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HIBRIDACÍÓN EN NOCHEBUENA DE SOL (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch)
CON LA VARIEDAD PRESTIGE EARLY Y SU VALIDACIÓN CON MARCADORES MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y DESARROLLO RURAL
P R E S E N T A:
ELIO CAMPOS BRAVO
DIRECTORA DE TESIS:
Dra. María Andrade Rodríguez
Cuernavaca, Morelos, Diciembre 2013
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
DEDICATORIA
Primeramente a Dios por guiarme, darme la fortaleza y entendimiento para concluir este reto en
mi paso por esta vida.
A mis hijos Juan de Dios, Adrián y Elías, porque son mi motor y mi aliento para cumplir todos
y cada uno de mis objetivos.
A mi fiel compañera Anallely Mejía Montejo, que me alienta a que cada día sea una
oportunidad más para dar lo mejor de mí.
A mi familia porque siempre están presentes en cada etapa de mi vida.
A la Dra. Andrade, por su paciencia y apoyo al enseñarme cosas nuevas y poder compartir sus
conocimientos conmigo.
Al Dr. Canul, porque hizo de esta investigación un yacimiento de conocimientos y aprendizajes
para mi persona.
Y todos los que pudieron compartir su conocimiento conmigo, de corazón un enorme
agradecimiento por su apoyo.
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por su apoyo a través
de la beca otorgada para mi manutención y su apoyo para la realización de los
estudios de maestría.
A la Facultad de Ciencias Agropecuarias, por las facilidades dadas para la
realización del presente trabajo y la oportunidad de poder realizar mis estudios de
posgrado.
A la Dra. María Andrade Rodríguez, por su apoyo, esfuerzo y paciencia en la
realización de esta investigación.
Al Dr. Jaime Canul Ku, por su apoyo, consejos y esfuerzo para la realización de
esta investigación.
Al Dr. Irán Alia Tejacal, por su apoyo en el proceso de esta investigación.
Al PhD. Antonio Castillo Gutiérrez, por su intervención para la realización de esta
investigación.
Al MC. Jesús Vargas Araujo, por su apoyo e interés para la realización de esta
investigación.
i
INDICE GENERAL
Página
ÍNDICE GENERAL………………………………………………………………… i
ÍNDICE DE CUADROS……………………………………………………………. iii
ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………... v
RESUMEN GENERAL…………………………………………………………….. 1
SUMMARY…………………………………………………………………………. 3
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN GENERAL……………………………………. 4
1.1.- Objetivos………………………………………………………………………. 7
1.2.- Hipótesis………………………………………………………………………. 7
CAPITULO II. HIBRIDACIÓN EN GERMOPLASMA DE NOCHEBUENA NATIVA COMO ESTRATEGIA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO………….
8
2.1.-Resumen………………………………………………………………………. 8
2.2.- Summary……………………………………………………………………… 9
2.3.- Introducción…………………………………………………………………… 10
2.4.- Materiales y métodos………………………………………………………… 12
2.4.1.- Localización………………………………………………………………… 12
2.4.2.- Material vegetal…………………………………………………………….. 12
2.4.3.- Receptividad estigmática y viabilidad de polen………………………… 13
2.4.4.- Hibridación………………………………………………………………….. 13
2.4.4.1.- Factores de estudio……………………………………………………… 13
2.5.- Resultados y discusión……………………………………………………… 15
2.6.- Conclusiones…………………………………………………………………. 24
2.7.- Agradecimientos……………………………………………………………… 24
2.8.- Literatura citada………………………………………………………………. 25
CAPITULO lll. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN NOCHEBUENA (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) MEDIANTE MARCADORES MORFOLÓGICOS…………………………………………………………………. 27 3.1.- Resumen……………………………………………………………………… 27
3.2.- Summary……………………………………………………………………… 28
3.3.- Introducción…………………………………………………………………… 28
MATERIALES Y METODOS……………………………………………………… 30
ii
3.4.1.- Ubicación del experimento………………………………………………... 30
3.4.2.- Material de estudio………………………………………………………… 30
3.5.3.- Caracteres evaluados…………………………………………………….. 31
3.6.4.- Análisis estadístico………………………………………………………… 32
3.4.- Resultados y discusión………………………………………………………. 32
3.5.- Conclusiones…………………………………………………………………. 48
3.6.- Agradecimientos……………………………………………………………… 49
3.7.- Literatura citada………………………………………………………………. 50
CAPITULO IV. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS F1 DE NOCHEBUENA MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD…………
52
4.1.- Resumen……………………………………………………………………… 52
4.2.- Summary……………………………………………………………………… 53
4.3.- Introducción…………………………………………………………………… 54
4.4.- Materiales y métodos………………………………………………………… 56
4.4.1.- Localización………………………………………………………………… 56
4.4.2.- Material vegetal…………………………………………………………….. 56
4.4.3.- Extracción de ADN genómico…………………………………………….. 57
4.4.4.- Evaluación de la calidad de ADN………………………………………… 58
4.4.5.- Concentración de ADN……………………………………………………. 58
4.4.6.- Amplificación de ADN con RAPD………………………………………… 58
4.4.7.- Análisis de datos moleculares……………………………………………. 60
4.5.- Resultados y discusión………………………………………………………. 60
4.6.- Conclusiones…………………………………………………………………. 66
4.7.- Agradecimientos……………………………………………………………… 66
4.8.- Literatura citada………………………………………………………………. 67
CONCLUSIONES GENERALES………………………………………………… 69
LITERATURA CITADA……………………………………………………………. 71
iii
ÍNDICE DE CUADROS
Página Cuadro 1. Cuadrados medios y nivel de significancia del análisis de varianza para frutos y semillas cosechadas…………………………………………………………………………… 18
Cuadro 2. Frutos y semillas cosechadas por genotipo, tipo de emasculación y hora de polinización en nochebuena nativa por ‘Prestige early’……………………………………………………………………..……………. 20
Cuadro 3. Número de flores polinizadas, frutos y semillas cosechadas de los cruzamientos de nochebuena nativa con ‘Prestige early’….…………….…………………………………………………………………. 22
Cuadro 4. Número de semillas generadas por cada uno de los cruzamientos y usadas para la identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos……………………………………………………………………... 31
Cuadro 5. Cuadrados medios (CM) y coeficiente de variación (CV) de los caracteres cuantitativos evaluados en la progenie F1 y sus progenitor femenino (Morelos)………………………………………………………………….. 33
Cuadro 6. Valores promedios de los caracteres de tallo, hoja, bráctea e inflorescencia en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’…………………………………………………………………..………….. 35
Cuadro 7. Cuadrados medios del análisis de varianza y coeficiente de variación de las variables de la progenie F1 y su progenitor femenino (Oaxaca)………………………………………………………………….…………… 36
Cuadro 8. Variables promedio de los caracteres de tallo, hoja, bráctea en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’…………………………………………..………………………………………. 37
Cuadro 9. Proporción de la varianza global, vectores y valores propios del análisis de componentes principales (CP) en la progenie F1 de nochebuena…………………………………………………………………………... 39
Cuadro 10. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’, así como de los progenitores………………………………………………………………………….. 42
Cuadro 11. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’, así como de los progenitores…………………………………………….……………………………. 44
iv
Cuadro 12. Valores de la composición de la inercia y Chi-cuadrada del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena………………….…………………………………………………....... 45
Cuadro 13. Contribuciones relativas (CR) y absolutas (CA) asociadas con los tres primeros ejes principales del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena…………………………….………………………………………......... 46
Cuadro 14. Iniciadores utilizados en la reacción de amplificación de ADN para la identificación de híbridos de nochebuena………………………………………………………………………….. 59
Cuadro 15. Bandas totales, polimórficas y porcentaje de polimorfismo para la identificación de plantas híbridas de nochebuena mediante RAPD……………………………………………………………………………......... 61
Cuadro 16. Bandas similares al progenitor macho para la identificación de híbridos de nochebuena mediante RAPD…………………….……………………………………………………………. 64
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Proceso de hibridación. a) Emasculación completa, b) Emasculación parcial, c) Polinización manual, d) Prendimiento de frutos.. 15
Figura 2. Desarrollo de la flor femenina……………………………………………………………. 16
Figura 3. Receptividad del estigma y viabilidad de polen en flores de nochebuena nativa. a) Estigma no receptivo, b) Estigma receptivo, c) Tinción de granos de pole con acetocarmin al 1 %..................................... 16
Figura 4. Temperatura y humedad relativa durante los meses en que se efectuaron las hibridaciones en nochebuena nativa y ‘Prestige early’……………………………………………………………………….…….. 23
Figura 5. Progenitores y su progenie F1: a: progenitor femenino, b: híbrido F1, c: progenitor masculino……………………………………………. 34
Figura 6. Distribución de ocho familias de medios hermanos y sus progenitores femeninos en función del primero y segundo componente principal…………………………………………………………… 40
Figura 7. Características de: diámetro de brácteas, color de tallo, forma de bráctea y forma de hoja de progenitores y su progenie F1, en nochebuena……………………………………………………………………… 41
Figura 8. Dispersión de ocho familias F1 y sus progenitores de acuerdo a sus características cualitativas………………………………………………… 48
Figura 9. Amplificaciones de ADN de las familias 1 y 7 obtenidas con el iniciador 2 (5’CAA TCG CCG 3’), kb escalera molecular, M: progenitor femenino, P: progenitor masculino, F1: familia 1, F7: familia 7. Las flechas indican las bandas que comparten las familias con el progenitor masculino..................................................................................................... 62
Figura 10. Agrupamiento entre familias de medios hermanos de nochebuena utilizando el análisis de agrupamiento UPGMA basado en el estimador de Dace tomando como referencia 101 fragmentos RAPD……………………………………………….……………………..…….. 65
1
RESUMEN GENERAL
México es centro de origen de la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex
Klotzsch), ésta se encuentra en estado silvestre distribuida principalmente por el
litoral del Océano Pacifico, donde se encuentra la mayor diversidad genética y
representa un recurso fitogenético de importancia para mejoramiento genético de
la especie. Sin embargo, el mejoramiento genético lo han realizado y realizan
otros países como Estados Unidos, Holanda y China entre otros. En México, la
investigación para hacer mejoramiento genético y generar materiales mejorados
con fines de introducirlos en el mercado con patente mexicana es incipiente. Bajo
este contexto, el objetivo del presente estudio fue generar las bases
metodológicas para hacer hibridación como un método de mejoramiento genético
en nochebuena, así como identificar la progenie F1 hibrida mediante marcadores
morfológicos y moleculares. Para realizar la hibridación se utilizó un diseño
completamente al azar con arreglo factorial 2x2x3, se utilizaron dos accesiones de
nochebuena silvestre (Morelos y Oaxaca) como progenitores femeninos, en las
cuales se probaron dos técnicas de emasculación de anteras (completa y gradual)
y tres horarios (10:00, 11:00 y 12:00 horas) para realizar las polinizaciones con la
variedad ‘Prestige early,’ como progenitor masculino. Se evaluó número de frutos
y semillas cosechadas. La hora más adecuada para realizar la polinización fue a
las 11:00 am con remoción gradual de las anteras. De las semillas hibridas F1
obtenidas se generaron ocho familias, las cuales se pusieron a germinar, al igual
que semillas de las dos accesiones como testigos. Para la identificación de
híbridos mediante marcadores morfológicos, se evaluaron 18 caracteres
cuantitativos y 8 cualitativos, con los datos generados se realizó análisis de
varianza (P≤0.05), y en las variables donde mostraron deferencias estadísticas se
realizó una comparación de medias mediante Tukey utilizando el programa SAS
9.0 y se complementó con análisis de componentes principales y de
correspondencia simple. De las ocho familias, cinco presentaron similitud
morfológica con el progenitor macho en diferentes variables. En la identificación
de híbridos F1 mediante marcadores moleculares RAPD, se realizó una selección
de aquellas plantas que presentaron características similares al progenitor macho,
se les realizó extracción de ADN para ser amplificado con diez iniciadores RAPD.
2
La evaluación de los híbridos se realizó comparando los patrones de bandeo
como presencia (1) y ausencia (0) de los progenitores y la progenie F1, con la
información se construyó una matriz de similitud empleando el coeficiente
desarrollado por Dice (1945). Con el método UPGMA del programa NTSYS se
construyo el dendrograma. Las familias 1 y 7 presentaron mayor similitud genética
con el progenitor macho a una distancia de 0.35.
3
SUMMARY
Mexico is the center of origin of poinsettia (Euphorbia pulcherrima Willd. ex
Klotzsch), it is mainly distributed in the wild along the littoral of the Pacific Ocean,
where is the greatest genetic diversity and represents an important plant resource
in breeding genetic of the species. However, breeding genetic have made other
countries like USA, Netherlands and China among others. In Mexico, research for
breeding purposes to introduce them into the market with Mexican patent is
incipient. In this context, the objective of this study was to generate the
methodological bases for hybridization as a method of breeding on poinsettia, as
well as identify progeny F1 hybrid using morphological and molecular markers. To
hybridization was used a completely randomized design with a 2x2x3 factorial
arrangement, two accessions of wild poinsettia (Morelos and Oaxaca) were used
as female parents, were tested two techniques emasculation of anthers (full and
incremental) and three times (10:00, 11:00 and 12:00 hours) for pollinations with
variety 'Prestige early,' as male parent were tested. Number of harvested fruits
and seeds were evaluated. The best time for pollination was at 11:00 am with
gradual removal of the anthers. Of F1 hybrid seeds eight families were generated,
which were germinated, like seeds of the two accessions were witnesses. For the
identification of hybrid was performed using morphological markers, were
evaluated 18 characters qualitative and 8 quantitative, with the data generated
was performed analysis of variance (P ≤ 0.05), and the variables which showed
statistical difference performed comparison of means was using Tukey using the
SAS 9.0 program and supplemented with principal component analysis and simple
correspondence. Of the eight families, five showed morphological similarity to the
male parent in different variables. In the identification of F1 hybrids using RAPD
molecular markers, a selection of plants that had similar characteristics to the male
parent was performed; they did DNA extraction with amplified RAPD primers ten.
