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Taller de entrenamiento internacional

en la micropropagación in vitro de diferentes

especies vegetales

Memoria

* Colaboradores: Pablo E. Machado, Jorge L. Montes de Oca, Mayra Jiménez, Pablo E. Machado, Zenaida Occeguera, Aydiloide Bernal, Odalis Nodarse, Ignacio Santana, Carlos F. Reyes, Mercedes Capote, Elva R. Carmona, Carlos Sayas, Yenima Pellón y Odamis Dihigo.

Leidy Cortegaza Ávila*

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Taller de entrenamiento internacional en la micropropagación in vitro de diferentes especies vegetales

La biotecnología aplicada a la agricultura

La micropropagación in vitro (en condiciones de laboratorio) es prácticamente una multiplicación masiva, ya que el cultivo de tejidos consiste en cultivar asépticamente diferentes explantes constituidos por fracciones de un tejido u órgano que se extrae de la planta.

Estas técnicas revisten gran importancia, puesto que permiten producir material de siembra libre de plagas y enfermedades, asegurándose la calidad fi tosanitaria de la semilla, además facilita el transporte e intercambio internacional de variedades.

El cultivo de meristemos es muy útil en el almacenamiento prolongado de germoplasma, mediante las técnicas de preservación lo cual nos permite un ahorro considerable de área y una mayor seguridad ante desastres naturales.

Las plantas propagadas in vitro presentan un mayor crecimiento y vigor, reportándose incrementos de los rendimientos en más del 20%.

Otro factor de mucha importancia es el alto coefi ciente de multiplicación que se alcanza con esta técnica, lográndose obtener miles de plantas en solo varios meses.

Por todo lo anteriormente expuesto podemos plantear la gran importancia que reviste este método para la producción de semillas de alta calidad en nuestro país.

Para lograr este objetivo es necesario crear instalaciones dotadas de todas las condiciones requeridas, tanto desde el punto de vista constructivo como del equipamiento.

A estos laboratorios le llamamos biofábricas. En estos instructivos técnicos se detallarán las distintas etapas de trabajo en el proceso de la micropropagación in vitro.

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Fundación Produce Sinaloa, A.C. Taller de entrenamiento internacional en la micropropagación in vitro de diferentes especies vegetales

Para que el medio tenga la calidad adecuada hay que tener en cuenta varios factores que son

•Calidad del agua.•Calidad de los reactivos y componentes.•Correcta preparación de las soluciones madres.•Ajuste de pH.•Óptima esterilización de los medios de cultivo, esterilización aecuada de cristalería, ropa e instrumental necesario.

•El agua que se utiliza para la preparación de las soluciones madres y los medios de cultivo debe ser un agua de óptima calidad, desionizada o bidestilada. Debe ser un líquido transparente, inodoro, incoloro e insípido.

Su pH a 20 °C.............. 5 a 7 Conductividad............... < 2 µS/cm3 (microsiemens por centímetro

cúbico).

Este tipo de agua no debe ser almacenada por más de tres días ni guardada en frascos de cristal porque absorbe iones.

La utilización de agua de mala calidad trae por consecuencia graves problemas en el crecimiento y desarrollo del material vegetal.

Calidad de los reactivos y componentesLos reactivos químicamente puros o comerciales que se utilizan deben encontrarse en buen estado físico, es decir, que no estén hidratados ni vencidos y que tengan su color característico.

Algunos de los reactivos deben ser conservados en congelación como son: la tiamina, ácido indol acético y la kinetina. El resto de los reactivos se almacenan a temperatura ambiente.

En el laboratorio se deben tener solamente los productos de uso diario y las grandes cantidades guardadas en un almacén con las adecuadas condiciones de sequedad y ventilación.

Los explosivos como el nitrato de amonio, el nitrato de potasio, deben almacenarse de acuerdo a sus requerimientos.

Los componentes del medio de cultivo se pueden clasifi car en•Sales inorgánicas.•Compuestos orgánicos.•Complejos naturales.•Materiales inertes de soportes.

Sales inorgánicasSon las formuladas por Murashige y Skoog (1962).•Nitrato de amonio (NH4NO3)•Nitrato de potasio (KNO3)•Sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O)•Fosfato de potasio dibásico (KH2PO4)•Ácido bórico (H3BO3)•Sulfato de manganeso (MnSO4.4H2O)•Sulfato de zinc (ZnSO4.4H2O)

Debido a las condiciones de esterilidad que requiere el proceso de la micropropagación vegetativa, este departamento es de vital importancia pues es el que le garantiza al área aséptica todo el medio de cultivo, instrumental, ropa y recipientes necesarios para poder llevar el cultivo in vitro con óptimas condiciones de limpieza.

La esterilización es de fundamental importancia porque todos los medios empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas bacterias y hongos.

El crecimiento abundante de ellos destruye o retarda el desarrollo de los tejidos vegetativos; aun los contaminantes con crecimiento lento son indeseables, pues pueden producir toxinas que afectan el crecimiento de las células vegetales.

Este departamento requiere de cristalería y equipos fundamentales para la producción de medio de cultivo, como son:

Equipos•Balanza analítica con precisión de 0.001.•Balanza técnica monoplato o biplato de 0 a 1500 gramos.•pH metro.•Autoclaves.•Estufas.•Refrigerador.•Destilador.•Desionizador-agitador magnético. •Plancha magnética con calentamiento o fogón de gas u hornilla

eléctrica. •Dosifi cador automático.•Conductímetro.

Cristaleria y útiles•Pipetas graduadas de 1.5 y 25 mL (mililitros).•Probetas volumétricas de 10 mL a 2 l.•Matraces volumétricas de 100 mL a 2 l.•Vasos de precipitados de 50 mL a 5 l.•Tubos de ensayo con tapones.•Frascos para guardar soluciones.•Pomos de conservas con tapas.•Embudos-morteros.•Frascos lavadores.•Jeringuillas meringer de 5 a 10 mL-espátulas.•Tanques plásticos con tapas de 50 l a 100 l-tamboras.•Cánulas de acero inoxidables para esterilización.

Medios de cultivoEl éxito que se obtenga en la micropropagación depende en gran medida del uso del medio nutritivo y de su calidad.

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•Molibdato de sodio (Na2Mo.2H2O)•Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O)•Cloruro de cobalto (CoCl2.6H2O)•Cloruro de calcio (CaCl2)

Continuación de sales inorgánicas•Ácido etilen-diamino-tetra-acético (sal sódica) (Na2EDTA)•Sulfato ferroso (FeSo4.7H2O)

La fórmula de Murashige se empleará como ejemplo para los propósitos de la micropropagación pues se ha demostrado que es el medio adecuado para una gran variedad de especies.

Esta fórmula contiene grandes cantidades de macronutrientes, también contiene una alta concentración de nitrógeno en forma de nitrato de amonio.

Compuestos orgánicosEstos podemos clasifi carlos en cuatro grupos:

1.Carbohidratos.2.Sustancias hormonales.3.Vitaminas.4.Otros compuestos orgánicos.

La sacarosa es la fuente de carbono más ampliamente usada, y se emplea en una concentración del 3 a 4.5 %.

En nuestro caso se utiliza azúcar blanco refi no de clase A en lugar de sacarosa.

Las sustancias hormonales son las auxinas y las citoquininas. Dentro de las auxinas se encuentran el ácido indol 3 acético (AIA), el ácido indol 3 butírico (AIB) y el ácido naftalenacético (ANA).

En el grupo de las citoquininas están el 6 bencil amino purina (6 BAP) y la N 6 furfuril amino purina (kinetina).

Las sustancias hormonales son básicas para todos los procesos de desarrollo de las vitaminas y es útil saber que las auxinas son particularmente importantes para estimular el crecimiento de los brotes foliares y radiculares; las citoquininas para promover la formación de brotes.

La única vitamina que ha demostrado tener importancia en la micropropagación es la tiamina que estimula los procesos de crecimiento.

Entre los exitoles, el inositol tiene un efecto estimulante muy signifi cativo.

Complejos naturalesMuchas sustancias de composición indefi nida como el agua de coco han sido utilizadas para enriquecer el medio de cultivo, se debe a que tiene estimulantes del crecimiento y otras sustancias aún desconocidas.

Materiales inertes de soportesEl agar es el material de soporte más ampliamente usado en el cultivo de tejidos, pues provee al medio de un excelente gel húmedo que sirve como soporte al inóculo y además es inerte.

La cantidad a utilizar estará en dependencia de la calidad y tipo de agar disponible. Para el agar técnico 1, 2, 3 o 4 se pesarán de 6 a 8 g/L del medio de cultivo.

Siempre que se utiliza un agar nuevo es necesario hacer pruebas para determinar la cantidad y ver la consistencia del medio después de esterilizado.

Las cantidades mencionadas son para medios de cultivo que se esterilizan durante 15 minutos a una presión de 1.1 atmósferas ya que a medida que aumenta la presión hay que aumentar la cantidad de agar por litro porque el sobrecalentamiento reduce la calidad gelifi cante del agar.

Cuando se usa medio líquido en el caso de tubos de ensayo para establecimiento, el papel de fi ltro empleado como puente o plataforma ha dado muy buenos resultados.

Otros gelifi cantes que pueden ser utilizados en medios de cultivo sólidos son las mezclas de agar con almidón y de agar con maicena.

La cantidad a utilizar de almidón y maicena dependerán del tipo de agar, maicena, almidón y el tipo de recipiente a utilizar.

El procedimiento para el cocinado del medio con estas mezclas así como la elaboración del almidón de yuca se anexan en este instructivo.

Preparación correcta de las soluciones madre•Tomar un balón aforado de 500 mL y colocar de 100 a 200 mL de agua

desionizada o bidestilada.•Depositar dentro del balón un imán y colocar el recipiente sobre

un agitador magnético. Si no se dispone de este equipo los reactivos se disuelven en un beaker con agitador de cristal.

•Añadir al balón los componentes indicados en las fórmulas de las soluciones madre correspondientes.

•Solución de macroelementos.•Solución de microelementos.•Después de agregar cada sal agitar y esperar que se diluya

completamente antes de agregar el siguiente producto, con el fi n de evitar la producción de precipitados dentro del balón.

•Sacar el imán y enjuagarlo bien dentro del balón con agua desionizada o bidestilada.

•Aforar con frasco lavador que contenga agua desionizada o bidestilada.•Colocar el imán de nuevo en el balón y agitar para lograr una buena

homogeneidad dentro del balón.•Colocar el contenido del balón en un recipiente (frasco con tapa) con

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su respectiva identifi cación: fecha de preparación, nombre de la solución, nombre de la persona y cantidad a utilizar por litro de medio.

•Guardar en frío.

Las soluciones madres de sales pueden guardarse en refrigerador hasta un mes

•Nitrato de amonio....................................... 66 gramos •Nitrato de potasio...................................... 76.0 gramos •Sulfato de magnesio heptahidratado..................... 14.8 gramos •Fosfato de potasio...................................... 6.8 gramos

•Ácido bórico............................................................ 6.2 gramos •Sulfato de manganeso tetrahidratado.................... 22.3 gramos •Sulfato de manganeso monohidratado pesar….16.0 gramos •Sulfato de zinc tetrahidratado.................................. 8.6 gramos •Sulfato de zinc monohidratado pesar.......……...10.5 gramos •Molibdato de sodio dihidratado ......................... 0.25 gramos •Sulfato de cobre pentahidratado ...................... 0.025 gramos •Cloruro de cobalto hexahidratado ...................... 0.025 gramos •Disolver en el orden en que se encuentran y guardar en frío.

