técnicas de reproducción asistida en humanos · 2021. 2. 10. · proceso mecánico y enzimático....

Tema 7. Inseminación in vitro

Técnicas de Reproducción Asistida en Humanos

Dra. Virginia García-Láez Moreno

© Virginia García-Láez Moreno

A) Fecundación in vitro convencional (FIV)

B) Microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)

Inseminación in vitro

Coincubación de los gametos masculino y femenino en una placa de cultivo.

A) Fecundación in vitro convencional (FIV)

Indicaciones: No problemas de fertilidad mayores (Ej. Solo hay patología tubárica bilateral)

Sospecha de inmadurez ovocitaria (cultivo con CC ! MII)

Semen buena calidad ! capacitado con recuento y calidad óptima. Fresco o cong.


Ovocito permanece con CC

A) Fecundación in vitro convencional

❑ Seminograma ❑ Capacitación ❑ Nuevo seminograma (EMP/ml) ❑ Dilución de la muestra

de semen (mc con GLU) ❑ Recuento de

comprobación

Protocolo:

80.000 -100.000 EMP/mL Si >[ ] ! TPN



❑ Preparación de la placa de inseminación

Protocolo:

80.000 -100.000 EMP/mL

10 ml aceite

1h antes



❑ Inseminación de los ovocitos

❑ Decumulación para evaluar la fecundación

4h post-punción Coincubación 16-20 horas

Protocolo:

Reacción acrosómica


Reacción en cadena en el ovocito! Bloqueo de la polispermia Entrada de un único spz ¿Entra entero?

Hialuronidasa 80UI/ml

Pipeteo mecánico

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B) Microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)


B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)

Antecedentes del ICSI

1. Disección Parcial de la Zona Pelucida (PZD: Parcial Zona Dissection o Parcial Zona Drilling)

1989

Inseminación

Semen de mala calidad ! No FIV

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Antecedentes del ICSI

2. Inseminación bajo la Zona Pelúcida (SUZI: Sub-Zonal Insemination)

1991


Inseminación

Introducción de un espermatozoide dentro del ovocito


Inseminación

¿error o a conciencia?

DecumulaciónLiberar a los ovocitos de las CC que lo rodean.

Seleccionar los ovocitos en estadio MII para ICSI.

A las 4h post punción ! ICSI 2 h ! vitrificación Hialuronidasa

80 UI/ml

Inseminación

Preparación de la placa (37ºC y 5.5% CO2)

Añadir 50 µl

Proceso mecánico y enzimático.

Aspirar y soltar los ovocitos repetidamente a través de la pipeta para que las células de la granulosa de alrededor se suelten.

Usamos pipeta pasteur estirada o micropipeta de 100 µl.

Pasamos por las 3 gotas NO >1 minuto en la hialuronidasa. (daño y activación del ovocito)

Decumulación más fina con pipeta pasteur más estirada o punta de stripper

Inseminación

Decumulación

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Inseminación

Estadios de maduración de los ovocitos

Ovocitos latentes en Profase I o VG Pico de LH: reanuda la meiosis ! MII Ovulación Entrada del espermatozoide Activación del ovocito (Ca intracel) Reactivación del ciclo celular para terminar la meiosis Extruye el 2do CP Continuar con los siguientes ciclos de división celular.

Ovocito MII

Ovocito MI

Ovocito VG

Ciclo de maduración de los ovocitos

Inseminación

Zigoto Mitosis

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Clasificación de los ovocitos

¿¿Ovocito MII??

Inseminación

Indicaciones.

Factor masculino grave (OAT)

Azoospermia (BT o AE)

Mala recuperación del semen tras capacitación (No IA o FIV)

Aglutinación de spz por causa inmunitaria

Sémenes valiosos (no desperdiciar)

Fallo de gestación tras IA (½ FIV y ½ ICSI)

Fallo de fecundación en FIV


Inseminación

Indicaciones Diagnóstico preimplantacional (no spz pegados) Congelación y descongelación de ovocitos ! Decumulados

Ovocitos MIV

Esterilidad de origen desconocido

Mala calidad ovocitaria

Pocos ovocitos

Edad materna avanzada

¿¿¿ICSI de rutina???


No arriesgar

Inseminación

1. Preparación de la placa de ICSI


10 ml

(Polivinil Pirrolidona)

Inseminación

ProtocoloDía anterior o en el momento

2. Colocación de las pipetas de microinyección ! Holding e ICSI


40x

Inseminación


Microinyectores ! Subir y bajar medio Micromanipuladores ! Desplazarnos en las direcciones de los ejes x-, y-, z-

Inseminación

3. Selección del espermatozoide


40x Spz+PVP ! ralentizar movimiento Mejor morfología y movilidad Desestabilizar la cola

Inseminación

3. Selección del espermatozoide


Lavado del spz en PVP solo Introducción en pipeta por la cola

Inseminación

4. Microinyección del espermatozoide


1er CP lejos de la zona de inyección (12 horarias) ! no dañar huso meiótico Rotura de ZP ! presión Rotura de mb plasmática ! presión o aspirado Depositar el spz + citoplasma aspirado Retirada lenta

Inseminación

Inseminación y Decumulación


Spz en zona 3 Si viscoso o succión ! zona 4

¿Anotación o pérdida de tiempo?

POLSCOPE


Birrefringencia de estructuras organizadas

Microscopio con luz polarizada

1. Indicador de la calidad de los ovocitos ! visualizar presencia del huso meiótico ! Comprobar MII

2. Indicador de la posición del huso ! ayuda a la microinyección

Muy útil en ovocitos congelados ! movimiento.

Inseminación

Dismorfismos ovocitarios

35%Ovocito: 110-115 micras, esférico

Mb pl (oolema) turgente

Citoplasma (Mit, REL, Ap Golgi) homogéneo

ZP: 15-20 micras, esférica

EP mínimo

CP único, aplanado y homogéneo.

Inseminación

Dismorfismos ovocitarios

¿¿¿Las anomalías morfológicas de los

ovocitos pueden afectar a la calidad de

los ovocitos y a las tasas de reproducción

asistida???

Inseminación

¿Anotación o pérdida de tiempo?

Tipos de ruptura de la membrana plasmática

Tipo SS (Sin Salto)

Tipo A1

Tipo A2

Tipo A3

Tipo Stirring


¿Anotación o

pérdida de tiempo?

Inseminación

Se pasan los ovocitos desde la placa de ICSI a una placa con medio de cultivo de crecimiento.

Incubador a 37ºC y 5%CO2.

Al día siguiente se evalúa la fecundación.


Inseminación

Patologías del semen

Bajo nº de EMP ! problema de movilidad

Pentoxifilina Activa las mitocondrias del spz Solución salina isotónica + Pentoxifilina + m.cultivo ! Concentración de 50 mg/mL

Se le añade a la gota con spz sin PVP Gota más grade y más aplanada


Inseminación

Patologías del semen

Ningún spz móvil ¿Astenozoospermia total o Necrozoospermia?

Solución hipoosmótica (Evaluación de la vitalidad) Suero salino (300 mOsm) y agua tetradestilada. Proporción 1:1 ! concentración de 150 mOsm. Los spz vivos ! permeabilidad de mb Incorporan solución en la cola y se enrolla. Incorporan solución en cabeza y se hinchan.


Inseminación

FIN !!!

Gracias por su atención

Inseminación

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