’
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Secuenciación automatizada de DNA
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Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda)
dCTP[αP32]
α β γ
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Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología
65oC 50oC
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IV. Southern Blot (detección de secuencias específicas de DNA)
1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o
nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de
fosforimager
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V. Northern blot (detección de secuencias específicas de RNA)
A nivel de transcriptoma (RNA) Northern Blot
1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda específica 6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de
fosforimager
Expresión de genes
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Bromuro de etidio
Sonda P32
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28S
18S
Southern Blot Northern Blot
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VI. Western Blot (detección de proteínas específicas con anticuerpos)
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La detección de proteínas sirve para conocer: 1. Niveles de expresión 2. Isoformas 3. Modificaciones postraduccionales 4. Tiempo de vida media y degradación 5. Localización subcelular
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VII. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Desnaturalizar Alineamiento Polimerización
cebador directo
cebador reverso
94-95ºC 55-65ºC 72ºC
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La amplificación es exponencial
En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés
1
2
4 8
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Pruebas de identidad (PCR a nivel de DNA)
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El RT-PCR se puede utilizar como alternativa del Northern blot
DNA: PCR Amplificación directa
RNA: RT-PCR 1. Transcripción
reversa (obtención de cDNA)
2. Amplificación por PCR Exones +
intrones Solo exones
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Después del PCR o RT-PCR los fragmentos se pueden clonar
Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción
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VIII. DNA recombinante
DNA A
DNA B
DNA AB
ligasa
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Mutagénesis sitio dirigida
La mutación se incluye en uno de los cebadores para el PCR
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Mutagénesis dirigida
Se pueden generar proteínas mutadas manipulando su DNA
Generalmente la mutagenesis se hace por PCR: - Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro) - Deleciones
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Vectores de clonación
1. Plásmidos
2. Fagos
3. Cósmidos
4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz)
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1. Plásmidos
Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos
DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación
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Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante
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Otras características de los plásmidos
Sitios de clonación múltiples: varias enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido
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Plásmidos de expresión
Caracteristicas adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripcion - Sitio de reconocimiento por el ribosoma
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Múltiples copias de DNA recombinante
Obtención de múltiples copias de la molécula recombinante
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La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante
Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias