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7/26/2019 te3182dsfdsafadssdfdsafcxvzresdfda

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA DE CONOCIMIENTO CIENCIAS AGROPECUARIAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE ZOOTECNIA

TESIS

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE BACTERIAS CON POTENCIAL

PATOGENO PARA OSTREIDOS

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE

MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

PRESENTA:

Daniel Israel Higuera Sandoval

Directora de Tesis:

Dra. Maurilia Rojas Contreras

Director externo:Dr. Jos Manuel Mazn Suastegui

CD. UNIVERSITARIA, LA PAZ, B.C.S SEPTIEMBRE DEL 2014


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i

DEDICATORIA

La presente tesis est dedicada a mis padres Enf. Armando Higuera y Arcelia Sandoval Cazares por

ser el pilar y motor, que gracias a su apoyo y sustento estoy subiendo un escaln ms en mi vida

profesional.

A mi hermano Dr. Armando Higuera Sandoval por su grandioso ejemplo que me ha transmitido, el

deseo de superacin en la vida profesional y aspiracin de alcanzar un sueo.

A mi hermosa hermana Aime Karina Higuera Sandoval tambin por estos maravillosos aos

viviendo juntos, solos, apoyndonos incondicionalmente en este arduo camino.

A mi maravilloso sobrino Daniel Armando que ha causado en mi corazn una revolucin de

sentimientos como el nuevo integrante de la familia.

A esta frase de mi padre que es una herencia ms para m vida diaria.

Si callamos la verdad siempre seremos sordos y ciegos


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ii

AGRADECIMIENTOS

Las instituciones en apoyo al conocimiento cientfico son las herramientas para el desarrollo de un

buen profesionista. Por tanto agradezco todo el apoyo brindado por la Universidad Autnoma de

Baja California Sur (UABCS), por permitirme ser parte de ella y proporcionarme el espacio para la

realizacin de este ideal.

Al Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste (CIBNOR) y al Consejo Nacional de Ciencia

y Tecnologa (CONACYT) por admitirme en este grandioso proyecto as como por la beca otorgada

para desarrollar mi tesis.

Al CIBNOR Unidad Guerrero Negro as como al personal que labora, el cual nos dio un excelente

trato y buena compaa.

A mis directores de tesis Dra. Maurilia Rojas Contreras y Dr. Jos Manuel Mazn Suastegui por la

confianza, oportunidad y el aprendizaje que han dejado en m.

A la Ing. Alejandra Coso Castro por su enseanza, paciencia, tolerancia y tiempo dedicado a m en

esas maanas y tardes de arduo trabajo, con esa alegra que siempre transmita.

Al Ing. Gaspar a. Petitt Higuera por su colaboracin en este proyecto, por el apoyo brindado en la

identificacin de bacterias.

Al Dr. Ricardo Vzquez Jurez por su apoyo en el trabajo realizado en Guerrero Negro.

Sin olvidar y no menos importantes al Dr. Alfredo Guevara Franco y Dr. Marco Antonio Cadena

Roa que tambin forman parte de este crculo de conocimiento.

A mis compaeros y amigos del Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos, Ing.

Adriana Ramrez Arroyo, Ing. Macario Savn Amador que somos parte del mismo proyecto y un

complemento para mi tesis.

A la Dra. Emilia Rosas Lliteras Martnez por el ltimo impulso y futuras oportunidades en el

mbito profesional en la Habana, Cuba. A todos mis docentes que han formado parte de mi

educacin aportando su granito de arena.


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iii

INDICE GENERAL

Dedicatoria I

Agradecimientos. II

ndice general. III

Lista de tablas V

Lista de figuras VII

Resumen VIII

1. Introduccin. 1

2. Justificacin 7

3. Objetivos. 8

3.1. Objetivo general 8

3.2. Objetivos particulares 8

4. Hiptesis. 8

5. Antecedentes. 9

5.1 Moluscos bivalvos en el contexto mundial 9

5.2 Ostricultura en Mxico 105.3 Ostricultura en Baja California Sur. 10

5.4 Riesgo sanitario asociado al cultivo y consumo de moluscos bivalvos 15

6. Materiales y Mtodos. 16

6.1 Colecta y transporte de organismos 16

6.2 Sitios de muestreo 16

6.3 Anlisis microbiolgico. 20

6.4 Aislamiento y purificacin de bacterias 21

6.5 Morfologa celular de las cepas 21

6.6 Tincin de Gram y prueba de la catalasa 22


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iv

6.7 Ensayo de adhesin a moco de ostin. 22

6.7.1 Preparacin del cultivo. 22

6.7.2 Preparacin de la membrana. 22

6.7.3 Ensayo de adhesin. 23

6.8 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas 23

6.8.1 Extraccin del ADN genmico de cepas 23

6.8.2 Visualizacin del ADN genmico. 24

6.8.3 Amplificacin del gen 16S DNA para identificacin molecularde bacterias

25

6.8.4 Visualizacin de los productos del PCR en geles de agarosa 26

6.8.5 Secuenciacin y anlisis bioinformtico. 26

7. Resultados. 27

7.1 Anlisis microbiolgico 28

7.2 Aislamiento y purificacin de bacterias 32

7.3 Caracterizacin de cepas aisladas de ostiones 33

7.4 Ensayo de adhesin 34

7.5 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas 37

8. Discusiones. 41

9. Conclusiones. 52

10. Bibliografa. 53

11. ANEXOS 71


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v

LISTA DE TABLAS

Tabla Titulo Pagina

Tabla 1 Ubicacin geogrfica de las granjas de moluscos en Baja CaliforniaSur, Zona Pacifico Norte.

12

Tabla 2 Ubicacin geogrfica de las granjas de moluscos en Baja CaliforniaSur, Zona Pacifico Sur.

13

Tabla 3 Produccin ostrcola por municipio en B.C.S. en el ao 2010. 14

Tabla 4 Medios de Cultivo utilizados 21

Tabla 5 Mezcla de reaccin usada para la amplificacin del gen 16S ARN. 25

Tabla 6 Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacteriascon potencial patgeno para ostin

27

Tabla 7 Anlisis microbiolgico de los ostiones de C. gigas tomados dediferentes zonas de Guerrero Negro.

28

Tabla 8 Anlisis microbiolgico de los ostiones de C. gigas tomados deRegin de Baha Magdalena (San Buto y Paredones)

29

Tabla 9 Anlisis microbiolgico de los ostiones de C. gigas tomados deSanto Domingo (Las Botellas)

30

Tabla 10 ANOVA del log UFC en Agar Marino de los tres muestreos 30

Tabla 11 ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos 31

Tabla 12 .Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1,

2 y 3

31

Tabla 13 ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2

y 3

31

Tabla 14 ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2

y 3

32

Tabla 15 Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre

muestreos

32

Tabla 16 Tipo y nmero de microorganismos con potencial patgeno,

aisladas en diferentes medios de cultivo selectivos.

32

Tabla 17 Caracterizacin de las cepas con potencial patgeno aisladas deostiones

33

Tabla 18 Caractersticas de adhesin de las cepas aisladas de ostiones endiferentes medios de cultivo

35


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vi

Tabla 19 Cepas con potencial patgeno aisladas de diferentes especies deostin y seleccionadas por su perfil de adhesin para identificarsemolecularmente

37

Tabla 20 Gnero y especie de las cepas con potencial patgeno aisladas de

ostin y seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco deostin.

39


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LISTA DE FIGURAS

Figura Titulo PaginaFigura 1 Crassostrea gigas 17Figura 2 Crassostrea gigas 17Figura 3 Crassostrea gigas 18Figura 4 Crassostrea gigas 18Figura 5 Crassostrea gigas 18Figura 6 S. palmula. 19Figura 7 C. gigas 19Figura 8 C. gigas 19Figura 9 S. palmula 19Figura 10 S. palmula 19Figura 11 C. palmula 19Figura 12 C. gigas 19Figura 13 C. gigas 19Figura 14 Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS. 20

Figura 15 Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genmico de las cepasde ostin: Carril 1. Lambda DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4.Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9.Cepa 065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.

38

Figura 16 Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA ypH* y con ADN genmico de las cepas: Carril 1. Marcador depeso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011,6 . Cepa 024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa072.

38


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viii

RESUMEN

La produccin mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada por numerosas

enfermedades y debido a su severo impacto en el desarrollo econmico y socioeconmico en

muchos pases, algunas de estas enfermedades se han convertido en una restriccin primaria para el

desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. En esta investigacin se cuantific la

microbiota en diferentes medios de cultivo para bacterias con potencial patgeno y se aislaron las

bacterias predominantes en diferentes especies de ostiones que se cultivan o se encuentran en el

medio natural a lo largo de las costas del Ocano Pacfico en Baja California Sur. Se caracterizaron

de acuerdo a su patrn de adhesin a extractos crudos de moco de ostin, asumiendo que los

microorganismos que se adhieren a moco tienen la capacidad de colonizar el tracto digestivo y

dems rganos que secretan mucosas en los ostiones. Se identificaron molecularmente diez cepas

con potencial patgeno que se adhirieron a moco de ostin. Los resultados mostraron que de las 80

cepas que se aislaron el 30% de las cepas presentaron la capacidad de adherirse a moco de ostin.

De las cepas aisladas en ABP el 47% presentaron adhesin fuerte, de AM el 23%, de AXLD el

80% y de ATCBS, el 22%. Las cepas con potencial patgeno, predominantes en organismos de

Crassostrea gigas, C. cortiziensisy C. sikamea, y Saccostrea palmula identificadas fueron: La cepa

01 presento un 100% de identidad con Enterococcus sp.C213. La cepa 011 present un 99% de

identidad con Enterococcus faecalis partial strain ZG7-15 y la cepa 062 tambin un 99% de

identidad conEnterococcus faeciumstrain FMC59. La cepas 03, 06 y 018, presentaron un 99% de

identidad conEscherichia colicepa FUA1242 y la cepa 072 present un 100% de identidad con E.

colicepa PMV-1. La cepa 012 tuvo tambin un 99% de similitud con Staphylococcus pasteuricepa

87. La cepa 065 present tambin un 99% de similitud con Enterobacter cloacaestrain AB2. De

acuerdo a la bibliografa, estos microorganismos con potencial patgeno han estado implicados en

brotes de enfermedades transmitidas por alimentos causando diferentes tipos de infecciones por lo

que de acuerdo a los resultados obtenidos, la prevalencia de estas bacterias en los ostiones, refleja

un riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, para saber si estas bacterias son tambin

patgenas para los ostiones en sus diferentes estadios de crecimiento, se requiere desarrollar otros

ensayos.


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1

1. INTRODUCCION

Los productos marinos, incluyendo los moluscos ostreidos, representan una proporcin

muy importante de los alimentos a escala mundial, y forman parte importante y esencial dela dieta del hombre en muchos pases. Los moluscos son, despus de los insectos, el grupo

de animales ms extendido sobre el planeta; se han clasificado aproximadamente 200 mil

especies. Se les encuentra lo mismo en la copa de los rboles que en las profundidades

marinas y su estudio ha ofrecido a los cientficos temas por dems interesantes, por lo que

constituyen uno de los grupos mejor entendidos en la actualidad. Los moluscos bivalvos

son las ostras, mejillones, almejas, vieiras siendo estos de gran importancia econmica para

la alimentacin. En cuanto a la contribucin de alimentos los moluscos ocupan el 3er lugar

junto a los peces didromos, las plantas y peces de agua dulce. En el panorama mundial las

ostras ocupan el segundo lugar ms importante despus de los Cyprinidos o carpas (Helm et

al., 2006).

Los moluscos bivalvos, son organismos filtro-alimentadores y se ubican en la base de la

cadena alimenticia; crecen rpido, especialmente en los trpicos, y son ampliamente

demandados como alimentos gourmet en los mercados globales. Por lo anterior son

candidatos ideales para la acuacultura, adems, en los proyectos comerciales no se

requieren inversiones grandes ni equipos sofisticados. A pesar de ser importante, la

acuacultura de moluscos no se ha consolidado como una actividad dominante en Mxico,

debido a que no se ha considerado una conjuncin de elementos tcnicos, econmicos y

sociales (Helm et al., 2006).

Entre los moluscos de la familia Ostreidae se incluye a un gran nmero de especies

comestibles; su distribucin est confinada a una franja de aguas costeras dentro de las

latitudes 64 N y 44 S. Su distribucin vertical se extiende desde un nivel

aproximadamente medio desde la zona intermareal, hasta profundidades de 32 m sin

embargo, las especies comerciales rara vez se encuentran en profundidades mayores de 12

m (Helmet al., 2006).


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2

Los ostreidos en particular incluyen las ostras u ostiones, que son indudablemente los

moluscos preferidos del hombre, tanto por las cantidades que pueden extraerse como por su

calidad nutricional, generalmente aceptada y que con el tiempo se han incluido al comercio

y al cultivo. Los ostiones son un alimento altamente nutritivo; su contenido en protena estotalmente digerible y representa el 50 % de la materia seca.. Adems, el ostin tiene un

contenido relativamente alto de carbohidratos (28 % de la materia seca) y relativamente

bajo de lpidos bajo (11 % de la materia seca). Contiene adems vitaminas (A, riboflavina,

tiamina, niacina) y minerales (hierro, yodo, magnesio, fsforo, cobre, calcio), por lo cual se

considera un alimento equilibrado para el consumo humano (Len, 1999).

Los ostiones son organismos bentnicos que se distribuyen en zonas fango-arenosas,

aunque pueden invadir sustratos slidos y duros como las rocas, e incluso se desarrollan

fijndose a las races areas del mangle, en los estuarios, desembocaduras de ros y lagunas

costeras, donde generalmente existen condiciones del medio favorables para su desarrollo y

prosperidad. En condiciones controladas de cultivo, pueden desarrollarse en otro tipo de

sustratos. Se alimentan principalmente de fitoplancton y son altamente gregarios, por lo que

se les encuentra formando agrupaciones compactas o islotes, denominados bancos. Se

distribuyen en las zonas tropicales y templadas, desde el nivel de las mareas hasta

profundidades de 40 m y sin embargo, prosperan principalmente en aguas poco profundas(SEPESCA/INP, 1994).

Al gnero Crassostrea pertenecen numerosas especies que habitan en medio marino y/o

esturico. Las que presentan un mayor inters y han sido objeto de cultivo o explotacin

son C. gigas, llamada ostra japonesa o del Pacfico, que ha sido importada, entre otros

pases occidentales, por Francia, en donde ha reemplazado totalmente a la ostra portuguesa

C. angulata; C. virginica u ostra americana, que es objeto de importantes cultivos en las

provincias martimas del Canad y sobre la costa oriental de los Estados Unidos,cultivndose en concurrencia con otras especies en la costa del Pacifico. C. angulata u ostra

portuguesa, se distribua por Portugal, Espaa, Marruecos y en las costas del Adritico.

Otras especies pertenecientes a este gnero son C. margaritacea, que es la especie ms


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comn en frica del Sur, C. glomerata es la ostra de Nueva Zelanda, siendo objeto de

cultivo en las zonas intertidales; C. rhizophorae que vive fija sobre los manglares en el mar

del Caribe y se cultiva en Venezuela, Martinica y Guadalupe; C.guyanensis, que se

encuentra fijada sobre rocas en la costa Atlntica de Amrica del Sur, desde Trinidad hastaBrasil. C. gasar puebla los mangles de las riveras del oeste africano desde Senegal a

Angola. C. commercialis es la especie de Australia, llamndose ostra de roca o de

mangrove y siendo objeto de un fuerte cultivo. Otras especies que se pueden citar son C.

nippona y C. rivularis en Japn y en Extremo Oriente, C. cuscullata en la regin

indopacfica y en las costas americanas desde Per a California, as como en frica desde

Cabo Verde al Cabo de Buena Esperanza y C. lacerata como especie cosmopolita. (Torres,

2001).

Las especies pertenecientes al gnero Ostrea que presentan un mayor inters son O. edulis

u ostra plana europea que junto a C. gigas son el objeto de este estudio; O. sinuata, que

puebla las costas de Nueva Zelanda; O. lurida, indgena de la costa pacfica de Amrica del

Norte desde la baja California hasta Alaska, aunque en la actualidad el cultivo de esta

especie ha sido suplantado por el de C. gigas, al igual que sucede con O. denselamellosade

las costas de China, Corea y Japn, que fue objeto de un cultivo intensivo desde 1918 hasta

1939 pero que actualmente se sustituye por el de C. gigas; O.chilensis, es la especie de

Nueva Zelanda, si bien se han encontrado poblaciones de estas en Per y Chile, dicha

localizacin es un ejemplo claro de dispersin de especies a causa de las corrientes. O.

puelchana, habita las riberas de Brasil hasta el golfo de San Matas al sur del Mar del Plata

en Argentina; O. stentina se localiza en el Cantbrico y el Mediterrneo, siendo abundante

en Marruecos. O. atherstonei existe en pequeas cantidades en frica del Sur y O. stentina

que est distribuida por las costas atlnticas, las riberas del Mediterrneo y la regin

indopacfica, as como O. folium, O. sandwichensis y O. crista-galli que habitan en la

regin indopacfica, O. lima es tpica de isla Mauricio, Filipinas y Hawi; O. megodon delgolfo de California, las islas Galpagos, Per y Australia y O. frons que es cosmopolita

(Torres, 2001).


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Mxico ocupa el sexto lugar en la produccin promedio mundial de ostin. El 96% de la

produccin es principalmente de origen pesquero y proviene del Golfo de Mxico. El 4%

restante proviene del Pacfico, e incluye la produccin acucola de ostin Japnes

Crassostrea gigasen sistemas tecnificados e intensivos, a partir de semillas producidas enlaboratorio. En trminos de volumen de produccin, la pesquera de este molusco est

considerada en la quinta posicin, aunque no ocupa igual posicin en trminos de valor

econmico (Cruz, 1996). En el Golfo de Mxico el ostin es una de las especies de mayor

importancia comercial. Su explotacin se centra en los estados de Campeche, Tabasco,

Veracruz y Tamaulipas. La mayor produccin se registra en Veracruz, ocupando el primer

lugar con un 60%. Tabasco se encuentra en segundo lugar con un 28%, seguido por

Tamaulipas en tercer lugar con un 8% y Campeche en cuarto lugar con un 4% (Avils y

Eusebio, 1991).

El impacto de los patgenos es variable y depende de la edad de los animales. La salinidad,

temperatura, cantidad de nutrientes, radiacin solar son algunos de los factores que pueden

influir en la supervivencia y la proliferacin de agentes patgenos que afectan el

crecimiento de los ostreidos y en muchos casos los llevan hasta la muerte. Las altas

densidades en cultivos de moluscos generan estrs y favorecen la aparicin de patgenos

oportunistas siendo las bacterias las que causan mayor ndice de mortalidad en ostreidos.Adems de que afectan tanto a larvas como juveniles y adultos (Granier et al., 2007;

Lafferty et al., 2004).

En organismos marinos y particularmente en aquellos que son objeto de cultivo intensivo,

la distincin entre la biota residente y transitoria es crucial porque debido a su forma de

alimentacin mediante filtrado, constantemente estn acumulando microorganismos que no

necesariamente se asientan en los tejidos y conductos de su tracto digestivo gastrointestinal

(TGI), sino que son digeridos y asimilados, mientras que otros ms, pueden convertirse enparte de su microbiota residente Moriarty 1990 en Jorquera et al., 2002). Durante los

estadios larvarios de bivalvos, una parte de la biota transitoria se vuelve rpidamente

microbiota residente (Jorquera et al., 2002). Por lo tanto, conocer la composicin de esta en


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el ostin permitir entender mejor el mecanismo de accin de los microorganismos, tanto

patgenos como benficos. Algunas enfermedades infecciosas solo afectan a los moluscos

en un estadio especfico de su desarrollo, de manera que parece razonable suponer que la

mayor susceptibilidad podra estar relacionada en parte con la falta de una barrerainmunolgica otorgada por la microbiota residente, que cumple una funcin

fundamentalmente protectora contra la colonizacin por potenciales patgenos (Jorquera et

al., 2002; Kue y Chang, 1985).

La microbiota normal del TGI es muy diversa y juega un papel muy importante en la salud

y nutricin de los animales (Dumoneceaux et al., 2006, Navarrete et al., 2009; Romero y

Navarrete, 2006). El TGI de los animales y en particular de las ostras, es el hbitat natural

de una gran diversidad de microorganismos y un amplio rango de ellos pueden ser

bacterias patgenas para el organismo, y/o para el consumidor (Schulze et al., 2006, Spite

et al., 2000). Este puede ser el caso de algunos microorganismos comnmente asociados

con el sedimento marino que son patgenos entricos (Grimes et al., 1986), Vibrio,

Aeromonas (Dumontet et al., 2000),Listeria (Colburn et al., 1990) y Clostridium (Huss,

1980)y se han encontrado albergados en estos animales.

Por otro lado entre los moluscos, las ostras ocupan el 1er lugar en transmisin de

enfermedades o agentes infecciosos. Adems de que causan muerte, generan cuantiosas

prdidas econmicas en la ostricultura (Thompson et al, 2005 en Witman y Flick 1995).La

acumulacin de microorganismos en el sistema digestivo de los moluscos bivalvos incluido

el ostin es muy difcil de eliminar, si no se aplican procesos cuidadosos y estrictos de

limpieza y depuracin. Existen diferentes agentes etiolgicos que han provocado brotes

epidmicos de gastroenteritis, clera y hepatitis A, dentro de los que podemos mencionar

los siguientes: Vibrio cholerae (Thompson et al, 2004), Vibrio vulnificus (Chatzidaki-

Livanis et al, 2006), Vibrio parahemolyticus (Zimmerman et al., 2007), Shewanella(Richards et al., 2008) E. coli enteropatognica (Ruchaud-Sparagno et al., 2007),

Norovirus (Le Guyader et al., 2008. Tambin se han reportado casos de enfermedades


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causadas por organismos no patgenos en personas inmunocomprometidas o desnutridas,

ancianos y nios (Avendao-Capitan, 1986).

Los moluscos son los organismos ms impactados por la contaminacin ambiental debido a

su condicin de organismos filtradores que acumulan gran cantidad de bacterias patgenas,

toxinas marinas y trazas de metales. Su microbiota guarda relacin con la calidad del medio

ambiente en donde se encuentran. En trminos generales son vehculos de transmisin de

toxiinfecciones alimentaras. La incidencia de brotes sigue constituyendo uno de los

problemas de salud pblica ms extendidos y permanecen como una de las causas

principales de morbilidad. Se ha estimado que una de cada dos mil comidas de moluscos

crudos origina enfermedades. Hoy da el riesgo de contraer una enfermedad de origen

entrico es mayor si se toma en consideracin la contaminacin de las aguas costeras por

desechos urbanos de alto contenido fecal. Dichos alimentos pueden poner a la gente en

riesgo de enfermedades peligrosas o la muerte por lo que no se recomienda comer ostiones

crudos. Diferentes especies de Vibrio, en particular Vibrio vulnificuses una bacteria que se

encuentra en aguas marinas, no es una amenaza para la gente sana, pero V. vulnificuspuede

causar un frio repentino, fiebre, nausea, vomito, envenenamiento de la sangre y muerte en

pocos das en personas con ciertas condiciones mdicas. La presencia de esta bacteria no es

el resultado de contaminacin o de una inadecuada manipulacin del producto. Comerostiones de aguas limpias o en restaurantes de alta calidad no provee proteccin. Comer

ostiones crudos con salsa picante o mientras se toma alcohol no mata la bacteria. Solamente

cocinando completamente los ostiones se mata la bacteria. Especies consideradas como

procedentes de heces fecales son reconocidas como contaminantes de estos animales

marinos filtro-alimentadores y como una causa importante de los brotes de enfermedades

asociadas al consumo de dichos organismos procedentes de la extraccin o el cultivo. Sin

embargo algunas especies como Salmonella (Asakura et al, 2002) y Campylobacter (Endtz

et al., 1997; Cappelier et al., 1999) han sido detectadas en ambientes donde no existe

actividad ni contaminacin humana, por lo que se sugiere considerarlos como parte de la

microbiota normal de molusco


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2. JUSTIFICACION

El ostin por su carcter filtrador es propenso a la acumulacin de patgenos causantes de

enfermedades (Sanidad) y su transmisin al humano (Inocuidad), principalmenteinfecciones bacterianas y parasitarias. El cultivo de ostin es una industria en crecimiento

en el Estado y requiere de estrategias para incrementar la supervivencia en la produccin de

semilla y el crecimiento en la engorda. Uno de los principales problemas que enfrenta el

cultivo de ostin en el Estado, es la falta de semilla en mayor cantidad y de buena calidad

que garantice cultivos exitosos. Para lograr este reto es importante conocer cul es la

problemtica actual en los diferentes laboratorios y granjas de ostin del estado, resolverla

y evitar cuantiosas prdidas econmicas en las granjas que se dedican a su explotacin.

Otro problema serio es la contaminacin por aguas residuales y desechos industriales. El

ostin es un alimento altamente nutritivo, con buena digestibilidad pero al consumirlo

crudo o ligeramente tratado, existe el riesgo de transmisin de una serie de enfermedades.

En este proyecto se propone investigar la microbiota predominante y con potencial

patgeno en ostiones de las granjas ostrcolas del estado con el objetivo de aislar e

identificar los microorganismos con potencial patgenos y analizar su capacidad de

adherirse a mucosas de ostin.


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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Aislamiento y caracterizacin de bacterias predominantes y con potencial patgeno, que

puedan afectar la sanidad del ostin como especie objeto de cultivo y la inocuidad del

producto cultivado.

3.2 OBJETIVOS PARTICULARES.

Aislar en medios selectivos para microorganismos patgenos, las bacterias

predominantes en ostiones nativos y ostiones cultivados procedentes de diferentes

granjas ostrcolas de Baja California Sur. Determinar experimentalmente, en condiciones de laboratorio, la capacidad de

adhesin de las bacterias aisladas, a mucosas del ostin.

Identificar molecularmente, a nivel de gnero y especie, las bacterias

potencialmente patgenas aisladas de ostiones, que pudieran representar un riesgo

desde el punto de la sanidad del organismo cultivado y de la inocuidad del producto

para el consumidor.

4. HIPOTESIS DE TRABAJO

Tomando en cuenta que las tcnicas y metodologas de trabajo propuestas para la

investigacin son eficientes para el aislamiento y caracterizacin de bacterias del

ostin, al menos una de esas bacterias presentar la capacidad de colonizar a

mucosas de ostin y habr sido previamente reportada como potencialmente

patgena para moluscos ostreidos.


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5. ANTECEDENTES

5.1 MOLUSCOS BIVALVOS EN EL CONTEXTO MUNDIAL

De acuerdo con la Organizacin Mundial de Epizootias (OIE), durante las ltimas dcadas,

la produccin mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada debido al severo

impacto de enfermedades infecciosas. La deteccin, seguimiento y medidas de mitigacin y

control de patgenos certificables y/o notificables se ha convertido en un requerimiento

primario para el desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. La transferencia de

agentes infecciosos va el transporte de moluscos vivos, ha sido la principal causa de

difusin de enfermedades y epizootias. La dinmica actual de libre comercio y el legtimo

derecho de los pases acuicultores de buscar nuevas alternativas para la produccin dealimentos y su distribucin en los mercados mundiales, con generacin de desarrollo

econmico y social, a menudo han propiciado se minimicen o se pasen por alto algunos

factores sanitarios esenciales que, de no considerarse en su justo contexto, pueden hacer

fracasar los cultivos de moluscos y demeritar la calidad de sus productos.

Entre los requerimientos bsicos de manejo para una mejor distribucin de dichos

organismos, se incluye el conocimiento de la condicin sanitaria de los moluscos bivalvos

a transferir, cules problemas sanitarios les afectan, qu riesgo hay de que esos problemasse transfieran a otras poblaciones naturales o cultivadas de moluscos bivalvos en la zona

receptora, y qu problemas sanitarios propios de los moluscos bivalvos de la zona receptora

pueden afectar al molusco bivalvo transferido. El conocimiento de sta informacin

proporciona una mayor garanta de xito para las empresas acucolas, ayuda a proteger la

biodiversidad de moluscos y otras especies en el ambiente y protege al consumidor.

La experiencia, que en materia sanitaria, han desarrollado algunos de los pases lderes en la

produccin de moluscos y otros organismos acuticos a niel mundial, ha permitido contarcon lineamientos relativamente precisos para evitar la transferencia de enfermedades,

mismos que se han agrupado en el Cdigo Sanitario para los Animales Acuticos y en el

Manual de Pruebas de Diagnstico para los Animales Acuticos de la OIE.


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10

Adicionalmente, muchos pases han desarrollado lineamientos sanitarios propios que

vienen a fortalecer las medidas generales para evitar la transferencia de enfermedades. La

mayor informacin cientfica sobre los agentes patgenos de moluscos bivalvos que

conocemos, se refiere fundamentalmente, a las especies mayormente cultivadas ydispersadas alrededor del mundo o nativas de pases desarrollados, tales como C. gigas, C.

virginica, Ostrea edulis, Mytilus edulis, M. galloprovincialis, Ruditapes philippinarum,

Saccostrea glomerata,entre otras (http://www.oie.int/).

5.2 LA OSTRICULTURA EN MEXICO

Mxico ocupa el cuarto lugar en cultivo de moluscos bivalvos en Amrica Latina y se

realiza en mayor parte en las costas del Pacfico de Baja California y Golfo de California.

La ostricultura comercial de Mxico se basa prcticamente en el cultivo intensivo de la

ostra del Pacfico C. gigas con semilla producida en el laboratorio. El 95.6 % de las

empresas dedicadas a la produccin intensiva de moluscos bivalvos, se dedican al cultivo

de la especie C. gigasen la Pennsula de Baja California y Mar de Cortez en el estado de

Sonora y en menor proporcin al cultivo del ostin americano C. virginicaen los estados

del Golfo de Mxicos. En Nayarit se realiza la acuicultura del ostin de Placer C.

corteziensispor medio de colecta de semilla del medio natural. En Sinaloa el futuro de esa

especie nativa es incierto, ya que existen problemas en la produccin de juveniles en el

laboratorio y al parecer hay un agente patgeno que limita la maduracin de los

reproductores(PMSMB, 2008).

5.3 OSTRICULTURA EN BAJA CALIFORNIA SUR

El Estado de Baja California Sur tiene caractersticas inigualables para el desarrollo de una

acuacultura sostenible y sustentada en elementos de sanidad e inocuidad, que podran

impactar considerablemente en la economa local si se respetan estas bases. Lacaracterstica de aislamiento geogrfico peninsular a pesar que puede verse como una

desventaja, es considerada como la principal caracterstica favorable para la industria

ostrcola local, ya que la adecuada aplicacin de restricciones a la libre movilizacin de


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11

semillas podra ser favorable para el adecuado control de enfermedades y parsitos que

afectan los cultivos en los estados vecinos del Noroeste de Mxico. Para tal efecto, el

Comit de Sanidad Acucola de B.C.S. tiene como funciones detectar, prevenir y

reducir/controlar la aparicin y dispersin de enfermedades en los cultivos acucolas delEstado, con el fin de reducir riesgos a la inversin, impulsando normas que coadyuven en

el crecimiento ordenado y sustentable de sta actividad respetando los ecosistemas, base

fundamental de la sanidad e inocuidad del producto destinado al consumidor.

Al respecto, durante el 2008, se supervisaron 12 localidades del Estado donde se tienen

establecidos grupos de cultivo principalmente de ostin y mano de len, as como, 2

laboratorios de produccin de abuln y uno de bivalvos en la Zona Pacifico Norte y 2

laboratorios de produccin de bivalvos en La Paz, B.C.S. Paralelamente se realizan anlisis

a los organismos en cultivo para detectar y prevenir posibles infecciones por enfermedades

certificables de la OIE, (Organizacin Mundial de Epizootias), as como, parsitos y para la

deteccin de herpes virus.

Estos parsitos, en general, causan daos en los tejidos, desarrollndose principalmente en

el tejido epitelial del estmago y de la glndula digestiva y estn asociados con bajas

condiciones de vida, enflaquecimiento de la ostra y agotamiento de sus reservas de energa

(glicgeno), decoloracin de la glndula digestiva, interrupcin del crecimiento,

reabsorcin de las gnadas y desorganizacin total del epitelio de la glndula digestiva,

causando inanicin (Caceres et al., 2008).

La mortalidad por estos parsitos parece estar relacionada con la esporulacin de los

mismos ya que sta se produce en el epitelio de los palpos, del estmago, del conducto

digestivo y probablemente de las branquias (Caceres et al., 2008). Es de destacar que la

variacin en la produccin de ostiones en 2005 cuando se produjeron 250,081 docenas, su

reduccin para 2006 a 129,520 docenas, y el incremento para el ao 2007 a 346,466

docenas y finalmente una nueva reduccin en el 2008 a 245,915 docenas, se puede explicar

principalmente en funcin de la inconstancia en la produccin de semillas y la

consecuente limitacin en la siembra de los productores. El cultivo de moluscos en Baja


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California Sur es una actividad dinmica en constante desarrollo, tanto en sus aspectos

tcnicos como en el impacto social y econmico que genera. El cultivo de esta especie, se

lleva a cabo exclusivamente en cuerpos de agua del pacifico sudcaliforniano, desde el

estero Rancho Bueno al sur del complejo lagunar Baha Magdalena, hasta la Laguna deGuerrero Negro al norte del estado. El alto contenido de alimento natural, temperatura

adecuada casi todo el ao y su excelente nivel de limpieza hacen de estos cuerpos de agua

sitios de privilegiados para la actividad ostrcola

(http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf). En el Pacfico norte de Baja

California Sur se encuentran ubicadas la mayora de las granjas ostrcolas del Estado (Tabla

1).

Tabla 1.- Ubicacin geogrfica de granjas ostrcolas en la zona Pacfico Norte de Baja

California Sur (Fuente:http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)

NOMBRE DE

LA EMPRESA

UBICACIN LOCALIDAD MUNICIPIO COORDENADAS

SCPP Y A La

Perla de Guerrero

Negro SC de RL

Campo Chupa-

Lodo. Laguna

Guerrero Negro

BCS

Guerrero Negro

BCS

Muleg 27 59 40.50 N

114 417.65 O

Comit Pesquero

Social y Privado

Laguna Ojo de

Liebre

Guerrero negro

BCS

Muleg 27 5510.09 N

1110 53.50 O

SCPP Baha

Tortugas SC de

RL

El Rincn Baha

Tortugas

Baha Tortugas

BCS

Muleg 27 39 46.52 N

114 51 56.08 O

Sol Azul SA de

CV

Estero el Cardn

BCS

El Cardn BCS Muleg 26 47 25.81 N

113 8 58.20 O
http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf


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SCPP Punta

Abreojos SC DE

RL

Estero El Coyote

BCS

Punta Abreojos

BCS

Muleg 26 47 25.81 N

113 26 4.57 O

SC El Progreso de

Produccin

Pesquera SCde RL

Estero La Bocana

BCS

La Bocana BCS Muleg 26 47 14.75N

113 41 24.67 O

Sin embargo tambin podemos encontrar algunas granjas ostrcolas en el centro sur de Baja

California Sur, cuya ubicacin geogrfica se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2.- Ubicacin geogrfica de granjas de moluscos en la zona Pacfico Sur de Baja

California Sur (Fuente:http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)

NOMBRE DE LA

EMPRESA

UBICACIN LOCALIDAD MUNICIPIO COORDENADAS

SCPP Santo

Domingo SCL

Campo El

Pailebote

Santo Domingo Comond 23 32 44.94 N

112 4 5.98 O

Moluscos Baha

Magdalena SPR de

RL

Campo Las

Botellas

Puerto Adolfo

Lpez Mateos

Comond 2518 9.05 N

112 4 59.76 O

Sistema de

Maricultura y Pesca

S de RL de CV

Campo Los

Islotes

Estero San Buto Comond 24 46 28.40 N

112 2 51.59 O

Argos AcuicultoresSA de CV

Campo 13 Estero San Buto Comond 24 46 14.65 N

112 2 11.69 O
http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf


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La produccin ostrcola en Baja California Sur, en el 2010 fue de 504,432, con una mayor

produccin en el Municipio de Muleg, Tabla 3.

Tabla 3. Produccin ostrcola por municipio en B.C.S. en el ao 2010.

(Fuente:http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)

Productor Municipio Localidad Cantidad (Dz)

La Perla Muleg Guerrero Negro 200

Sol Azul Muleg El Cardn 294,177

Verde Mar Acucola Muleg El Cardn 41,666

Baha Tortugas Muleg Baha Tortugas 819

Punta Abreojos Muleg Punta Abreojos 67,000

El Progreso Muleg La Bocana 47,000

Total municipal: Muleg 450,862

Molusco Baha

Magdalena

Comond Pto. Adolfo Lpez

Mateos

NR

Santo Domingo Comond Santo Domingo 48,879

Acuacultura El Paraso Comond Santo Domingo 4,691

Sistemar Comond Estero San Buto NR

Argos Acuacultores Comond Estero San Buto 0

Total municipal: Comond 53,570

Cultemar La Paz Rancho Bueno 0

Total estatal 504, 432
http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdfhttp://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf


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5.4 RIESGO SANITARIO ASOCIADO AL CULTIVO Y CONSUMO DE

MOLUSCOS BIVALVOS.

En aos recientes se ha incrementado la preocupacin del sector pblico por asegurar la

inocuidad de diversos alimentos de origen marino, pesquero y acucola, para el consumo

humano directo. Esto se debe en parte, a que se han detectado casos de envenenamiento y

de enfermedades infecciosas (Martnez y Montoya, 2003; Thompson et al., 2005). Los

aspectos de salud pblica relacionados con el consumo de productos provenientes de la

ostricultura, se enfocan principalmente a evitar la presencia de peligros biolgicos (ej.

parsitos, bacterias y virus) y qumicos (ej. plaguicidas, metales pesados y biotoxinas)

(Martnez y Montoya, 2003).

Los moluscos bivalvos son sedentarios y filtradores; sus branquias cubiertas de mucus y

cilios vibrtiles, adems de cumplir con la funcin respiratoria, retienen fitoplancton,

materia orgnica particulada y diversos microorganismos como bacterias, virus y protistas

planctnicos. (Di Girolamo et al., 1977). El riesgo en el consumo de ostiones es debido a

que son propensos a acumular y en consecuencia, a transmitir microorganismos patgenos

al consumidor. Por otro lado, tambin pueden acumular biotoxinas y productos qumicos

como fertilizantes, metales pesados, compuestos organoclorados y medicamentos

veterinarios como antibiticos que pueden ser nocivos para la salud humana. Una buena

parte de los brotes epidmicos causados por la intoxicacin o infeccin alimentaria

provienen de moluscos bivalvos provenientes de la pesca o de la acuacultura, cuando han

sido contaminados con virus y/o bacterias debido a que las aguas en las que crecen, pueden

en algunos casos contaminarse con materia fecal de aguas residuales, e incluso por

infecciones que tiene la persona que manipula dichos alimentos (Metcalf et al., 1979,

Rippey, 1994).


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6. MATERIALES Y METODOS.

6.1 COLECTA Y TRANSPORTE DE ORGANISMOS

Se viaj a cada lugar de muestreo, en las costas del Ocano Pacfico a lo largo de Baja

California Sur, Figura 14. En el caso de granjas se hizo previa cita con los responsables.

De cada lugar se tomaron al azar al menos tres organismos. Cada organismo colectado, se

escurri, se coloc en una bolsa de papel estril y se cubri con otra bolsa de plstico

debidamente higienizada y se guardaron en un ambiente fresco en una hielera para

transportarse hasta el laboratorio y analizarse inmediatamente.

Los organismos colectados en el municipio de Muleg se analizaron microbiolgicamente

el mismo da en la Unidad del CIBNOR que se encuentra en Guerrero Negro. Los

organismos que se colectaron en los municipios de Comond y la Paz se analizaron en el

Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de Alimentos.

6.2 SITIOS DE MUESTREO.

1ER MUESTREO. FECHA: 19 ENERO 2012

En el primer muestreo llevado a cabo en las Zonas 1, 2 y 3 del municipio de Muleg, solo

se colectaron organismos de C. gigas, como se observa en las figuras 1, 2, 3, 4 y 5.

Zona 1

Municipio: Muleg. Localidad: Gro. Negro. Ubicacin: La Salinera. Coordenadas:

Latitud 27 53 19.34 N Longitud 114 08 34.76 O. No. Mestras:3. Analizadas:2


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Zona 2

Municipio: Muleg. Localidad: Gro. Negro. Ubicacin: Granja Ostin del Pacifico.

Laguna de Gro. Negro. Coordenadas: Latitud 27 5940.50 N Longitud 114 417.65

O. No. Muestras:3. Analizadas: 3

Fig. 2. Crassostrea gigas

F ig 1. Crassostrea gigas


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Zona 3

Municipio: Muleg. Localidad: Gro. Negro. Ubicacin: Granja Intermareal

Coordenadas:Latitud 28 02 26.34 N Longitud 114 06 36.32 O. No. Muestras:

6. Analizadas:6

2DO. MUESTREO FECHA: 26 ABRIL 2012

Municipio: Comond. Localidad: San Buto. Ubicacin: Baha Magdalena.

Coordenadas: Latitud 24480Ny Longitud 11230 O. No. Muestras: 8.

F ig 3. Crassostrea gigas F ig 4. Crassostrea gigas

F ig 5. Crassostrea gigas


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3ER. MUESTREO FECHA: 4 MAYO 2012

3er. MUESTREO FECHA: 4 MAYO 2012

Municipio: Comond. Localidad: Santo Domingo. Ubicacin: Las Botellas.

Coordenadas: Latitud251732 N y Longitud 115608 O. No. Muestras:13

En este muestreo se colectaron 3 organismos de las especies C. corteziensis, 3 de C.

rhizophorae, 3 de S. palmula y 4 de C. gigas.

F ig. 6. S. palmula F ig 7. C. gigas Fig 8. C. gigas Fig 9. S. palmu la

F ig 10. S. palmula F ig 11. S. palmula F ig 12. C. gigas F ig 13. . C. gigas


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Fuente:http://cesabcs.org/pdf/UbicacionTermografosMoluscos2010%282%29.pdf

6.3 ANLISIS MICROBIOLGICO

Se analizaron todos los organismos colectados de cada especie y de cada punto de

muestreo. Los ostiones recin llegados al laboratorio se lavaron con agua corriente, la

superficie se cepill hasta observarla limpia, se enjuagaron con agua estril y

posteriormente se realiz la diseccin en una charola con un punzn, pinzas y tijeras

estriles. Se colocaron en tubos falcn de 40 ml previamente estriles; se homogenizaron

con un homogenizador de tejidos y se realizaron diluciones decimales para llevar a cabo

cuentas viables por la tcnica de extensin en superficie de mesfilos aerobios y en medios

F ig 14. Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS.


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selectivos para los gneros Vibrio, Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococcus,

hongos y levaduras.

6.4 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS (Marvin, 1976)

Del crecimiento obtenido en las diluciones ms altas sembradas en los medios de cultivo de

la Tabla 4, se seleccionaron colonias predominantes aisladas y se resembraron

individualmente por estra cruzada en cajas de petri con los mismos medios de cultivo.

Tabla 4: Medios de Cultivo utilizados

Agar marino Agar Baird Parker Agar Papa Dextrosa

Agar TCBS Agar XLD Agar y Caldo EC

Caldo Selenito Cistina Caldo Vassiliadis-Rappaport Caldo lactosado

De las siembras por estra cruzada se seleccionaron colonias aisladas y se resembraron en

Caldo TSB. Se incubaron de 12 a 18 horas a 30C para su crecimiento. Posteriormente

alcuotas de 250 l se adicionaron con igual cantidad de glicerol al 80% en tubos eppendorfde 1.5 ml, se etiquetaron y se guardaron en ultracongelacin, hasta su anlisis.

6.5 MORFOLOGA CELULAR DE LAS CEPAS

Del crecimiento obtenido en el punto anterior, se hicieron preparaciones en fresco para

observar las caractersticas morfolgicas de cada bacteria en el microscopio de contraste de

fases.


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6.6 TINCIN DE GRAM Y PRUEBA DE LA CATALASA (Marvin 1976).

Todas las cepas seleccionadas de los diferentes medios fueron resembradas en caldo TSB

por 12 horas. Se llevaran a cabo frotis en portaobjetos de cada cepa y se les realiz la

tincin de Gram, posteriormente se observaron en un microscopio de contraste de fases. La

prueba de la catalasa se llev a cabo poniendo una gota de cultivo fresco sobre el

portaobjetos y se le agreg una gota de perxido de hidrgeno, se observo la formacin de

burbujas para determinar si la prueba fue positiva.

6.7 ENSAYO DE ADHESIN A MOCO DE OSTION

Para el ensayo de adhesin de las cepas con potencial patgeno a moco de ostin se utilizo

el mtodo reportado por Rojas and Conway 2001, el cual se describe a continuacin.

6.7.1 Preparacin del cultivo.

Cada cepa de bacteria con potencial patgeno se reactiv en agar TSA, se inocul al 1% en

3-5 ml del medio TSB y se incub a 37C hasta que el cultivo alcanzo la fase de

crecimiento logartmica mxima. Se centrifug a 3500 rpm durante 5 min, se lav el pellet

con 3 ml de buffer H-H, se centrifug otra vez a 3500 rpm durante 5 minutos.

Posteriormente se suspendi en 1 ml del mismo buffer, ajustando la densidad ptica a 0.9 auna longitud de onda de 600 nm en un espectrofotmetro Bio-Rad SmartSpec tm3000.

6.7.2 Preparacin de la membrana.

Se cort un trozo suficiente de membrana Immobilon-P (PVDF: Polyvinilidene difluoride

microporous membrane marca Millipore), de acuerdo al nmero de cepas y por triplicado.

Se dividi la membrana en cuadros de 1 cm2. Se coloc la membrana en metanol por 2

segundos y se enjuag con agua destilada por 5 min. Se equilibr en Buffer H-H y se

coloc sobre el papel filtro previamente humedecido con el Buffer H-H, con el fin de

mantenerla hmeda todo el tiempo. Se utiliz como control positivo la cepa L. fermentum

86 (Macas Rodrguez M. E., 2008) a la cual se le di el mismo tratamiento que al cultivo.

El ensayo se realiz por triplicado, usando como control negativo H-H.


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6.7.3 Ensayo de adhesin.

Sobre cada cm2 de la membrana colocada sobre la cama de papel filtro hmedo con H-H se

depositaron 20 L de cada suspensin celular hasta que se absorbi el lquido. Se incub la

membrana en una solucin al 3% de albumina de suero bovino (BSA) preparada con Buffer

H-H y se mantuvo por 20 min a temperatura ambiente para bloquear sitios no especficos.

Se desech la albumina y se lav la membrana 2 veces con H-H. Posteriormente se incub

la membrana en una solucin que contena 300 L de extracto crudo de moco de ostin

marcado enzimticamente (HRP-Moco en 10 ml de Buffer H-H y se dej incubando por 2

horas a temperatura ambiente. Se desech el moco marcado y se lav la membrana 2 veces

con buffer H-H 10 min cada vez, se desech el Buffer y se enjuag con una solucin de

acetato de sodio 0.1 M pH=5.0 para enseguida desarrollar color con el sustrato de la enzima

y un cromgeno (3.5 mg de diamino bencidina, 2.5 L de perxido de hidrogeno y 10 ml

de acetato de sodio 0.1 M) Cuando se desarroll el color, la membrana se enjuago con

metabisulfito de sodio 0.1 M por 3 min para detener la reaccin.

Por ltimo la membrana se sec a temperatura ambiente y fue llevada a un documentador

de geles (Bio Rad) para posteriormente analizar los resultados en forma cualitativa.

6.8 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTEPATGENAS

6.8.1 Extraccin del ADN genmico de cepas

Las cepas guardadas con glicerol a -85C se reactivaron por estra cruzada en agar TSA,

incubndose por 18-24h a 30C. Se tom una colonia aislada de cada cepa y se inocularon

al 1% en caldo TSB y se incubaron por 12 h a 30C, una vez pasando este tiempo los

cultivos se pusieron (1.5 ml) en tubos eppendorf de 1.5 ml. Se centrifug por 5 minutos a

6000 rpm a 4C, y se desech el sobrante. A partir de este punto se utiliz el Kit WizardGenomic DNA Purification Kit Part # TM050, protocolo 3.G. para el aislamiento de ADN

genmico de bacterias Gram negativas. Brevemente. Se suspendieron las clulas agitando

vigorosamente en 480l de 50mM EDTA y se agregaron 600 l de la Solucin de Lysis


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Nuclei. Se resuspendi con la micropipeta subiendo y bajando la suspensin y se incub a

80C por 5 minutos para terminar de lisar las clulas y entonces enfriar a temperatura

ambiente. Se agregaron 3 l de la solucin RNasa al lisado de clulas, se Invirti el tubo de

2 a 5 veces para mezclar y se incub a 37C por 15-60 minutos. La muestra se enfri atemperatura ambiente y se agregaron 200l de la solucin para precipitar protenas al lisado

de clulas tratado RNasa. Se agit vigorosamente por 20 seg para mezclar y se incub la

muestra en hielo por 5 minutos, se centrifug a 13,000-16,000 x g por 3 minutos y se

transfiri el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo para centrfuga limpio de 1.5 ml

conteniendo 600l de isopropanol a temperatura ambiente. Se mezcl vigorosamente por

inversin del tubo hasta que La red de hebras de DNA form una masa visible. Se

centrifug a 13,000-16,000 x g por 2 minutos y se decant cuidadosamente el sobrenadante.

Se dren el tubo con un papel absorbente y se agregaron 600l de etanol al 70% a

temperatura ambiente, se invirti el tubo varias veces para lavar el pellet de ADN, se

centrifug a 13,000-16,000 x g por 2 minutos. Se aspir cuidadosamente el etanol y se

dren el tubo sobre un papel absorbente limpio para permitir que el pellet se seque al aire

por 10-15 min. Se agregaron 100 l de solucin de rehidratacin de ADN al tubo y se dej

rehidratar el DNA incubando a 65C por una hora. Peridicamente se mezcl la solucin

invirtiendo el tubo. Alternativamente, para rehidratar el DNA se incub la solucin toda la

noche a temperatura ambiente o a 4C. El DNA se almacen a 2-8C.

6.8.2 Visualizacin del ADN genmico.

La medicin de la concentracin de ADN se llev a cabo comparndolo con diferentes

concentraciones de lambda () DNA Para visualizar el ADN se prepararon geles de agarosa

al 1% en buffer TAE (tris 40 mM, pH 7.6, cido actico 20mM y EDTA 1mM) y en

presencia de bromuro de etidio 1 l. (10mg/ml EtBr). Se prepararon 5 l de muestra

mezclados con 5l (una gota) del buffer de la muestra (10X stlc, 50% glicerol, 0.25%bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF en 1X buffer TAE). Se colocaron las muestras

en los carriles del gel de agarosa acomodado en la cmara. El gel se corri en una cmara

de electroforesis horizontal (Bio-Rad) conectada a una fuente de poder (Bio Rad) a 50


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Volts. Despus de correr el gel por 45 minutos se procedi a analizarlo en una cmara de

luz UV.

6.8.3 Amplificacin del gen 16S DNA para identificacin molecular de bacterias (Broda et

al,. 1999).

Una vez purificado el ADN genmico de cada cepa, se llev a cabo la reaccin de

amplificacin de los genes ribosomales 16sRNA por PCR en la que se utilizaron los

oligonucletidos pA y PH*, Broda et al., 1999.

pA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

pH*: 5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.

La composicin de la mezcla de reaccin se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Mezcla de reaccin usada para la amplificacin del gen 16S ARN.

Componente (Concentracinstock)

Concentracin final Volumen por 50 lde reaccin (enl)***

Buffer de enzima Taq(10X) 1.5X 5

MgCl2(50mM) 0.15mM 3

dNTPS 0.20mM 1

Oligo pA(100 mM) 0.5 M 0.25

Oligo PH*(100 M) 0.5 M 0.25

Taq polimerasa (5U/ l) 0.01 u/ l 0.25

ADN genmico (0.5 g/ l) 5ng/ l 2

H2O bi-destilada libre de

DNAsas

38.3

Volumen final 50


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***Cantidades estandarizadas para el kit de PCR de Invitrogen, deben considerarse las

concentraciones stock indicadas para kits de otras marcas.

Una vez mezclados los componentes, se llev a cabo la siguiente reaccin colocando los

tubos que contienen la mezcla en un termociclador (Perkin Elmer).

El programa consisti de 35 ciclos, 95C por 4 minutos, 94C por 45 seg y 72C por 1

minutos. El programa termin con 5 minutos de incubacin a 72C. Finalmente se baj la

temperatura a 4C.

Una vez concluida la reaccin se observ el producto de la amplificacin en un gel de

agarosa al 1.5%.

6.8.4 Visualizacin de los productos del PCR en geles de agarosa

Para observar los productos de PCR se prepar un gel de agarosa al 1.5%. Cada producto 5

l se mezcl con 1 l de buffer para la muestra (Tris-HCl 0.5 M, Glicerol, SDS 10%,2-

Mercapto-etanol, Bromofenol azul 1%) y se corri una electroforesis a 70 Volts durante 40

minutos, se utiliz un marcador de peso molecular (PCR Markers, Promega), un control

positivo (Lactobacillus fermentum) y un blanco (agua libre de nucleasas). Los productos de

PCR se enviaron a la empresa Macrogen (Korea) para su purificacin y secuenciacin.

6.8.5 Secuenciacin y anlisis bioinformtico.

Las secuencias obtenidas y sus cromatogramas fueron editados en Chromas, se quitaron los

extremos que no tenan buena resolucin y se alinearon (forward and reverse) con el

software Align de Blast. Las secuencias resultantes fueron comparadas en la base de

secuencias de NCBI con la herramienta Blast.


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7. RESULTADOS

Se hicieron tres muestreos de campo a lo largo del Estado de Baja California Sur,

colectando ostiones cultivados y organismos silvestres (Tabla 6). Se colectaron msmuestras de ostin Japons C. gigas que de las otras especies, debido a que es la especie

ms cultivada en el estado. En una granja ostrcola de la regin de Santo Domingo (Las

Botellas), se colectaron ejemplares de ostin de placer C. corteziensisy ostin Kumamoto

C. sikamea

El ostin de mangle Saccostrea palmula, una especie nativa que generalmente crece en

forma silvestre, pegada a los mangles y otros objetos presentes en la zona intermareal, fue

incluido en los muestreos 2 y 3, como fuente potencial de bacterias patgenas y punto dereferencia para los resultados con las especies de cultivo no-nativas.

Tabla 6. Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias con

potencial patgeno para ostin.

No.

Muestreo

Ubicacin Organismos

analizados

Cepas

aisladas

Observaciones

1 G. Negro

Zona 1

Zona 2

Zona 3

2

3

6

25 Aisladas de C. gigas

2 Regin de

Baha

Magdalena

8

25

Aisladas de C. gigas y S.

palmula

3

Las Botellas 13 30

8 Aisladas de C. gigas, 13 de C.

corteziensis, 5 de C. sikamea,4

S. palmula(ostin de mangle)


37/79

28

7.1.- ANLISIS MICROBIOLGICO.

Los anlisis microbiolgicos se realizaron a todas las especies de ostiones trados allaboratorio. Estos anlisis se hicieron por cuenta viable usando la tcnica de diluciones en

diferentes medios de cultivo selectivos para diferentes microorganismos patgenos. Para

cuantificar la microbiota predominante se us agar marino, un medio de cultivo rico en

nutrientes donde pueden crecer todos los microorganismos cultivables del ambiente marino.

En general las cuentas ms altas de bacterias en agar marino se encontraron en los ostiones

colectados en Guerrero Negro (Tabla 7), sin embargo, en esta misma regin se presentaron

cuentas bajas de microorganismos con potencial patgeno.

Tabla 7. Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) procedentes de diferentes

zonas de Guerrero Negro, B.C.S.

Medio

de

cultivo

Muestreo 1. Log UFC/g de OSTIONES, C gigas

ZONA 1 ZONA 2 ZONA 3

Ostin O1 02 O3 O4 O5 O6 O7 O8 09 010 011

AM 6.2 7.0 6.3


38/79

29

para microorganismos del Gnero Vibrio, en APD (Agar Papa Dextrosa) donde crecen

hongos y levaduras y en ABP (Agar Baird Parker), donde crece Staphylococcus sp.

Con respecto a los tipos de microorganismos, la cuenta viable total en agar marino (AM)

estuvo en un rango de 3.0 a 7.9 Log UFC, Tabla 8.

Tabla 8.- Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) colectados en Baha

Magdalena B.C.S. (San Buto y Paredones).

Medio de cultivo Muestreo 2. Log UFC/g de OSTIONES

Ostin O12 013 O14 O15 O16 O17 O18 O19

AM3.6 3.0 5.8 3.5 3.3 3.9 4.8 5.2

TCBS


39/79

30

Tabla 9. Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) colectados en Santo

Domingo B.C.S. (Las Botellas).

Medio de

cultivo

Muestreo 3. Log UFC/g de OSTIONES

Ostin O21 022 O23 O24 O25 O26 O27 O28 O29 030 O31 O32 O33

AM

3.3 6.6 6.0 4.6 6.9 5.5 4.2 5.1 5.5 5.2 5.5 5.2 4.9

TCBS

4.6 3.5 3.8 3.1 3.55 2.8 2.9 1.9 3.9 3.3 3.4 4.0 3.0

APD

ND ND 1.0 1.7 ND 3.6 1.0 ND 1.3 ND ND ND ND

ABP

1.3 2.6 2.0 1.3 1.8 3.5 4.2 ND 1.7 1.3 ND 3.0 ND

ND. No Determinado

De acuerdo con los resultados del anlisis microbiolgico, en general los ostiones

analizados tienen bajas concentraciones de hongos y levaduras (detectables en medio

APD); se observaron en un rango de


40/79

31

Error 57.0264 29 1.9664

Sin embargo, en el anlisis estadstico del log UFC de bacterias crecidas en Agar TCBS, se

observ que hubo diferencias significativas entre los tres muestresos y la prueba de Tukkeyconfirm que en el muestreo 2 present diferente log de UFC que los muestreos 1 y 3.

Tabla 11. ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos de ostiones

SS Degr. of MS F p

Intercept 161.8111 1 161.8111 122.2543 0.000000

Numero de Muestreo 27.7298 2 13.8649 10.4754 0.000377

Error 38.3833 29 1.3236

Tabla 12. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1, 2 y 3

Con respecto al anlisis estadstico realizado para el log UFC en Agar Papa Dextrosa, se

observ que tampoco hubo diferencias significativas, Tabla 13.

Tabla 13. ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2 y 3

En el anlisis estadstico del log de UFC en Agar Baird Parker si hubo diferencias

significativas entre los diferentes muestreos de ostiones, como se muestra en la Tabla 14.

La Prueba de Tukkey confirm que el muestreo 3 fue diferente a los muestreos 1 y 2. En la

Numero de Mues ades Logaritm 1 2

2 2 1.000000 ****

1 1 2.518182 ****

3 3 3.365385 ****

SS Degr. of MS F p

Intercept 19.22855 1 19.22855 12.38116 0.002040


Error 32.61402 21 1.55305


41/79

32

grfica de medias en Anexo 3, se observ que el log de UFC de Staphyilococcus fue mayor

que en el 1 y 2.

Tabla 14. ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2 y 3

Tabla 15. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos

7.2. AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS.

El aislamiento de bacterias con potencial patgeno se hizo resembrando colonias de las

cajas de petri sembradas con las diluciones ms altas durante las cuentas viables. El mayor

nmero de cepas aisladas se obtuvieron de cajas Petri con Agar Marino debido a que eneste medio se observ en lo general, mayor crecimiento bacteriano. A partir de cajas Petri

con agar TCBS, un medio de cultivo selectivo para vibrios, se aislaron un mayor nmero de

cepas, lo cual es congruente tomando en cuenta que el Gnero Vibriotiene varias especies

reportadas en la bibliografa como patgenas para moluscos. procedentes de cajas Petri con

Agar Baird Parker se aislaron 15 cepas de colonias con caractersticas morfolgicas tpicas.

El material biolgico resultante del primer muestreo se sembr tambin en Caldo Selenito

Cistina y en Agar XLD, de donde se aislaron 5 cepas de enterobacterias, Tabla 16.

Tabla 16. Tipo y nmero de microorganismos con potencial patgeno, aislados en

diferentes medios de cultivo selectivos.

SS Degr. of MS F p

Intercept 51.09740 1 51.09740 42.91428 0.000001


Error 30.95782 26 1.19069

Numero de Muestre nidades Logaritmica 1 2

2 2 0.675000 ****

1 1 1.072727 ****3 3 2.270000 ****


42/79

33

MEDIO DE CULTIVO No. DE CEPAS AISLADAS TIPO DE MICROORGANISMOS

AGAR MARINO 35 Mesfilos aerobios

AGAR BAIRD PARKER 15 Staphylococcus

AGAR PAPA DEXTROSA 2 Hongos y levaduras

AGAR TCBS 23 Vibrio

CALDO SELENITO

CISTINA/AXLD

5 Enter.obacterias, ej Salmonella

7.3 CARACTERIZACIN DE CEPAS AISLADAS DE OSTIONES.

Las cepas aisladas fueron sometidas a diferentes pruebas bioqumicas y microscpicas, conel propsito de caracterizarlas. Como se puede observar en la Tabla 17, de 34 cepas 17

fueron Gram+ y 17 Gram-, 18 fueron bacilos y 16 cocos.

Tabla 17. Caracterizacin de cepas con potencial patgeno aisladas de ostiones.

