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TRABAJO EN EXTENSO

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

CIUDAD JUAREZ CHIHUAHUA. NOVIEMBRE 12-14, 2007

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OBTENCIÓN DE UN CUAJO VEGETAL A PARTIR DEL FRUTO DE LA

PLANTA Solanum elaeagnifolium PARA LA ELABORACIÓN DE QUESO

Aquino-Favela Alejandra, López-Díaz José A.1, Vargas-Requena Claudia Lucía2 y Martínez-Ruiz Nina del Rocío1*. 1Laboratorio de Ciencias de los Alimentos, 2Laboratorio de Biotecnología. Instituto de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Anillo Envolvente del Pronaf y Estocolmo s/n Cd. Juárez, Chihuahua, México. *e mail: [email protected]

RESUMEN

El fruto de la planta Solanum elaeagnifolium contiene enzimas proteolíticas

capaces de coagular la caseína de la leche, lo que resulta significativo dentro

de la industria quesera. Del fruto amarillo del trompillo se obtuvo un extracto

proteico con actividad coagulante y se empleó en la elaboración de queso

asadero, mismo que resultó ser el producto preferido y con mayor grado de

satisfacción en comparación del queso elaborado con cuajo comercial.

Palabras Clave: Solanum elaeagnifolium, trompillo, cuajo vegetal, proteólisis,

queso.

INTRODUCCIÓN

El aumento en el consumo de quesos tanto a nivel mundial como nacional, ha

incrementado la demanda y provocado la escasez de la quimosina, enzima que

se obtiene del cuarto estómago de las terneras lactantes. Esta enzima se

emplea en la industria quesera para realizar la coagulación de la leche, pues

tiene la capacidad de realizar una proteólisis específica que ocasiona la

precipitación de la caseína, principal componente proteico de la leche.

Actualmente, la industria quesera utiliza además de la quimosina, nuevas

fuentes de enzimas coagulantes tales como los cuajos de origen microbiano y

los cuajos de origen vegetal provenientes de plantas como Cynaras Solanum

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elaeagnifolium o trompillo, como se le conoce comúnmente, es una planta

considerada como maleza y crece con mayor abundancia en el suroeste de

Estado Unidos y al Norte de México. Particularmente en el estado de

Chihuahua, desde la antigüedad, los indios Pimas utilizaron el fruto de la

planta Solanum elaeagnifolium para la elaboración de queso, siendo hasta el

momento empleado de manera empírica y artesanal con el mismo propósito.

El objetivo del presente estudio fue obtener un cuajo vegetal a partir del fruto

de la planta de trompillo y emplearlo en la elaboración de queso asadero,

proponiendo así una opción más de sucedáneo del cuajo para la industria

quesera.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de la muestra

Se recolectaron frutos de la planta Solanum elaeagnifolium en sus diferentes

estadios de maduración (verde, amarillo y negro) durante el periodo de junio a

noviembre del 2005 en Cd. Juárez, Delicias y Rodrigo M. Quevedo, del estado

de Chihuahua, México. Las muestras fueron transportadas a temperatura

ambiente hasta el laboratorio para su tratamiento. Una parte de las muestras se

guardó en fresco y otra se secó. Los frutos frescos se colocaron en bolsas de

plástico y se congelaron a -20 °C en un refrigerador marca LG modelo GR-

T482XC hasta su posterior análisis. Los frutos secos se obtuvieron por

desecación a temperatura ambiente durante 40 días, y se guardaron para

posteriormente llevar a cabo su análisis.

La leche utilizada para la elaboración de quesos fue proporcionada por la

unidad de prácticas rumiantes del Programa de Veterinaria de la Universidad

Autónoma de Ciudad Juárez, de animales vacunos de la raza Hollstein.

