sÍntesis, evaluaciÓn biolÓgica y estudios …

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Departamento de Farmacología

Cátedra de Química Medicinal

Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco

SÍNTESIS, EVALUACIÓN BIOLÓGICA Y

ESTUDIOS COMPUTACIONALES DE

TIOSEMICARBAZONAS DE 1-INDANONAS

N4-ARIL SUSTITUIDAS COMO POTENCIALES

ANTIVIRALES Y ANTIPARASITARIOS

Farm. María Cristina Soraires Santacruz

Director: Prof. Dra. Liliana Finkielsztein

Codirector: Dr. Esteban Bontempi

Tesis Doctoral | 2019

1

AGRADECIMIENTOS

A mi directora Lili y mi codirector Esteban por su orientación y apoyo para llevar a

cabo esta tesis. Por permitirme crecer profesionalmente.

Al grupo de investigación de la Dra. Cavallaro por los ensayos biológicos en virus y en

células MDBK.

A mis compañeros de medicinal por su apoyo y compañerismo. A Guido por compartir

las horas en medicinal. A Lucas por responder siempre mis inquietudes y su gran ayuda

en la realización de los espectros de RMN. A Gabriel por el intercambio de ideas.

A todas las personas del quinto y segundo piso del Fatala Chabén por hacer un ambiente

en el cual da gusto trabajar. A Mónica Esteva por su invalorable ayuda con el ensayo en

tripomastigotes. A Vilma Duschak por la asistencia con los geles de actividad y la

provisión de cruzipaína. A Octavio Fusco por siempre buscar la forma de ayudarme. A

Patricia Bustos por enseñarme a usar el citómetro. A Alina Perrone y Luz Piedad por

iniciarme en los cultivos de tripos y amastigotes.

A Nico por su amor y apoyo incondicional.

A mi familia, Tito y Teo, por estar siempre. Los amo.

3

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo de tesis es contribuir en el hallazgo de compuestos

terapéuticos frente a la enfermedad de la diarrea viral bovina (DVB) y a las parasitosis

debidas a Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei. Para cumplir con dicho objetivo,

se realizó un estudio exhaustivo y multidisciplinario que comprendió la síntesis,

evaluación biológica y estudios computacionales de tiosemicarbazonas de 1-indanonas

N4-aril sustituidas (N

4-TSCs).

Se sintetizaron y caracterizaron 30 N4-TSCs, de las cuales 24 son descriptas por primera

vez en el marco de esta tesis. Los compuestos preparados poseen diferentes

sustituyentes en el núcleo indánico y en la posición para del arilo unido al N4 con el fin

de evaluar la variación de la actividad según el patrón de sustitución. La síntesis fue

llevada a cabo mediante dos metodologías, una convencional y otra utilizando

tecnología de microondas, por lo cual se pudo determinar qué método resulta más

ventajoso según tiempos y rendimientos de reacción.

Se determinaron las actividades de las N4-TSCs frente al virus de la DVB (VDVB), a

partir de las cuales se realizó un estudio de la relación estructura-actividad en el que se

identificaron patrones estructurales claves para la actividad de las N4-TSCs como

agentes anti-VDVB. El compuesto más activo fue identificado como probable inhibidor

de la ARN polimerasa viral dependiente de ARN por lo cual se llevaron a cabo estudios

computacionales de docking y de dinámica molecular con esta enzima. Los resultados

computacionales obtenidos permitieron conocer en detalle las características de esta

serie de compuestos que serían determinantes para su actividad.

Por otro lado, se llevó a cabo la evaluación de las N4-TSCs frente a T. cruzi para las

formas epimastigote, tripomastigote y amastigote. Los resultados obtenidos mostraron

que cuatro compuestos fueron activos frente a los tres estadios del parásito. De acuerdo

a los antecedentes en literatura para este tipo de compuestos como inhibidores de la

enzima cruzipaína, varias N4-TSCs fueron evaluadas frente a esta enzima. Los

compuestos no mostraron ser inhibidores de la cruzipaína.

Se llevaron a cabo estudios in vitro frente a T. brucei, los cuales mostraron que varios

compuestos fueron activos frente al parásito. Uno de los derivados (N4-TSC 8) se

4

destacó por su potencia y se estudió su capacidad de inhibir las proteasas del parásito.

Los resultados indicaron que estas enzimas no serían el blanco de acción del compuesto.

Teniendo en cuenta los valores de actividad se realizó un estudio de relación estructura-

actividad cuantitativa (QSAR), el cual permitió establecer una posible conformación

activa y determinar las propiedades de las cuales dependería la actividad biológica

estudiada. Asimismo, mediante distintos ensayos se estudió por citometría de flujo el

tipo de muerte celular que induce el compuesto 8 en T. brucei. Los resultados indicaron

que el compuesto desencadena en los parásitos un proceso similar a la apoptosis.

Por otro lado, se evaluó la citotoxicidad de todos los compuestos sobre células de

mamífero, no evidenciándose efectos tóxicos a las máximas concentraciones que

pudieron ser investigadas las N4-TSCs.

A partir de los resultados de la presente tesis se identificaron compuestos activos como

antivirales y antiparasitarios, se estudió la relación estructura-actividad, se realizaron

estudios del mecanismo de acción y del tipo de muerte celular. Asimismo, se generaron

modelos teóricos de QSAR, y se llevaron a cabo estudios de docking y dinámica

molecular que permitieron conocer las características moleculares que estarían

implicadas en la acción de estos compuestos.

Finalmente, los resultados alcanzados permiten sentar bases para continuar con el

diseño de nuevas moléculas antivirales y antiparasitarias. La información obtenida

podrá ser aplicada en otras estrategias de la Química Medicinal como el cribado virtual

de librerías de compuestos y la posterior farmacomodulación de los candidatos más

prometedores para el tratamiento de la enfermedad de la DVB y las tripanosomiasis.

5

PUBLICACIONES

Parte de los resultados que se presentan en este trabajo de tesis doctoral dio lugar a la

redacción del siguiente artículo científico publicado:

M.C. Soraires Santacruz, M. Fabiani, E.F. Castro, L.C. Cavallaro, L.M. Finkielsztein.

“Synthesis, antiviral evaluation and molecular docking studies of N4-aryl

substituted/unsubstituted thiosemicarbazones derived from 1-indanones as potent anti-

bovine viral diarrhea virus agents”. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2017. 25, 15,

4055-4063.

La experiencia adquirida durante el desarrollo de la tesis permitió la siguiente

publicación:

A. Sólimo, M.C. Soraires Santacruz, A.I. Loaiza Perez, E. Bal de Kier Joffé, L.M.

Finkielsztein, M.A. Callero. “N4-aryl substituted thiosemicarbazones derived from 1-

indanones as potential anti-tumor agents for breast cancer treatment”. Journal of

Cellular Physiology. 2017. 233, 6, 4677-4687.