CEPA Medio

de

Cultivo

Tincin

Gram

Prueba

Catalasa

Morfologa

cellular Origen

O1 ABP + + Coco C. gigas


O3 ABP - + Bacilo C. gigas



O6 ABP - + Bacilo C. gigas

O7 XLD - - Coco C. gigas

O8 XLD - - Bacilo C. gigas

O9 XLD - + Bacilo C. gigas

O10 XLD - + Coco C. gigas


43/79

34

O11 XLD + - Coco C. gigas

O12 AM - + Coco C. gigas

O13 AM - + Bacilo C. gigas

O14 AM + + Coco C. gigas


O16 AM + - Coco C. gigas

O17 AM + - Bacilo C. gigas

O18 AM + + Bacilo C. gigas



O21 TCBS - + Bacilo C. gigas



O24 TCBS - - Bacilo C. gigas


O62 TCBS - - Cocos C. sikamea

O65 TCBS - + Bacilo C. sikamea

O26 AM - + Coco C. gigas

O27 AM - + Coco C. palmula.

O28 AM + + Bacilo C. gigas

O29 AM + + Bacilo C. palmula


O31 AM + + Coco C.gigas

O72 AM - + Bacilo C. corteziensis.

7.4 ENSAYO DE ADHESIN


44/79

35

El factor ms significativo que afecta los cultivos de importancia acucola es la incidencia

de patologas microbianas, principalmente de origen bacteriano. La adhesin bacteriana a

superficies y a tejidos es el paso inicial esencial en la colonizacin del tejido del hospedero

y subsecuente ocurrencia de infeccin en sistemas patognicos (Montgomery et al., 1994),

involucrando diferentes estructuras llamadas adhesinas (Hacker 1992 y Hoepelman et al.,

1992). Se ha reportado que la capa de moco est involucrada en la prevencin de la

colonizacin microbiana de patgenos por un mecanismo de competicin con la microbiota

presente en el moco(Westerdahl et al., 1991). Sin embargo el papel que juega el moco en

moluscos como la primera capa involucrada en la adhesin microbiana o como un

mecanismo de defensa en contra de la invasin por patgenos no ha sido completamente

elucidado. Los resultados del ensayo de adhesin realizado usando el mtodo de dot blot de

las bacterias con potencial patgeno a estracto crudo de moco de ostin marcadoenzimticamente, se muestra en la Tabla 18, donde se observan las caractersticas de

adhesin cualitativa a extracto crudo de moco de ostin de cepas con potencial patgeno

aisladas de ostiones. Las figuras del ensayo de adhesin se encuentran en el anexo 1.

Tabla 18.- Caractersticas de adhesin de las cepas aisladas de ostiones en diferentes

medios de cultivo.

Medio CEPA ADH

1 ABP O1 +

2 ABP O2 -

3 ABP O3 +

4 ABP O4 +

5 ABP O5 +

6 ABP O6 +

7 AXLD O7 +8 AXLD O8 +

9 AXLD O9 +

10 AXLD O10 -

11 AXLD O11 +

12 AM O12 +

13 AM O13 +

14 AM O14 +

15 AM O15 -

16 AM O16 -

17 AM O17 -

18 AM O18 +

19 AM O19 +

20 AM 020 -21 TCBS O21 -

22 TCBS O22 -

23 TCBS O23 -

24 TCBS O24 +

25 TCBS O25 -


45/79

36

26 TCBS O25-A -

27 APD O26 -

28 TCBS O27 +

29 ABP O28 +

30 AM O29 +31 AM O30 -

32 AM O31 -

33 AM 032 +

34 ABP O33 -

35 APD O34 -

36 ABP O35 -

37 AM O36 -

38 AM O37 -

39 AM O38 -

40 ABP O39 -

41 ABP O40 -

42 TCBS O41 -

43 ABP O42 -

44 AM O43 -

45 AM O44 -

46 AM O45 -

47 AM O46 -

48 AM O48 -

49 TCBS O49 -

50 AM O50 -

51 AM O51 -

52 AM O52 -

53 AM O53 -

54 TCBS O54 -

55 ABP O55 -

56 AM O56 -

57 TCBS O57 -

58 ABP O58 -

59 AM O59 -60 TCBS O60 -

61 ABP 061 -

62 TCBS O62 +

63 TCBS O63 -

64 AM O64 -

65 TCBS O65 +

66 AM O66 -

67 TCBS O67 -

68 AM 068 -

69 TCBS O69 +

70 AM O70 -

71 AM O71 -

72 AM O72 +

73 TCBS O73 -

74 TCBS O74 -

75 AM O75 -

76 AM O76 -

77 TCBS O77 -

78 TCBS O78 -

79 TCBS O79 -

80 AM 080 -

Como puede observarse en esta Tabla 19, el 30% de las cepas aisladas en los diferentes

medios de cultivo presentaron la capacidad de adherirse ms fuertemente a moco de ostin

que las dems, De las 15 cepas que se aislaron en ABP, el 47% tuvieron una adhesin

fuerte. De las 35 cepas aisladas en AM, el 23% se adhirieron ms. De las 5 cepas aisladas


46/79

37

de AXLD el 80% se adhirieron fuerte y de las 23 cepas aisladas en ATCBS, solo el 22%

presentaron adhesin fuerte. Tomando en cuenta que la adhesin a moco intestinal es un

prerequisito para la colonizacin, las cepas con adhesin fuerte tienen la capacidad de

colonizar los ostiones y si son patgenas tendrn la capacidad de infectar.

7.5 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTE

PATGENAS.

Adems de las pruebas anteriores realizadas a las cepas que ms se adhirieron, se llev a

cabo su identificacin molecular. Las cepas seleccionadas para la identificacin molecular se

observan en la Tabla 13, donde se observa la morfologa y el medio de cultivo donde fue

aislada.

Tabla 19. Cepas con potencial patgeno aisladas de diferentes especies de ostin y

seleccionadas por su perfil de adhesin para identificarse molecularmente

No. Cepa Morfologia /Medio de cultivo

1 012 Cocos, diplococos, Agar Marino

2 018 Bacilos cortos mviles , Agar Marino

3 072 Bacilos cortos mviles, Agar Marino

4 01 Coco, diplococos Agar Baird Parker

5 03 Coco, diplococos Agar Baird Parker

6 06 Bacilos cortos mviles, Agar Baird Parker

7 024 Cocos y diplococos, Agar TCBS

8 062 Cocos y diplococos, Agar TCBS

9 065 Bacilos cortos y medianos, Agar TCBS

10 011 Coco, Agar XLD


47/79

38

La calidad del ADN genmico purificado se observ en un gel de agarosa al 1%, Figura 15.

En algunos carriles se observa mayor cantidad de ADN y en otro el ADN se observa un

poco degradado, sin embargo fue suficiente para llevar a cabo las reacciones de PCR.

Los productos de PCR tambin se corrieron en un gel de agarosa y se observan en la Figura

16, donde se observa una banda de alrededor de 1,500 pares de bases.

Los productos de PCR se enviaron a la empresa Macrogen para su limpieza y

secuenciacin.

1000

Figura 15. Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genmico de las cepas de ostin: Carril 1. Lambda

DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9. Cepa

065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.

Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y pH* y con ADN genmico de las

cepas: Carril 1. Marcador de peso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6 . Cepa

024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa 072.


48/79

39

Las secuencias recibidas se editaron, se alinearon y las secuencias consenso resultantes se

compararon con las bases de secuencias de NCBI usando la herramienta BLASTn, donde se

encontr la mayora de los gneros y especies de las bacterias en estudio Tabla 20. La

mayora de estos gneros y especies de bacterias son consideradas como patgenosoportunistas.

Tabla 20. Gnero y especie de las cepas con potencial patgeno aisladas de ostin y

seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco de ostin.

DescriptionMax

score

Total

score

Query

cover

E

valueIdent

Numero de

acceso a

NCBI

CEPA Morfologa/Medio

cultivo/especie

Enterococcus sp.C213 16S

ribosomal RNA gene, partial

sequence

1126 1126 100% 0.0 100% FJ513910.1

O1

Coco

ABP

C.gigas

Escherichia colistrain FUA1242

16S ribosomal RNA gene, partial

sequence

2583 2583 100% 0.0 99% HQ169124.1

O3

Coco-bacilo

ABP

C.gigas

Escherichia colistrain FUA1242


sequence

2583 2583 100% 0.0 99% HQ169124.1 O6

Coco-bacilo

ABP

C.gigas

Enterococcus faecalispartial 16S

rRNA gene, strain ZG7-151202 1623 98% 0.0 99% HE646431.1 O11

Coco

XLD

C.gigas

Staphylococcus pasteuristrain 87


sequence

2578 2578 99% 0.0 99% KF735653.1 012

Coco

AM

C.gigas

Escherichia coli strain FUA1242


sequence

2634 2634 100% 0.0 99% HQ169124.1 018

Bacilo

AM

C.gigas

Bacterium PJ-38 16S ribosomal

RNA gene, partial sequence1146 1403 99% 0.0 98% KF146333.1 024

Bacilo

TCBS

C.gigas

Enterococcus faeciumstrain FMC59 2547 2547 100% 0.0 99% KF358453.1 O62 Coco
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