•Ioduro de potasio ..................................... 0.83 gramos •Disolver con agua desionizada o bidestilada y enrasar en matraz

aforado y guardar en frío.

•Cloruro de calcio bihidratado ........................... 150 gramos •Si se usa cloruro de calcio anhidro pesar 113 gramos.•Enrasar, rotular y guardar en frasco plástico en congelación.

•Na EDTA ............................................... 3.73 gramos •Sulfato ferroso heptahidratado ........................ 2.78 gramos •Se coloca 1 litro de agua desionizada o bidestilada a calentar hasta

ebullición. •Se divide el agua a la mitad y se disuelve por separado cada uno. •Luego se mezcla el Fe (hierro) sobre el EDTA. Nunca a la inversa.

Primero aparece un color verde muy claro y luego se pone amarillo.•Enrasar, rotular en frasco ámbar y guardar en frío.

•Para preparar ........l00 mL ...... 500 mL ...... 1 L •AIB .................. 0.01 gramos ...... 0.05 gramos ...... 0.1 g•Alcohol .................. 3.0 mL ...... 15.0 mL ..... 30 mL

•Se disuelve en alcohol caliente y enrasar con agua desionizada o bidestilada en matraz aforado, guardar en frasco ámbar en frío por un espacio de tiempo no mayor de siete días.

•Para preparar ............ 500 mL ...................... 1 L•AIA ...................... 0.25 gramos ...................... 0.5 gramos •Alcohol .................. 15 mL ...................... 30 mL•Disolver en alcohol caliente y enrasar con agua desionizada o

bidestilada en matraz aforado, guardar en frasco ámbar en frío, por un espacio de tiempo no mayor de siete días.

•6 BAP ................................................... 0.5 gramos •HCl 0.5 N .............................................. 30 mL•Disolver en ácido clorhídrico caliente y enrasar con agua desionizada

o bidestilada en matraz aforado, guardar en frasco ámbar en frío, por un espacio de tiempo no mayor de siete días.

•Tiamina ................................................. 0.5 gramos •Disolver con agua desionizada o bidestilada, enrasar en matraz

aforado, rotular, guardar en frasco plástico en congelación. •Si no se tiene el reactivo se pueden utilizar tabletas de vitaminas B1

teniendo en cuenta que cada una aporta 50 mg de tiamina, la tableta se macera en mortero, se disuelve en agua desionizada o bidestilada y luego se fi ltra, se enrasa y guarda igual a la tiamina.

•Todas las soluciones madre acabadas de preparar tienen que alcanzar la temperatura ambiente para poder ser utilizadas.

Indicaciones para preparar 1 L de medio de cultivo:1.Tomar un beaker de 500 mL.2.Agregar 25 mL de agua desionizada o bidestilada y un imán.3.Agregar cada uno de los siguientes compuestos, agitando la mezcla:

a.Macroelementos.b.Microelementos.c.Cloruro de Calcio CaCl2d.Ioduro de Potasio KIe.EDTA-Fef.Tiamina.g.Hormonas.h.Azúcar.

4.Sacar el imán y enjuagarlo bien dentro del beaker (si no se dispone de agitador magnético, agitar con uno de cristal).

5.Enrasar con agua desionizada o bidestilada.6.Ajustar el pH (acidez).7.Poner a calentar, y cuando esté caliente añadir poco a poco el agar

hasta que esté disuelto (medios sólidos). Esto se hace en una plancha

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magnética con calentamiento o en fogón de gas u hornilla eléctrica.8.Distribuir la cantidad de medios requeridos por frasco de cultivo.

Esto se hace con una dosifi cadora automática, jeringuilla Meninger o simplemente con beaker de 50 mL o más pequeños.

9.Esterilizar el medio en la autoclave 15 minutos a 121 °C (grados centígrados) y 1.1 atmósferas.

10.Cuando se emplean medios de cultivo líquidos se reducirá el contenido de sales en la misma proporción que el líquido se pierda en forma de vapor, este valor estará en dependencia del tipo de autoclave variando entre 10 y 30 %.

11.En el medio de enraizamiento sólido no se le adiciona el 6 BAP y se emplean 10.00 mL de AIA por litro de medio de cultivo.

Otros medios que se elaboran son el agar nutriente y el agar papa, utilizados para conocer los microorganismos que se encuentran en el ambiente del área aséptica.

Los medios de cultivo se almacenan en locales que se encuentran dentro del área aséptica, a temperatura ambiente o en refrigeración y no deben permanecer más de cinco días almacenados, tres para detectar cualquier contaminación y el resto para prepararlo para su uso.

El pH metro debe ser ajustado por las soluciones buffer y luego ajustar el pH al medio con soluciones de KOH 0.1 N y HCL 0.5 N.

El pH se medirá después de enrazar el medio de cultivo y se ajustará de tal manera que después de autoclaveado el medio sea 5.8 ± 0.1 para un buen desarrollo de las plantas.

Optima esterilización de los medios de cultivo, cristalerita, ropa e instrumental

La esterilización por autoclave es la más conveniente para los medios de cultivo, pero debe evitarse la sobreesterilización, porque altera mucho los componentes nutritivos del medio, inclusive algunos que no están incluidos como termolábiles1.