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Determinación de la Composición del Fruto

Se determinó la humedad, cenizas, proteína, grasa y carbohidratos totales del

fruto siguiendo los métodos estandarizados de la AOAC (2000). Para la

determinación de la humedad en los frutos de Solanum elaeagnifolium se utilizó

el método de desecación por estufa; para las cenizas totales se llevó a cabo el

método de incineración y calcinación de la muestra; proteína total fue por el

método Kjeldahl; grasa por el método Soxhelt y carbohidratos totales se

determinó por diferencia. Se determinaron azúcares reductores por una

titulación de Lane y Eyron (Kirk, et al 2002). Cada determinación se realizó por

triplicado y los resultados se compararon mediante un análisis de varianza

(p<0.05).

Determinación de pH

Se maceraron 5 g de fruto y se le añadieron 50 mL de agua destilada, se

homogenizó y calentó a 25 °C, posteriormente se determinó el valor de pH con

un potenciómetro marca Corning Scholar 425 (SCFI, 1978).

Realización de la Prueba de Coagulación

Para esta prueba se prepararon extractos crudos de los frutos verdes, amarillos

y negros; frescos, congelados y secos. Se maceró 1 g de cada fruto y se

adicionaron 10 mL de solución amortiguadora de acetatos 0.1 M y pH 5.2. En

un tubo de ensaye se colocó 1 mL de leche a pH 6.0 y 1 mL de extracto crudo.

Se incubó a 40 °C por 40 min y transcurrido este tiempo se realizó una

observación de la presencia o ausencia de coágulo en la leche (Hernández et

al., 2000). Para la fracción proteica se realizó la misma prueba.

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Extracción de la Fracción Proteica

Se siguió el método de precipitación con sulfato de amonio descrito por

Hernández y colaboradores (2000), con algunas modificaciones. Se pesaron 30

g de la muestra (fruto amarillo congelado) y se maceraron en un mortero

conservado a 4 °C. Al macerado se le adicionó el 1 % (p/v) de

polivinilpolipirrodilidona (PVPP) y se mezclaron con 100 mL de solución

amortiguadora de acetatos 0.1 M a pH 5.2. Esta mezcla se centrifugó durante

20 min a 3,500 rpm en una centrifuga marca IEC HN SII, a 4 °C. Al

sobrenadante se le adicionó sulfato de amonio con agitación lenta, hasta

alcanzar una proporción del 20 % p/v con respecto al volumen total del

extracto, todo esto a 4 °C. Posteriormente se centrifugó por 20 min a 3,500

rpm. El precipitado obtenido se descartó y el sobrenadante se midió con una

probeta y se le adicionó sulfato de amonio nuevamente en una proporción del

20 % p/v. Se volvió a centrifugar por 20 min a 3,500 rpm, se descartó el

sobrenadante y el precipitado fue resuspendido con 10 mL de solución

amortiguadora de acetatos 0.1 M a pH 5.2. El sulfato de amonio se eliminó del

extracto proteico a través de un proceso de diálisis contra la solución

amortiguadora, utilizando una membrana con un tamaño de poro de 12-14

KDa. El tiempo de dializado fue de 36 horas, con un mínimo de tres cambios de

la solución amortiguadora con agitación constante y en refrigeración

(Hernández et al., 2000). La fracción proteica extraída se conservó a -20 °C

para las pruebas posteriores.

Cuantificación de proteína

El procedimiento de cuantificación espectrofotométrico de proteínas, se realizó

en base al método diseñado por Bradford (1976). A 0.1 mL de solución

problema se le agregó 1 mL de reactivo de Bradford y se leyó la absorbancia a

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una longitud de onda de 595 nm. La absorbancia resultante se interpoló en una

curva patrón para conocer la cantidad de proteína contenida en la muestra

(Bradford, 1976).