Evaluation of hybrids was performed comparing banding patterns as presence (1)
and absence (0) of the parents and F1 progeny, with information is constructed
similarity matrix using the Dice coefficient (1945). UPGMA method with the
program NTSYS dendrograma was constructed. Families 1 and 7 showed greater
genetic similarity to the male parent at a distance of 0.35.
4
CAPÍTULO I. INTRODUCCION GENERAL
La Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, conocida comúnmente como
Cuetlaxóchitl, poinsettia, flor de pascua, o nochebuena es nativa de México (Lee,
2000; Ecke et al., 2004). Se encuentra ampliamente distribuida por las zonas
tropicales de México (Lee, 2000), desde el nivel del mar hasta los 2,000 m,
alcanzando su diversidad y abundancia en los bosques tropicales caducifolios
(Steinmann, 2002); es común encontrarla de manera natural, semicultivada y
cultivada en varios estados del país, por ejemplo en los estados de Morelos,
Guerrero, México, Puebla, Michoacán, Nayarit y Oaxaca, entre otros; así como, el
Distrito Federal; se distingue por su vistosidad, diversidad en color, tamaño, forma
de hoja y bráctea. En la actualidad, las especies ornamentales de mayor
importancia en México son la nochebuena, crisantemo (Dendranthema spp), rosa
(Rosa spp), clavel (Dianthus caryophyllus), entre otros (Mejía et al., 2006).
Esta especie fue introducida a Estados Unidos en el año de 1825, por Joel Robert
Poinset, cuando en una visita a México se encontró con plantas vistosas
creciendo de forma natural, las mandó hacia su país para su cultivo y a partir de
ahí se dispersó a otros países del mundo. Sin embargo, fue hasta 1909 cuando se
comercializaron las primeras plantas, antes del híbrido interespecifico ‘Dulce
Rosa’.
El mejoramiento genético se inició a mediados de los 50´s (Ecke et al., 2004). Sin
embargo, los primeros cultivares comerciales fueron producidos hasta 1963
(Parks y Moyer, 2004), todos a partir de Euphorbia pulcherrima (Ecke et al.,
2004).
El mejoramiento genético en nochebuena se ha realizado y se realiza en países
como Estados Unidos, China, Corea del norte, entre otros. En México no existen
variedades mejoradas de nochebuena; hasta el momento se han registrado 5
variedades que son de sol, como: ‘Juan Pablo’, ‘Amanecer Navideño’, ‘Rehilete’,
‘Belén’ y ‘Valenciana’ (Galindo et al., 2012). Por lo anterior, es necesario generar
conocimientos que permitan establecer las bases metodológicas para realizar
mejoramiento genético con el fin de generar variedades adaptadas a las
condiciones ambientales de México, con las características que exige el mercado
5
como porte bajo, color rojo intenso en las brácteas, para cultivarlas en maceta a
nivel masivo.
El mejoramiento genético se define como los cambios dirigidos por la actividad del
hombre orientados para la generación de nuevos cultivares, y se realiza por varios
métodos. Los métodos de mejoramiento que se pueden aplicar en especies de
plantas ornamentales son muy variados, van desde los métodos tradicionales de
selección e hibridación, pasando por la biotecnología moderna, hasta llegar a la
ingeniería genética. La hibridación es uno de los métodos de mejoramiento
genético que aprovecha la generación F1 proveniente del cruzamiento entre dos
parentales P1 y P2 (Márquez, 1985), donde el conocimiento de la biología floral es
muy importante para programar la fecha exacta para realizar los cruzamientos
necesarios y dirigidos. Los estadíos óptimos para efectuar los cruzamientos son
primordialmente flor abierta, aunque también prevalece la necesidad de polinizar
en estadío de botón, y para una exitosa hibridación es importante seleccionar
progenitores fértiles (Huang y Chu, 2008).
La biología floral es un proceso complejo y por tanto la polinización puede tomar
lugar solamente cuando los progenitores con características deseables florecen
simultáneamente; por lo general, los órganos masculinos (estambres) maduran
antes que los femeninos (pistilo) y el estigma alcanza su madurez
aproximádamente a los dos o tres días después de la apertura de las flores
(Erwin, 2007). La nochebuena presenta una flor poco común, la inflorescencia
denominada ciatio produce en primera instancia estambres y polen seguido por
los pistilos. El ovario emerge del centro de la flor y crece hacia los lados conforme
se desarrolla la semilla (Ecke et al., 2004).
Por lo general, en un cruzamiento entre dos progenitores se hereda material
genético de ambos, es decir, el híbrido combina caracteres de ambos
progenitores, los cuales segregarían en la progenie (Bai y Lindhout, 2007). En
mejoramiento genético es importante conocer si se dió una verdadera hibridación,
esto se puede valorar mediante marcadores morfológicos y moleculares. Los
marcadores morfológicos se basan en caracteres cualitativos y cuantitativos de la
especie en estudio; estos son afectados por el ambiente. Los marcadores
6
moleculares son pequeños fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN), que
reconoce partes del genoma a través de una secuencia complemento (Collard et
al., 2005). Los más comunes son los marcadores SSR, RFLP y AFLP (Edmeades
et al., 2004; Francia et al., 2005).
Son varias las técnicas moleculares que pueden utilizarse para valorar la
hibridación, los marcadores moleculares sirven para distinguir genotipos dentro de
poblaciones (Terzopoulos y Bebeli, 2008), cada una de ellas con sus ventajas y
desventajas. Los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción) son laboriosos y consumidores de tiempo para
aplicaciones rutinarias; las SSR (secuencias simples repetidas) son altamente
polimórficas y se basan en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), pero
implican alto costo y la necesidad de conocimiento previo de la secuencia de
algunas regiones del genoma; los AFLP (polimorfismo en la longitud de
fragmentos amplificados) pueden producir gran número de marcadores en corto
tiempo, y se basan en la amplificación selectiva de PCR de fragmentos de
restricción, pero también implican alto costo (Staub et al., 1996); los RAPD
(polimorfismo en el ADN amplificado al azar) son de menor costo y fáciles de
efectuar, no es necesario el conocimiento previo de la secuencia del genoma y
consumen poco tiempo (Williams et al., 1990).
Dentro de toda esta gama de marcadores, los RAPD han llegado a ser usados
para diferenciar algunos genotipos dentro de especie principalmente en plantas
alógamas por ser dominantes y de alta reproducibilidad; en nochebuena fueron
usados por Ling et al. (1997) para identificar cultivares de nochebuena.
Con base en todo lo antes expuesto, es necesario conocer las características de
la biología reproductiva, técnicas de emasculación y polinización para hacer la
hibridación, usar las características morfológicas y técnicas moleculares para
identificar híbridos. Para subsanar la necesidad antes mencionada, se desarrolló
la presente investigación cuyos objetivos e hipótesis se presentan a continuación.
7
Objetivo general
Determinar la metodología para realizar hibridación en genotipos de nochebuena
de sol, colectados en los estados de Morelos y Oaxaca con la variedad mejorada
‘Prestige early’, así como evaluar la generación (F1) de los cruzamientos mediante
marcadores morfológicos y moleculares.
Objetivos específicos
Conocer la fenología floral, viabilidad de polen, receptividad del estigma y método
de emasculación para efectuar la hibridación.
Identificar los híbridos de la progenie F1 de los cruzamientos de nochebuena de
sol por la variedad mejorada ‘Prestige early’, mediante marcadores morfológicos.
Verificar el origen híbrido de plantas F1, obtenidas de los cruzamientos entre
nochebuena de sol y la variedad mejorada ‘Prestige early’, mediante marcadores
moleculares RAPD.
Hipótesis
La viabilidad de polen, receptividad del estigma y método de emasculación son
importantes para obtener amarre de fruto y desarrollo de semillas híbridas de
nochebuena.
Los caracteres morfológicos permitirán identificar híbridos F1 producto de los
cruzamientos de nochebuena de sol por la variedad mejorada ‛Prestige early’.
Los marcadores RAPD serán de utilidad para identificar las plantas de origen
híbrido obtenidas de los cruzamientos de nochebuena de sol por la variedad
mejorada ‛Prestige early’.
Para cumplir el objetivo general planteado, la investigación se organizó de
acuerdo a los tres objetivos específicos. Los resultados obtenidos se presentan en
tres artículos, mismos que se incluyen a continuación.
8
CAPITULO II. HIBRIDACIÓN EN GERMOPLASMA DE NOCHEBUENA NATIVA COMO ESTRATEGIA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO
Elio Campos Bravo1, Jaime Canul Ku2, María Andrade Rodríguez1*, Iran Alia
Tejacal1, Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1
1Posgrado en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural, Facultad de Ciencias
Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777)
3297046.
2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias,
3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de
Morelos.
*Autor responsable: [email protected], [email protected]
RESUMEN
En México, la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) aún tiene
ejemplares en estado silvestre, con amplia variabilidad genética y es un reservorio
de genes para realizar mejoramiento genético. La hibridación es el método más
utilizado para generar nuevos individuos con diferente composición genética y
para realizarla es necesario conocer la viabilidad de polen, receptividad del
estigma, así como la forma adecuada de emascular y polinizar. El objetivo de este
estudio fue conocer la biología reproductiva, la mejor estrategia para realizar la
emasculación y determinar el momento oportuno para efectuar la polinización
para establecer las bases metodológicas y científicas para realizar la hibridación
entre nochebuena nativa con la variedad comercial ‘Prestige early’. Se usaron
plantas de nochebuena nativa procedentes de Morelos y Oaxaca, así como la
9
variedad ‘Prestige early’. Se realizaron pruebas de receptividad del estigma
mediante el método de Osborn et al. (1988) y viabilidad de polen por el método de
Dempsey (1993). De igual forma se evaluó el método de emasculación (completa
y gradual) en combinaciones con la hora de polinización (10:00, 11:00 y 12:00
horas del día) en un diseño completamente al azar con arreglo factorial de
tratamientos (2x2x3). Se determinó que el estigma estuvo receptivo uno o dos
días después de que ocurre la trifurcación y aún no ha emergido el ovario del
receptáculo floral. El mayor porcentaje de fruto amarrado fue de 82.75% con
emasculación gradual y polinizadas a las 11:00 de la mañana. El mayor número
de semillas cosechadas fue de 88, cuyas flores fueron emasculadas
gradualmente y polinizadas a las 11:00 horas. El análisis de varianza mostró
diferencias estadísticas altamente significativas para tipo de emasculación y hora
de polinización para frutos y semillas cosechadas (P<0.01), así como interacción
entre tipo de emasculación y hora de polinización. La hora adecuada para realizar
hibridación fue a las 11:00 de la mañana con emasculación gradual según el
análisis de varianza y la prueba de comparación de medias con Tukey (P ≤ 0.05).
Palabras clave: Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, emasculación,
población nativa, semilla.
SUMMARY
In Mexico, the poinsettia (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) still has
specimen wild, with wide genetic variability and is a reservoir of genes for genetic
improvement. Hybridization is used to generate new individuals with different
genetic composition and to realize it is necessary to know the pollen viability,
stigma receptivity and the proper way to emasculate and pollinate. The aim of this
study was to know the reproductive biology, the best strategy for emasculation and
determine the appropriate time to effect pollination to lay the foundations
methodological and scientific to hybridization between native poinsettia with the
commercial variety ‘Prestige early’. Native poinsettia plants from Morelos and
Oaxaca and the variety ‘Prestige early’ were used. Were performed Stigma
receptivity tests using the method of Osborn et al. (1988) and viability pollen
method Dempsey (1993). Similarly the was assessed method of emasculation (full
10
and gradual) in combination with the time of pollination (10:00, 11:00 and 12:00
hours on the day) in a completely randomized design with factorial arrangement of
treatments (2x2x3 ). It was determined that the stigma was receptive one or two
days after the trifurcation occurs and has not yet emerged from the ovary floral
receptacle. The highest percentage of fruit moored was 82.75% with gradual
emasculation and pollinated at 11:00 am. The highest number of seeds harvested
was 88, whose flowers were emasculated gradually and pollinated at 11:00 hrs.
Analysis of variance showed highly significant differences for type of emasculation
and time of pollination for fruits and seeds harvested (P <0.01), as well as
interaction between type of emasculation and time of pollination. The time
adequate for hybridization was at 11:00 am with gradual emasculation according
to analysis of variance and comparison mean test with Tukey (P ≤ 0.05).
Key words: Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch , emasculation, native
population, seed.
INTRODUCCIÓN
En México, la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch), conocida
comúnmente como Cuetlaxóchil, se encuentra en estado silvestre y se distribuye
desde cero metros hasta 2,000 msnm aproximádamente (Steinmann, 2002). Es
un arbusto perenne con abundante látex lechoso, mide de 1 a 4 m de altura, con
hojas sencillas, membranáceas, elípticas, con márgenes denticulados o
lobulados, alternas y a veces opuestas en la región superior, de 10 a 20 cm de
largo y 3 a 5 de cm ancho, pecíolo largo, con brácteas vistosas de color roja,
rosada o blanca.