Los calentamientos prolongados inactivan los factores de crecimiento, degradan azúcares, aminoácidos, reducen la calidad gelifi cante del agar y disminuye el volumen fi nal de los medios líquidos en pomos.

La cristalería, como las placas Petri, pomos y tubos vacíos, se esterilizan en horno o estufa a 160 °C por dos horas.

Este material debe ponerse dentro de tamboras o envuelto en papel de Aluminio. La placa petry puede ser sustituida por platos de aluminio. Estos se esterilizarán en estufa durante 120 minutos y a 160 °C y se secarán a 100 °C durante 30 minutos. Para ello se pondrán en tamboras.

La ropa, el agua para el laminar, tapas y tapones se esterilizan en autoclaves durante 40 minutos y a 1.5 atmósferas de presión y se seca en 1 Termolábil: que se altera fácilmente por la acción del calor.

estufa a 100 °C durante un tiempo de 30 a 45 minutos. Los materiales contaminados se esterilizan en autoclave durante 60

minutos y a 1.5 atmósferas de presión.

Los instrumentos como pinzas, tijeras, bisturís, etc. se esterilizan en horno o estufa igual a las placas Petri, pero introduciéndolas dentro de cajas metálicas o envolviéndolas en papel de estaño.

Si no se dispone de estos envases, también se pueden envolver en papel estraza y esterilizarlos en autoclaves igual que la ropa.

El instrumental también puede ser esterilizado por medio de frecuentes inmersiones en alcohol seguidas por fl ameos o fl amearlos en una bandeja, o sumergiéndolos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos antes de comenzar la jornada y durante tres minutos en el manejo sucesivo a través de la jornada.

Implantación de ápices caulinaresEsta implantación se realiza en cuatro etapas fundamentales:

1.Selección de plantas madres o plus de las cuales se obtendrán los hijos para la multiplicación

2.Siembra en cámaras de CRAS de las porciones del chopo. 3.Desinfección de los ápices caulinares4.Llevar a cabo la siembra de los ápices caulinares en los medios de

cultivo apropiados.

La selección de las plantas madres debe realizarse en bancos de semillas categorizadas, concebidas para ello, o en el peor de los casos en plantaciones de producción, debe hacerla un personal califi cado y con experiencia de trabajo en el plátano capaz de diferenciar fácilmente una variedad de otra.

Esta selección se hace basándose principalmente en las características fenotípicas de cada clon o variedad, deben escogerse plantas que tengan racimos para seleccionar de ellas las de mayores producciones, también debe observarse el estado fi tosanitario de las plantas tratando de no llevar plantas enfermas.

Con todos los requisitos anteriores dispondremos de un material listo para comenzar la multiplicación sin riesgo alguno.

El chopo obtenido en el campo será plantado en cámaras de CRAS que contengan un sustrato previamente desinfectado con solución de formol compuesto por 50% de suelo, 25% arena y 25% de materia orgánica, esto se realizará limpiando el chopo de restos de tierra y realizando el mondado del mismo, seccionando en forma de cuñas que se desinfectarán en una solución fungicida, sembrándose posteriormente a una distancia de 20 x 20 cm, permaneciendo en esta fase entre 45 y 60 días dependiendo de la época del año en que se realiza la siembra.

El tamaño óptimo de los hijos debe ser entre 25 y 60 cm de altura, procurando que al momento de extraerlos de la planta se estropeen lo menos posible, evitando así penetración de agentes patógenos al interior del cormo.

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Luego de transportadas al laboratorio se le realiza a los cormos el primer mondado y rebajado, hasta dejarlos con un tamaño aproximado a 2.5 cm de base y 5 cm de largo; esto debe realizarse en un lugar apropiado para eliminar todos los restos y tratar de acercar lo menos posible ese material sucio a la biofábrica.

Mientras más rápido se realice todo el proceso de siembra menos riesgo de contaminación se corre, ya que se ha demostrado que la contaminación y el tiempo que tengan de sacados los hijos es directamente proporcional. Debe ser antes de las 24 horas.

Después de este paso estaría listo el material vegetativo para comenzar la desinfección, para ello tendremos que disponer primeramente de una serie de materiales como son:

1.Detergente.2.Hipoclorito de sodio previamente valorado.3.Agua estéril.4.Pomos con tapas estériles (vacíos).5.Probetas para la preparación de las soluciones.6.Cuchillos estériles.7.Recipientes apropiados para la desinfección (beaker de 5 litros o

cubos plásticos).8.Cepillos de cerdas plásticas fi nas.

Usualmente antes de poner en contacto el material vegetativo con el agente desinfectante, es necesario lavar bien con detergente para eliminar toda la suciedad que trae y además para que actúe como agente humectante.

Luego realizamos la primera desinfección con hipoclorito al 3%, durante 20 minutos, esta asegura trabajar con un material mucho más limpio.

Terminado el tiempo se desecha el hipoclorito y se comienza el rebajado de toda la parte afectada por el cloro, hasta un tamaño de 1.5 cm de base y 3 cm de largo.

A medida que se rebajan los ápices caulinares estos se introducen en los pomos estériles con agua esterilizada. En cada pomo la cantidad de ápices no excederá de la mitad del envase. Todo el trabajo posterior se realiza en el área estéril.

Se lavan o enjuagan varias veces los pomos con los ápices, para eliminar suciedad y la fenolización, esto se realiza con agua esterilizada.

Se prepara el hipoclorito con agua estéril al 3% y se comienza una segunda desinfección por espacio de 20 minutos. Es necesario que la cantidad de hipoclorito sea de dos a tres veces mayor que la cantidad de ápices, para que exista sufi ciente sustancia activa capaz de reaccionar con la superfi cie del vegetal.