7

ABREVIATURAS Y SIGLAS

AM1: método semiempírico Austin Model 1

AV: anexina V

BHE: barrera hematoencefálica

BHT: medio líquido monofásico cerebro corazón triptosa

Bz: benznidazol

CC50: concentración citotóxica 50

CCD: cromatografía en capa delgada

CI50: concentración inhibitoria 50

CP: citopático

Cz: cruzipaína

3D: tridimensional

DMSO: dimetilsulfóxido

DMSO-d6: dimetilsulfóxido deuterado

DVB: diarrea viral bovina

E-64: trans-epoxisuccinil-L-leucilamido-(4-guanidino)-butano

ECP: efecto citopático

Efl: eflornitina

EM: espectrometría de masa

EtOH: etanol

F: estadístico de Fisher

FSC: dispersión frontal

FM: fase móvil

fs: femtosegundo

H2-DCF-DA: diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína

HF: método de Hartree-Fock para cálculos mecanocuánticos

HMBC: correlación heteronuclear a múltiples enlaces

HOMO: orbital molecular ocupado de mayor energía

HSQC: correlación heteronuclear a un enlace

IR: infrarrojo

IUPAC: unión internacional de química pura y aplicada

IS: índice de selectividad

8

J: constante de acoplamiento

LUMO: orbital molecular desocupado de menor energía

MCR: muerte celular regulada

MM: mecánica molecular

MM/PBSA: mecánica molecular/área de superficie de Poisson Boltzmann

MTT: bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol

MTS/PES: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-

tetrazolio/etilsulfato de fenazina

MW: microondas

ns: nanosegundo

N4-TSC: tiosemicarbazona de 1-indanona N

4-aril sustituida

NOESY: espectroscopía de efecto nuclear Overhauser

OMS: Organización Mundial de la Salud

PBS: buffer fosfato salino

pCI50 calc: -logaritmo de la concentración inhibitoria 50 calculada o predicha

pCI50 exp: -logaritmo de la concentración inhibitoria 50 experimental

pCI50: -logaritmo de la concentración inhibitoria 50

PDB: banco de datos de proteínas

Pf: punto de fusión

PI: yoduro de propidio

ppm: partes por millón

PS: fosfatidilserina

QSAR: relación estructura-actividad cuantitativa

R2: coeficiente de determinación

RdRp: ARN polimerasa dependiente de ARN

RMN: resonancia magnética nuclear

13C-RMN: resonancia magnética nuclear de carbono

1H-RMN: resonancia magnética nuclear de hidrógeno

ROS: especies reactivas del oxígeno

rpm: revoluciones por minuto

SD: desvío estándar

SDS: dodecilsulfato sódico

SSC: dispersión lateral

PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida

9

Ptm: pentamidina

SFB: suero fetal bovino

TSC: tiosemicarbazona

TUNEL: marcado de corte terminal de dUTP mediado por la deoxinucleotidil

transferasa

VDVB: virus de la diarrea viral bovina

vdW: van der Waals

VHC: virus de la hepatitis C

VSG: variación antigénica de glicoproteínas

δ: desplazamiento químico

ΔG: diferencia de energía libre

11

ÍNDICE

Capítulo I. INTRODUCCIÓN 15

1. Desarrollo de fármacos 17

1.1. Desarrollo de un medicamento. Generalidades 17

1.2. Estrategias en el desarrollo de fármacos 18

1.3. Diseño de fármacos asistido por computadora 19

2. Tiosemicarbazonas 20

2.1. Síntesis de TSCs 20

2.2. Síntesis asistida por radiación de microondas 22

2.3. Actividades biológicas de las TSCs 22

2.4. Antecedentes en el grupo de investigación 24

3. Diarrea viral bovina 25

3.1. Generalidades 25

3.2. Virus de la diarrea viral bovina 26

3.3. Transmisión y replicación del virus 27

3.4. Control y prevención 28

4. Enfermedad de Chagas 29


4.2. Transmisión y ciclo de vida del parásito 29

4.3. Etapas de la enfermedad 31

4.4. Terapia antichagásica disponible 32

5. Enfermedad del sueño y nagana 33


5.2. Transmisión y ciclo de vida del parásito 33

5.3. Etapas de la enfermedad 35

5.4. Terapia anti Trypanosoma brucei disponible 36

Capítulo II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 41

Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45

1. Síntesis de las N4-TSCs 47

1.1. Selección de los compuestos a sintetizar 47

12

1.2. Métodos de síntesis 48

1.3. Tiempos de reacción y rendimientos 49

1.4. Análisis de la isomería Z/E 52

2. Virus de la diarrea viral bovina 59

2.1. Actividad anti-VDVB de las N4-TSCs 59

2.2. Relación estructura-actividad 60

2.3. Estudios de resistencia cruzada 62

2.4. Docking molecular 64

2.5. Cálculo de energía libre de unión 68

3. Trypanosoma cruzi 73

3.1. Actividad anti-T. cruzi de las N4-TSCs 73

3.2. Relación estructura-actividad cualitativa 78

3.2.1. Resultados en epimastigotes 78

3.2.2. Resultados en tripomastigotes 79

3.3. Evaluación de las N4-TSCs frente a la cruzipaína 79

4. Trypanosoma brucei 83

4.1. Actividad anti-T. brucei de las N4-TSCs 83

4.2. Relación estructura-actividad cualitativa 85

4.3. Estudios de QSAR 86

4.4. Evaluación de la N4-TSC más activa frente a proteasas 96

4.5. Captación intracelular de las N4-TSCs 97

4.6. Mecanismo de muerte celular inducido por el compuesto 8 99

4.6.1. Determinación del tamaño celular 102

4.6.2. Determinación de especies reactivas del oxígeno 103

4.6.3. Determinación del potencial de membrana mitocondrial 105

4.6.4. Ensayo de doble marcación con anexina V e yoduro de propidio 106

4.6.5. Ensayo TUNEL 109

4.6.6. Microscopía electrónica de transmisión para ultraestructura 110

Capítulo IV. MATERIALES Y MÉTODOS 113

1. Síntesis de las N4-TSCs 115

1.1. Reactivos y solventes 115

1.2. Técnicas instrumentales 115

1.3. Procedimiento general para la síntesis de las N4-TSCs 116

13

1.4. Descripción de los compuestos nuevos 116

2. Estudios biológicos 131

2.1. Virus de la diarrea viral bovina 131

2.1.1. Cultivo celular y virus 131

2.1.2. Ensayo de reducción de placas 131

2.1.3. Estudios de resistencia cruzada 131

2.2. Trypanosoma cruzi 132

2.2.1. Cultivo celular de epimastigotes 132

2.2.2. Actividad anti-epimastigotes de T. cruzi 132

2.2.3. Obtención de tripomastigotes sanguíneos 133

2.2.4. Actividad anti-tripomastigotes sanguíneos de T. cruzi 133

2.2.5. Cultivo celular de tripomastigotes 133

2.2.6. Actividad anti-amastigotes de T. cruzi 133

2.2.7. Obtención de la cruzipaína 134

2.2.8. Zimografía 135

2.3. Trypanosoma brucei 135

2.3.1. Cultivo celular 135

2.3.2. Actividad anti-T. brucei 136

2.3.3. Lisado de T. brucei 136

2.3.4. Zimografía 136

2.3.5. Captación intracelular de las N4-TSCs 137

2.3.6. Determinación de tamaño celular 137

2.3.7. Determinación de especies reactivas del oxígeno 137

2.3.8. Determinación del potencial de membrana mitocondrial 138

2.3.9. Ensayo de doble marcación con anexina V e yoduro de propidio 138

2.3.10. Ensayo TUNEL 139

2.3.11. Microscopía electrónica de transmisión para ultraestructura 139

2.4. Ensayo de citotoxicidad 140

2.4.1. Ensayo de efecto citotóxico en células MDBK 140

2.4.2. Ensayo de efecto citotóxico en células Vero 140

3. Estudios computacionales 140

3.1. Modelado molecular 140

3.2. Docking molecular 141

3.3. Dinámica molecular y MM/PBSA 141

14

3.4. Cálculo de descriptores 142

3.5. QSAR 142

4. Análisis estadístico 143

Capítulo V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 145

REFERENCIAS 151

.

Capítulo I

INTRODUCCIÓN

Introducción

17

Capítulo I. INTRODUCCIÓN

1. Desarrollo de fármacos

El fármaco es un compuesto químico de estructura definida que posee un efecto

farmacológico. Su combinación con otros componentes da lugar al medicamento, el

cual permite su administración para la prevención, diagnóstico, tratamiento de una

enfermedad o estado patológico y/o para modificar sistemas fisiológicos en beneficio de

la persona o animal a quien se le administre.

La Química Medicinal tiene como objetivo el estudio químico de los fármacos, sus

propiedades biológicas y el estudio de la relación estructura-actividad, con el fin último

de diseñar, descubrir, interpretar el modo de acción y optimizar compuestos

farmacológicamente activos.

1.1. Desarrollo de un medicamento. Generalidades

El desarrollo de un medicamento es un proceso multidisciplinario y complejo el cual se

estima que lleva entre 10 y 15 años, cuesta un promedio de 800 millones de dólares e

involucra un alto riesgo1,2

.

El proceso se inicia con la selección de las moléculas a estudiar mediante estrategias de

la Química Medicinal (Figura 1). Una vez definidos los compuestos se continúa con las

valoraciones biológicas y se optimiza el más promisorio, llamado compuesto líder. A

partir de este compuesto se avanza con los estudios pre-clínicos, los cuales engloban los

ensayos in vitro e in vivo en animales, se realizan estudios de estabilidad y se desarrolla

la formulación.

La siguiente etapa corresponde a los estudios clínicos en los cuales se diferencian

distintas fases, en la primera de ellas se evalúa la tolerabilidad en un grupo reducido de

personas. Si los resultados son los esperados se continúa con la fase II la cual

compromete a pacientes con la patología a estudiar, se observa la eficacia y se ajusta la

dosis. En la fase III el número de pacientes aumenta y es posible que los mismos

presenten no sólo la patología a estudiar sino también otras; en esta fase se confirma la

Introducción

18

dosis, se tienen en cuenta el régimen de administración, la tolerancia y los efectos

adversos3.

Finalmente, de superarse todas las etapas anteriores, el medicamento puede ser evaluado

por el organismo regulador, en nuestro país la ANMAT. En caso de aprobarse, el

medicamento podrá comercializarse. Sin embargo, el proceso no culmina aquí ya que

existe una última fase llamada farmacovigilancia, en la cual el medicamento y sus

efectos en la salud tienen un seguimiento continuo en la comunidad4.

Figura 1. Esquema del proceso de desarrollo de un medicamento.

1.2. Estrategias en el desarrollo de fármacos

Respecto al desarrollo de fármacos propiamente dicho, el proceso inicia con la

identificación de moléculas que muestren cierta actividad biológica deseada. Las vías de

hallazgo de estas moléculas pueden ser muy diversas, desde la observación fortuita de

los efectos biológicos, como fue el caso del descubrimiento de la penicilina, o bien de

los efectos adversos de fármacos ya existentes como las sulfas hipoglucemiantes, el

cribado sistemático de familias químicas en determinados ensayos

biológicos/bioquímicos, o el diseño racional basado principalmente en estudios

computacionales.

Una vez encontradas aquellas moléculas con la actividad biológica deseada por alguna

de las aproximaciones mencionadas, se selecciona el compuesto más promisorio. Para

esta selección, se tienen en cuenta los valores de actividad, toxicidad y propiedades

físico-químicas que permiten adelantar buenos perfiles farmacológicos y

farmacocinéticos. Sin embargo, a pesar de que el compuesto líder es prometedor, en

general es necesario introducirle ciertas modificaciones que mejoren su características,

es decir, es necesario realizar una farmacomodulación.

La farmacomodulación es una estrategia clave en Química Medicinal, la cual tiene tres

aproximaciones: la disyuntiva, la conjuntiva y la modulativa. En la disyuntiva el

objetivo es la simplificación molecular manteniendo la configuración mínima para que

Introducción

19

el producto final mantenga la actividad biológica (farmacóforo). En la aproximación

conjuntiva el fin es reunir en una única molécula dos fragmentos estructurales, en el

cual al menos uno posea actividad biológica, de esta forma se trata de solucionar un

problema terapéutico o farmacotécnico. En la tercer aproximación, la modulativa, la

complejidad de la molécula no se encuentra significativamente modificada, siendo de

gran utilidad para obtener copias terapéuticas (me too), explorar la importancia

conformacional y obtener resultados de relación estructura-actividad, entre otras. En

particular, dentro de la aproximación modulativa es posible encontrar varias

herramientas de modificación estructural como son: la formación, apertura o variación

del tamaño de anillos, la homología, la isomerización, la ramificación, saturación de

dobles enlaces, la isostería clásica y la bioisostería no clásica5.