La nochebuena presenta flores unisexuales reunidas en inflorescencias
compuestas. La inflorescencia está constituida por flores pequeñas llamadas
ciatios de color verde que tienen glándulas que secretan néctar como estrategia
para atraer a los polinizadores como abejas (Apis mellifera), hormigas (Lasius
11
spp), mariposas (Lepidópteros) y abejorros (Bombus Terrestris), entre otros. Las
anteras son biloculares dehiscentes en forma longitudinal; mientras que, el
estigma tiene tres estilos unidos, óvulos de 1 a 2 en cada cavidad (Sánchez,
1986). Su fruto es capsular dehiscente, de 1.5 cm de diámetro aproximádamente
(Hoyos, 1985).
La nochebuena nativa es un recurso fitogenético con potencial para realizar
mejoramiento genético y generar nuevos cultivares con características como las
que demanda el mercado nacional e internacional.
Los métodos de mejoramiento genético que se pueden aplicar en especies de
plantas ornamentales de interés comercial son muy variados, van desde los
métodos tradicionales de selección e hibridación, pasando por la biotecnología
moderna, hasta llegar a la ingeniería genética. En especies ornamentales el
método que ha dado excelentes resultados es la hibridación, pero hay que
considerar que la variabilidad genética es un aspecto esencial para cualquier
programa de mejoramiento genético (Clarke, 2008), donde el conocimiento de la
biología reproductiva de los genotipos facilita la selección apropiada de
progenitores; además, permite diseñar y planear los cruzamientos entre ellos
(Ariyarathana et al., 2011).
La hibridación es uno de los métodos de mejoramiento genético que aprovecha la
generación F1 proveniente del cruzamiento entre dos poblaciones parentales P1 y
P2 (Márquez, 1985). Por lo general, en un cruzamiento entre dos individuos se
hereda material genético; es decir, el híbrido combina caracteres de ambos
progenitores, los cuales se manifiestan en la progenie (Bai y Lindhout, 2007). En
la hibridación es indispensable un sistema de control eficiente en la polinización
para evitar la autopolinización, lo cual es una labor intensiva.
Para que la hibridación ocurra deben conjuntarse la receptividad de la flor
hembra, así como la viabilidad del polen de las flores masculinas. La receptividad
estigmática es un parámetro floral que determina el tiempo en el que los estigmas
mantienen la capacidad de generar un ambiente propicio para la germinación de
los granos de polen (Lozada y Herrero, 2006).
12
La nochebuena es una especie alógama, durante su desarrollo emite primero solo
flores masculinas y posteriormente flores femeninas. Esta condición hace
necesario el control de la polinización para conocer cuáles son los parentales que
intervinieron. El mejoramiento genético de esta especie se ha realizado fuera de
México; por lo general, lo realizan empresas privadas, en el país es incipiente
(Canul et al., 2010a, b); por lo que, se necesita establecer las bases
metodológicas para llevarlo a cabo.
Bajo este contexto, el objetivo de este estudio fue conocer la biología
reproductiva, la mejor estrategia para realizar la emasculación, determinar el
momento oportuno de efectuar la polinización, para establecer las bases
metodológicas para realizar hibridación entre nochebuena nativa con la variedad
comercial ‘Prestige early’.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización
El estudio se realizó de junio del 2011 a marzo del 2012 en el Campo
Experimental “Zacatepec” del INIFAP, ubicado a los 18° 39´ 16´´ Latitud Norte y
99° 11´ 54.7´´ Longitud Oeste, a una altitud de 911.8 m, el clima de este lugar es
cálido subhúmedo (Aw0), con lluvias en verano, precipitación promedio anual de
800 mm y temperatura promedio anual de 24 °C (García, 1981).
Material vegetal
Se utilizaron dos procedencias de nochebuena nativa, del estado de Morelos y de
Oaxaca. Las accesiones de Morelos se recolectaron a una altura de 1522 a 1857
msnm, 18°56”15” a 18°56”82” longitud Oeste y 99°09”41” a 98°47”23” longitud
Norte, y las de Oaxaca fueron colectadas a 1963 msnm, 19°30”30” longitud Oeste
y 100°22”24” longitud Norte. Las plantas fueron puestas en un contenedor de 16
L-1 con una mezcla de sustrato a base de tierra de hoja, ocochal y polvillo de coco
13
(60-20-20 v/v, respectivamente) y colocadas bajo una malla luminizada al 80% de
luz.
Receptividad estigmática y viabilidad de polen
Para determinar en qué momento es receptivo el estigma se seleccionaron
botones florales con el estilo recién emergido, aproximadamente de dos mm de
longitud y se consideró como el día uno. Se siguió el desarrollo del estigma por
doce días. Se evaluó la receptividad estigmática por el método de Osborn et al.
(1988), el cual consiste en la aplicación de una gota de peróxido de hidrogeno al
3% sobre la superficie del estigma y se consideró como receptivo cuando
presentó una reacción de burbujeo.
Se realizó la prueba de viabilidad de polen por el método de Dempsey (1993), que
consiste en aplicar una gota de acetocarmin al 1% a los granos de polen. Se
recolectaron anteras antes de que estas emergieran del la flor y antes de la
liberación de polen (antesis), se colocaron en un porta objetos y con un bisturí se
realizó un corte longitudinal y se aplastó suavemente para liberar los granos de
polen, a los cuales se aplicó el acetocarmin al 1%. Con la ayuda de un
microscopio compuesto se observó a 40x el cambio de color de los granos de
polen y se consideraron viables aquellos que se tiñeron de color rojo y no viable
los que presentaron un color rosado.
Hibridación
Factores de estudio
Genotipo. Se usaron 45 plantas procedentes del estado de Morelos y 45 plantas
del estado de Oaxaca.
Tipo de emasculación. Para la emasculación, se realizó una selección de 3 a 4
botones florales por inflorescencia con un mismo desarrollo fenológico del
estigma, eliminando el resto de las flores. En los botones seleccionados se
aplicaron dos técnicas de emasculación (eliminación de anteras), emasculación
completa, que consistió en eliminar completamente las anteras antes que
emergieran del botón floral, dejando el ovario expuesto totalmente, esto se realizó
14
con la ayuda de una pinza de punta fina y con lupa realizando un corte por todo el
perímetro del botón floral sin tocar el ovario (Figura 1a); la segunda técnica fue la
emasculación gradual, que consistió en la remoción de anteras conforme
emergieron del botón floral, pero antes que liberaran el polen (antesis) (Figura
1b). Los botones emasculados se cubrieron con bolsa de glassine para su
protección hasta antes de la polinización manual.
Hora de polinización. Para definir la hora adecuada para realizar los
cruzamientos, la polinización se realizó en tres momentos: 10:00, 11:00 y 12:00
horas del día. Durante este periodo de tiempo se registró la temperatura y
humedad relativa mediante un data logguer Hobo.
La hibridación se realizó en el periodo otoño-invierno 2011, de cada inflorescencia
se seleccionaron de 3 a 4 botones florales en un mismo estadió de desarrollo, los
cuales se emascularon y se cubrieron con una bolsa de glassine. Cuando estuvo
receptivo el estigma se retiró la bolsa para realizar la polinización manual, el polen
se tomó de las anteras del progenitor masculino ‘Prestige early’, mismas que se
retiraron del botón floral con la ayuda de una pinza de punta fina y lupa, la antera
se frotó directamente en el estigma (Figura 1c). Se colocó una etiqueta con la
fecha, hora de polinización y número de flores polinizadas (Figura 1d). Después
se cubrió nuevamente con la bolsa para evitar la contaminación por polen de otras
plantas y otros polinizadores. La bolsa se retiró hasta la cosecha de semilla.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial
2x2x3 donde la unidad experimental fue una planta en un contenedor de 16 L-1
con cinco repeticiones. Los factores fueron; genotipo, dos procedencias de
nochebuena nativa (Morelos y Oaxaca); tipo de emasculación, en dos niveles
completa y gradual; y hora de polinización, en tres niveles: 10:00, 11:00 y 12:00
horas del día para realizar la polinización. Se evaluó el número de frutos
cosechados y número de semillas cosechadas. Se realizó análisis de varianza y
prueba de comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05).
15
Figura 1. Proceso de hibridación. a) Emasculación completa, b) Eliminación gradual de anteras, c) Polinización manual, d) Prendimiento de frutos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Receptividad estigmática y viabilidad de polen
El desarrollo fenológico del estigma mostró que en el día siete se empezó a
trifurcar (Figura 2) y al aplicar el peróxido de hidrógeno al 3% no se observó
cambio alguno (Figura 3a). En los días ocho y nueve (Figura 2) se aplicó de
nuevo el peróxido, la respuesta fue una reacción de burbujeo en el estigma al
entrar en contacto con la sustancia en ambos días (Figura 3b), esto indicó que el
estigma estaba receptivo, y permaneció en ese estado durante aproximádamente
48 horas. Lo anterior indica que la polinización debe efectuarse durante el día
ocho y nueve cuando los estigmas de los tres pistilos están completamente
expuestos, además de observarse turgentes. Cuando el ovario ha emergido del
receptáculo floral el estigma ya no es receptivo (Figura 2).
a b
c d
16
Figura 2. Desarrollo de la flor femenina.
Figura 3. Receptividad del estigma y viabilidad de polen en flores de nochebuena nativa. a) Estigma no receptivo, b) Estigma receptivo, c) Tinción de granos de polen con acetocarmin al 1%.
Con respecto a la viabilidad de polen, se observaron los cambios que ocurren en
los granos de polen al aplicar una gota de acetocarmin al 1%, cuando se tiñeron
de color rojo evidenciaron que fueron viables y cuando fueron de color rosado
fueron infértiles (Figura 3c). Huang y Chu (2008) señalan que durante el amarre
de frutos de cualquier genotipo, la viabilidad del polen es lo primero que debe ser
revisado antes de realizar la polinización; ya en la polinización manual, la
17
capacidad del polen para germinar es un aspecto primordial (Mihalte y Sestras,
2011).
Los resultados obtenidos para receptividad del estigma y viabilidad de polen
indicaron que no existen barreras para que ocurra la fertilización durante el
proceso de hibridación. La no fertilización puede ocurrir debido a las condiciones
del medio ambiente como alta temperatura y humedad relativa baja; la técnica de
emasculación empleada y el manejo de las estructuras reproductivas por parte del
mejorador. Horsley et al. (2010), mencionan que en Eucalyptus se aplicaron tres
técnicas de polinización controlada para probar la efectividad de producción de
semilla y nivel de contaminación genética, los resultados demostraron que un
corte del estilo en la parte superior antes de la antesis sin emascular y sin
aislamiento mediante bolsas produjo la mayor cantidad de semillas y tuvo la
mayor contaminación por autopolinización y a través de polen extraño; mientras
que, el método convencional fue intermedio. Ariyarathana et al. (2011) mencionan
que el conocimiento de la biología reproductiva de los genotipos facilita la
selección apropiada de progenitores en los programas de mejoramiento genético.
Además, permite diseñar y planear los cruzamientos entre los progenitores.
Hibridación
El análisis de varianza mostró diferencias estadísticas altamente significativas por
efecto del tipo de emasculación y la hora de polinización para frutos y semillas
cosechadas; mientras que, no hubo diferencias estadísticas en esos caracteres
por efecto de los genotipos. Asimismo, se presentó interacción altamente
significativa del tipo de emasculación con la hora de polinización para frutos y
semillas cosechadas, e interacción significativa de genotipos por tipo de
emasculación para semilla cosechada (Cuadro 1).
18
Cuadro 1. Cuadrados medios y nivel de significancia del análisis de varianza para frutos y semillas cosechadas.
Fuentes de variación Frutos cosechados
por planta
Número de semillas
cosechadas por fruto
Genotipo (G) 0.26ns 0.52ns
Tipo de emasculación (TE) 12.02** 25.99**
Hora de polinización (HP) 2.90** 16.09**
G x TE 1.61ns 4.14*
TE x HP 2.17** 8.60**
G x HP 0.03ns 0.32ns
G x TE x HP 0.89ns 0.27ns
C.V. (%) 43.58 51.99
C.V.= Coeficiente de variación, ns= no significativo, *= significativo,**= altamente significativo (P ≤ 0.05).
Los cruzamientos realizados entre las accesiones procedentes del estado de
Morelos con ‘Prestige early’ y los realizados con las de Oaxaca, estadísticamente
produjeron similar número de frutos y número de semillas cosechadas; lo anterior
indica que la procedencia de las plantas no tuvo efecto en el éxito de la
hibridación. Tanto el número de frutos como semillas cosechadas fueron bajos
(Cuadro 2), Trejo et al. (2012) mencionan que los haplotipos nucleares de
cultivares contemporáneos están presentes en las poblaciones silvestres; es por
eso que la procedencia de las plantas no afectó la hibridación entre nochebuena
nativa y la variedad ‘Prestige early’ ya que comparten información genética. Esto
indica que los genotipos mexicanos de nochebuena dieron origen a las
variedades comerciales.