Determinación de Fuerza de Cuajo

Se realizó por medio de la prueba de Soxhlet y consistió en colocar 500 mL de

leche fresca y calentarla a 35 °C, posteriormente se le adicionó 1 mL de la

fracción proteica y se contó el tiempo en segundos hasta la obtención de una

cuajada firme (Veisseyre, 1988). La prueba se realizó bajo diferentes

condiciones, en donde las variantes fueron: el pH de la leche en 6.0 y 5.5; la

temperatura de cuajado fue de 35 °C y 40 °C y, empleando una concentración

simple del extracto y otra a doble concentración. La determinación también se

realizó utilizando cuajo comercial. Para determinar el momento en que se

forma la cuajada, se aplicó el método empírico de la paja, el cual se basa en

utilizar un pedazo de paja, colocarlo sobre la cuajada y tomar el tiempo en el

cual la paja se mantiene vertical (Keating, 2002).

Elaboración de queso asadero

Se utilizaron 6 L de leche fresca, la cual se acidificó con ácido cítrico grado

alimentario al 5 %, hasta obtener una acidez de 35 °D (pH 5.2 - 5.5); se le

añadió 1.2 g de cloruro de calcio grado alimentario diluido en 12 mL de agua y

la leche se calentó a 35 °C. Posteriormente se le adicionó 6 mL de la fracción

proteica extraída y se homogenizó lentamente, se dejó reposar durante 90 min

hasta que se formó una cuajada firme; se cortó la cuajada en pequeños cubos

de 2 cm3 y se mantuvo a 35 °C, con agitación intermitente hasta alcanzar una

acidez de 32 °D en suero. Se efectuó el desuerado total y se hizo un salado

directo de la cuajada con cloruro de sodio grado alimentario en relación del 1.3

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%. Se procedió al fundido de la pasta a 70 °C, hasta obtener hebras elásticas,

que se dejaron enfriar, para finalmente formar bolas de queso asadero (Villegas

De Gante, 2004; Silva, 2005).

Este mismo procedimiento se efectuó para elaborar queso asadero con cuajo

comercial con una dilución 1:11, a efecto de tener la misma concentración que

el extracto de trompillo. Los quesos se guardaron en bolsas plásticas selladas a

4 °C.

Evaluación sensorial del queso

Se contó con un panel de 41 jueces no entrenados y que cumplieron como

características la de ser consumidores de éste producto lácteo y no tener

relación en el transcurso de la investigación. Se realizó una prueba de

preferencia, en donde se le presentó al panel dos muestras de queso asadero;

las cuales se colocaron en recipientes pequeños y se codificaron

aleatoriamente. Las muestras se colocaron sobre un plato enseguida de un

vaso con agua purificada y una servilleta, y se le entregó a cada juez una ficha

de cata para esta prueba. Cada muestra constó de dos unidades de queso de

aproximadamente 5 g en forma de rectángulo (2.5 x 1.5 cm). Una de las

muestras correspondió al queso elaborado con el cuajo vegetal (A) y la otra

muestra al queso elaborado con el cuajo comercial (B). Para evitar el efecto de

posición, se repartió al 50 % de los jueces el orden A-B y para el resto el orden

B-A. Adicionalmente, se aplicó una prueba de medición del grado de

satisfacción en donde participaron los mismos 41 catadores, a quienes se les

presentaron las muestras de la forma antes descrita junto con una segunda

ficha de cata para esta prueba (Anzaldúa-Morales, 1994; Ibáñez y Barcina,

2001).

RESULTADOS

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Los resultados del análisis proximal en base húmeda y seca de los frutos de la

planta Solanum elaeagnifolium se muestran en la Tabla I. Se comparó la

composición de los frutos en base seca y mediante una prueba de diferencia

entre dos medias utilizando t student se estableció que existe diferencia

significativa entre los frutos frescos y secos en sus valores de cenizas,

proteína, grasa y carbohidratos, excepto en las cenizas del fruto negro donde

no hay tal diferencia.

Como puede observarse en la Figura 1 el fruto amarillo fresco fue el que

presentó el mayor contenido de proteína, con 11.66 %, mientras su homólogo

seco sólo 6.11 %.

En cuanto a la presencia de azúcares reductores, la prueba resultó negativa.

Figura 1. Comparativo del porcentaje de proteína de los frutos frescos y secos de la planta Solanum elaeagnifolium.

