t©cnicas gen©ticas aplicadas a las ciencias forenses - victor acu±a alonzo
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Técnicas genéticas aplicadas a las ciencias forenses
Víctor Acuña Alonzo Licenciatura de Antropología FísicaEscuela Nacional de Antropología e Historia
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de ?
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
El ADN como evidencia
• Prueba de rutina para identificación humana y disputas de paternidad
• PCR de alta sensibilidad → obtención de evidencia a partir de escaso material biológico
• Bases de datos de perfiles genéticos
→ búsqueda ágil de coincidencia de perfiles genéticos (total o parcial)
→ posibilidad de resolver casos no resueltos (cold cases)
→ asignación de un valor estadístico a la identificación
Conc
epto
s
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.
El ADN como evidencia Co
ncep
tos
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.
La evidencia genética debe considerarse en el marco de otros datos, el papel del genetista no
es hacer presunciones de inocencia o culpabilidad, sino proveer información objetiva
al juez o jurado
• En la actualidad se usan PCR multiplex para microsatélites autosómicos (amplificación simultánea de varios loci)
• Otros marcadores para usos específicos: SNPs autosómicosMarcadores del cromosoma Y (crY)Marcadores del ADN mitocondrial (mtDNA)
• Además de la determinación de perfiles genéticos para identificación y disputas de paternidad, otras posibles aplicaciones de la genética son:
Deducción del origen (ancestría)Información fenotípicaAnálisis de otras especies
Conc
epto
s
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.
http
://ww
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
23 Pares de Cromosomas + mtDNA
Cromosomassexuales
mtDNA16,569 bp
Autosomas
ADN mitocondrial
ADN nuclear3,200 millones bp
Núcleo de la célula
Mitocondria (múltiples copias)
2 copias por
célula
Varias copias por célula
Butler JM. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Conc
epto
s
Conc
epto
s• STRs autosómicos (microsatélites)
Fuente de variación:Herencia independiente, recombinación y mutación
Ventajas:Poder de discriminación extremadamente alto
Desventajas:Difícil de tipificar en muestras degradadas
> 20 mil STRs
Conc
epto
s• SNPs autosómicos
Fuente de variación:Herencia independiente, recombinación y mutación
Ventajas:Se pueden tipificar en muestras degradadas
Desventajas:Poder de discriminación relativamente bajo (bialélicos)
Frazer KA, et al 2009. Human genetic variation and its contribution to complex traits. Nature Reviews Genetics 10, 241251
> 3 millones de SNPs
Conc
epto
s• STRs crY
Fuente de variación:Sólo mutación
Ventajas:Específico de varones, útil en mezcla de muestras de mujer y varónDistribución filogeográfica bien definida
Desventajas:Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía paterna, posibles problemas de estructura de poblaciones
Conc
epto
s• SNPs del ADN mitocondrial
Fuente de variación:Sólo mutación
Ventajas:Mayores probabilidades integridad Distribución filogeográfica bien definida
Desventajas:Heteroplasmia, Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía materna, posibles problemas de estructura de poblaciones
A, B, C, D, XAméricaA, B, C, D, G, Y, ZAsia
H, I, J, N1b, T, U, V, W, XEuropaL0, L1, L2, L3.ÁfricaHaplogruposRegión
Variación en el genoma humano Co
ncep
tos Nuestras secuencias son idénticas en un 99.9% (especie “joven”).
En el genoma humano hay más de 10 millones de SNPs y decenas de miles de STRs entre otros polimorfismos
Esta variación se estructura en bloques cromosómicos (haplotipos) de 5 a 200K bp
85 a 90% de la variación genética neutral se atribuye a diferencias entre individuos dentro de las poblaciones
El restante 10 a 15% se distribuye entre grupos
Esta variación es modesta pero influencia las diferencias que existen entre las poblaciones respecto a características fenotípicas
Conc
epto
s
1900
Primer polimorfismo genético, ABO (Landsteiner)
1920
1920s1950s otros polimorfismos de grupos sanguíneos y proteínas (MNSs, Rhesus, Lewis, Kell, haptoglobinas ...)
1984
Multilocus DNA fingerprint, minisatélites (Jeffreys)
1988
PCR
Primer kit forense comercial HLADQA1
1991
Primeros STRs para identificación humana
1992
Primer kit comercial de STRs forenses
Uso de mtDNA y YSTRs en casos forenses
1993
Primer caso de desastre masivo (Waco Texas)
1995
UK National DNA Database
1997
Determinación de perfiles genéticos a partir del contacto con objetos
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.