El tipo de emasculación afectó al número de frutos y semillas cosechadas
(P<0.01). La eliminación de las anteras conforme fueron apareciendo
19
(emasculación gradual) fue mejor, ya que el número de frutos y semillas fueron
mayores en comparación a los obtenidos con la remoción total de las anteras
(emasculación completa) (Cuadro 2). Lo anterior pudo deberse a que la
emasculación completa implicó mayor daño a la flores, lo que condujo a la
abscisión de las mismas. Esto concuerda con lo reportado por Polverente et al.
(2005) quienes reportan que la manipulación de las flores y la polinización manual
en berenjena afectaron negativamente los órganos femeninos al reducir la
producción de semillas y afectar la calidad de estas. De manera similar, Datson et
al. (2006) mencionan que la eliminación total de anteras no permitió la generación
de semillas en 13 especies de Nemesia.
El momento de la polinización fue determinante para la producción de frutos y
semillas, los resultados indicaron que a las 11:00 am es la hora más apropiada;
sin embargo, es posible iniciar esta actividad desde las 10:00 (Cuadro 2); a las
12:00 del día fue la hora menos conveniente para hacer los cruzamientos porque
se tuvo menor amarre de fruto y menos semillas por fruto. Lo anterior se debió
probablemente a que a esa hora se tuvo mayor temperatura y menor humedad
relativa, mismos que aunados a la manipulación de las flores contribuyeron a la
deshidratación del estigma y granos de polen. En mejoramiento genético el
periodo de polinización debe ser amplio, ya que es conveniente realizar la mayor
cantidad de polinizaciones puesto que la recombinación es aleatoria y esto
permitirá aumentar la posibilidad de obtener caracteres de interés.
20
Cuadro 2. Frutos y semillas cosechadas por genotipo, tipo de emasculación y hora de polinización en nochebuena nativa por ‘Prestige early’.
Fuente de variación
Frutos cosechados por planta
Número de semillas cosechadas por fruto
Genotipo ( G ) Morelos x Prestige early 1.38 az 1,66 az Oaxaca x Prestige early 1.5 a 1.47 a DMSH 0.32 0.42
Tipo de emasculación Completa 1.0 b 0.91 b Gradual 1.9 a 2.22 a DMSH 0.32 0.42
Hora de polinización 10:00 a.m. 1.40 ab 1.30 b 11:00 a.m. 1.85 a 2.56 a 12:00 p.m. 1.10 b 0.83 b DMSH 0.48 0.62
z: Letras iguales en el sentido de las columnas dentro de cada factor indican similitud estadística de acuerdo a la prueba Tukey (P ≤ 0.05).
La polinización artificial es un factor que determina la fertilización del ovario para
generar embriones que alcancen su madurez fisiológica. Lo que concuerda con
Chun et al., (2011) quienes indicaron que la fertilización fue una barrera para la
hibridación entre Crisantemo grandiflorum 'Yuhuaxingchen' y C. nankingense.
Se polinizó un total de 374 flores, de las cuales 171 se emascularon
completamente y 203 parcialmente. Las flores emasculadas se polinizaron en tres
horarios: 10:00 y 11:00 am, y 12:00 pm. Con la emasculación completa, el mayor
número de frutos cosechados se obtuvo al polinizar a las 11:00 am, esto
representó el 11.59% de prendimiento; mientras que, a las 12:00 no hubo amarre
de frutos. Cuando se realizó emasculación gradual, el mayor número de flores
fertilizadas se logró a las 11:00 con 82.75%, seguido de las flores polinizadas a
las 10:00 con 42.30%, en tanto que la polinización a las 12:00 solo generó 7.81%
de ovarios fecundados (Cuadro 3).
21
La eliminación de las anteras conforme fueron emergiendo generó mejores
resultados de frutos cosechados por planta y semillas por fruto. El tipo de
emasculación determinó de forma significativa el porcentaje de ovarios
fertilizados. Estos convertidos ya en embriones se desarrollaron normalmente a
los 10 días después de la polinización artificial; mientras que, los no fertilizados se
empiezan a degenerar y a iniciar la abscisión.
De las flores que se emascularon de forma gradual y se polinizaron a las 11:00
am, de Morelos por ‘Prestige early’ fue donde se cosechó el mayor número de
frutos; mientras que, en las flores emasculadas de forma completa la cosecha fue
casi nula. En el otro cruzamiento, Oaxaca por ‘Prestige early’, las flores con
emasculación gradual y polinizada a las 11:00 produjeron la mayor cantidad de
frutos, seguido de aquellas con emasculación completa y polinizada a la misma
hora; en cambio, las de emasculación completa y parcial, ambas polinizadas a las
10:00 dieron similar número de frutos (Cuadro 3).
La emasculación gradual de anteras generó mayor cantidad de semillas por hora
de polinización en comparación con la emasculación completa. Asimismo, la
polinización realizada a las 11:00 en ambas formas de emasculación fue donde se
cosechó mayor cantidad de semillas (Cuadro 3). En un trabajo sobre fertilidad de
variedades comerciales de nochebuena Huang y Chu (2008) señalan que el
cuajado de fruto y producción de semilla aumentaron de 23.3 a 40% y de 56 a
73%, respectivamente cuando los progenitores provienen de cultivo de tejidos en
comparación con los que se obtuvieron por esquejes.
22
Cuadro 3. Número de flores polinizadas, frutos y semillas cosechados de los cruzamientos de nochebuena nativa con ‘Prestige early’.
Número flores
polinizadas
Número de flores no
fecundadas
Frutos cosechados
Semillas cosechadas
MxPE OxPE MxPE OxPE % de
amarre de fruto
Emasculación completa
10:00 am 52 48 0 e 4 c 0 9 7.69
11:00 am 69 61 1 d 7 b 1 14 11.59
12:00 pm 50 0 0 e 0 d 0 0 0
Emasculación gradual
10:00 am 52 30 18 b 4 c 25 12 42.30
11:00 am 87 15 38 a 34 a 88 79 82.75
12:00 pm 64 59 5 c 0 d 8 0 7.81
Total 374 213 29.67
M= Morelos, O= Oaxaca, PE= ‘Prestige early’
En los cruzamientos donde no se generó fruto pudo deberse en gran medida a las
condiciones ambientales adversas, las cuales pueden causar la no funcionalidad
polínica. En la Figura 4 se muestra el comportamiento de la temperatura durante
el periodo de polinizaciones y es evidente que a partir del 24 de octubre de 2012
la diferencia en temperatura en las horas desde las 10:00 hasta las 12:00 del día
está muy marcada. La temperatura intermedia ocurrió a las 11:00 am y es cuando
se lograron los mejores resultados de la polinización en frutos y semillas
cosechadas.
La humedad relativa muestra un comportamiento similar, a las 10:00 se observa
que es mayor y disminuye conforme transcurre el tiempo. El ambiente es más
seco a las 12:00 pm; por lo tanto a las 11:00 am se obtuvieron las mejores
condiciones para la fecundación (Figura 4)
23
Figura 4. Temperatura y humedad relativa durante los meses en que se efectuaron las hibridaciones en nochebuena nativa y ‘Prestige early’.
24
CONCLUSIONES
Se determinó que el estigma es receptivo cuando los tres pistilos están expuestos
completamente, y aun no emerge el ovario del receptáculo floral.
La producción de semilla por hibridación artificial, se vió afectada por la hora de
polinización, la mejor hora para depositar el polen en el estigma fue las 11 de la
mañana, ya que produjo la mayor cantidad de frutos y semillas. En ese horario se
tuvieron condiciones de temperatura y humedad relativa más favorables.
Los cruzamientos que generaron el mayor número de semillas fueron de la
procedencia de Morelos por ‘Prestige early’ con remoción gradual de anteras y
polinizadas a las 11:00 am.
AGRADECIMIENTOS
El primer autor, agradece al CONACYT el apoyo otorgado mediante la beca
261446 para la realización de estudios de maestría en ciencias.
25
LITERATURA CITADA
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pulcherrima L. International Journal of AgriScience Vol. 1 303-310.
27
CAPITULO lll. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS EN NOCHEBUENA (Euphorbia
pulcherrima Willd. ex Klotzsch) MEDIANTE MARCADORES MORFOLÓGICOS
Elio Campos Bravo1, Jaime Canul Ku2, María Andrade Rodríguez1*, Iran Alia
Tejacal1, Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1
1Posgrado en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural, Facultad de Ciencias
Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777)
3297046.
2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias,
3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de
Morelos.
*Autor responsable: [email protected], [email protected]
RESUMEN
En México se encuentra la mayor diversidad de nochebuena en estado silvestre,
por lo que se tiene disponibilidad de gran variabilidad genética para realizar
mejoramiento genético. La hibridación es un método por el cual se pueden
incorporar características deseadas de una planta a otra que no las tiene; sin
embargo, después de la hibridación es importante identificar los híbridos para
darles el manejo adecuado. El objetivo de este estudio fue identificar híbridos en
ocho familias F1 obtenidas de la cruza de nochebuena silvestre y la variedad
‘Prestige early’; mediante marcadores morfológicos. Se sembraron semillas de
ocho familias F1. En las plantas obtenidas, así como en los progenitores se
evaluaron 18 caracteres cuantitativos y 8 cualitativos; la evaluación se hizo en
diferentes etapas fenológicas del desarrollo. Se observó que los caracteres
28
morfológicos fueron de utilidad para identificar las diferencias y similitudes de las
ocho familias con sus progenitores, así como entre familias. Se obtuvo progenie
híbrida con características similares al progenitor masculino, variedad ‘Prestige
early’ en cinco de las ocho familias de nochebuena estudiadas.
Palabras clave: mejoramiento, híbridos, marcador morfológico, caracteres
cualitativos, caracteres cuantitativos.
SUMMARY
In Mexico there is the highest diversity of poinsettia wild, so it has high genetic
variability for breeding test. Hybridization is a method using for incorporated
desired characteristics in a plant; however, after hybridization is important to
identify the hybrids for proper handling. The objective of this study was to identify
hybrids in eight families F1 obtained from crosses with wild poinsettia variety
‘Pretige early’, using morphological markers. The seeds of the eight families were
sown. 19 quantitative and 8 qualitative characters the plants obtained and parents
were evaluated in different phenological stages. It was observed that the
morphological characters were useful to identify differences and similarities of the
eight families with parents and between families. Hybrid progeny was obtained
with characteristics similar to parent male var. “Prestige early” in five of the eight
families studied.
Key words: Improvement, hybrids, morphological marker, qualitative characters,
quantitative characters.
INTRODUCCIÓN
La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) forma parte del grupo
de plantas de la familia Euphorbiaceae que cuenta con 782 especies reconocidas,
mismas que están ubicadas en 43 géneros; la mayoría de ellas son endémicas
(Steinmann, 2002). Pertenece a una de las familias botánicas más grandes y
29
diversas del mundo (Taylor et al., 2011); se encuentra distribuida por toda la
franja del Pacifico y Centro del país.
La nochebuena es conocida comúnmente como Cuetlaxóchil, flor de navidad o
poinsettia; es símbolo de las fiestas de navidad debido a su belleza, pero además
se usa como flor de corte, en jardines, tumbas en panteones, entre otros (García
et al., 2013), es nativa de México y constituye un recurso fitogenético con
potencial para realizar mejoramiento genético a través de hibridación para generar
nuevos cultivares con características como las que exige el mercado nacional.
Por lo general, en un cruzamiento entre dos progenitores se heredan genes de
ambos progenitores, es decir, el híbrido combina caracteres de ambos
progenitores (Bai y Lindhout, 2007). Después de la hibridación es necesaria la
identificación de híbridos por medio de marcadores que ayuden a detectar las
características de similitud o diferencias de la progenie con respecto a sus
progenitores. Existen varios tipos de marcadores, la elección de alguno de ellos
depende de los objetivos, la exactitud y grado de confiabilidad que se desea
lograr, de la facilidad y de los costos que implique su utilización.
Los marcadores de tipo morfológico han sido utilizados tradicionalmente para
distinguir variedades (Tapia et al., 2005; Adugna et al., 2006), identificar
especies, familias, géneros de plantas e híbridos, por lo que se pueden estimar
diferentes niveles de variabilidad. Estos tipos de caracteres son usualmente
recesivos, codominantes o dominantes. En plantas cultivadas, los órganos más
importantes para la caracterización morfológica son los menos afectados por el
ambiente.
El conocimiento de la variación genética generada como resultado del
cruzamiento entre dos genotipos diferentes, indica que por lo general se obtendrá
variación morfológica, fisiológica, así como en la estructura genética de los
descendientes (Wen y Hsiao, 2001); la variación fenotípica puede deberse
también a diversos factores como el altitudinal, por lo que es común encontrar
diferentes fenotipos de una misma especie, en poblaciones desarrolladas a
diferentes altitudes (Ohsawa y Ide, 2007).
30
El objetivo de este trabajo fue obtener la evidencia fenotípica de que ocurrió la
hibridación entre nochebuena silvestre y la variedad ‛Prestige early’, mediante el
estudio de caracteres morfológicos de tallo hoja y bráctea.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación del experimento
La presente investigación se realizó en el Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), de Zacatepec Morelos, el cual se
encuentra a 915 msnm y ubicado a los 18° 39´ 16´´ LN y 99° 11´ 54´´ LW; el lugar
presenta clima cálido subhúmedo (Aw0), con lluvias en verano, precipitación
promedio anual de 800 mm y temperatura promedio anual de 24 °C (García,
1981).
