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7/24/2019 T_CNICAS_DE_SIEMBRA_E_INCUBACI_N UNIDAD 7.pdf

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TCNICAS DE SIEMBRA e

INCUBACIN


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En la naturaleza los mo no se encuentranaislados, sino integrados en poblaciones

mixtas Para llevar a cabo el estudio de estos mo y de

sus propiedades, es necesario separar unos deotros y trabajar con especies aisladas,

obtenindose cultivos axnicos o puros Un cultivo axnico o puro es aquel que

contiene un solo tipo de mo y que procede

generalmente de una sola clula, elcrecimiento de sta origina en un medioslido una masa de clulas fcilmente visibleque recibe el nombre de colonia


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Para obtener cultivos axnicos a partir de unapoblacin microbiana mixta se utilizan lasdenominadas tcnicas de aislamiento

TCNICAS DE SIEMBRA

Un inculo es una cantidad suficiente y

representativa del mo problema El paso de una muestra microbiana a un medio

de cultivo, ya sea lquido o slido, se den siembra

o inoculacinEl paso de una muestra microb. de un medio decultivo a otro se den resiembra


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Antes de sembrar se procede a la toma delinculo que es una operacin simple pero

requiere alguna atencin:AQU SE INCLUIRA TODO LO QUE YASABEMOS SOBRE TRABAJAR EN

CONDICIONES DE ESTERILIDADPARA PROTEGERNOS A NOSOTROS Y A LAMUESTRA


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TIPOS DE SIEMBRA

A.- SIEMBRA EN MEDIO LQUIDO

A.-1. Si la transferencia se va a realizar a uncaldo estril utilizando el asa de siembra,escobilln o hisopo, este se introduce en el

medio lquido y se agita para disolver elcontenido del inculo.


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A.-2. Con pipeta, se toma un volumendeterminado de muestra problema

aadindolo en el tubo con el medio decultivo lq, homogeneizndolo posteriormentepor rotacin entre las manos


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En los cultivos lq no tiene lugar laformacin de colonias, por lo tanto se

examinar la existencia de enturbiamiento, laformacin de una pelcula o velo sobre lasuperficie, la aparicin de sedimento en elfondo del tubo, etc.

Estos cultivos permiten la obtencin de unamasa microbiana grande, con elevado n demo.


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B.- SIEMBRA EN MEDIO SLIDO

B.-1. SIEMBRA EN TUBO

B.-1.1 Siembra por estra en tubos con medioinclinado

Con el asa de siembra tomar los mo de muestra einocular el tubo realizando un movimiento de zig-

zag en la superficie. El proceso se inicia en elfondo y se va avanzando hacia arriba por el reainclinada

Este mtodo es utilizado para conservar cepasdurante cortos perodos de tiempo, as comopara la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas


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B. 1. 2 Siembra por picadura

Se suele hacer con hilo desiembra el cual se introduce en la

zona central del tuboverticalmente hasta el fondo y sesaca por el mismos orificio

Se utilizan para realizar pruebas

bioqumicas, para comprobar siun mo es o no mvil, ya que en elprimer caso se observar que elcrecimiento difunde alrededor de

la zona donde se hizo la picadura,de ah la importancia de sacarpor el mismo orificio el hilo


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B.-1.3. Siembra por picadura y estra

Consiste en la utilizacin de las 2 tcnicas

anteriormente descritas

Se lleva a cabo cuando el medio es slido yest inclinado, 1 se realiza la siembra por

picadura y posteriormente la siembra porestra

Se emplea para ciertas pruebas bioqumicas


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B.2. EN PLACA

En funcin del objetivo que se desee

conseguir, hay varios tipos de siembra enplaca.

B.-2.1. Siembra masiva en placa

Siembra en superficie1. Se toma en condiciones aspticas elinculo con pipeta estril o con micropipeta,0,1 ml

2. Se aade al centro de una placa petri quecontiene un medio de cultivo slido


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3. Se homogeniza con esptula Driglasky por latcnica del rastrilleado:

Se le induce a la placa un movimiento derotacin mientras que con la otra mano serastrillea con movimiento de vaivn hasta que

se nota, por la resistencia al rastrilleo quetodo el inculo se ha absorbido por el medio

Se suele utilizar esta tcnica para el recuento

de mo aerobios, cuando se utiliza comomedio de cultivo PCA (Plate Counting Agar)