Pm ∼ 0.010.001 < 1013
pocos loci muchos locipoco polimórficos muy polimórficosalta probabilidad de coincidencia muy baja probabilidad
de coincidencia
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Sistema de identificación más usado:
Combined DNA Index System
Iden
tifica
ci
ó n
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
• Alta tasa de mutación• Gran número de alelos en cada
población• Alta heterocigosidad• Herencia independiente (no ligados)• Buenos marcadores individuales, no
suelen ser marcadores de ancestría• Neutrales en su mayoría• Tetranucleótidos, fáciles de amplificar• Alto poder de discriminación• Probabilidad muy baja de coincidencia
aleatoria (match)• ¡Muchas bases de datos!
Características de los STRs seleccionados para idId
entif
icaci
ó n
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
• Sangre• Semen• Saliva• Orina• Cabello• Diente• Hueso• Tejido• Uñas• Objetos x contacto
Fuentes de evidenciaId
entif
icaci
ó n
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Muestra de escena del delito o investigación de
paternidad (dubitada)
ExtracciónADN
Cuantificación del ADN
Amplificación de múltiples marcadores
Biología
Separación y detección de los productos de PCR
TecnologíaDeterminación de los
genotipos de la muestra
GenéticaComparación del perfil
genético con otros resultados (muestras de referencia, indubitadas)
Si se da una coincidencia, comparación con bases de datos
poblacionales
Generación de un reporte de caso con la probabilidad de coincidencia al azar (match)
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Iden
tifica
ci
ó n
?Prueba de identificación
Resultados posibles de la prueba
• Match – Los perfiles genéticos coinciden. Se reporta la significancia estadística.
• Exclusión (Nonmatch) – La comparación de genotipos muestran diferencias en el perfil genético.
• No concluyente – Los datos no permiten llegar a una conclusión (desacuerdo entre los expertos, falta de datos, etc).
Iden
tifica
ci
ó n
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Probabilidad de match (Pm)
• La probabilidad de que dos individuos no relacionados compartan un perfil de DNA
• Se calcula con la regla del producto para la probabilidad conjunta de que ocurra un perfil genético determinado en una población determinada
• Puede aumentar en los siguientes casos:– Perfil de ADN parcial por degradación y reducción del
número de loci informativos– Si el sospechoso y el culpable real tienen parentesco o si se originan de la misma subpoblación
Iden
tifica
ci
ó n
Bases de datos poblacionalesPara una correcta valoración estadística de la prueba de ADN es
necesario disponer de una base de datos lo más extensa posible (N > 200) que sea representativa de la población a la que pertenecen los individuos que se han analizado.
En el caso de que existan subgrupos de población claramente diferenciados es importante que estén incluidos en la base de datos
Iden
tifica
ci
ó n
• Generar datos de la población o las poblaciones deseadas (en caso de poblaciones multiétnicas) N>100
• Determinar las frecuencias alélicas para cada locus
• Usar la frecuencia alélica para estimar la rareza de un perfil genético particular
– Homocigotos (p2), Heterocigotos (2pq)– Usar la regla del producto combinada en varios loci
Iden
tifica
ci
ó n
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Tablas de frecuencias alélicas
CaucasianN= 302
0.0017*
0.10270.2616
0.25330.21520.152320.01160
African American
N=258
0.0019*0.08920.30230.0019*0.33530.20540.06010.0039*
20 0.0017* 0.0001*
D3S1358
Butler et al. (2003) JFS 48(4):908911
CaucasianN= 7,636
0.0009
0.12400.2690
0.24300.20000.14600.0125
Einum et al. (2004) JFS 49(6)
Allele 11
131415
15.216171819
12 0.0017* 0.00070.0031
African AmericanN= 7,602
0.0003*
0.00770.09050.29200.00100.33000.20700.06300.0048
0.0045
20
Allele 11
131415
15.216171819
12
Butler J.M. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Frecuencia del perfil genético con los 13 loci STR CODIS
21.283.50
18.6213.8
31.8530.69
9.2526.1811.3116.2912.35
8.879.171 in
8.37 x 10140.2169 10CSF1PO 3.94 x 10130.5348 8TPOX 1.13 x 10130.2318 6THO1 6.05 x 10110.3212 11 0.1126 9D16S539 4.38 x 10100.17729D7S820 1.38 x 1090.0480 140.3394 11D13S317
44,818,2590.1407 130.384112D5S818 4,845,2170.1391 160.1374 14D18S51
185,0730.2782 30 0.1589 28 D21S11 16,3640.1656 140.1854 12D8S1179
10050.2185220.185421FGA
810.2003 180.2815 17 VWA 9.170.2152 17 0.2533 16D3S1358
Combined value allele value allele Locus
Probabilidad de coincidencia al azar para este perfil en la población eurodescendiente e EUA: 1 en 837 trillones
AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)
AMELD3
TH01 TPOX
D2D19FGA
D21 D18
CSFD16
D7D13
D5 VWAD8Perfil
16,1717,1821,2212,1428,3014,1612,1311,14
9,99,116,68,8
10,10
PRODUCT
RULE
Aplicaciones del genotipado para identificación
o Casos forenseso Bases de datos de ADNo Desastres masivoso Desaparecidoso Pruebas de parentescoo Genealogías y casos históricoso Identidad de líneas celulares humanaso Detección de quimeras genéticaso Monitoreo de trasplanteso Detección de tumoreso Mapeo de enfermedades o Estudio de la diversidad humana
Otros• Identificación de especies (conservación)• Identificación de animales domésticos
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
Iden
tifica
ci
ó n
Límites de las técnicas genéticas
o Cantidad e integridad del material genéticoo Contaminación (mezcla de perfiles genéticos, inhibición PCR)o Bases de datos de referencia (→ estimación probabilística)o Muestras de referencia para el caso (familiares, sospechosos...)o $
Aspectos básicos
o Toma de muestra adecuadao Cadena de custodiao Extracción exitosa del material genéticoo Control de calidad de todos los procesos del laboratorio
→ Laboratorios certificados
Iden
tifica
ci
ó n
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de ?