Material de estudio
A partir de la hibridación entre nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’
se obtuvieron ocho familias de medios hermanos con diferente número de
semillas por cada una (Cuadro 3). Las semillas se pusieron a germinar en
macetas de tres pulgadas con sustrato “Sunshine mix #3. Mezcla especial” y
como testigos se pusieron a germinar veinte semillas por cada uno de los
genotipos silvestres (Morelos y Oaxaca).
Las plántulas fueron trasplantadas a los 15 días después de la emergencia y se
establecieron en macetas de 3 L con sustrato a base de tierra de hoja, ocochal y
polvillo de coco (60-20-20 v/v, respectivamente), las cuales se colocaron en un
diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones, bajo malla
luminizada (80% de luz). Las plantas no se podaron para que estas expresaran su
potencial genético en altura.
31
Cuadro 4. Semillas generadas por cada uno de los cruzamientos, y usadas para
la identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos.
Familias
Progenitor
femenino
Progenitor
masculino
Tipo de
emasculación
Hora de
polinización
Semillas
utilizadas
Familia 1 Morelos ‘Prestige early’ Gradual 10:00 25
Familia 2 Oaxaca ‘Prestige early’ Gradual 10:00 12
Familia 3 Morelos ‘Prestige early’ Gradual 11:00 88
Familia 4 Oaxaca ‘Prestige early’ Gradual 11:00 79
Familia 5 Oaxaca ‘Prestige early’ Completa 11:00 14
Familia 6 Morelos ‘Prestige early’ Completa 11:00 1
Familia 7 Morelos ‘Prestige early’ Gradual 12:00 8
Familia 8 Oaxaca ‘Prestige early’ Completa 11:00 9
Caracteres evaluados
Los caracteres cualitativos y cuantitativos se evaluaron tomando como referencia
el Manual Gráfico para la Descripción Varietal de Nochebuena (Mejía et al., 2006).
Se consideraron 26 caracteres morfológicos como los más representativos para
determinar la diferencia o similitud de la progenie con sus progenitores, los cuales
se dividieron en cuantitativos (continuos) y cualitativos (de doble estado y
multiestado). Se consideraron 18 caracteres cuantitativos como, altura de planta
(AP), distancia de entre nudos (DEN), número de nudos (NN), diámetro de
inflorescencia (DDI), longitud de pedúnculo floral (LPF), longitud de peciolo en
hoja (LPH), longitud de lámina de hoja (LLH), anchura de lámina en hoja (ALH),
luminosidad en hoja (L*H), cromaticidad en hoja (C*H), matiz de hoja (M*H),
longitud de peciolo en bráctea (LPB), longitud de lámina en bráctea (LLB),
anchura de lámina en bráctea (ALB), número de brácteas (NB), luminosidad en
bráctea (L*B), cromaticidad de bráctea (C*B) y matiz en bráctea (M*B).
Se evaluaron ocho caracteres morfológicos discretos como forma de hoja (FH),
forma de la base de la hoja (FBH), color de haz de peciolo en hoja (CHPH), color
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de envés en peciolo de hoja (CEPH), presencia de lóbulos en hojas (PLH), color
de tallo (CT), forma de bráctea (FB) y ángulo de inserción de las brácteas (AIB).
La toma de datos de realizó en diferentes etapas fenológicas del desarrollo de la
planta. La toma de datos cuantitativos de tallo, hoja y brácteas se tomaron a los
165 días después de la emergencia de planta cuando estaban en floración. El
color de hoja y brácteas se determinó con un espectrofotómetro (X- Rite® Mod.
SP 64) y los parámetros fueron luminosidad, cromaticidad y matiz, colocando las
muestras sobre una superficie de color blanco.
Análisis estadístico
Con la información generada de las variables continuas se realizó análisis de
varianza (P≤0.05) y cuando este mostró diferencias estadísticas se llevó a cabo la
comparación de medias por el método de Tukey utilizando el programa SAS (9.0).
Con base en los promedios de las variables continuas se realizó análisis de
componentes principales (ACP), con el procedimiento PRINCOMP (SAS 9.0). En
base a las modas de las variables discretas de cada una de las familias se hizo
análisis de correspondencia simple mediante el procedimiento PRINCORRESP
(SAS 9.0).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el análisis de varianza se detectaron diferencias estadísticas significativas
(P≤0.05) en la mayoría de las variables registradas, las únicas que no mostraron
diferencia estadística fueron número de nudos, longitud de lámina de hoja y matiz
de bráctea. El coeficiente de variación fue de 4.48 hasta 20%, lo cual indica las
diferencias en respuesta por cada tipo de carácter (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Cuadrados medios (C.M). y coeficiente de variación (C.V.) de los caracteres cuantitativos evaluados en la progenie F1 y su progenitor femenino (Morelos).
Variable C. M C. V. (%) Altura de planta (cm) 5344.59** 20.98
Distancia entre nudos (cm) 8.57** 32.65
Número de nudos 130.38ns 19.71
Diámetro de inflorescencia (cm) 121.91* 23.40
Longitud de pedúnculo floral (cm) 20.41** 69.97
Longitud de peciolo en hoja (cm) 5.02* 29.06
Longitud de lámina en hoja (cm) 5.55ns 14.84
Ancho de lámina en hoja (cm) 24.72** 20.19
Luminosidad de hoja 166.32** 10.47
Cromaticidad de hoja 315.15** 21.12
Matiz de hoja 86.83* 4.48
Longitud de peciolo en bráctea (cm) 2.55* 36.94
Longitud de lamina en bráctea (cm) 16.94* 24.18
Anchura de lamina en bráctea (cm) 15.31** 32.86
Número de brácteas 3792.60** 40.04
Luminosidad en bráctea 131.40** 8.84
Cromaticidad en bráctea 187.73** 9.39
Matiz en bráctea 7.87ns 10.54 *: Significativo, **: Altamente significativo, ns: no significativo, (P≤0.05).
Las plantas obtenidas de los genotipos de Morelos presentaron la mayor altura y
distancia de entrenudos comparado con las plantas F1 de las familias obtenidas
de ellas (Figura 5); en contraste, la familia 1 tuvo la menor altura y distancia de
entrenudos (Cuadro 6); para nochebuena de interior se requieren plantas de porte
compacto, por lo que la familia 1 podría ser una opción para seleccionarse,
clonarse y propagarse como nueva variedad.
Las características de luminosidad y cromaticidad de la hoja del genotipo de
Morelos mostraron valores altos de 42.77 y 31.45, respectivamente; en cambio,
valores menores fueron para la familia 7, esto significa que las hojas de familia 7
fueron de color verde obscuro. Para matiz los valores más altos los presentaron
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las familias 6 y 7. En las variables longitud de peciolo en bráctea, longitud de
bráctea, anchura de bráctea y número de brácteas, la familia 7 presento los
valores más altos. Para las variables longitud de peciolo en bráctea, longitud de
bráctea y anchura de bráctea los valores más bajos los tuvo la familia 6. Sin
embargo, en número de brácteas el genotipo Morelos fue el que presentó el valor
más bajo respecto a las familias obtenidas de las cruzas. En cuanto a la
luminosidad y cromaticidad en bráctea, la familia 6 presentó los valores más altos
(40.05 y 60.76, respectivamente), lo que significa que son plantas con brácteas de
color rojo fuerte (Cuadro 6).
Figura 5. Progenitores y su progenie F1: a: progenitor femenino, b: híbrido F1, c: progenitor masculino.
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Cuadro 6. Valores promedios de los caracteres de tallo, hoja, bráctea e inflorescencia en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Morelos por ‘Prestige early’.
Familia AP
(cm)
DEN
(cm)
AH
(cm)
L*H C*H M*H LPB
(cm)
LB
(cm)
AB
(cm)
NB L*B C*B
1 112.44b 2.04c 9.05b 40.44ab 27.25a 113.39ab 2.88ab 10.22ab 2.97ab 43.50bc 37.42ab 54.11b
3 128.21ab 2.48bc 9.05b 40.90ab 27.89a 113.39b 3.23ab 10.25ab 3.70a 52.37abc 33.75c 52.18b
6 138ab 3.5ª 12.0a 38.25b 26.06a 117.80a 2.6b 9.0b 2.50b 59.0ab 40.05a 60.76a
7 120.14ab 2.55bc 10.64ab 33.75c 19.23b 118.31a 3.7a 12.57a 4.0a 66.71a 35.89b 53.68b
Morelos 147.54a 3.27ab 8.89b 42.77a 31.45a 113.31b 2.9ab 9.63b 2.14b 33.72c 36.02bc 54.82b
DMSH 28.38 0.88 1.87 4.10 5.73 4.89 1.14 2.44 1.05 18.89 3.06 4.96
*Letras iguales en el sentido de las hileras significa similitud estadística. AP: altura de planta, DEN: distancia de entre nudos, AH: anchura de hoja, L*H: luminosidad de hoja, C*H:cromaticidad de hoja, M*H: matiz en hoja, LPB: longitud de peciolo en bráctea, LB: longitud de bráctea, AB: anchura de bráctea, NB: número de brácteas, L*B: luminosidad de bráctea, C*B: cromaticidad de bráctea. DMSH: desviación mínima significativa.
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En las familias derivadas del cruzamiento de la accesión de Oaxaca con ‘Prestige
early’ se obtuvieron diferencias altamente significativas (P≤0.01) en altura de planta,
longitud de nudos, luminosidad de hoja, cromaticidad de hoja y anchura de bráctea,
así como diferencias significativas en matiz de hoja, longitud de peciolo de hoja y
número de brácteas por planta. La mitad de los caracteres estudiados no mostraron
diferencias significativas. El intervalo de variación fue mayor que el obtenido en las
familias provenientes del cruzamiento de la accesión de Morelos con el mismo
Progenitor ‘Prestige early’ (Cuadro 7).
Cuadro 7. Cuadrados medios del análisis de varianza y coeficiente de variación de las variables de la progenie F1 y su progenitor femenino (Oaxaca).
Variable
Cuadrados
medios
Coeficiente de
variación (%)
Altura de planta (cm) 12825.55** 21.05
Distancia entre nudos (cm) 4.52** 27.16
Número de nudos 99.55 ns 17.52
Diámetro de inflorescencia (cm) 42.62ns 25.72
Longitud de pedúnculo floral (cm) 4.31ns 75.26
Longitud de peciolo en hoja (cm) 2.39ns 30.34
Longitud de lámina en hoja (cm) 7.76ns 15.54
Ancho de lámina en hoja (cm) 6.87ns 21.61
Luminosidad de hoja 166.22** 13.17
Cromaticidad de hoja 200.78** 20.72
Matiz de hoja 43.38* 3.30
Longitud de peciolo en bráctea (cm) 2.08* 26.91
Longitud de lámina en bráctea (cm) 8.06ns 23.34
Anchura de lámina en bráctea (cm) 17.39** 30.15
Número de brácteas 1318.40** 39.23
Luminosidad en bráctea 47.53ns 22.22
Cromaticidad en bráctea 33.01ns 12.63
Matiz en bráctea 13.34ns 15.15
*Significativo ** Altamente significativo, ns=no significativo (P≤0.05).
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La mayor altura de planta y la distancia de entre nudos la presentó el genotipo de
Oaxaca respecto a las familias. En tanto que, la familia 2 tuvo los valores más bajos
(Cuadro 8). Para el mercado es importante tener plantas de porte bajo y con un
peciolo corto, por lo que la familia 4 reúne las características antes mencionadas y
es candidata a ser seleccionada.
En cuanto a luminosidad y cromaticidad de la hoja la familia 8 presentó los valores
más bajos lo que indica que son plantas de un color de hoja verde obscuro; mientras
que, el genotipo de Oaxaca presentó los valores más altos, por lo anterior se puede
decir que esas plantas son de un color verde pálido. En la longitud de peciolo en
bráctea, la familia 8 tuvo la máxima longitud; mientras que, la familia 2 tuvo el valor
mínimo con respecto a las demás familias. En cuanto a ancho de bráctea, la familia
2 presentó brácteas más anchas; en tanto que, el genotipo de Oaxaca tuvo menos
anchura de este órgano con respecto a las familias (Cuadro 8).
Cuadro 8. Variables promedio de los caracteres de tallo, hoja, bráctea en plantas de nochebuena obtenidas a partir del cruzamiento del genotipo de Oaxaca por ‘Prestige early’.
Familia AP
(cm)
DEN
(cm)
L*H C*H M*H LPB
(cm)
AB
(cm)
2 122.43b 2.14b 42.09ab 31.55a 111.85b 2.57b 4.85a
4 115.63b 2.48ab 40.0ab 27.77ab 113.96ab 2.76ab 3.63b
5 122b 3.02a 42.18ab 29.59ab 112.96ab 3.06ab 3.43bc
8 128.39ab 2.57ab 36.23b 23.74b 116.40a 3.72a 4.05ab
Oaxaca 158.41a 3.20a 42.96a 31.94a 112.32ab 2.93ab 2.33c
DMSH 31.27 0.84 2.67 6.80 4.19 0.87 1.12
*Letras iguales en el sentido de las hileras significa similitud estadística. AP: altura de planta, LN: longitud entre nudos, LH: longitud de hoja, C*H: cromaticidad de hoja, M*H: matiz en hoja, LPB: longitud de peciolo en bráctea, AB: anchura de bráctea, NB: número de brácteas. DMSH: desviación mínima significativa.