1.3. Diseño de fármacos asistido por computadora

El diseño de fármacos asistido por computadora engloba una integración de métodos

mediados por software que tienen como objetivo facilitar el diseño o identificación de

nuevos compuestos, la selección de candidatos, o la optimización de compuestos

líderes. Estos objetivos conducen finalmente a la obtención de un compuesto con altas

probabilidades de ser un fármaco exitoso. Los métodos utilizados en esta tarea

dependerán en gran medida de la información experimental disponible y de los

objetivos específicos6.

En las últimas décadas, los métodos computacionales han permitido ahorrar tiempo,

dinero y aumentar las posibilidades para el hallazgo y optimización de fármacos. Casos

de fármacos exitosos en los cuales los métodos in silico han contribuido de manera

sustancial son: dorzolamida, para el tratamiento del glaucoma de ángulo abierto y la

hipertensión arterial; zanamivir y oseltamivir, utilizados para el tratamiento de algunos

tipos de influenza; saquinavir, para el tratamiento de la enfermedad por el virus de la

inmunodeficiencia humana; norfloxacina, como antibacteriano y donepezilo, para la

enfermedad de Alzheimer.

Por otro lado, más allá de las bondades de estos métodos, es importante desmitificar

ciertos preconceptos con respecto al uso de las computadoras en el proceso de

desarrollo de fármacos. Los métodos computacionales no diseñan por si solos los

fármacos sino que forman parte de una herramienta más, aunque muy valiosa, en la cual

Introducción

20

están en juego esfuerzos multidisciplinarios. El uso de métodos computacionales no

consiste en “apretar un botón” para obtener resultados (push-a-buttom drug discovery)

sino que demandan una gran preparación, análisis e interpretación de los datos

obtenidos. Finalmente, si bien estos métodos permiten el ahorro del tiempo, no por ello

se obtienen resultados instantáneos debido a la frecuente complejidad de los sistemas

analizados que deben ser calculados en las máquinas.

Existen varias estrategias para diseñar, seleccionar u optimizar fármacos por

computadora, las cuales se las puede clasificar en métodos directos y métodos

indirectos. Para el primer método es necesario conocer la diana biológica y contar con

su estructura tridimensional. Dicha estructura puede ser obtenida a partir de técnicas de

difracción de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) o utilizando técnicas de

modelado por homología. De esta forma será posible llevar a cabo estudios de docking

en los cuales se estudia la complementariedad de un ligando con su sitio de acción, o de

dinámica molecular donde se pueden estudiar las interacciones de manera temporal.

Por el contrario, en los métodos indirectos no es necesario conocer la diana biológica ya

que el modelo se basa en conocer las propiedades de los compuestos para desarrollar

modelos de correlación con la actividad biológica. Dentro de este tipo de métodos se

encuentra la estrategia de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) la cual

busca una relación, expresada de forma matemática, entre las propiedades

fisicoquímicas de una molécula con una determinada actividad biológica.

2. Tiosemicarbazonas

2.1. Síntesis de TSCs

Entre las familias de compuestos que despiertan mayor interés en la búsqueda de nuevos

fármacos se encuentran las tiosemicarbazonas (TSCs), de considerable interés desde el

punto de vista farmacológico ya que presentan un amplio espectro de actividades. La

estructura química de las TSCs y la numeración de sus átomos, según las reglas de

nomenclatura IUPAC, se describe en la Figura 2.

Introducción

21

Figura 2. Estructura y numeración de TSCs.

Desde el punto de vista sintético presentan como característica principal su facilidad de

obtención. En general se obtienen por la reacción quimioselectiva de aldehídos y/o

cetonas con tiosemicarbazidas en medio alcohólico y en presencia de cantidades

catalíticas de ácido. Esta reacción se caracteriza por su rapidez y por los altos

rendimientos de obtención. La síntesis de estos compuestos tiene un bajo costo y una

gran economía de átomos ya que, a excepción de la molécula de agua que se libera en su

síntesis, todos los átomos de los reactivos están presentes en el producto final de la

reacción.

El mecanismo de reacción para la formación de TSCs transcurre a través de la

protonación del átomo de oxígeno del carbonilo para formar el intermediario ion

oxonio. Luego se produce el ataque nucleofílico del N1 de la tiosemicarbazida sobre el

carbono carbonílico para dar lugar a la formación de un hemiaminal protonado, el cual

pierde una molécula de agua, obteniéndose luego de la neutralización la TSC

correspondiente (Figura 3).

Figura 3. Mecanismo de reacción de TSCs

En este tipo de reacciones es importante trabajar en condiciones contraladas de pH

ácido, en general entre 4 y 5. Valores de pH menores a 4 no son recomendables ya que

conducen a la protonación del N1 de la tiosemicarbazida y, como consecuencia, a una

menor velocidad de reacción ya que pierde el carácter de nucléofilo por carecer de

electrones no compartidos. Asimismo, valores de pH mayores a 5 también

Introducción

22

comprometen la velocidad de reacción de formación de las TSCs ya que la protonación

del átomo de oxígeno del carbonilo no se encontraría favorecida, dejando el carbono

menos susceptible del ataque nucleofílico.

2.2. Síntesis asistida por radiación de microondas

Tradicionalmente el mecanismo de calentamiento en síntesis química ocurre utilizando

una fuente externa, la cual de forma conductiva calienta la pared del recipiente para

finalmente llegar al solvente y los reactivos. Este tipo de mecanismo se caracteriza por

una transferencia de calor ineficaz que vuelve lenta las reacciones químicas. Asimismo,

la formación de productos de descomposición se encuentra favorecida debido a los

tiempos de reacción y al gradiente de temperaturas existente entre el exterior, con

mayores temperaturas, y el seno de la reacción más frío.

El calentamiento mediante el uso de radiación de microondas ha demostrado ser de gran

valor en la síntesis química, ya que permite trabajar en condiciones controladas de

temperatura y disminuye los tiempos de reacción. Uno de los aspectos más apreciables

es la baja incidencia de reacciones secundarias debido a que los compuestos están poco

tiempo expuestos a altas temperaturas. Por otro lado, el uso de la tecnología de

microondas constituye un aspecto significativo en el concepto de química verde o eco-

compatible por el considerable ahorro de energía que permiten.

2.3. Actividades biológicas de las TSCs

Las TSCs presentan un abanico de actividades biológicas muy diversas, las cuales se

han venido estudiando desde 1946 cuando Domagk y col.7 describieron su actividad

antituberculosa. Desde entonces, se han reportado ésta y muchas otras actividades

biológicas tales como la antitumoral, antifúngica, antiparasitaria y antiviral8–12

.

En 1951, Hamre y col.13

reportaron la actividad antiviral de una serie de TSCs derivadas

de benzaldehídos, administradas en ratones de forma oral, frente a infecciones

producidas por el virus vaccinia. Posteriormente, Bauer y col.14

demostraron que el

derivado N-metilado de la TSC de la isatina (metisazona) (Figura 4) era efectivo en la

prevención de la enfermedad de personas expuestas al virus de la viruela. Estudios

posteriores demostraron la acción de TSCs frente al citomegalovirus15

, el VIH16

y el

herpes simple17

, entre otros.

Introducción

23

Figura 4. Metisazona

En cuanto a la actividad antitumoral de las TSCs, la primera observación fue realizada

por Brockman y col.18

quienes describieron la acción de la TSC derivada de la piridina-

2-carboxaldehído en un modelo de ratones con leucemia. A partir de ese momento,

muchos derivados de TSCs han sido descriptos con diversas acciones antitumorales. Sin

embargo, la más relevante debido a su potencial uso en la clínica es la TSC de la 3-

aminopiridina-2-carboxaldehído (triapina) (Figura 5), la cual se encuentra en la fase II

de estudios clínicos19

.

Figura 5. Triapina

En relación a las propiedades antibacterianas, la acción frente al Mycobacterium

tuberculosis fue la primera que se describió para esta familia química20

. Luego de ello

se han reportado numerosos derivados con acción frente a Staphylococcus aureus

Enterococcus faecalis, Salmonella typhimurium, Escherichia coli entre otros21,22

. Por

otro lado, varias TSCs mostraron tener una buena actividad antifúngica frente a distintas

especies como Aspergillus niger, Candida albicans, Amathia alternata y Fusarium

oxysporum23

.

Otra actividad biológica que presentan las TSCs es la antiparasitaria, en particular se ha

observado que tienen acción frente a Plasmodium falciparum, Plasmodium berghei,

Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei. En 2002, Du y col.11

publicaron un estudio

exhaustivo de más de cien TSCs derivadas de aldehídos y cetonas y encontraron que

muchas de ellas resultaron activas frente a T. cruzi, destacándose la TSC de la 3’-

bromopropiofenona. En cuanto al mecanismo de acción se ha demostrado que la diana

Introducción

24

biológica de muchas TSCs activas frente a T. cruzi resulta ser la cruzipaína24

. Esta

enzima es una cisteína proteasa esencial en el ciclo de vida del parásito que participa en

la infección y la replicación de T. cruzi en las células huésped, por lo cual ha surgido

como un blanco válido para el desarrollo de nuevas drogas24,25

. En 2004, Greenbaum y

col.12

describieron la actividad de una librería de TSCs como inhibidores de las cisteína

proteasas de los parásitos P. falciparum, T. brucei y T. cruzi.

2.4. Antecedentes en el grupo de investigación

Nuestro grupo de investigación desarrolló la síntesis de una serie de TSCs derivadas de

1-indanonas, las cuales mostraron una excelente actividad frente al virus de la diarrea

viral bovina26

. Muchos de estos compuestos presentaron índices de selectividad

mayores que el de la ribavirina (droga de referencia), resultando la TSC derivada de la

5,6-dimetoxi-1-indanona (5,6-TSC) (Figura 6) la más activa de la serie estudiada (CE50

= 1,75µM). Asimismo, se dilucidó el mecanismo de acción de dicho compuesto

demostrándose que inhibe la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRp)27

, la

cual resulta una enzima imprescindible en la replicación del virus.

Figura 6. Tiosemicarbazona derivada de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (5,6-TSC).