Dentro del fl ujo laminar se elimina el cloro y se realizan tres enjuagues con agua estéril a los ápices, dejándolos siempre sin agua. En este momento están listos para comenzar la siembra.

Los medios de cultivo serán líquidos, en tubos de ensayo y con soporte de papel de fi ltro. Estos tubos deben tener como diámetro 25 mm y 10 mL de medio.

La siembra se realiza haciendo cortes con el escalpelo o bisturí hasta

dejar el ápice con 0.5 de base y 1 cm de largo, decapitando a 2 mm sobre la base de las hojas, para facilitar su rápido crecimiento, tratando que esté sumergido parcialmente hasta la mitad, en el medio de cultivo, para que siempre exista el contacto entre ambos.

Los tubos de ensayo son colocados en las cámaras y se observará su desarrollo, haciendo análisis alrededor de los 6 o 7 días de realizada la siembra, para ver la contaminación.

Al cabo de 21 a 30 días estarán listos para realizar su primer pase al medio de multiplicación o ahijamiento.

Con estos subcultivos se repican o seccionan los explantes para obtener una alta proliferación de los mismos, estos se realizan en el área aséptica y en el fl ujo laminar con medios de cultivos sólidos.

Del primero al onceno pase de ahijamiento se debe usar medio de cultivo cuyo gelifi cante sea agar.

En esta etapa los explantes deben ser decapitados a una altura entre 7 y 10 mm y subdivididos en dos o más partes en dependencia de su grosor y vigor, estos se introducirán a una profundidad no mayor de 2 mm.

En el pase número 12 se debe usar medios de cultivo cuyo gelifi cante sea una mezcla de agar con maicena o almidón.

Aquí se decapitan los explantes a una altura de 10 a 12 mm y separar entre sí los vástagos sin realizar seccionado.

Es importante tener en cuenta que los vástagos con tamaños entre 1 y 3 cm se decapiten y se coloquen separados en el medio fresco, mientras que los de tamaño menor que 1 cm no se separan entre sí ni se decapitan y colocándose en grupos de a dos en medio fresco.

De acuerdo al tipo de pomo, se colocará la cantidad de explantes adecuada y estos se sembrarán equidistantes entre sí.

Cada subcultivo de ahijamiento tendrá una duración de 21 días y nunca pasará de 30 días, ya que se afecta el manejo del material en el próximo subcultivo, porque aparecen raíces y se pierde la visibilidad del medio de cultivo para detectar cualquier contaminación.

En esta etapa se colocan los explantes en medios de enraizamiento sólidos y líquidos para lograr la formación de raíces.

Los vástagos a utilizar para el enraizamiento líquido son aquellos que tienen una altura mayor a 2.5 cm y más de dos o más hojas formadas y este material seria de un 20 a 30% del total.

El resto de los vástagos se separan sin ser decapitados y se sitúan en medios de cultivos sólidos. Los menores de 1 cm no se separan entre sí, colocándose en grupos de dos a tres en un medio fresco.

Se trata que los explantes queden agrupados en los pomos según el tamaño, logrando una uniformidad del material por su tamaño.

•La limpieza en el área aséptica se realiza diariamente con solución de hipoclorito de sodio a 30 ppm (partes por millón), limpiando todas las

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superfi cies horizontales, rincones, debajo de los laminares etc. •Se hará una limpieza semanal del piso, paredes, estantes vacíos u

otras superfi cies horizontales con abundante agua y detergente. Luego se enjuagaran con solución de hipoclorito de sodio a 30 ppm.

•Además, se limpian los fi ltros de aires acondicionados y consolas. La luz ultravioleta se usará en los cuartos de siembra, fl ujos laminares y almacenes de medios, encendiéndola 15 minutos antes de comenzar a trabajar y 15 minutos a mitad de la jornada.

•Cuando se hace la limpieza general se enciende durante una hora; el personal entrará a los locales después de transcurridos 10 minutos.

•Se evitará exceso de agua cuando exista una humedad relativa alta. •Cuando existan problemas de contaminación ambiental detectados

en el control ambiental microbiológico se realizará una buena desinfección con permanganato de potasio y formol.

•El permanganato de potasio al 100% debe emplearse en dosis de 1.4 g/m3 y el formol al 40% (12.5 mL/m3). Para determinar la cantidad de ambos a utilizar por locales estos deben medirse para calcular el área. Este debe estar puesto como mínimo 18 horas después de haber realizado una buena limpieza y cuando se retire, encender los aires acondicionados en baja, de 8 a 10 horas antes de comenzar a trabajar los técnicos, y se deberá usar una careta antigas; dicha desinfección no es recomendable aplicarla en las cámaras de luz, por el efecto tóxico que puede producir sobre los explantes.

•El control ambiental se realiza colocando las placas Petri o frascos que contienen agar nutriente o agar papa previamente esterilizados, dos dentro del fl ujo laminar en la izquierda y derecha del mismo y encima de otras superfi cies que se quieran analizar. Estas pruebas deben exponerse durante 10 minutos destapadas y se marcan con la posición que ocupaban, semanalmente se le realizará una prueba al aire emitido por el fl ujo laminar.

•Al cabo de cuatro o cinco días se cuentan las colonias de hongos o bacterias que se encontraron. Es normal el crecimiento de una o dos colonias en alguno de los frascos puestos dentro de los fl ujos y de 1 a 20 colonias fuera de este. Cuando sea mayor esta cantidad se repite la desinfección tal y como se explicó anteriormente.