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Los cuatro primeros componentes principales explicaron el 82% de la variabilidad
morfológica observada. El CP1 con un valor propio de 6.61 explicó el 36.75% de
variación, donde las variables de mayor contribución fueron luminosidad de hoja,
cromaticidad de hoja, matiz de hoja y número de nudos. Como se demuestra, este
componente estuvo formado por los caracteres que determinan el color de las hojas.
El CP2 explicó el 26.14% de la variación total, las variables luminosidad en bráctea,
cromaticidad en bráctea, longitud de bráctea y distancia de entre nudos fueron los
caracteres que influyeron en mayor proporción para determinar el componente. De la
misma forma, el CP3 contribuyó con el 10.75% de la variación y su relación es
principalmente con anchura de lamina en hoja. El CP4 fue determinado
principalmente por la altura de la planta (Cuadro 9). Estos resultados fueron
similares a lo reportados por Nieto et al. (2008), al caracterizar poblaciones nativas
de pasto banderita (Bouteloua curtipendula Michx.) quienes encontraron que los tres
primeros componentes explicaron el 63% de la variación total entre los diferentes
ecotipos de pasto banderita.
39
Cuadro 9. Proporción de la varianza global, vectores y valores propios del análisis de componentes principales (CP) en la progenie F1 de nochebuena.
Variables CP1 CP2 CP3 CP4
AP -0.176 0.219 -0.126 0.502
DEN -0.089 0.362 -0.043 0.159
NN -0.109 -0.315 0.175 0.367
DDI 0.253 0.015 -0.074 -0.110
LPF 0.185 0.099 -0.294 0.335
LPH 0.235 0.003 0.397 0.400
LLH -0.284 -0.166 -0.109 0.011
ALH 0.221 0.176 0.426 0.258
L*H -0.371 -0.062 0.081 0.017
C*H -0.369 -0.044 0.151 0.089
M*H 0.335 0.213 -0.011 -0.035
LPB 0.238 -0.131 -0.461 0.073
LDB -0.092 0.383 -0.009 -0.180
AB 0.170 -0.337 0.205 0.012
NB 0.364 0.111 -0.066 0.067
L*B -0.092 0.383 -0.009 -0.180
C*B -0.064 0.352 0.371 -0.133
M*B -0.202 0.207 -0.287 0.367
Valores propios 6.61 4.70 1.93 1.67
Varianza explicada (%) 36.75 26.14 10.75 09.32
Varianza acumulada (%) 36.75 62.90 73.64 82.96
AP: Altura de planta; DEN; Distancian entre nudos; NN: Número de nudos; DDI: Diámetro de inflorescencia; LPF: Longitud del pedúnculo floral; LPH: Longitud de peciolo en hoja; LLH: Longitud en lámina de hoja; ALH: Anchura de lámina en hoja; L*H: Luminosidad en hoja; C*H: Cromaticidad en hoja; M*H: Matiz en hoja; LPB: Longitud de peciolo en bráctea; LDB: Longitud de bráctea; AB: Anchura de bráctea; L*B: Luminosidad en bráctea; C*B: Cromaticidad en bráctea; M*B: Matiz en bráctea.
Con base en CP1 y CP2 se construyó la Figura 6, donde se observa la distribución
de las ocho familias con sus respectivos progenitores femeninos. Las familias 3, 7 y
8 comparten similitud en longitud del peciolo de bráctea y fueron las que tuvieron el
mayor número de brácteas. Las familias 1, 2 y 5 presentan similar longitud de
pedúnculo floral y poseen los valores más bajos respecto a las otras familias, lo que
40
quiere decir, que tienen una inflorescencia compacta. La familia 6, presenta los
valores más altos en características como; distancia entre nudos, luminosidad y
cromaticidad en bráctea; sin embargo, en longitud de bráctea tuvo el valor más bajo
con respecto a las demás familias.
Figura 6. Distribución de ocho familias de medios hermanos y sus progenitores femeninos en función del primero y segundo componente principal.
La forma de hoja que presentan las familias 6 y 7 es triangular y difiere de la forma
de hoja de ambos progenitores, lo que permite señalar que son plantas híbridas. En
la forma de la base de hoja, la familia 3 mostró similar forma que su progenitor
masculino, esto indica que la tendencia o carga genética fue hacia la nochebuena
mejorada. En color del haz del peciolo de hoja todas las familias fueron parecidas al
progenitor masculino; mientras que, en el color del envés de peciolo en hoja solo la
familia 1 presentó similitud con el progenitor masculino. En lóbulo de hoja y color de
tallo las familias fueron completamente distintas a sus parentales (Figura 7), por lo
que se puede decir que el tipo de herencia posiblemente es intermedia. En forma de
bráctea e inserción de brácteas las familias 3, 6 y 7 presentaron similitud con el
progenitor masculino y la familia 1 con el progenitor femenino, la tendencia fue a
tener mayor parecido con el progenitor masculino (Cuadro 10).
41
Figura 7. Características de: diámetro de brácteas, color de tallo, forma de bráctea y forma de hoja en progenitores y su progenie F1 en nochebuena. a: progenitor femenino, b: hibrido F1, c: progenitor masculino.
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Cuadro 10. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo Morelos por ‘Prestige early’, así como de los progenitores.
Familia FH FBH CHPH CEPH PL CT FB AIB
1 Elíptica Cuneiforme Rojo intenso Rojo medio Fuerte Verde medio Elíptica Agudo
3 Ovalada Circular Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde medio Ovalada Llano
6 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde medio Ovalada Llano
7 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Rojo medio Ovalada Llano
Morelos Elíptica Cuneiforme Rojo medio Rojo bajo Medio Verde bajo Ovalada Agudo
Prestige
Early Ovalada Circular Rojo intenso Rojo medio Ausente Rojo bajo Elíptica Llano
FH: forma de hoja, FBH: forma de la base de la hoja, CHPH: color del haz del peciolo de hoja, CEPH: color de envés de peciolo de hoja, PL: presencia de lóbulos en hoja, CT: color de tallo, FB: forma de bráctea y AIB: ángulo de inserción de bráctea.
43
La forma de hoja que tienen las familias 2, 4 y 8 es triangular, que es diferente a la
forma de hoja de los progenitores, lo que permite decir, que el tipo de herencia para
ese carácter fue intermedio. La forma de base de hoja de las familias 2 y 8 es similar
con el progenitor masculino. Mientras que, las familias 4 y 5 comparten forma de
hoja con el progenitor femenino. Para el color de haz de peciolo en hoja, todas las
familias comparten el mismo color con el progenitor masculino. Lo que permite saber
que para ese carácter el progenitor masculino fue dominante. En el color del envés
de peciolo la familia 2 fue totalmente diferente a los progenitores, esto indica que
son plantas hibridas. En la presencia de lóbulos en hojas las familias 2, 4 y 8 fueron
diferentes a sus progenitores. El color de tallo de la F1 fue más parecido al progenitor
de Oaxaca. Sin embargo, para inserción de brácteas las familias tendieron a ser
similares al progenitor masculino ‘Prestige early’ (Cuadro 11).
44
Cuadro 11. Caracteres morfológicos cualitativos de las familias obtenidas del cruzamiento del genotipo Oaxaca por ‘Prestige early’, así como de los progenitores.
Familia FH FBH CHPH CEPH PL CT FB AIB
2 Triangular Circular Rojo intenso Verde bajo Fuerte Verde bajo Ovalada Llano
4 Triangular Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Fuerte Verde bajo Ovalada Llano
5 Elíptica Cuneiforme Rojo intenso Rojo bajo Ausente Verde bajo Ovalada Agudo
8 Triangular Circular Rojo intenso Rojo medio Fuerte Rojo bajo Ovalada Llano
Oaxaca Elíptica Cuneiforme Rojo medio Rojo bajo Medio Verde bajo Ovalada Agudo
‘Prestige
early’ Ovalada Circular Rojo intenso Rojo medio Ausente Rojo bajo Ovalada Llano
FH: forma de hoja, FBH: forma de la base de la hoja, CHPH: color del haz del peciolo de hoja, CEPH: color de envés de peciolo de hoja, PL: presencia de lóbulos en hoja, CT: color de tallo, FB: forma de bráctea y AIB: ángulo de inserción de bráctea.
45
El análisis de correspondencia simple indica que el valor singular (0.27312) 1ג explicó
el 54.19% de la variabilidad; el valor singular (0.20786) 2ג contribuyó con el 31.39%;
ambos ejes aportan el 85.59% de la variación global. Los primeros cuatro ejes
explican el 96.97% de la varianza total (Cuadro 12).
Cuadro 12. Valores de la composición de la inercia y Chi-cuadrada del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena.
Eje principal Valor singular
Inercia
principal Chi-cuadrada Porcentaje
Porcentaje
acumulado
54.19 54.19 30.8829 0.0746 0.27312 1ג
85.58 31.39 17.8869 0.0432 0.20786 2ג
92.76 7.19 4.0957 0.00989 0.09946 3ג
96.97 4.21 2.3983 0.00579 0.07611 4ג
98.49 1.52 0.8682 0.0021 0.0458 5ג
99.45 0.96 0.545 0.00132 0.03628 6ג
99.84 0.39 0.2228 0.00054 0.0232 7ג
100 0.16 0.0906 0.00022 0.01479 8ג
En la integración del primer eje la mayor contribución estuvo dada por color de tallo y
color del envés en peciolo de hoja; el segundo eje fue definido por la forma de hoja y
el tercer eje por la intensidad de color en tallo (Cuadro 13).
46
Cuadro 13. Contribuciones relativas (CR) y absolutas (CA) asociadas con los tres primeros ejes principales del análisis de correspondencia simple en familias F1 de nochebuena.
Variable CR1 CA1 CR2 CA2 CR3 CA3
FH 0.0367 0.0151 0.9388 0.6676 0.0198 0.0616
FBH 0.1489 0.0122 0.603 0.0851 0.0403 0.0249
CHP 0.1401 0.0025 0.6312 0.0198 0.0872 0.0119
ICHP 0.1847 0.0054 0.2926 0.0148 0.0435 0.0096
CEP 0.8416 0.0614 0.0465 0.0059 0.0783 0.0431
ICEP 0.0975 0.0079 0.3625 0.0508 0.2417 0.1479
PL 0.7065 0.1516 0.0067 0.0025 0.2215 0.3584
CT 0.9727 0.7187 0.0105 0.0134 0.0141 0.0786
ICT 0.0203 0.0023 0.3096 0.0602 0.3015 0.2561
FB 0.3398 0.0205 0.4974 0.0518 0.0097 0.0044
AIB 0.1001 0.0024 0.687 0.0282 0.0195 0.0035
FH : Forma de hoja; FBH: Forma de la base en hoja; CHP: Color del haz en peciolo de hoja; ICHP: Intensidad de color en el haz de peciolo de hoja; CEP: Color del envés en peciolo de hoja; ICEP: Intensidad de color en envés de peciolo de hoja; PL: Presencia de lóbulos en hoja; CT: Color de tallo; ICT: Intensidad de color en tallo; FB: Forma de bráctea; AIB: Angulo de inserción de bráctea.
47
La agrupación de las familias con base en los ejes 1 y 2 fue la formación de tres
grupos.
En el cuadrante I se localiza solamente la familia 5 que se caracteriza por tener
forma de hoja elíptica, base de hoja cuneiforme, color rojo intenso del haz de peciolo,
color rojo bajo en el envés de peciolo, lóbulos de hoja ausente, color verde bajo en
tallo, forma de la bráctea ovalada y ángulo de inserción de brácteas agudo (Figura 8).
En el cuadrante II se localizó solo el progenitor masculino ‘Prestige early’
caracterizado por tener forma de hoja ovalada, base de hoja circular, color rojo
intenso del haz de peciolo, color rojo medio en el envés de peciolo, lóbulos de hoja
ausente, color rojo bajo en tallo, forma de la bráctea ovalada y ángulo de inserción de
brácteas llano.
En el cuadrante lll se ubicaron cinco de las ocho familias evaluadas, las cuales
comparten el color rojo intenso en el haz del peciolo en hoja, presencia fuerte de
lóbulos en las hojas, forma de brácteas ovalada y ángulo de inserción de las brácteas
llano (recto), esto indica que son plantas hibridas principalmente por el color rojo
intenso del peciolo y la presencia fuerte de lóbulos en las hojas.
En el lV cuadrante se encuentran localizados los progenitores y la familia 1 que
comparten la forma elíptica de hoja, forma cuneiforme en base de hoja, color rojo
medio en envés de peciolo, forma elíptica de bráctea y el ángulo de inserción agudo
en brácteas. Esto permite ver que en la hibridación los caracteres que expresó la
familia 1 fueron más similares al progenitor femenino (Figura 8). Esto indica que los
marcadores morfológicos son útiles para determinar similitud y diferencias de la
progenie con sus progenitores. Lo que concuerda con lo reportado por Puga et al.
(2011), al caracterizar el Lirio Azteca mediante marcadores morfológicos, donde
estos permitieron diferenciar las cuatro variedades de Sprekelia formosissima.
48
Figura 8. Dispersión de ocho familias F1 y sus progenitores de acuerdo a sus características cualitativas.
CONCLUSIONES
Los 26 marcadores morfológicos fueron útiles para identificar las diferencias o
similitudes de las familias F1 con respecto a sus progenitores, así como la
variabilidad fenotípica entre las familias F1 de nochebuena.
El análisis de correspondencia simple permitió la formación de cuatro grupos con
integración de los mismos con base a sus características cualitativas.