Estas TSCs derivadas de 1-indanonas a su vez fueron evaluadas en cuanto a su actividad

antiparasitaria frente a la forma epimastigote de T. cruzi (cepa Tulahuén), mostrando

varias de ellas valores de CI50 entre 1,8 y 7,5 µM, superiores al del nifurtimox (droga de

referencia: 7,7 µM)28

. La capacidad inhibitoria in vitro de las TSCs derivadas de 1-

indanonas sobre la cruzipaína mostró hasta un 60% de inhibición con respecto al

compuesto usado como referencia (TSC de 3’-bromopropiofenona: 100% de

inhibición).28

Por otro lado, los compuestos presentaron una limitada solubilidad tanto en solventes

acuosos como orgánicos. En tal sentido, su posterior utilización como fármacos se ve

comprometida debido a su posible baja biodisponibilidad. De esta manera, se

Introducción

25

prepararon nuevas TSCs derivadas de 1-indanonas que resultan de la incorporación de

un grupo arilo sustituido en la posición N4

de la función tiosemicarbazona (N4-TSCs)

(Figura 7), buscando así mejorar el balance lipo-hidrofílico de las TSCs. Se sintetizaron

seis nuevos compuestos, los cuales fueron evaluados frente a T. cruzi (cepa Tulahuén),

exhibiendo algunos de ellos una mejor actividad con respecto a las TSCs de las cuales

derivaron.28

Figura 7. Tiosemicarbazonas de 1-indanonas N4-aril sustituidas

3. Diarrea viral bovina

3.1. Generalidades

La diarrea viral bovina (DVB) es una enfermedad viral que afecta al ganado, así como

también a otras especies del orden artiodáctilo (cerdos, cabras, ovejas y otros

rumiantes)29,30

. Si bien en la actualidad la mayoría de las infecciones producidas por el

virus de la DVB (VDVB) son subclínicas, el impacto económico de los casos que se

manifiestan clínicamente es considerable. Las pérdidas económicas causadas por las

infecciones del VDVB se asocian con una reducción en la producción de leche, menores

tasas de concepción, trastornos respiratorios y muerte durante la infección aguda. La

infección fetal durante las etapas tempranas de la gestación puede causar aborto,

defectos congénitos, retraso del crecimiento y puede dar lugar al nacimiento de terneros

infectados persistentemente.31,32

Los porcentajes de animales infectados persistentemente alcanzan el 1-2% a nivel

mundial mientras que la sero-prevalencia del virus en áreas endémicas puede variar

entre el 40 y el 70%29–31,33–35

. En Argentina, la prevalencia de anticuerpos anti-VDVB

en el ganado adulto es aproximadamente del 70%, aunque este número varía

dependiendo la zona36–39

. Las diferencias de los porcentajes en cuanto a la sero-

Introducción

26

prevalencia se encuentran ligadas principalmente a factores como la densidad de

población de animales, sistemas de confinamiento y prácticas de manejo.

3.2. Virus de la diarrea viral bovina

El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, en la cual se incluyen los géneros

Flavivirus, Hepacivirus y Pestivirus. Dentro de este último género se encuentra el

VDVB con sus dos genotipos (VDVB1 y VDVB2), el virus de la peste porcina clásica y

el virus de la enfermedad de las fronteras.

En cuanto a la morfología, los virus que pertenecen a este género se caracterizan por su

pequeño tamaño, ya que tienen un diámetro entre 40 a 60 nm, la cápside es icosaédrica

y la misma se encuentra limitada por una envoltura conformada por tres glicoproteínas

de membrana: E1, E2 y Erns

. El VDVB puede ser inactivado por altas temperaturas y

detergentes. Asimismo, es sensible al éter etílico, cloroformo y tripsina. Con respecto al

pH, presenta resistencia en un amplio rango, encontrándose su mayor estabilidad entre

pH 5,7 y 9,3.

El genoma del VDVB está compuesto por ARN de polaridad positiva (ARNss+) por lo

cual el ARN genómico cumple la función de ARN mensajero. La traducción del

genoma genera una poliproteína que luego de ser procesada da lugar a las proteínas

estructurales y no estructurales del virus. Estas proteínas están ubicadas desde el

extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal de la siguiente manera: Npro

-C-Erns

-E1-

E2-p7-NS2-NS3-NS4B-NS5A-NS5B, donde NS hace referencia a proteínas no

estructurales (Figura 8). NS5B es el gen que codifica para una proteína con actividad de

ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) responsable de la replicación viral40,41

.

Según los efectos en cultivos celulares y la expresión de la proteína NS2-3, los

Pestivirus se pueden clasificar en dos biotipos: citopáticos (CP) y no citopáticos (NCP).

Los virus CP expresan las proteínas NS2 y NS3 de forma separada42

e inducen muerte

celular mediada por apoptosis, ocasionando la vacuolización del citoplasma. Por otro

lado, los virus NCP no ocasionan cambios visibles en el cultivo celular, manteniendo su

aspecto y crecimiento normal. Sin embargo, estas características no implican que dichos

virus no sean patogénicos. Este biotipo es el más común en la naturaleza y expresa NS2-

3 como proteína fusionada43

.

Introducción

27

Por otra parte, es interesante remarcar que la organización del genoma, la traducción, la

estrategia de replicación y las funciones proteicas de los Pestivirus guardan similitud

con el virus de la hepatitis C (VHC), el único miembro del género Hepacivirus, por lo

cual el VDVB se ha adoptado como modelo sustituto para los estudios de VHC dado

que este no puede replicar in vitro.44,45

Figura 8. Organización genómica del VDVB.

3.3. Transmisión y replicación del virus

La transmisión de los virus del género Pestivirus no depende de vectores sino que

ocurre de forma vertical (transplacentaria en hembras preñadas) o transmisión

horizontal por contacto directo o cercano indirecto con animales infectados ya que el

virus se propaga a través de las secreciones nasales y oculares y de las heces.

Adicionalmente, fluidos, gametas y otras células derivadas de algún animal enfermo

resultan fuentes de contaminación cuando son usados en la reproducción46

.

El virus ingresa a la célula por un mecanismo de endocitosis dependiente de clatrina

mediada por la unión del virus a receptores específicos del huésped47

. Luego de la

fusión de la membrana del virus con la del huésped, se desarma la nucleocápside y el

ARN se libera dentro del citoplasma celular. El ARNss+ es traducido a una poliproteína

la cual es clivada para dar origen a todas las proteínas estructurales y no estructurales.

La replicación viral se lleva a cabo en la superficie del retículo endoplasmático48

en un

complejo de replicación. Este complejo está compuesto por: ARN viral, polimerasas

virales y otras proteínas virales y celulares. Se sintetiza una cadena negativa de ARN a

Introducción

28

partir del ARNss+, dando como resultado intermedio ARNds los cuales se transcriben y

replican dando lugar a ARNm y nuevas ARNss+, respectivamente. Finalmente el virus

se ensambla y es liberado mediante exocitosis49,50

.

En la búsqueda de nuevos fármacos antivirales se tienen en cuenta las distintas etapas

del ciclo de replicación. Una estrategia prometedora es apuntar a la polimerasa viral,

como lo muestran los resultados obtenidos frente a la transcriptasa reversa del VIH, y

con los inhibidores de VHC NS5B, actualmente en uso clínico. La RdRp del VDVB

resulta ser una diana biológica validada como blanco de terapia antiviral por lo cual es

de interés en la búsqueda de compuestos que logren inhibir su actividad51

.

3.4. Control y prevención

Hasta el momento la enfermedad no cuenta con un tratamiento farmacológico por lo

cual se han centrado los esfuerzos en el control y prevención de la misma. El

diagnóstico de animales infectados persistentemente permite llevar a cabo la detección y

eliminación de dichos animales, ya que son la principal fuente de infección y reservorio

del virus. Debido al amplio tipo y severidad de lesiones inespecíficas, el diagnóstico se

basa únicamente en el aislamiento del virus o detección del antígeno viral específico.

Entre los métodos disponibles se encuentran: RT-PCR52,53

, ELISA de captura de

antígeno36

, aislamiento viral, o inmunohistoquímica en biopsia de la piel54

.

Por otro lado, es posible un control sistemático con vacunación. Entre las vacunas

disponibles se encuentran las inactivadas y las de virus vivo modificado55,56

. Las

vacunas inactivadas resultan seguras y se pueden administrar en cualquier momento de

la gestación pero requieren de una inmunización cada 6 meses para mantener el título de

anticuerpos. Estas vacunas no inducen inmunidad celular, pueden provocar reacciones

inflamatorias localizadas y son de alto costo. Por otro lado, las vacunas a virus vivo

modificados al contener cepas atenuadas del VDVB inducen la respuesta inmune en el

huésped de forma rápida, pudiéndose detectar anticuerpos dentro de las 4 semanas

postvacunal y manteniéndose estos por más de un año. Las desventajas de estas vacunas

son la inmunosupresión que provocan, predisponiendo al animal a infecciones con otros

patógenos, y su capacidad potencial de causar la infección fetal por atravesar la barrera

placentaria.

Introducción

29

Por lo mencionado anteriormente, las vacunas convencionales (formulaciones con virus

atenuado o inactivado) pueden no ser óptimas para controlar las infecciones por

VDVB57,58

. En consecuencia, existe la necesidad de agentes antivirales como una

alternativa útil para este propósito51

.

4. Enfermedad de Chagas

4.1. Generalidades

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es una enfermedad parasitaria

endémica de América Latina, causada por el protozoo Trypanosoma cruzi. Representa

una de las enfermedades más serias de la región debido a su impacto social y

económico59,60

. Pertenece al grupo de las denominadas enfermedades desatendidas u

olvidadas según la clasificación de la OMS.