•Para la desinfección con hipoclorito de sodio se tendrán en cuenta los siguientes aspectos:

•El instrumental a utilizar se desinfecta con hipoclorito de sodio al 1% y durante un tiempo mayor de cinco minutos.•La primera limpieza que se realiza en el fl ujo antes de comenzar a trabajar se hace con hipoclorito al 0.1%. •Las limpiezas restantes, así como la desinfección de todos los pomos y manos de las operadoras se realiza con hipoclorito al 0.01%. •La manipulación durante el trabajo se hará lo más cerca posible al fi ltro del equipo.

•El vestuario debe ser batas o pijamas de cirujano, previamente esterilizados, así como los tapabocas y gorros.

•El calzado debe permitir el lavado y la desinfección.

•Los instrumentos de limpieza beben ser usados solo dentro del área aséptica.

•Extraer diariamente los materiales contaminados y materiales de desecho.

•Hacer un uso adecuado de las puertas.

Adaptación 60 días

Comercializar

Total de t a partir del primer meristemo aprox. 204 días aprox. 7 meses.

Para 2 millones al año 166.66 plantas ↓

326 meristemos ↓

14 meristemos ↓

Implantar 20 plantas/día para evitar pérdidas

1 2Meristemo → 1 planta→2→ 10 →25 (x 2.5)

3 ↓21 días 62.5 4

↓ SIT 812x13

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Cuadro1. Medio de establecimiento de plátano.Componentes UM 1 litro 2 litros 3 litros 4 litros 5 litros

Macro mL 25 50 75 100 125

Micro mL 1 2 3 4 5

CaCl2 mL 2.9 5.8 8.7 11.6 14.5

KI mL 1 2 3 4 5

EDTA mL 10 20 30 40 50

Tiamina mL 2 4 6 8 10

AIB mL 0.23 0.46 0.69 0.92 1.15

6BAP mL 4 8 12 16 20

Ácido cítrico gramos 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Sacarosa gramos 30 60 90 120 150

Vitrofural gramos 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8

Cuadro 2. Medio de multiplicación de plátano (A4+0.65).Componentes UM 1 litro 5 litros 10 litros 15 litros

Macro mL 25 125 250 375

Micro mL 1 5 10 15

CaCl2 mL 2.9 14.5 29 43.5

KI mL 1 5 10 15

EDTA mL 10 50 100 150

Tiamina mL 2 10 20 30

6BAP mL 8 40 80 120

AIA mL 5 25 50 75

Ácido cítrico gramos 0.05 0.25 0.5 0.75

Sacarosa gramos 30 150 300 450

Agar E gramos 3.5 17.5 35 52.5

Vitrofural gramos 0.1 0.5 1 1.5

pH 5.8 5.8 5.8 5.8

Cuadro 3. Medio de enraizamiento de plátano.Componentes UM 1 litro 5 litros 10 litros 15 litros

Macro mL 25 125 250 375

Micro mL 1 5 10 15

CaCl2 mL 2.9 14.5 29 43.5

KI mL 1 5 10 15

EDTA mL 10 50 100 150

Tiamina mL 2 10 20 30

AIA mL 5 25 50 75

Ácido cítrico gramos 0.05 0.25 0.5 0.75

Sacarosa gramos 40 200 400 600

Agar E gramos 3.5 17.5 35 52.5

Vitrofural gramos 0.1 0.5 1 1.5

pH 5.8 5.8 5.8 5.8

Fase ILa semilla de papa se lava bien con agua común y se pone a pregerminar durante 21 horas en la oscuridad, los brotes germinados se ponen en una solución de alcohol al 70% de alcohol durante 1-3 minutos, retira el alcohol y deja que se evapore por unos minutos, después se le agrega la solución de hipoclorito al 2% durante 20 minutos, se lleva a la cámara y se enjuaga tres veces con agua destilada estéril.

En condiciones asépticas bajo cabina de fl ujo laminar se van quitando las hojas que envuelven al meristemo hasta llegar a la zona de tejido más joven, obteniéndose un explante de un tamaño entre 0.3 y 0.5 cm, que incluye el meristemo apical y varios primordios de hojas.

Luego son inoculados en tubos de ensayo de 14.5 cm x 2.5 cm conteniendo el medio de establecimiento con un volumen de 10 mL, luego son colocados en condiciones de iluminación (1500-2000 lux).

La regeneración de plantas se observa como promedio al cabo de las dos semanas de cultivo. Estas plantas son subcultivadas en un medio de multiplicación.

Establecimiento de líneasLas plantas regeneradas de los ápices son multiplicadas durante dos subcultivos en medio de ahijamiento para establecer líneas a partir de cada una de ellos.

Cada tubo de ensayo y frasco llevará su identifi cación con el código de la variedad, el número de la línea y la fecha de subcultivo.

Desde este momento se comenzará a llevar el registro del comportamiento in vitro de cada una de las líneas en un expediente que

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incluye: origen del material donante, edad, condiciones fi tosanitarias y estado fi siológico de las plantas, fecha de establecimiento, coefi ciente de multiplicación, número de explantes en cada subcultivo, diagnóstico serológico y detección de contaminantes microbianos.

DiagnósticoEn esta etapa se enviarán las muestras de cada línea a los laboratorios acreditados para realizar el diagnóstico fi nal y certifi car el estado sanitario para las principales enfermedades que establece la norma mexicana para la producción de semilla categorizada (material prenuclear), los resultados del diagnóstico se entregarán por parte del laboratorio acreditado el cual se añadirá al expediente de las líneas.

Detección de contaminantes microbianos.

Diariamente se revisará por observación visual todo el material vegetal y se desecharán los tubos o frascos que presenten contaminación.

Los datos de pérdidas por este concepto se registrarán en la documentación correspondiente.

Se utilizará el método de transferir secciones de explantes a medios de cultivo bacteriológicos.