11.66

2.55

9.98

6.11

9.68

3.27

0

2

4

6

8

10

12

14

Fruto verde Fruto amarillo Fruto negro

% P

rote

ína

Fresco

Seco

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El pH determinado en los frutos fue de 5.2 y en base a este valor se preparó la

solución amortiguadora para la extracción a fin de preservar las condiciones

naturales del extracto proteico de interés.

En la prueba de coagulación se tuvo que la cuajada más firme fue formada por

el fruto amarillo fresco, el congelado, y el seco; en segundo lugar fue el fruto

verde y finalmente la prueba de coagulación resultó negativa para el fruto

negro. En función de este resultado se eligió al fruto amarillo congelado para

realizar la extracción de la fracción proteica. La extracción fue probada a

diferentes concentraciones de sulfato de amonio como lo fueron: 10, 20, 30, 40,

50 y 80 % p/v y mediante una prueba de coagulación se observó que las

fracciones obtenidas con el 40% o más de sulfato de amonio formaron los

Tabla I. Composición química de los frutos de la planta Solanum elaeagnifolium.

Parámetro Estadio Fruto Fresco BH

Fruto Seco BH

Fruto Fresco BS

Fruto Seco BS

Humedad (%)

Verde Amarillo Negro

68.76 ±0.0082 51.43 ±0.0060 37.86 ±0.0042

32.80 ±0.0050 26.34 ±0.0121 4.80 ±0.0002

Cenizas (%)


1.41 ±0.0020 2.34 ±0.0012 2.86 ±0.0021

3.74 ±0.0011 4.12 ±0.0026 4.53a ±0.0025

4.52 ±0.0020 4.82 ±0.0012 4.61 ±0.0021

5.58 ±0.0011 5.60 ±0.0026

4.76a

±0.0025

Proteínas (%)


3.11 ±0.0009 5.66 ±0.0041 1.58 ±0.0007

6.50 ±0.001 4.50 ±0.002 3.11a ±0.001

9.98 ±0.0009 11.66 ±0.0041 2.55 ±0.0007

9.69 ±0.001 6.11 ±0.002 3.27a ±0.001

Grasas (%)


1.66 ±0.0021 0.81 ±0.0004 1.40 ±0.0011

4.01 ±0.0003 4.80 ±0.0022 8.53 ±0.0020

5.34 ±0.0021 1.68 ±0.0004 2.55 ±0.0011

5.97 ±0.0003 6.52 ±0.0022 8.96 ±0.0020

Carbohidratos (%)


25.03 39.79 56.28

52.92 60.21 79.01

80.14 81.82 90.58

78.76 81.75 82.99

BH = Base Húmeda, BS = Base Seca. a Estos valores se obtuvieron con un nivel de significancia (p =0.052)

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coágulos más firmes, siendo la de 40% la que reportó la mayor concentración

de proteínas, tal y como se observa en la Figura 2. Del extracto preparado se

obtuvieron 90 mL con una concentración de proteína de 301.5 g/mL.

En la prueba de fuerza de cuajo se observaron variaciones en el tiempo de

coagulación con respecto al pH, a la temperatura y a la concentración de

cuajo, tanto vegetal como comercial, siendo los tiempos menores para el cuajo

comercial y los mayores para el vegetal. En las condiciones de pH 5.5, doble

concentración de cuajo y 35 °C, que representan condiciones similares a la

elaboración del queso asadero, se determinó para el comercial una fuerza de

cuajo de 1:20,000, mientras que el vegetal resultó de 1:2,500.

En el queso asadero elaborado con el extracto proteico o cuajo vegetal se

obtuvo un rendimiento del 8.45 % y para el elaborado con cuajo comercial el

8.35%. En relación a la evaluación sensorial a que se sometieron ambos

quesos, participaron 41 jueces no entrenados, todos ellos estudiantes

universitarios, con una edad promedio entre 20 y 25 años; el panel estaba

integrado por 33 mujeres y 8 hombres y a todos ellos les gustaba consumir el

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

10 20 30 40 50 Sulfato de amonio (%)

Pro

teín

a (u

g/m

L)

Sobrenadante Precipitado

Figura 2. Concentración de proteínas en el precipitado y sobrenadante a distintos porcentajes de sulfato de amonio.