Actualmente, se estima que existen 6 a 8 millones de personas infectadas con T. cruzi, y

cada año ocurren más de 10 mil muertes asociadas a esta parasitosis61

. La incidencia de

la enfermedad está relacionada con el nivel socioeconómico y, en particular, con las

viviendas precarias, ya que el vector de la enfermedad encuentra allí un ambiente

favorable para desarrollarse. Por otro lado, debido al creciente movimiento migratorio

de las últimas décadas, el patrón epidemiológico tradicional de la enfermedad se vio

modificado, ya que el número de pacientes infectados ha aumentado en las zonas

urbanas y en los países desarrollados62,63

.

4.2. Transmisión y ciclo de vida del parásito

La transmisión del T. cruzi puede darse a través del vector Triatoma infestans conocido

en nuestro país con el nombre de vinchuca. El vector es un insecto hematófago, el cual

transmite el parásito a través de las heces contaminadas que elimina al picar. Otras

formas de infección son mediante transfusión de sangre, transmisión congénita (el

parásito puede atravesar la placenta), trasplante de órganos y los accidentes de

laboratorio. A su vez, otra forma de infección que ha cobrado relevancia es la

Introducción

30

denominada vía digestiva, debida al consumo de alimentos contaminados con heces de

la vinchuca portadora de T. cruzi.

El parásito T. cruzi presenta un ciclo de vida complejo que involucra estadios

diferenciados para su adaptación tanto en el vector como en el mamífero. Según

criterios morfológicos y la posición relativa del kinetoplasto respecto del núcleo, se

distinguen tres formas principales del parásito: 1) Amastigote, replicativa e intracelular

en el mamífero. Es de forma redondeada con un flagelo de corta longitud que no

sobresale del bolsillo flagelar y con el kinetoplasto anterior al núcleo. 2)

Tripomastigote, forma infectiva no replicativa, que puede encontrarse tanto en el insecto

vector como en el mamífero. Es de forma ahusada con el kinetoplasto ubicado posterior

al núcleo. 3) Epimastigotes, es la forma replicativa que se encuentra en el insecto

vector. Es de forma ahusada con el kinetoplasto ubicado anterior al núcleo (Figura 9).

Figura 9. Principales estadios que adopta T. cruzi durante su ciclo de vida.

El ciclo de vida de T. cruzi se puede describir como se ilustra en la Figura 10. El vector

luego de picar libera tripomastigotes metacíclicos con sus defecaciones, los que

ingresan al torrente sanguíneo del nuevo huésped a través de la piel dañada, iniciando

de esta manera el ciclo de vida en el mamífero. Una vez que los tripomastigotes están en

la sangre, estos invaden células nucleadas para diferenciarse en amastigotes, donde

sufren varios ciclos de división y se diferencian en tripomastigotes sanguíneos. Cuando

los mismos alcanzan alta densidad en la célula, y debido al movimiento de los mismos,

se provoca la ruptura de la célula hospedadora, liberando los parásitos a la circulación

sanguínea donde pueden alcanzar otras células. Por otro lado, cuando un nuevo vector

se alimenta de un mamífero infectado, junto con la sangre estará ingiriendo

tripomastigotes, los cuales en el insecto se diferencian a la forma epimastigote. Éstos se

Introducción

31

dividen repetidas veces y finalmente se diferencian a tripomastigotes metacíclicos en el

intestino, cerrando así el ciclo de vida del parásito.

Figura 10. Ciclo de vida de T. cruzi.

4.3. Etapas de la enfermedad

La enfermedad de Chagas es una infección que persiste durante toda la vida del

paciente. Presenta dos fases claramente diferenciadas: la etapa aguda y la crónica64

.

La fase aguda suele durar unos dos meses después de contraerse la infección y se

caracteriza por la presencia de un gran número de parásitos en circulación. En la

mayoría de los casos no se presentan síntomas o son leves e inespecíficos: fiebre,

malestar general, agrandamiento de ganglios linfáticos, palidez, dolores musculares,

dolor abdominal y dificultad para respirar. En el caso de transmisión vectorial se

observa la presencia de reacciones cutáneas en el sitio de la picadura llamado chagoma,

o la reacción conjuntiva ocular llamado signo de Romaña. Es en esta fase aguda cuando

los parásitos invaden y se multiplican en diferentes células del mamífero.

Introducción

32

La fase crónica suele presentarse asintomática durante 10 a 20 años. Sin embargo, los

parásitos se encuentran en el músculo cardíaco y digestivo lo cual da lugar a tres formas

de la enfermedad: la cardíaca, la digestiva y la cardiodigestiva. La forma cardíaca se

caracteriza por daño miocárdico en la que pueden presentarse desde arritmias y

tromboembolismos hasta insuficiencia y falla cardíaca con muerte súbita, siendo esta

última la principal causa de muerte en los pacientes con enfermedad de Chagas. Por otro

lado, la forma digestiva se caracteriza por alteraciones funcionales y anatómicas en el

esófago y colon debido a la denervación intrínseca del sistema parasimpático. Las

alteraciones clínicas que se observan son las modificaciones en la movilidad peristáltica

y el agrandamiento de las vísceras. Por último, la forma cardiodigestiva es la asociación

de la enfermedad cardíaca con megaesófago y/o megacolon.

4.4. Terapia antichagásica disponible

A pesar de que la enfermedad de Chagas afecta a millones de personas, no es

considerada una patología rentable por la industria farmacéutica. No existen vacunas ni

tratamientos seguros, siendo la eliminación del insecto vector la forma de controlar la

aparición de nuevos casos.

Los únicos dos fármacos que se utilizan para el tratamiento de la enfermedad, desde

hace más de cuatro décadas, son el nifurtimox (1972) y el benznidazol (1974), (Figura

11)65

. Ambos presentan diversos efectos adversos que incluyen: anorexia, vómitos,

dermatitis alérgica, polineuropatía periférica, leucopenia, entre otros. Estos efectos

adversos pueden llevar a la falta de adhesión al tratamiento. Asimismo, la existencia de

varias cepas que han sido aisladas en distintas zonas geográficas, marca diferencias

significativas en cuanto a la resistencia y susceptibilidad a las drogas.

Figura 11. Quimioterápicos disponibles para la enfermedad de Chagas

Introducción

33

El mecanismo de acción más aceptado para el nifurtimox es la alteración del equilibrio

redox del parásito. Por otro lado, el efecto tripanocida del benznidazol probablemente se

debe a la unión covalente de los metabolitos reducidos del fármaco con

macromoléculas. A pesar de ser fármacos ampliamente utilizados, su modo de acción

todavía no es comprendido totalmente.

Considerando entonces las notables limitaciones de los quimioterápicos disponibles, se

presenta como un importante desafío el tratamiento de esta enfermedad olvidada. Es

necesario encontrar pronto un fármaco más efectivo y seguro65

.

5. Enfermedad del sueño y nagana

5.1. Generalidades

Trypanosoma brucei spp, es el agente etiológico de la tripanosomiasis africana, que

puede afectar tanto a humanos como al ganado. En el caso de los humanos la

enfermedad es conocida como la enfermedad del sueño y es producida por las

subespecies T. b. gambiense y T. b. rhodesiense. Por otro lado, la subespecie T. b.

brucei es la responsable de la enfermedad que afecta a los animales, la cual se conoce

como nagana.

La enfermedad del sueño amenaza a millones de personas en 36 países del África

subsahariana, las cuales en muchos casos viven en áreas rurales remotas con acceso

limitado a servicios de salud, lo que complica la vigilancia y, por lo tanto, el diagnóstico

y tratamiento. De acuerdo con el último informe de la OMS, aproximadamente 20.000

personas se infectan cada año y más de 65 millones de personas están en riesgo

de contraer la enfermedad 66

.

Por otro lado, la enfermedad veterinaria también reviste gran relevancia ya que

compromete la actividad ganadera, restringiendo así el desarrollo de la economía, lo que

a su vez contribuye a la pobreza de las zonas más afectadas.

5.2. Transmisión y ciclo de vida del parásito

La transmisión del T. brucei se da a través de la mosca tsé-tsé (transmisión vectorial),

aunque también es posible mediante transfusión de sangre, transmisión congénita (el

Introducción

34

parásito puede atravesar la placenta), trasplante de órganos y los accidentes de

laboratorio.

T. brucei presenta un ciclo de vida complejo el cual comprende a un vector, la mosca

tsé-tsé (Glossina spp), y a un hospedador mamífero (Figura 12). Durante cada etapa del

ciclo de vida el parásito sufre diferentes cambios bioquímicos y morfológicos que le

permite su adaptación al entorno.

La mosca tsé-tsé inocula tripomastigotes metacíclicos en el hospedador mamífero, los

cuales se diferencian a tripomastigotes sanguíneos de forma alargada (long slender) y se

multiplican en la sangre y linfa, pudiendo alcanzar también el sistema nervioso central

al traspasar la barrera hematoencefálica (BHE). A medida que se incrementa la

parasitemia algunos tripomastigotes se diferencian a la forma sanguínea redondeada

(stumpy), la cual no es proliferativa pero está preadaptada a las condiciones que

encontrará en el vector.

El sistema inmune del hospedador reconoce las glicoproteínas de la superficie celular de

los parásitos y comienza a producir anticuerpos. De esta manera se neutralizan los

tripanosomas y disminuye la parasitemia. Sin embargo, T. brucei tiene la capacidad de

cambiar las glicoproteínas de superficie por otras con una región antigénica diferente.

Dicho mecanismo conocido como variación antigénica de glicoproteínas (VSG) permite

al parásito no ser reconocido por los anticuerpos circulantes. De esta manera logra

evadir el sistema inmune del huésped y puede seguir proliferando alcanzando una

infección persistente.

La mosca al alimentarse ingiere los tripomastigotes redondeados, los cuales poseen la

capacidad de diferenciarse rápidamente en el tracto digestivo a tripomastigotes

procíclicos, la forma replicativa no infectiva. Los parásitos migran a las glándulas

salivales de la mosca donde se adhieren como formas epimastigotes, las cuales son

replicativas. Posteriormente se transforman a tripomastigotes metacíclicos que serán

transmitidos al hospedador mamífero, completándose así el ciclo.

Introducción

35

Figura 12. Ciclo de vida de T. brucei67

.