En el primer subcultivo de multiplicación por cada línea se tomarán asépticamente de tres a cinco segmentos de 5 mm de largo de las hojas de las vitroplantas y se incubarán en placas de Petri con medio de cultivo bacteriológico (agar wilbrink, agar nutriente, agar triptona soya) a 35 °C de uno a cinco días y al cabo de ese tiempo se verifi cará la presencia de crecimiento bacteriano alrededor de los segmentos. Este procedimiento se repetirá también en el segundo subcultivo.

Las líneas que resulten positivas a este control se eliminarán del proceso y las negativas se reportarán como libres de contaminantes bacterianos endógenos detectables. Se emitirá un documento donde quede constancia del resultado.

Expediente maestroAl recibirse el material de propagación en las biofábricas deberá iniciarse un expediente por cada lote que refl ejará todas las operaciones que se realicen en el proceso de propagación in vitro y fase de adaptación, en el cual se incluirán los siguientes datos:

•Acta de resultado del diagnóstico.•Para cada subcultivo: fecha, existencias, coefi ciente de multiplicación,

porciento de pérdidas y sus causas, tipo de medio de cultivo, calidad del agua, pH antes y después de esterilizar.

•Acta de entrega de biofábrica a los productores.•Observaciones generales.

Fase II (multiplicación)El medio que se utilizará en esta etapa será el descrito en la Cuadro 4.

Durante los primeros cuatro subcultivos se utilizará el medio en estado semisólido para todo el material de propagación, pudiéndose emplear también otros gelifi cantes como el Phytagel o Agargel, con los cuales se logra un mayor coefi ciente de multiplicación y un mayor peso de los explantes, además de que facilitan la detección de la contaminación al tener el gel una mayor transparencia.

Las condiciones de cultivo en las cámaras para esta fase serán las siguientes: temperatura 18-22 °C, iluminación natural 2000-2500 luxes.

Durante esta fase las plantas no son muy exigentes a la iluminación, no así en la fase siguiente de enraizamiento, por tanto de existir diferencias en la iluminación dentro de las cámaras de crecimiento deben reservarse las zonas de mayor iluminación para el enraizamiento.

Se obtendrá un máximo de 10 mil plantas por cada explante inicial.

Fase III (enraizamiento)El medio de cultivo que se empleará en esta fase (Cuadro 4) se utilizará en estado. En los medios líquidos se dosifi cará 20 mL y se colocarán hasta 10 plantas por frasco.

Las plantas serán individualizadas al igual que en la fase de multiplicación. Las condiciones de cultivo son similares a la fase de ahijamiento: temperatura 18-22 °C, iluminación natural 2000-2500 lux, aunque como se señaló anteriormente en esta fase cumplir las exigencias de iluminación es de gran importancia en la calidad y supervivencia de las plantas cuando son llevadas al área de adaptación.

Esta fase tiene una duración promedio de dos semanas, las plantas deben tener una altura mayor de 5 cm y de cuatro a cinco hojas.

Se sacarán de los frascos, serán lavadas e individualizadas en el cuarto de muestras y luego se procederá a clasifi carlas por tamaño, un grupo de 5-7 cm de altura y el otro de mayores de 5 cm, con el objetivo de garantizar la uniformidad en el trasplante a la fase de adaptación

Cuadro 4. Composición de los medios de cultivo empleados en la micropropagación de la papa.

Componentes Medio de establecimiento

Medio de multiplicación

Medio de enraizamiento

Macronutrientes 25 mL 25 mL 25 mLMicronutrientes 1 mL 1 mL 1 mL

KI 1 mL 1 mL 1 mLCaCl2 2.9 mL 2.9 mL 2.9 mL

EDTA-Fe 10 mL 10 mL 10 mLMyoinositol 100 mg 100 mg --

Vitaminas de Heinz 10 mL -- --Ácido Giberélico 2ml 2ml -

Tiamina -- 2 mL --Sacarosa 20 gramos 20 gramos 30 o 40 gramos

Agar 3 gramos 6 gramos --pH 5.8 5.8 5.8

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•Todo el personal del área tiene que trabajar diariamente con ropa previamente esterilizada, incluyendo los tapabocas y gorros.

•El personal debe trabajar con calzado que permita su desinfección sistemática (al menos una vez por semana).

•Está prohibido que el personal del área aséptica permanezca con ropa estéril fuera de esta área.

•Prohibir la entrada de personal a las cámaras de crecimiento y cuartos de transferencia, sin la vestimenta adecuada (ropa y gorro).

•Limpiar diariamente todas las superfi cies del área con una solución desinfectante, por ejempolo: agua común e hipoclorito de sodio al 0.01%, incluyendo los estantes, cajas, paredes.

•Los instrumentos de limpieza del área aséptica, solo deben ser utilizados esta área.

•El personal que manipula los frascos de material o medios tiene que tener las manos limpias, con agua común y jabón o detergente, y debidamente desinfectadas con alcohol al 70%.

•Extraer diariamente del área estéril los frascos con medio y/o materiales, contaminados, así como los platos y frascos con residuos utilizados en el proceso de transferencia.

•Disponer que todas las cajas, depósitos, medios de transporte y otros que se emplean en el área estéril, sean solo de uso para esa área. En el caso que se introduzca del área no estéril, debe estar debidamente desinfectado.

•Todas las puertas que comunican al área estéril, los cuartos de siembra y las cámaras de crecimiento, deben permanecer cerradas.

•Revisar cada dos meses, el estado técnico de los techos, cristales, equipos de clima, conductos de aire, fi ltros de laminar.