49
La diversidad en caracteres de distribución cualitativa fue importante para la
selección de materiales con posibilidades de ser introducidos al mercado como
nuevas variedades de origen mexicano.
En cinco de ocho familias F1 de nochebuena se observó progenie híbrida con
características similares al progenitor macho comercial.
AGRADECIMIENTOS
El autor principal agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)
el apoyo otorgado mediante la beca 261446 para la realización de estudios de
Maestría en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural.
50
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52
CAPÍTULO IV. IDENTIFICACIÓN DE HÍBRIDOS F1 DE NOCHEBUENA (Euphorbia
pulcherrima Willd. ex Klotsch) MEDIANTE MARCADORES RAPD
Elio Campos Bravo1, María Andrade Rodríguez1*, Jaime Canul Ku2, Iran Alia Tejacal1,
Antonio Castillo Gutiérrez3, Jesús Vargas Araujo1
1Posgrado en Ciencias Agropecuarias y Desarrollo Rural, Facultad de Ciencias
Agropecuarias, 62209, Col. Chamilpa, Cuernavaca Mor. Tel. y Fax. 01(777) 3297046.
2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias,
3 Instituto Profesional de la Región Oriente. Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
*Autor responsable: [email protected], [email protected]
RESUMEN
Aunque la nochebuena es una planta nativa de México, el mejoramiento genético se
ha efectuado en otros países. Sin embargo, en el Instituto de Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias del estado de Morelos se realizó
hibridación entre plantas de nochebuena silvestre con la variedad comercial Prestige
early, se obtuvieron ocho familias F1, en las cuales es necesario comprobar tal
hibridación, al comparar la relación genética que existe entre la progenie y sus
progenitores. El objetivo de este estudio fue verificar el origen híbrido de plantas F1
obtenidas del cruzamiento de nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’,
mediante el uso de marcadores moleculares RAPD. Se hizo extracción de ADN puro
de 37 plantas F1; así como, de tres muestras de los progenitores. Se realizaron
amplificaciones de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa con 10
iniciadores RAPD. Los fragmentos generados por los iniciadores mostraron alto
53
polimorfismo (37 a 56%) y permitieron identificar como híbridas a las 37 plantas F1
estudiadas. El iniciador de mayor utilidad fue el 2 cuya secuencia fue 5’ CAA TCG
CCG T 3’. Además, se identificó que las plantas de la familia 1 tuvieron mayor
similitud genética con el progenitor macho ‘Prestige early’.
Palabras clave: Hibridación, similitud genética, fragmentos marcadores
SUMMARY
Although the poinsettia is a native of Mexico, genetic improvement has been made in
other countries. However, in National Institute for Forestry, Agriculture and agriculture
in the state of Morelos hybridization was performed between wild plants poinsettia
with commercial variety ‘Prestige early’ eight families F1 in which it is necessary to
check such hybridization were obtained, comparing genetic relationship between
progeny and their progenitors. The aim of this study was to verify the origin of plants
F1 produced by crossing wild poinsettia by variety ‘Prestige early’ using molecular
markers RAPD. Pure DNA extraction of 37 F1 plants and three samples of the parents
were made. Were performed amplifications DNA using the chain reaction of the
polymerase with primers RAPD. The fragments generated by primers showed high
polymorphism (37-56%) and helped identify as hybrid F1 at 37 plants studied. The
most useful initiator was two whose sequence was 5 'CAA TCG CCG T 3'. In addition,
it was found that plants from family 1 had greater genetic similarity to the male parent
‘Prestige early’.
Key words: Hybridization, genetic similarity, fragments markers.
54
INTRODUCCIÓN
México es el centro de origen de la nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex
Klotzsch), esta especie se distribuye desde el litoral del Océano Pacifico hasta
Guatemala (Steinmann, 2002). La nochebuena fue introducida a los Estados Unidos
por Joel Robert Poinsett en 1825 (Lee et al., 2004). Ecke et al. (2004) reportan que
Robert Buist fue quien la vendió como planta ornamental por primera vez en el año
1834. En México, los principales estados donde se produce planta de nochebuena
son Jalisco, Michoacán, Morelos, Oaxaca y Puebla, así como el Distrito Federal
donde se destinan 252.48 h-1 a la producción, con un valor de $431,315.33 pesos de
la producción. Morelos destina a la producción 97.5 h-1 con un valor de $142,518.85
pesos de la producción (SIAP, 2012).
En los últimos años, los mejoradores han puesto en el mercado variedades
mejoradas con gran diversidad en colores (rosa, variegado, mármol y bicolores) y
tamaños de brácteas, éstas variedades se generaron por diversos métodos de
mejoramiento genético como son hibridación, selección y mutagénesis con rayos X o
rayos gama (Starman, 1999).
Para generar variabilidad en esta planta ornamental se han utilizado diversos
métodos desde el más sencillo, que es la hibridación hasta llegar a la biotecnología,
pero uno de los más importantes y que ha dado buenos resultados es la hibridación.
Después de obtener la progenie por hibridación es necesario identificar si ésta
presenta características de ambos progenitores o de alguno de ellos, principalmente
las de interés para el fitomejorador.
Existen varias formas para identificar a los híbridos entre las que destacan los
marcadores morfológicos y moleculares a nivel de ADN (ácido desoxirribonucleico).
Los marcadores morfológicos son fáciles de realizar y de bajo costo, pero son
afectados por el medio ambiente. Bajo este contexto, los marcadores moleculares
representan una alternativa más confiable, aunque sean costosos y se requiera de
equipo especializado (Hebert et al., 2003).
55
Los marcadores moleculares se han utilizado en estudios de diversidad genética intra
e inter poblacional en especies silvestres, cultivadas o mejoradas, para el desarrollo
de mapas de ligamiento y de las relaciones filogenéticas entre especies (Azofeifa-
Delgado, 2006), hoy en día son la principal herramienta empleada en
microorganismos, animales y plantas para la identificación de genotipos, determinar
la pureza, caracterización de germoplasma, asistir el mejoramiento genético e
identificación de genes específicos para realizar la recombinación genética (Sánchez,
2002).
Las variaciones en los marcadores de ADN no se muestran por sí mismas en el
fenotipo, porque pueden ser diferencias en un solo nucleótido o en un fragmento de
ADN repetitivo. La mayoría de los marcadores moleculares se clasifican en dos
categorías, las técnicas que se basan en la hibridación, o aquellas que emplean la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR); la introducción de esta tecnología
permitió nuevas posibilidades para la detección del polimorfismo genético. El
polimorfismo se observa debido a que la variación en la secuencia del genoma altera
los sitios de reconocimiento del iniciador, permite la generación de grandes números
de marcadores; su utilización no es técnicamente difícil y solo utiliza mínimas
cantidades de material genético. Los marcadores de PCR emplean iniciadores de
secuencia arbitraria, semiarbitraria o específica (Velasco, 2005). Los marcadores
moleculares son una herramienta útil para analizar directamente el ADN, sin la
influencia del ambiente u otros factores.
La técnica RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) se emplea para la
identificación de híbridos. Pillay et al. (2000) utilizaron este marcador para la
identificación de genes ligados a los genomas A y B de Musa spp; Göntér et al.
(2002) indican que los RAPD fueron de utilidad para la detención de híbridos
somáticos de trigo con maíz, Cheng et al. (2004) usaron ésta técnica para la
identificación de híbridos somáticos en productos de fusión de trigo con Agropyron
elongatum, Crouch et al. (2000) emplearon los RAPD como una técnica de análisis
de diversidad genética en variedades de Musa spp.
56
Como ya se indicó, aunque la nochebuena es una planta nativa de México el
mejoramiento genético se ha efectuado en otros países. Sin embargo, en el Instituto
de Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias del estado de
Morelos se realizó hibridación entre plantas de nochebuena silvestre con la
variedad comercial ‘Prestige early’, se obtuvieron ocho familias F1, a las cuales es
importante comprobar su origen híbrido.
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue verificar el origen híbrido de plantas F1
obtenidas del cruzamiento de nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’,
mediante el uso de marcadores moleculares RAPD.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización
La investigación se realizó en el laboratorio de Producción Agrícola del Campo
Experimental de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma
del Estado de Morelos, con ubicación geográfica de 18° 58’ 54.71’’ LN, 99° 13’
59.14’’ LO y 1876 msnm.
Material vegetal
Se utilizaron ocho familias de plantas F1 provenientes de cruzamientos entre
nochebuena silvestre y la variedad comercial ‘Prestige early’, previamente
seleccionadas de manera visual, ya que presentaron diferencias morfológicas con
relación a sus progenitores o bien fueron similares con el progenitor masculino. En
total se estudiaron 37 plantas F1 más 3 muestras de las plantas progenitoras.
57
Extracción de ADN genómico
Se utilizaron segmentos de hojas jóvenes y sanas, eliminando las nervaduras. Se
pesaron 100 mg en condiciones asépticas, se colocaron en tubos eppendorf de 1.5
mL y se almacenaron a -20 °C en un congelador hasta la extracción de ADN.
La extracción de ADN se basó en el método descrito por Andrade et al. (2005) con
algunas modificaciones. Las hojas se molieron en morteros de porcelana (congelados
y esterilizados) con nitrógeno líquido hasta obtener polvo fino, el cual se colocó en un
tubo eppendorf de 1.5 mL y homogenizado con 900 µL de amortiguador de
extracción de ADN (5% (w/v) CTAB (hexadeciltrimetil-amonio bromuro), 100 mM Tris-
HCI pH 7.5, 10 mM EDTA (ácido ethilenediaminotetracetico, sal disodio, dihidrato-
Na2), 0.7 M NaCl, 5% (w/v) sarcosil, 140 mM 2-mercaptoetanol) y calentado por 30
min a 65 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, después se aplicó
cloroformo: alcohol isoamílico (24:1 v/v) y se centrifugó a 12 000 rpm por 8 min. El
sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorf esterilizado y se realizó una
segunda extracción de ADN con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1
v/v) y centrifugado a 12 000 rpm por 8 min, se realizó una tercera extracción de ADN
con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se agregó 0.1 volumen de
CTAB [10% (w/v) CTAB, 0.7 M Na Cl].
Para la precipitación del ADN, el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf
esterilizado, se agregó un volumen de amortiguador de precipitación [1% (w/v)
CTAB, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA] y después se centrifugó a 10 000 rpm
por 5 min. El sobrenadante se desechó y la pastilla o “pellet” obtenida se disolvió en
500 µL de solución TE alto en sales (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 M NaCl)
más 75 µL de cloruro de sodio 5 M calentado a 65 °C. Después de enfriar a
temperatura ambiente, el ADN se precipitó agregando 800 µL de etanol frío y luego
fue centrifugado a 12 000 rpm por 5 min, el sobrenadante fue desechado. El ADN se
lavó con 700 μL de etanol al 70% frío y centrifugando a 12 000 rpm por 5 minutos. El
procedimiento de lavado se repitió con 400 mL etanol puro frío y nuevamente
centrifugado a 12 000 rpm por 5 min, el sobrenadante se eliminó y se dejó que el
58
etanol se evaporara completamente. El ADN resultante fue disuelto en 30 μL de 0.1
TE (1 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA) con 20 ng μL−1 de Ribonucleasa (SIGMA),
incubándose a 37.5 °C por 40 min. El ADN se almacenó a -20 °C.
Evaluación de la calidad de ADN
La integridad de ADN extraído fue determinada mediante separación de fragmentos
por electroforesis en gel agarosa ultrapura (Invitrogen®) al 0.8%, el gel fue teñido con
bromuro de etidio, EDTA] (Andrade et al., 2005). La electroforesis se realizó por 2
horas a 80 volts en cámara de electroforesis (Apollo® Mod. 75-2321) con
amortiguador TAE 1X [0.04 M Tri-Base, 0.1142% (v/v) ácido acético glacial, 1 mM. El
gel se visualizó en un transiluminaror con luz ultra violeta y se fotografió.
Concentración de ADN
La concentración de ADN se estimó con lectura a densidad óptica (DO) de 260 nm,
la relación entre las lecturas de absorción a 260 y 280 nm (DO260/280) permitió
determinar la pureza. La cuantificación se realizó en espectrofotómetro (HACH®
Mod. DR 5000). Para estimar la concentración de ADN genómico (1.8 a 2.0 ng/µL),
se utilizó la fórmula:
Concentración de ADN (µg µL-1)= DO260 X 100 (factor de disolución) X 50 µg/mL
1000
Amplificación de ADN mediante RAPD
Para la identificación de híbridos se seleccionaron diez iniciadores RAPD, con una
secuencia aleatoria de diez oligonucleótido, de acuerdo a los trabajos realizados por
Ling (1997) y Galindo (2010) mismos que se muestran en el Cuadro 14.
59
Cuadro 14. Iniciadores utilizados en la reacción de amplificación de ADN para la identificación de híbridos de nochebuena.