5.3. Etapas de la enfermedad

La enfermedad del sueño presenta dos fases patológicas principales. La primera etapa,

conocida como fase hemolinfática, se caracteriza por la presencia del parásito

únicamente en sangre y en linfa68

, describiéndose los siguientes síntomas: fiebre,

dolores musculares, debilidad, inflamación de los ganglios linfáticos, dolores de cabeza

y pérdida de peso. En la segunda etapa conocida con el nombre de fase neurológica, el

parásito logra atravesar la BHE invadiendo así el sistema nervioso central, causando

cambios en el comportamiento, confusión, mala coordinación, alteración de los ciclos

del sueño, coma y finalmente la muerte69

.

La progresión de la enfermedad depende tanto de las características del parásito, del

hospedador y de la interacción parásito-hospedador. En el caso de la infección sin

tratamiento con la subespecie T. b. gambiense la enfermedad se caracteriza en general

por una progresión lenta de aproximadamente 3 años, hasta la muerte de la persona

infectada, mientras que en el caso de una infección por T. b. rhodesiense, la muerte en

general sucede en el plazo de semanas o pocos meses.

Introducción

36

Los animales también pueden verse infectados con T. b. gambiense y T. b. rhodesiense,

aunque no desarrollan la enfermedad. Sin embargo, constituyen una reserva a partir de

las cuales las moscas tsé-tsé pueden adquirir la infección70

. Por otro lado, la infección

con T. b. brucei causa enfermedad en el ganado, la cual se caracteriza por fiebre

intermitente, anemia, diarrea, inflamación de tejidos con compromiso en muchos casos

del sistema nervioso central y debilitamiento del animal, que con frecuencia termina

causando la muerte. Hay que mencionar que esta última subespecie no es infectiva en

humanos por la presencia en sangre de apolipoproteina L1, conocida como “factor

tripanolítico” la cual produce la lisis del parásito.

5.4. Terapia anti Trypanosoma brucei disponible

El manejo de la enfermedad comprende en primer lugar la detección de la infección

mediante la determinación directa o indirecta del parásito, el control de signos y

síntomas clínicos y la evaluación del grado de avance de la enfermedad. En este sentido,

es importante realizar el diagnóstico lo antes posible para evitar la etapa neurológica de

la enfermedad.

En cuanto a la inmunización, no existe en la actualidad una vacuna disponible. Si bien

se han intentado diversos planes de inmunización en animales, todos ellos han fracasado

en gran parte debido a la asombrosa capacidad de los parásitos para cambiar la cubierta

antigénica o VSG. En este contexto, la principal alternativa para el tratamiento de la

enfermedad sigue siendo la quimioterapia.

Los fármacos disponibles para controlar la enfermedad del sueño son: pentamidina,

suramina, melarsoprol, eflornitina y nifurtimox en combinación con eflornitina. Estas

drogas tienen notables limitaciones que incluyen: toxicidad, ineficacia, alto costo y

largos períodos de administración.71,72

La pentamidina (Figura 13) es una diamidina aromática que se ha utilizado desde 1937

en la etapa temprana de la tripanosomiasis humana causada por T. b. gambiense. A pH

fisiológico se encuentra principalmente bajo la forma cargada positivamente, por lo cual

su paso a través de la BHE se encuentra desfavorecido, explicando así su eficiencia sólo

en la primera etapa de la enfermedad del sueño73

. Recientemente se descubrió que la

pentamidina tiene un paso a través de la BHE, pero es excluida por transportadores 74

.

Introducción

37

En cuanto a su mecanismo de acción, el compuesto tiene la capacidad de unirse al surco

menor del ADN, por lo cual se postula que podría inhibir el proceso de transcripción75–

77.

Figura 13. Pentamidina

Como se mencionó anteriormente, la pentamidina es sólo efectiva en la etapa inicial de

la enfermedad y se deben administrar varias dosis de forma intramuscular. Dentro de los

efectos adversos se encuentra la nefrotoxicidad, diabetes mellitus, náuseas, dolor

abdominal, taquicardia, hipotensión arterial, daño pancreático y hepático71,78,79

.

La suramina (Figura 14) es una modificación del colorante rojo trypan, y se utiliza en

las primeras etapas de la enfermedad por T. b. rhodesiense y T. b. gambiense. Al tener

la capacidad de unirse a las proteínas del plasma, incluyendo las lipoproteínas de bajo

peso molecular (LDLs), el compuesto es endocitado por el parásito mediante receptores

de membrana específicos71,80

. El modo de acción por el cual produce la muerte del

parásito todavía no se conoce pero se evidenció en T. b. brucei la inhibición de varias

enzimas de la glucolisis y otras que incluyen la ruta de las pentosas fosfato71,81,82

.

Figura 14. Suramina

La suramina se administra mediante una lenta infusión intravenosa para evitar el riesgo

de shock anafiláctico. Algunos efectos adversos comunes en el tratamiento con

Introducción

38

suramina incluyen: toxicidad renal, fiebre, nauseas y vómitos. Otros efectos menos

comunes son: ictericia, diarrea severa, anemia y anafilaxia que puede llevar a la

muerte81–83

.

El melarsoprol (Figura 15), un derivado orgánico del arsénico, es el fármaco de elección

en la segunda etapa de la enfermedad del sueño causada por T. b. gambiense o T. b.

rhodesiense debido a su capacidad de atravesar la BHE. Si bien también es activo en las

etapas tempranas de la infección, no se lo suele utilizar hasta no verse avanzada la

enfermedad debido a los peligrosos efectos adversos que puede ocasionar. Se administra

de forma intravenosa y el paciente requiere estar hospitalizado ya que el 10% sufre de

encefalopatías que resultan mortales en el 50% de los casos. Asimismo, en los últimos

años, se han registrado casos de falla terapéutica luego de utilizar melarsoprol,

especialmente frente a T. b. gambiense en áreas de alta transmisión84,85

.

Figura 15. Melarsoprol

La eflornitina (Figura 16) fue desarrollada originalmente como antitumoral, pero

actualmente es una alternativa al tratamiento para la enfermedad del sueño. El

mecanismo de acción comprende la inhibición específica e irreversible de la enzima

ornitina decarboxilasa, la cual actúa en el primer paso de la biosíntesis de

poliaminas73,84

.

Figura 16. Eflornitina

Muchas desventajas han limitado el uso de la eflornitina en el tratamiento, entre ellas

están el alto costo y la corta vida media en el plasma luego de una inyección intravenosa

(alrededor de 3 h), con la consiguiente eliminación por orina del 80% del fármaco luego

de 24 h. Asimismo, el tratamiento con eflornitina está relacionado a efectos adversos

Introducción

39

tales como: anemia, leucopenia, pancitopenia, dolores de cabeza y convulsiones86

.

Además, se ha demostrado que la resistencia a la eflornitina puede ser inducida

rápidamente ya que en un estudio con T. b. brucei cepa 427 se observó que luego de

exponer los parásitos a concentraciones crecientes de la droga, estos se volvían

resistentes luego de 60 días. Por este motivo, en un intento para prevenir la pérdida de

efectividad del tratamiento, se introdujo una terapia combinada de eflornitina con

nifurtimox.

El nifurtimox (Figura 11), se utiliza desde la década de 1960 para tratar la forma aguda

de la enfermedad de Chagas y recientemente en la etapa neurológica de la enfermedad

del sueño. Las ventajas de este fármaco son principalmente su administración oral y su

costo relativamente bajo. Sin embargo, presenta numerosos efectos adversos y la

duración de su tratamiento es muy prolongada por lo cual no puede ser empleada como

monoterapia, administrándose en conjunto con la eflornitina.

En cuanto a los fármacos de elección para el tratamiento de la tripanosomiasis animal

africana (nagana), uno de los más utilizados es el aceturato de diminazeno (Figura 17).

Dicho compuesto pertenece a la familia de las diamidinas aromáticas, resulta de bajo

costo relativo y es efectivo frente a varias infecciones animales. Sin embargo, en los

últimos años se han registrado casos de resistencia a la droga, lo cual ha complicado la

eficacia del tratamiento.

Figura 17. Aceturato de diminazeno

En conclusión, la falta de una vacuna contra esta enfermedad desatendida y las notables

limitaciones de los tratamientos quimioterápicos representan un importante desafío para

la química medicinal. Es necesario encontrar una terapia más efectiva, segura y menos

costosa.

Capítulo II.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Hipótesis y objetivos

43

Capítulo II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Visto y considerando los antecedentes anteriormente mencionados se propone la

siguiente hipótesis: “El estudio de compuestos pertenecientes a la familia de las

tiosemicarbazonas de 1-indanonas N4-aril sustituidas permitirá el hallazgo de

nuevos agentes líderes como antivirales y antiparasitarios”

Para demostrar esta hipótesis se propone como objetivo general de la presente tesis: la

síntesis de 30 TSCs N4-aril sustituidas derivadas de 1-indanona (N

4-TSCs) siendo 24 de

ellas derivados nuevos, las cuales serán evaluadas como probables agentes terapéuticos

frente a la enfermedad causada por el virus de la DVB y a las parasitosis debidas a T.

cruzi y T. brucei. Asimismo, se buscará para los compuestos más promisorios su

probable blanco de acción mediante la aplicación de métodos computaciones y/o

ensayos in vitro.

Con el fin de avanzar en la concreción del objetivo general formulado, se plantean los

siguientes objetivos específicos:

I. Sintetizar y caracterizar estructuralmente una serie de 30 N4-TSCs que posean

variabilidad estructural tanto en los sustituyentes del anillo indánico como en

los del arilo en posición N4. De esta forma se podrán llevar a cabo estudios

de relación estructura-actividad.

II. Evaluar la actividad biológica de las N4-TSCs:

a) Antiviral frente al VDVB.

b) Antiparasitaria frente a T. cruzi en sus formas epimastigote,

tripomastigote y amastigote y frente a T. brucei en su forma

tripomastigote sanguíneo.

c) Selectividad mediante estudios de citotoxicidad frente a células de

mamíferos.