•Siempre que se justifi que debe utilizarse un desinfectante ambiental.•Realizar semanalmente una limpieza general del área aséptica,

incluyendo los medios que se utilizan (cajas, mesas, etc.)•Si las vías de acceso para la introducción de medios de cultivo,

bandejas, etc. y la de extracción de frascos con medios y/o materiales contaminados, es la misma, se orienta que todas las introducciones se realicen al inicio de la jornada laboral de una sola vez y las extracciones se efectúen posteriormente a esto.

•Los técnicos de laminar al comienzo de la jornada laboral y/o cuando se hayan ausentado del fl ujo laminar, tienen que proceder a lavarse las manos, desde los codos hasta las puntas, con agua común y jabón o detergente y se desinfectarán las manos con alcohol al 70%.

•La mesa del fl ujo de laminar tiene que ser desinfectada con una solución de agua estéril e hipoclorito de sodio al 0.01% (incluyen las paredes), antes de comenzar la operación de subcultivo de material, así como cada vez que culmine de procesar cada frasco de material.

•Todos los frascos que se introducen en el laminar deben ser desinfectados con una solución de agua estéril e hipoclorito de sodio al 0.01% , se deben humedecer el paño en la solución cada dos frascos que se desinfectan. La cantidad de pomos a introducir a la vez en el fl ujo no debe sobrepasar a 30.

•Se colocará el plato de la mitad de la mesa del fl ujo de laminar para atrás.

•Se destaparán los pomos de materiales e inmediatamente se revisa la tapa; el frasco se deja en la mano, pegada al fl ujo y hacia arriba. La extracción del material con la pinza se hará colocando el frasco horizontalmente y paralelo al fl ujo o al operario. El material debe extraerse sin arrastrarlo por las paredes del frasco, colocándolos en el plato, en la posición ya mencionada. Tanto las pinzas como los bisturís deben colocarse en una solución de agua estéril e hipoclorito de sodio al 1%, por el plazo de tiempo no menor de 10 minutos, aunque para su uso deben estar previamente escurridos de la solución.

•El material que se subcultivará debe ser manipulado según la orientación del jefe de brigada del área de laminar y se debe tener en cuenta las siguientes reglas:

•No se colocarán las manos encima del plato.•Adoptar una postura de trabajo donde el cuerpo este fuera de la mesa o de trabajo.•El material no debe tocar los bordes del plato.•Los explantes deben estar separados por tamaños y de los residuos.• Los restos de material, gelifi cantes u otros que caigan en la mesa del fl ujo deben ser recogidos después de terminar de colocar los explantes producidos en los frascos y además desinfectar la mesa con la solución señalada.

•Los explantes se colocarán en los frascos por tamaños, en la cantidad establecida por el jefe de brigada, a distancias similares entre ellos.

•Los frascos con material producido deben ser bien tapados, comprobando la hermeticidad.

•Los frascos usados de material y platos deben ser colocados en los depósitos o lugares establecidos al efecto, donde se prohíbe su acumulación excesiva en los cuartos de siembra.

•Los frascos de material producidos se extraerán culminado el proceso de extracción de los platos y frascos usados, tratando de sacar las manos del fl ujo la menor cantidad de veces y en el menor tiempo.

•Deben evitarse las conversaciones de los operarios mientras están laborando en el fl ujo y menos aun sin el tapabocas colocado. Se prohíben las conversaciones con otras personas que estén cerca del fl ujo sin tapabocas.

•Tener debidamente identifi cado por tipo, cultivo y fecha de elaboración los medios de cultivo existentes en el almacén. Diariamente deben revisar los frascos para detectar y eliminar inmediatamente los medios contaminados. Los frascos de medios que salgan del almacén deben estar en el tiempo establecido para su uso.

•Debe verifi carse sistemáticamente en las cámaras de crecimientos y los cuartos de siembra, la temperatura y humedad existente.

•Esta prohibido la entrada de alimentos en el área aséptica.

Reglas de trabajo para la manipulación del material in vitro•No manipular en una brigada en una misma sesión más de un genotipo.•Garantizar limpieza total de los cuartos de siembra y regreso de todo

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el material a las cámaras de crecimiento antes de iniciar otra sesión de trabajo con otro genotipo.

•No mezclar genotipos distintos en un mismo estante, piso o gradilla, debiendo identifi carse cada frasco con los datos siguientes: código de la variedad (de ser posible con distinto color), fecha y número de operario.

•Cada estante debe tener su tarjeta de existencias (Modelo 5) que incluya: número del estante, variedad, lote, subcultivos y fecha, número de explantes por frasco, número de explantes totales (entradas y salidas).

•Identifi car las variedades y lotes para su extracción de los frascos de cultivo y su trasplante a fase de adaptación, no debiendo manipularse más de un genotipo en una misma sesión. Cada bandeja que se envíe al área de adaptación debe ir identifi cada correctamente con los datos correspondientes al lote.

•Las bandejas tienen que estar debidamente identifi cadas con (variedad, lote, fecha de siembra y operario).

•No debe realizarse la venta ni trasladar más de una variedad al mismo tiempo.

•La siembra de material de rechazo de la biofábrica debe hacerse por variedad y debidamente identifi cado con (variedad, lote, fecha de siembra y operario).

Coordinador de Seguimiento a ProyectosIng. Julio César Zamudio Loaiza

Coordinador del Programa Estatalde Divulgación y CapacitaciónM.C. José Nedel Sánchez Valencia

Coordinador Operativo zona norteIng. Fernando Antonio Urías Preciado

Coordinador Operativo zona centroDr. Tomás Díaz Valdes

Coordinador Operativo zona surMC. César Óscar Martínez Alvarado

Corrector de EstiloLic. Óscar Paúl Castro Montes

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