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Siembra en profundidad = Siembra previa alvertido en placa = Tcnica de Barry

1. En una placa petri vaca se deposita unpequeo volumen conocido de muestra

2. Se aade el medio de cultivo fundido y

atemperado aproximadamente a 45C3. Se mezclan ambos por rotacin suave de la

placa, para que los mo se distribuyan

homogneamente, permitiendo el desarrollode colonias separadas por todo el agar


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Una variante de esta tcnica consiste eninocular el medio de cultivo fundido y

atemperado, contenido en un tubo, con undeterminado volumen de muestra. Lahomogenizacin se realiza por rotacin deltubo entre las manos o con una agitador,

antes de verterlo en la placa

En ambos casos, tras la homogenizacin, sedeja enfriar el medio hasta que solidifique y

despus se incuba


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B.2.2.Siembra en placa para aislamiento

Tiene por finalidad obtener colonias aisladas,

cuya posterior resiembra nos dar un cultivopuro o axnico

Las siembras para aislamiento utilizan todas,

medio de cultivo slido Dependiendo de la tcnica de sembrado

podemos distinguir multitud de variantes,

algunas de ellas son:


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B.2.2.1 SIEMBRA POR AGOTAMIENTO ENESTRA MLTIPLE.

1. Se toma la muestra con el asa de siembraestril y se deposita en uno de los extremos

2. Se hace una primera estra en zig-zag muy

junta que ocupe aproximadamente 1/3 de laplaca

3. Flameamos el asa de platino y giramos

ligeramente dicha placa y hacemos una 2estra en esa direccin tocando la estraanterior slo al principio.


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4. Se vuelve a flamear de nuevo el asa y seprocede de igual manera repitiendo la

operacin 4 o 5 veces, teniendo en cuenta queel ltimo tramo se efectuar hacia el interiorde la misma


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http://recursos.cnice.mec.es/bancoimagenes/ArchivosImagenes/DVD13/CD05/23892__10_a_1.wmf


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El resultado son colonias cada vez msseparadas como consecuencia de que cada

vez se va arrastrando y separando ms lamuestra, ya que en cada giro se arrastranmenos bacterias con el asa


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B.2.2.2 SIEMBRA EN 4 CUADRANTES

1. Se divide la placa en 4 cuadrantes (con un

rotulador en el reverso de la placa)2. Se deposita el inculo en uno de los 4

cuadrantes y se siembra en estra

3. Sin flamear el asa, se realiza la mismaoperacin sucesivamente en los 3 cuadrantesgirando cada vez la placa 90

4. En cada uno de ellos se sembrar el inculoque queda adherido al asa, tras la siembraanterior


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Observamos que en elltimo cuadrante lascolonias estn msaisladas o separadas.


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INCUBACIN DE MICROORGANISMOS

Incubacin= es el acondicionamiento

ambiental de los medios de cultivo yainoculados para favorecer la multiplicacin ycrecimiento de los mo

Las condiciones de incubacin (tiempo, T yatmsfera) depende de cada mo

Aunque existen condiciones especiales de

cultivo la mayora de mo crecen en 24-48h a35 y en atmsfera aerbica


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A.- TEMPERATURA

Existe siempre una T para cada mo donde su

proliferacin es ideal y fuera de sta, o nocrecen o lo hacen mucho ms despacio

En funcin de la T ptima de crecimiento los

mo se clasifican:-Mesfilas: son la mayora y su T pt. estentre 35-44C.

-Psicrfilas: pueden crecer a T muy bajasincluso por debajo de 0C

- Termfilas: crecen entre 50-55C e

incluso pueden tolerar hasta 100C


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B.- PRESENCIA DE OXGENO Y CO21. Aerobios estrictos: necesitan O2 para vivir

2. Microaerfilos: crecen bien a tensiones bajasde O2 pero no se desarrollan a elevadasconcentraciones del mismo

3. Anaerobios estrictos: la atmsfera debecarecer totalmente de O2

4. Hay mo que requieren para su crecimiento

una mayor concentracin de CO2 a laexistente en la atmsfera


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C.- TIEMPO

Generalmente inferior a una semana,

habitualmente de 24-48hD.- HUMEDAD

E.- INFLUENCIA DE LA LUZ

Normalmente las bacterias crecen mejor enambientes oscuros. La luz y las radiaciones UVinhiben el crecimiento e incluso matan a los

mo.

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