III. Frente al virus de la diarrea viral bovina:

a) Estudiar la relación entre las estructuras de los compuestos con sus

actividades biológicas, relación estructura-actividad.

b) Determinar in silico interacciones ligando-diana biológica (N4-TSC-

RdRp) y definir los aspectos moleculares claves en la actividad del

Hipótesis y objetivos

44

compuesto más activo mediante estudios computacionales de docking y

de dinámica molecular.

IV. Frente a Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei:

a) Estudiar la relación entre las estructuras de los compuestos con sus

actividades biológicas de forma cualitativa y cuantitativa, relación

estructura-actividad y relación estructura-actividad cuantificada (QSAR)

respectivamente. De esta manera se podrán encontrar patrones

fisicoquímicos claves que modulan la actividad.

b) Investigar para el compuesto de mayor actividad su probable mecanismo

de acción y tipo de muerte celular mediante ensayos in vitro específicos.

Capítulo III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados y discusión | Síntesis de las N4-TSCs

47

Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Síntesis de las N4-TSCs

Teniendo en cuenta los antecedentes de las actividades biológicas de las TSCs derivadas

de 1-indanonas y, en particular, los resultados obtenidos previamente en el grupo de

investigación, se propuso para el presente trabajo de tesis estudiar nuevas N4-TSCs

como antivirales y antiparasitarios. Para ello se sintetizó una serie de análogos para

evaluar su acción biológica con el fin de encontrar compuestos promisorios y realizar

estudios de relación estructura-actividad. En esta sección se describen los métodos de

síntesis, los tiempos y rendimientos de la reacción de formación de los compuestos y el

análisis de la isomería Z/E.

1.1. Selección de los compuestos a sintetizar

Antes de llevar a cabo la síntesis se hizo una selección de los sustituyentes del núcleo

indánico y el arilo unido al N4 (Figura 18). Para ello se tuvieron en cuenta los resultados

de actividad obtenidos previamente por el grupo de investigación. En este sentido, la

TSC derivada de la 5,6-dimetoxi-1-indanona sin sustituir en el N4 (5,6-TSC) demostró

ser la más activa frente al VDVB con un valor de CE50 de 1,75 µM.26

Por otro lado, en

los estudios frente a epimastigotes de T. cruzi cepa Tulahuén 2 las TSCs derivadas de la

4,5-dimetoxi-, 5-bromo- y 5-metil-1-indanona fueron las que resultaron más activas con

valores de CI50 de 1,8, 2,3 y 3,6 µM respectivamente28

. Asimismo, se observó que la

sustitución en el N4 por restos arilos favorecía la actividad de los compuestos, resultando

el compuesto derivado de la 5,6-dimetoxi-1-indanona con la sustitución p-cloro en el

arilo unido al N4

la más activa, con un valor de CI50 de 1,0 µM.

Figura 18. Tiosemicarbazonas de 1-indanonas N4-aril sustituidas (N

4-TSCs)


48

De acuerdo a estos antecedentes, se decidió sintetizar las N4-TSCs (Figura 18) que

tuvieran sustituyentes R1 = H; 5,6-dimetoxilo (5,6-diOCH3); 4,5-dimetoxilo (4,5-

diOCH3); 5-bromo (5-Br) y 5-metilo (5-CH3), seleccionados teniendo en cuenta la

actividad antiviral y anti T. cruzi observada en las TSCs y N4-TSCs previamente

evaluadas. Por otro lado, los sustituyentes R2 fueron los siguientes: H; CH3; F; Cl;

OCH3; NO2, los cuales fueron elegidos en función de las distintas calidades electrónicas

y/o estéricas de los mismos que permitieran así proporcionar variabilidad en cuanto a

propiedades fisicoquímicas de los compuestos para los posteriores ensayos biológicos y

análisis de la relación estructura-actividad.

1.2. Métodos de síntesis

Con respecto al método de síntesis, el grupo de investigación describió dos posibles

caminos alternativos, el Método A: a partir de las hidrazonas de 1-indanonas con

fenilisotiocianatos ambos convenientemente sustituidos en condiciones de reacción

convencionales; y el Método B: a partir de 1-indanonas convenientemente sustituidas,

hidrato de hidracina y fenilisotiocianatos, también sustituidos convenientemente, por

medio de una reacción one-pot multicomponente utilizando tecnología de microondas.

Se decidió entonces realizar la síntesis de cada compuesto mediante ambas

metodologías para comparar sus rendimientos y tiempos de reacción.

En el siguiente esquema se muestran las dos rutas sintéticas:

Ruta de síntesis método A:

Las hidrazonas se obtuvieron previamente por tratamiento de las correspondientes 1-

indanonas con hidrato de hidracina.


49

Ruta de síntesis método B:

R1= H; 5,6-diOCH3; 4,5-diOCH3; 5-Br; 5-CH3

R2= H; CH3; F; Cl; OCH3; NO2

La determinación de las estructuras se realizó en base a métodos espectroscópicos (IR,

1H,

13C-RMN mono y bidimensionales) y espectrométricos (masa de alta resolución).

1.3. Tiempos de reacción y rendimientos

Se sintetizaron 30 N4-TSCs de las cuales 24 son compuestos nuevos, empleando ambas

metodologías (A y B). Los resultados de tiempo y rendimiento de las reacciones se

detallan en la Tabla 1.

N4-TSCs R1 R2 R3 R4

Método A Método B

Tiempo

(h)

Rendimiento

(%)

Tiempo

(min)

Rendimiento

(%)

128

H H H H 25 87 20 89

2 H H H NO2 20 46 45 70

3 H H H F 27 19 130 87

428

H H H Cl 4 79 30 73

528

H H H CH3 48 72 10 78

6 H H H OCH3 72 86 60 79

728

H OCH3 OCH3 H 25 77 15 74

8 H OCH3 OCH3 NO2 72 56 65 100


50

9 H OCH3 OCH3 F 96 41 30 53

1028

H OCH3 OCH3 Cl 48 79 20 84

1128

H OCH3 OCH3 CH3 72 53 20 69

12 H OCH3 OCH3 OCH3 73 29 45 52

13 H CH3 H H 96 8 40 51

14 H CH3 H NO2 4 32 20 90

15 H CH3 H F 25 4 40 91

16 H CH3 H Cl NR NR 70 20

17 H CH3 H CH3 NR NR 50 70

18 H CH3 H OCH3 96 11 60 60

19 OCH3 OCH3 H H 24 48 30 62

20 OCH3 OCH3 H NO2 72 52 40 53

21 OCH3 OCH3 H F 20 35 120 97

22 OCH3 OCH3 H Cl 16 24 45 51

23 OCH3 OCH3 H CH3 20 14 20 67

24 OCH3 OCH3 H OCH3 50 28 60 59

25 H Br H H 48 10 60 22

26 H Br H NO2 72 41 15 64

27 H Br H F 40 5 45 66

28 H Br H Cl NR NR 30 10

29 H Br H CH3 60 8 45 20

30 H Br H OCH3 72 19 50 40

Tabla 1. Resultados comparativos de la síntesis de las N4-TSCs utilizando las

metodologías A y B. NR: No hubo reacción, es decir que no se obtuvo el compuesto

deseado.

Como se puede ver en la Tabla 1, la metodología B, es decir la que emplea radiación de

microondas, resultó ampliamente ventajosa para esta familia de compuestos en cuanto a

tiempos y rendimientos de reacción. Los tiempos para esta metodología estuvieron en el

orden de los minutos, mientras que en la metodología convencional la reacción se midió

en horas, dándose para todas las reacciones tiempos más cortos con la metodología B.

Inclusive, cabe mencionar que en el caso de los derivados 16, 17 y 28 la N4-TSC

esperada no pudo ser obtenida mediante la metodología A.


51

Figura 19. Rendimientos de la síntesis de N4-TSCs empleando las metodologías A y B.

Con respecto a los rendimientos se obtuvieron porcentajes variables para un mismo

método, sin embargo se observó que la metodología B resultó en su gran mayoría

significativamente más ventajosa respecto a la metodología A, tal como se observa en la

Tabla 1 y en la Figura 19. Para los únicos casos donde la metodología convencional

resultó ligeramente superior que la de microondas fue para los compuestos 4, 6 y 7, no

obstante hubo una diferencia muy marcada en cuanto a los tiempos (horas vs. minutos,

respectivamente), lo cual posiciona la metodología B como igualmente ventajosa. Estos

resultados, en los cuales se evidenciaron las bondades de la metodología por radiación

de microondas para todos los derivados estudiados, pueden ser explicados en base al

fundamento de la técnica en la cual se trabaja en condiciones controladas y homogéneas

de temperatura en todo el volumen de la reacción.

Analizando los resultados obtenidos con la metodología B se observó que para los

derivados de la 1-indanona y de la 5,6-dimetoxi-1-indanona los rendimientos fueron

muy buenos a excelentes, obteniéndose sólo en el caso del compuesto 9 y 12 un

rendimiento moderado con 53 % y 52 % respectivamente. Respecto a la metodología A

para esta serie de derivados, los valores de rendimiento fueron regulares a muy buenos.

Se evidenciaron diferencias muy marcadas entre ambas metodologías para los

compuestos 2, 3, 8 y 12.

En la serie de la 5-metil-1-indanona se observaron para todos los casos diferencias muy

marcadas de rendimiento entre ambas metodologías. Inclusive, hubo dos compuestos, el


52

16 y 17, que no pudieron ser obtenidos empleando la metodología A pero sí con la B.

En tanto, para los otros derivados los rendimientos alcanzados con el método A fueron

muy pobres.

En la serie de la 4,5-dimetoxi-1-indanona los rendimientos con el método B fueron

variables, con valores desde 51 % con R5 = Cl a 97 % con R5 = F. En el caso del método

A todas las reacciones tuvieron un rendimiento pobre, el máximo fue de 52 % para el

compuesto 20 y el mínimo de 14 % para el 23.