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producto lácteo al menos tres veces por semana. En la prueba de preferencia

como se observa en la Figura 3, 38 de los panelistas, esto es, el 93 %

prefirieron el queso elaborado con el cuajo vegetal y solamente 3 panelistas, el

7 % optaron por el queso elaborado con cuajo comercial. De la aplicación de la

tabla de significancia para pruebas de dos muestras en dos colas y a un nivel

de probabilidad p<0.05 (Anzaldúa-Morales, 1994) se obtuvo que el número

mínimo de juicios coincidentes para establecer una diferencia significativa era

de 28; por lo que se determinó que si existe diferencia significativa entre las

muestras de queso.

La prueba de medición del grado de satisfacción que se muestra en la Figura 4

indicó que el 85 % de los juicios para el queso elaborado con el cuajo vegetal

se ubicaron en el grado de satisfacción de me gusta mucho y me gusta ;

mientras que para el queso elaborado con cuajo comercial prevalecieron los

juicios de ni me gusta ni me disgusta y me gusta . Del análisis de varianza

aplicado se obtuvo un valor de F calculada para las muestras y para los jueces,

y se estableció que no existe diferencia significativa entre jueces, pero si entre

muestras (p<0.05). Para éstas últimas se realizó la prueba de Tukey y

nuevamente se estableció diferencia significativa entre el queso elaborado con

cuajo vegetal y el elaborado con cuajo comercial.

DISCUSIÓN

Figura 4. Medición del grado de satisfacción para el queso asadero con trompillo y con cuajo.

0

5

10

15

20

25

Trompillo Cuajo

1 Me gusta mucho2 Me gusta3 Ni me gusta ni me disgusta4 Me disgusta5 Me disgusta mucho

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Los frutos de la Solanum elaeagnifolium en sus diferentes estadios de

maduración presentan diferencias a medida que avanza la etapa de

maduración, esta tendencia observada tiene relación con lo citado por Días

(2001); quien explica que los frutos en las plantas provocan un proceso de

secado natural a medida que el fruto va madurando y en esta medida las

reacciones metabólicas van disminuyendo y se preservan las reservas

acumuladas; así también Villee (1992) subraya que frutos de tipo simple se

secan al madurar para abrirse y exponer las semillas, lo que ocasiona una

variación en su nutrientes en función de sus necesidades metabólicas y la

creación de reservas necesarias para la germinación de la semilla. En relación

a su contenido proteico, el fruto amarillo fresco fue el que presentó el mayor

valor, lo que permite estimar que es en este estadio donde el fruto ha

alcanzado su mayor madurez fisiológica, expresando así sus componentes

proteicos en mayor cantidad (Carvajal, 2000; Bidwell, 1979). La principal forma

de reserva de carbohidratos en las plantas y muchos frutos es en forma de

sacarosa y almidón (Perissé, 2002 y Audesirk, 2003), ambos son azúcares no

reductores lo que está relacionado con la prueba negativa sobre éstos

azúcares y permite descartar que el cambio de color del fruto durante la

maduración se deba a reacciones de Maillard que pudieran afectar el contenido

proteico (Badui, 1993).