Iniciador Clave Secuencia de bases
1 7 5’ GAA ACG GG T G 3’
2 11 5’ CAA TCG CCG T 3’
3 12 5’ TCG GCG ATA G 3’
4 26 5’ TGC TCT GCC C 3’
5 27 5’ GGT GAC GCA G 3’
6 30 5’ CTG CTG GGA C 3’
7 31 5’ GTA GAC CCG T 3’
8 46 5’ GAA CGG ACT C 3’
9 49 5’ CTC ACC GTC C 3’
10 53 5’ AAG CCT CGT C 3’
La mezcla de reacción estuvo constituida por 4 µL de ADN molde (20 ng µL-1) y 2 µL
de iniciador (10 pmol mL-1), 10 µL de dNTPs (5 µM de cada dNTPs), 2 µL de
amortiguador de carga (buffer PCR), 1.5 µL de cloruro de magnesio (MgCl, 75 mM),
4.7 µL de agua destilada deionizada estéril, y por último 0.3 µL (1.5 U) de enzima
Taq ADN polimerasa (Thermus aquaticus) por cada muestra. La ampliación del ADN
genómico se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un
termociclador (Techne® Mod. TC-412), la cual comprendió un ciclo de pre-
desnaturalización de ADN a 94 °C por 4 min y 36 ciclos integrados: 1 min a 94 °C
para separar las hélices de ADN, 1 min a 36 °C para alineación del iniciador, 2 min a
72 °C para la polimerización de ADN y un ciclo de extensión final de 10 min a 72 °C.
60
La separación de fragmentos amplificados se hizo por electroforesis en gel de
agarosa al 1.5% (w/v) (Invitrogen®), la cual se disolvió en 250 mL de TAE 1X y se
añadieron 13 µL de bromuro de etidio, se usó una cámara de electroforesis (Apollo®
Mod. 75-2321) con amortiguador TAE 1X [0.04 M Tris-Base, 0.1142% (v/v) ácido
acético glacial, 1 mM EDTA]. La electroforesis se corrió a 80 volts por un periodo de
3.5 horas. En el primer carril se colocó la escalera de ADN (kb ladder plus ADN,
Invitrogen®), la cual se utilizó para estimar el peso de las bandas de ADN de los
productos amplificados. Los geles fueron fotografiados en el fotodocumentador y se
obtuvieron los tamaños de los fragmentos generados por los RAPD, utilizando el
programa Genetools®.
Análisis de datos moleculares
El análisis de datos moleculares para la evaluación de los híbridos se realizó
comparando los patrones de bandeo, como presencia (1) y ausencia (0) de bandas,
de los progenitores y la plantas F1. Con esta información se construyó una matriz de
similitud empleando el coeficiente de similitud desarrollado por Dice (1945). Los
valores de dicho coeficiente se calcularon mediante la expresión: coincidencias
(coincidencias + no coincidencias) entre RAPD. Con estos datos se realizó un
análisis de grupos (clúster) usando el método UPGMA (unweighted pair-group
method arithmetical averages) (Rolf, 1972) del programa de computo NTSYS
(Applied Biostatistic Inc; NY USA). Con los resultados de dicho análisis se construyó
un dendrograma.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todos los iniciadores utilizados en la amplificación de ADN generaron bandas
monomórficas y polimórficas; en total fueron 101 bandas, de las cuales 49% fueron
polimórficas. El iniciador 5 con la secuencia 5’ GGT GAC GCA G 3’ amplificó el
mayor número de fragmentos de ADN (Figura 9), de la cuales 46% fueron
polimórficas; sin embargo, el iniciador 8 con la secuencia 5’ GAA CGG ACT C 3’ fue
61
el que tuvo el mayor porcentaje de polimorfismo (Cuadro 15). En este estudio el
porcentaje de polimorfismo varió de 37 a 56% y fue mayor a lo reportado por Ling
(1997) en la identificación de nueve cultivares comerciales de nochebuena, ya que
obtuvo 48 bandas en total y polimorfismo de 33%; de igual modo Starman (1999) al
investigar las relaciones estrechas entre 11 cultivares de nochebuena solo obtuvo
31% de bandas polimórficas.
Todas las plantas F1 estudiadas fueron identificadas como híbridas dado que
generaron bandas similares al progenitor macho, mismas que no estuvieron
presentes en el progenitor femenino. Sin embargo, ningún iniciador generó las
bandas necesarias para corroborar el origen de las 37 plantas estudiadas.
Cuadro 15. Bandas totales, polimórficas y porcentaje de polimorfismo para la identificación de plantas hibridas de nochebuena mediante RAPD.
Iniciador-Clave Secuencia de bases Bandas totales
Bandas polimórficas
Porcentaje de polimorfismo
1-7 5’ GAA ACG GG T G 3’ 10 5 50
2-11 5’ CAA TCG CCG T 3’ 11 6 55
3-12 5’ TCG GCG ATA G 3’ 9 4 44
4-16 5’ TGC TCT GCC C 3’ 11 5 45
5-17 5’ GGT GAC GCA G 3’ 13 6 46
6-20 5’ CTG CTG GGA C 3’ 8 3 37
7-21 5’ GTA GAC CCG T 3’ 10 5 50
8-36 5’ GAA CGG ACT C 3’ 9 5 56
9-39 5’ CTC ACC GTC C 3’ 12 6 50
10-43 5’ AAG CCT CGT C 3’ 8 4 50
Total 101 49
62
Figura 9. Amplificaciones de ADN de las familias 1 y 7 obtenidas con el iniciador 2 (5’ CAA TCG CCG T 3’), kb: escalera molecular, M: progenitor femenino, P: progenitor masculino, F1: familia 1, F7: familia 7. Las flechas indican las bandas que comparten las familias con el progenitor masculino.
El tamaño de los fragmentos que fueron útiles para identificar el origen híbrido de las
plantas varió de 300 pb a 2500 pb. El iniciador 2 y 5 fueron los que generaron mayor
número de bandas que permitieron identificar el origen híbrido de las plantas de todas
las familias. También el iniciador 2 junto con el 3 fueron los que identificaron plantas
hibridas en 6 de las 8 familias estudiadas, con al menos 3 fragmentos. Los diez
iniciadores fueron de utilidad para corroborar que las seis plantas de la familia 1 tuvieron
como padre a ‘Prestige early’ (Cuadro 16), los iniciadores 2 y 4 fueron los que
contribuyeron con mayor número de bandas para hacer la identificación.
Como se observa en el Cuadro 3, la familia 1 con seis plantas fue la que presento
mayor número de bandas similares al progenitor macho (40); en tanto que, el menor
número de bandas fue generado por la familia 6 con 16 bandas similares a dicho
progenitor. Esta condición de similitud de bandas con el progenitor macho permitió
63
corroborar que se dió la hibridación entre el genotipo silvestre y la variedad ‘Prestige
early’.
Con el coeficiente de Dice (1945) se construyó el dendrograma, en donde se
formaron 7 grupos a una distancia de 0.35. El grupo uno reunió a las familias 1 y 7,
más el progenitor masculino (‘Prestige early’), esto indica que estas familias tienen
mayor similitud genética con dicho progenitor, dado que generaron 99 y 58 bandas
respectivamente con los diez iniciadores. El segundo y tercer grupo lo conformó la
familia 3, para esta familia el iniciador 9 genero el mayor número de bandas similares
(23) a su progenitor masculino con la secuencia 5’ CTC ACC GTC C 3’. En el cuarto
grupo se integró la familia 4, en el quinto grupo la familia 2, en el sexto grupo la
familia 5 y 4 y en el séptimo grupo las familias 6 y 8 que son las más alejadas del
progenitor masculino debido a que comparten menor número de bandas (Figura 10).
No obstante, que las 37 plantas fueron identificadas como híbridas, los miembros de
la familia1 mostraron mayor similitud genética con ‘Prestige early’, en tanto que las
plantas de las familias 6 y 8 fueron las menos similares.
64
Cuadro 16. Bandas similares al progenitor macho para la identificación de híbridos de nochebuena mediante RAPD.
Número de plantas por familia. F1=6, F2=4, F3=10, F4=7, F5=2, F6=1, F7=4, F8=3
Iniciador y clave Secuencia Banda marcadora (pb)/plantas identificadas por familia
1-7 5’ GAA ACG GG T G 3’
F1 (1000/6, F2 (1400/3, 900/1), F3 (1600/4, 900/7), F4 (700/3), F6 (1700/1),
F7 (1400/1, 700/2), F8 (1600/2,1400/3, 1000/1, 900/1, 700/2).
2-11 5’ CAA TCG CCG T 3’
F1 (2500/5, 1200/5, 800/2, 700/2, 500/6, 300/6) F2 (2100/1, 800/4, 500/1),
F3 (2500/4, 2100/1, 800/2, 700/4, 600/7), F4 (2500/2, 1200/1, 600/5),
F5 (2500/1, 2100/1,600/1), F6 (1200/1, 700/1), F7 (2500/1, 1200/1, 800/1),
F8 (700/2).
3-12 5’ TCG GCG ATA G 3’ F1 (2300/1, 1800/4, 1600/6, 1400/6, 300/4), F2 (1800/1, 1400/3, 400/2),
F3 (2300/3, 1800/3, 1400/7), F4 (1800/2, 1400/4, 400/3), F5 (1800/1, 1400/1),
F6 (1600/1, 1100/1, 400/1), F8 (1600/2, 1400/2, 1100/3, 400/2).
4-26 5’ TGC TCT GCC C 3’ F1 (2300/3, 1900/6, 1500/1, 300/5, 1000/6, 800/6), F2 (1300/4, 800/4, 500/1),
F3 (2300/2, 1500/3), F4 (1900/1), F7 (2300/3, 1900/3).
5-27 5’ GGT GAC GCA G 3’ F1 (1400/5, 1100/5, 1000/2, 400/5), F2 (2500/3, 1300/1, 1000/2, 800/4),
F3 (800/4, 400/8), F4 (2000/2, 1700/2), F5 (1700/2), F6 (1700/1, 1000/1,
700/1), F7 (2500/4, 2000/4, 1300/3, 1000/4, 800/2,400/4), F8 (2000/1,
1700/1, 700/2).
6-30 5’ CTG CTG GGA C 3’ F1 (1800/6, 1600/5, 1100/4, 1000/6), F2 (1400/2, 1000/2), F3 (1400/6,
1200/4), F4 (1400/5, 1200/1), F5 (1400/2, 1200/2), F8 (1800/1).
7-31 5’ GTA GAC CCG T 3’ F1 (2200/6, 1300/2, 1100/4, 900/6), F2 (1500/2, 600/4), F3 (1500/7, 900/1,
600/4), F4 (1500/2, 900/5, 600/6), F5 (1500/1, 900/1, 600/1), F6 (1100/1,
600/1), F8 (1500/1, 1100/1).
8-46 5’ GAA CGG ACT C 3’ F1 (2100/6, 1600/6, 400/6), F2 (1800/1, 1600/1, 1000/4, 500/1), F3 (1000/7),
F4 (900/3), F5 (900/2), F6 (1800/1, 1000/1, 700/1), F7 (2100/4, 1800/4,
1000/4), F8 (1800/3, 1000/3, 700/3).
9-49 5’ CTC ACC GTC C 3’ F1 (1500/1, 1300/1, 1100/1, 400/6), F2 (1100/2, 800/3), F3 (1100/4), F4
(1300/1, 1100/3), F5 (1500/1, 1100/1), F6 (1300/1, 1100/1), F7 (1500/4,
1300/2), F8 (1300/3, 1100/1, 600/3).
10-53 5’ AAG CCT CGT C 3’ F1 (1700/6, 1200/6, 800/3, 500/6, 300/3), F2 (2100/4, 800/4), F3 (2100/4,
800/7), F4 (900/1, 800/4), F5 (1700/1, 900/1), F8 (900/2, 500/1).
65
Figura 10. Agrupamiento entre familias de medios hermanos de nochebuena utilizando el análisis de agrupamiento UPGMA basado en el coeficiente de Dice (1945), tomando como referencia 101 fragmentos RAPD.
66
CONCLUSIONES
Los fragmentos generados por los iniciadores usados permitieron identificar como
híbridas a las 37 plantas F1 estudiadas.
Los diez iniciadores RAPD fueron útiles para identificar que las plantas de la familia 1
tienen mayor similitud genética con el progenitor macho ‘Prestige early’.
AGRADECIMIENTOS
El primer autor, agradece al CONACYT el apoyo otorgado mediante la beca 261446
para la realización de estudios de maestría en ciencias.
67
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69
CONCLUSIONES GENERALES
Se determinaron las bases científicas para realizar hibridación entre genotipos de
nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige early’, mediante la aplicación de
técnicas de emasculación, hora adecuada para realizar las polinizaciones, pruebas
en receptividad de estigma y viabilidad de polen. Se concluye que el tipo de
emasculación con la remoción parcial de las anteras antes de la antesis fue la que
generó mayor cantidad de frutos cosechados y por lo tanto mayor número de
semillas. La hora más adecuada para realizar polinización fue a las 11:00 de la
mañana, donde las condiciones de temperatura y humedad relativa fueron óptimas
(27 °C y 39% HR, respectivamente).
La identificación de híbridos mediante marcadores morfológicos en la progenie F1
resultado de los cruzamientos entre nochebuena silvestre y la variedad ‘Prestige
early’ fueron de utilidad, ya que se determinaron características en la progenie que
son similares a las del progenitor macho, lo que nos indica que se dió la hibridación
entre el genotipo silvestre y la variedad mejorada. Se encontró que cinco de las
familias de medios hermanos comparten mayor similitud con el progenitor macho.
Los diez marcadores moleculares RAPD utilizados en la identificación de híbridos
entre nochebuena silvestre y la variedad comercial ‘Prestige early’, fueron de utilidad,
ya que se encontró que la progenie comparte fragmentos de ADN de diferente peso
molecular con el progenitor masculino, lo que confirma a un nivel más confiable que
existió la recombinación de genes entre el genotipo silvestre y la variedad comercial.
70
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