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Características
• Cuando el perfil genético de una escena del crimen no coincide con ningún perfil de las bases de datos, cualquier información que se pueda obtener será útil:
• Deducción del origen (ancestría)STRs de uso forense no son marcadores de ancestría individualPor el contrario, mtDNA y crY han sido excelentes marcadores de filogeografía, sin embargo su uso sería problemático en poblaciones mestizas
• Información fenotípica
STRs de uso forense no aportan ninguna información fenotípica.
¿USAR OTRAS VARIABLES GENÉTICAS?
Cara
cter
í stica
s
Cara
cter
í stica
sMarcadores para estimar ancestría
Ancestry Informative Markers
Los AIMs se seleccionan para maximizar las diferencias absolutas en las frecuencias alélicas entre dos poblaciones ancestrales. El AIM ideal está fijado en una población y es muy abundante en otra (>60%). Permiten realizar estimaciones de ancestría individualSólo el 2% de los SNPs autosómicos tiene valores > 60% entre las 3 grandes agrupaciones continentales.
VL MartinezMarignac, et al 2007. Admixture in Mexico City: implications for admixture mapping of type 2 diabetes genetic risk factors. Hum Genet, 120(6): 80719.
El caso excepcional de D9S1120 9AR en amerindios
Wang S, et al. 2007. Genetic Variation and Population Structure in Native Americans. PLoS Genet 3(11): e185.
Cara
cter
í stica
sMarcadores asociados a variaciones
fenotípicas
No se habían descrito polimorfismos inequívocamente asociados para la gran mayoría de las características fenotípicas que podrían ser de interés para describir al
culpable de un crimen (estatura, color de piel...)
Recientemente se han identificado alelos asociados a fenotipos que eventualmente podrían ser usados estimar
algunas características.
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.
Bases de datos poblacionales
ENFSI DNA WG Population DatabaseEuropean Network of Forensic Science Instituteshttp://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
STRBase Short Tandem Repeat DNA Internet DataBaseCreated by John M. Butler and Dennis J. Reeder (NIST Biochemical Science Division) http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
Revistas especializadas:
Forensic Science International Genetics
Journal of Forensic Sciences
Base
s de
dat
os
Autosomal SNPs
•70 Loci (Vallone et al. 2005 Forensic Sci. Int. 149: 279286.)• U.S. Caucasian (N=74)• African American (N=71)• U.S. Hispanic (N=44)Ba
ses
de d
atos
Elsevier ScienceElsevier Science
SpringerVerlagASTM and American Academy of Forensic Sciences
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Ejem
plos
American Journal of Human BiologyVolume 20, Issue 5, Date: September/October 2008, Pages: 605613
In the early morning hours of July 17, 1918 the royal family and their staff were led to the cellar of the Ipatiev House where they
were being held and executed.
In the late 1970s, a local geologist, Dr. Alexander Avdonin was able to locate the mass grave containing the remains of five of the seven members of the royal family and their four servants.
In the summer of 2007, a group of amateur archeologists discovered a few bone fragments approximately 70 meters from
the first grave. Following an official archeological excavation conducted by Dr. Sergei Pogorelov, Deputy Director of the
Sverdlovsk Region's Archaeological Institute, a set of 44 bone fragments and teeth were carefully recovered from the site.
(..) the LR of the hypothesis (H1) that samples 146.1 and 147 are the children of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra (and siblings of the three princesses from grave one) compared to the alternative
hypothesis that these samples are individuals completely unrelated to the Romanov family (H2), we found that the DNA evidence is 4.36
trillion times more likely if sample 147 is a daughter of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra, and over 80 trillion times more likely if sample 146.1 is a son of Tsar Nicholas II and
Tsarina Alexandra than if these samples were from two unrelated individuals.