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Con respecto a la prueba de coagulación los frutos amarillos en fresco,

congelado y seco formaron el coágulo más firme de entre todos los demás

frutos, lo cual permite relacionar el grado de maduración del fruto con la

presencia de diferentes tipos de enzimas proteolíticas, denominadas proteasas,

que provocan la hidrólisis de las proteínas de reserva que se transforman en

otras de menor peso molecular, especialmente pequeños péptidos y

aminoácidos. Los aminoácidos liberados son utilizados en la síntesis de nuevas

proteínas en el desarrollo de la nueva planta o para proporcionar energía

mediante la oxidación de su esqueleto carbonado (Barceló et al., 1984;

Carrasco, 2005). No obstante, no se observó un efecto de la congelación, ni del

secado sobre la acción proteolítica de las proteínas del fruto, lo que resulta de

interés para considerar diferentes formas de conservación del fruto amarillo

antes de realizar la extracción. Por otra parte, durante la maceración de los

frutos para realizar la extracción de la fracción proteica, se observó la

formación de una coloración que va de tonalidades de café hasta negro, lo que

sugiere la oxidación de algunos de sus componentes. El polivinilpolirrolidona

(PVPP) redujo significativamente este efecto al adicionarse como antioxidante,

debido a la afinidad por los grupos hidroxilos de los compuestos fenólicos de

bajo peso molecular; éstos compuestos tienden a provocar cambios en la

tonalidad de los frutos (Badui, 1993).

La fuerza del cuajo vegetal, en condiciones similares a las de elaboración del

queso asadero, resultó ocho veces menor en comparación con el cuajo

comercial, ambos a la misma concentración de proteína, sin embargo es

necesario considerar que para el primero se tiene un extracto en donde la

proteína o proteínas con acción proteolítica sobre la leche no se encuentran en

forma pura, lo que implica que en esa concentración posiblemente se tengan

otras fracciones proteicas que realicen un impacto sobre la concentración pero

no así sobre la actividad proteolítica. Por el contrario el cuajo comercial posee

la enzima pura en solución; por lo que para considerar una fuerza de cuajo real

Cuajo

Trompillo

93%

7 %

Figura 3. Juicios de preferencia para el queso asadero elaborado con cuajo comercial y trompillo.

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resulta necesario que esta prueba se realice teniendo a la enzima o enzimas en

forma pura. De acuerdo a Veisseyre (1988), el rendimiento en la elaboración de

queso varía dependiendo de los métodos de fabricación y sobre todo de la

intensidad del desuerado. Lo anterior se relaciona con los bajos rendimientos

de los quesos elaborados en este estudio, esto debido a la falta de experiencia

en la elaboración de queso asadero.

Finalmente, de la evaluación sensorial aplicada a ambos quesos se establece

que la preferencia fue hacia el queso asadero elaborado con el cuajo vegetal,

los comentarios de los panelistas hacia el producto fueron acerca de la textura

más blanda y cremosa, un sabor y olor agradable. Para el queso asadero

elaborado con cuajo comercial se obtuvieron comentarios referentes a una

textura plástica y de poco sabor. Numerosos estudios señalan una relación

entre el tipo de proteólisis generada por el cuajo sobre la caseína de la leche y

el impacto de los péptidos generados sobre las características organolépticas

del queso (Torres, et al, 2005). La quimosina realiza una proteólisis específica y

limitada ocasionado la ruptura de la caseína, lo que genera dos péptidos: uno

de 64 aminoácidos y otro de 105 (Veisseyre, 1988). En el caso del cuajo

vegetal del trompillo se presume, en función de estudios con otros cuajos

vegetales, que se realiza una proteólisis inespecífica que puede generar una

cantidad de péptidos y aminoácidos libres, que modifican substancialmente las

propiedades y características organolépticas del queso (Vioque, et al 2000;

Chen, et al 2003ª; Chen, et al 2003b y Llorente, et al 2004).

CONCLUSIONES

El fruto amarillo tiene un mayor contenido de proteína y actividad proteolítica,

por lo que es el más conveniente a utilizar en la elaboración de queso. La

fuerza de cuajo que presenta es menor a la del cuajo comercial, sin embargo la

evaluación sensorial del queso asadero elaborado con este extracto obtuvo una

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marcada preferencia y un mayor grado de satisfacción. Por lo expuesto, se

confirma que el cuajo vegetal obtenido del trompillo, puede ser utilizado en la

Industria Quesera como un sucedáneo del cuajo animal o microbiano.

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