Por último, la serie de la 5-bromo-1-indanona fue la que presentó en general los

rendimientos más bajos con valores máximos de 41 % y 66 % para la metodología A y

B respectivamente. Al igual que con las otras series, para ésta se siguió observando las

ventajas del uso de microondas frente a la metodología convencional ya que en todos

los casos fue posible mejorar el rendimiento de la reacción con el método B e incluso

para el caso del derivado 28 se logró obtener el compuesto cuando de la otra forma no

pudo ser posible.

Respecto a los sustituyentes en el grupo arilo del N4 los rendimientos en general fueron

aleatorios según la serie que se trató, concluyéndose que no influyen en las variables

analizadas.

1.4. Análisis de la isomería Z/E.

Las TSCs tienen la capacidad de formar isómeros Z y E alrededor de la unión C=N1, por

lo cual en la síntesis es probable obtener uno de ellos o una mezcla de los mismos

(Figura 20). La formación y estabilidad de estas dos configuraciones depende de cada

TSC en particular.

Figura 20. Isómeros Z (izquierda) y E (derecha) de las N4-TSCs.


53

Mediante el análisis espectroscópico de las N4-TSCs por

1H-RMN y

13C-RMN se

observó la presencia de señales únicas para cada protón y carbono respectivamente

(Figuras 21 y 22, Tabla 2), demostrando la formación preferencial de uno de los

isómeros frente al otro. Asimismo, se realizó la asignación de los protones y carbonos

por medio de espectros bidimensionales de HSQC y HMBC (Figuras 23 y 24, Tabla 3).

Mediante dichos análisis se asignó el H unido al N2, cuyo desplazamientos químico para

los compuestos sintetizados se encuentra entre 8,4 y 8,6 ppm, mientras que el H unido al

N4 tiene un desplazamiento químico entre 9,1 y 9,7 ppm.

Luego de la asignación de las señales se analizó cuál de los isómeros Z ó E fue

obtenido. Para ello, se llevó a cabo un estudio de NOESY el cual permite determinar

qué protones se aproximan entre sí en el espacio independientemente del número de

enlaces que haya entre ellos. Luego del análisis se observó que el protón de

aproximadamente 8,4 a 8,6 ppm que corresponde al N2 se acopla con el protón de

aproximadamente 2,3 ppm que corresponde a los hidrógenos del metileno del núcleo

indánico más próximos a la función tiosemicarbazona (Figura 25). Cabe destacar que en

ningún espectro se observó correlación entre el protón del N2 con los protones del arilo

del indano.

Los espectros mostrados a continuación corresponden al compuesto 17, el cual fue

considerado como ejemplo. Las señales y correlaciones observadas y analizadas fueron

repetitivas para toda la serie de compuestos estudiada.


54

Figura 21. A) 1H-RMN del derivado 17 en CDCl3. B) Ampliación de espectro

correspondiente a la zona aromática.

A

B


55

H δ (ppm) Multiplicidad Integración J (Hz)

a 7,66 d 1H 7,88

b 7,15 d 1H 7,88

c 2,42 s 3H -

d 7,19 s 1H -

e 3,17 m 2H -

f 2,84 m 2H -

g 8,48 s 1H -

h 9,28 s 1H -

i 7,55 d 2H 8,27

j 7,22 d 2H 8,27

k 2,38 s 3H -

Tabla 2. Señales del espectro 1H-RMN del derivado 17 en CDCl3.

Figura 22. 13

C-RMN del derivado 17 en CDCl3


56

Figura 23. HSQC del derivado 17 en CDCl3.

Figura 24. HMBC del derivado 17 en CDCl3.

δ 1H (ppm) δ

13C (ppm) Correlación

H C

2,38 21,0 k o

2,42 22,0 c e

2,84 27,0 f i

3,17 28,6 e h

7,15 128,8 b c

7,19 126,4 d f

7,22 129,6 j n

7,55 124,8 i m

7,66 121,7 a b

Tabla 3. Correlaciones carbono-hidrógeno del derivado 17 en CDCl3 determinadas por

HSQC y HMBC.


57

Figura 25. NOESY del derivado 17 en CDCl3.

Con el fin de conocer las distancias espaciales probables entre el protón del N2 y los

protones del metileno del indano se modeló mediante el programa HyperChem y

Gaussian 09 los dos isómeros geométricos. De esta manera se analizó la cercanía

espacial de los protones por métodos de cálculo para contrastar dichas observaciones

con los resultados del NOESY. Los resultados teóricos (Figura 26) mostraron que la

distancia entre el protón del N2 y los hidrógenos de los metilenos en el isómero E es de

aproximadamente 2,3 Å, mientras que para el isómero Z dicha distancia es

aproximadamente el doble, 4,4 Å. Asimismo, se calculó para el isómero Z la distancia

entre el protón N2 y los protones del arilo del indano, obteniéndose el valor de 2,0 Å

para la distancia más cercana. De esta forma, los resultados obtenidos por RMN

(correlación del hidrógeno g con los f, y falta de correlación del hidrógeno g con el a) y

de modelado molecular indican que las N4-TSCs se obtuvieron preferentemente en la

configuración E.


58

Figura 26. Distancias interatómicas para el isómero A) E y B) Z

En resumen:

Se sintetizaron 30 N4-TSCs de las cuales 24 son nuevas.

Se evaluaron dos metodologías de síntesis, siendo la síntesis one-pot

mediante el uso de tecnología de microondas la mejor opción para preparar

estos derivados. Los compuestos se obtienen en tiempos cortos de reacción

y con buenos rendimientos.

Se estudió la isomería Z/E mediante diversas técnicas de RMN resultando el

isómero E el obtenido preferentemente en la síntesis de los compuestos.

A B

Resultados y discusión | Virus de la diarrea viral bovina

59

2. Virus de la diarrea viral bovina

Como se mencionó en la introducción, nuestro grupo de investigación sintetizó una

serie de TSCs las cuales fueron evaluadas frente al VDVB26

. De dicha serie, el

compuesto derivado de la 5,6-dimetoxi-1-indanona (5,6-TSC) resultó ser el más activo.

Por este motivo, se continuó en un principio con el estudio de N4-TSCs derivadas de

esta indanona con el objetivo de mejorar el perfil de liposolubilidad. Para completar

dicho estudio se evaluaron nuevas N4-TSCs obtenidas de otras indanonas que habían

resultado activas.

En esta sección se describen las actividades de las N4-TSCs frente al VDVB y se

presenta un estudio de la relación estructura-actividad con el fin de determinar las

propiedades que modulan la actividad observada. Se exponen resultados de resistencia

cruzada del compuesto más activo y la 5,6-TSC frente a la enzima RdRp (wild type y

mutada N264D/A392E) y estudios de docking molecular con el fin de conocer el

probable mecanismo de acción de los compuestos como inhibidores de la polimerasa

viral. Finalmente, se muestran los resultados del cálculo de energía libre por MM/PBSA

para conocer las contribuciones energéticas claves del complejo de la enzima con los

compuestos.

2.1. Actividad antiviral de las N4-TSCs

Se evaluaron 24 N4-TSCs frente al VDVB mediante el ensayo de reducción de unidades

formadoras de placas virales (UFP).

Dicha metodología permite titular las partículas virales que se producen en una célula

cuando es infectada. El fundamento de la técnica se centra en la infección viral de

células (en este caso MDBK), la cual genera una progenie viral que al liberarse inicia

nuevos ciclos de infección y replicación en células adyacentes dando lugar a zonas

localizadas de células muertas denominadas placas. Este tipo de estudio permite la

evaluación de compuestos como antivirales, ya que se determina la capacidad de los

mismos de disminuir el número de placas formadas. Dado que hasta el momento no

existe un fármaco para el tratamiento de la enfermedad de la DVB, para el ensayo se

tomaron como compuestos de referencia la 5,6-TSC y la ribavirina (análogo sintético de

guanosina de amplio espectro).


60

Los resultados de actividad antiviral mostraron que varias N4-TSCs fueron activas frente

al virus. Los compuestos 7 a 11 y el 14 presentaron valores de CE50 por debajo de 10

µM (Tabla 4). A su vez, se determinó la citotoxicidad de los compuestos frente a células

MDBK mediante el método MTS/PES y se determinó la selectividad de los mismos (IS)

como el cociente entre la máxima concentración evaluada para la citotoxicidad y la CI50.

Los resultados indicaron que los compuestos 17 y 23 presentaron una CC50 de 24,1 y

13,0 µM. Para el resto de las N4-TSCs no se evidenció citotoxicidad a la máxima

concentración soluble en el medio de cultivo (Tabla 4).

2.2. Relación estructura-actividad

Con el fin de encontrar las características estructurales de las N4-TSCs que modifican la

actividad anti-VDVB, se llevó a cabo un análisis de la relación estructura-actividad.

Los resultados indicaron que el compuesto más activo fue el derivado 8, con un valor de

CE50 de 0,7 µM. Dicho compuesto fue 11 veces más activo que la droga de referencia

ribavirina (CE50 = 7,7 µM) y 5 veces más que la TSC de la cual deriva (CE50 de la 5,6-

TSC = 3,8 µM).

Se observó que los derivados con la sustitución 5,6-dimetoxilo al igual que el

compuesto de referencia presentaron muy buenas actividades con valores de CE50 de 0,7

a 12,9 µM. Los compuestos con 5-metilo en el núcleo indánico presentaron buenos

valores de CE50 de 8,7 a 19,9 µM, con excepción del compuesto 13 para el cual el valor

de CE50 no fue definido y el derivado 17 al cual no se le determinó su actividad por

haber presentado citotoxicidad. En este análisis se pone en contraste la pobre actividad

presentada por todos los compuestos sin sustituir en el núcleo indánico y con la

sustitución 4,5-dimetoxilo, para los cuales no se pudo establecer un valor definido de

CE50 para ningún compuesto, encontrándose valores superiores a 10, 15 ó 20 µM. Se

evidencia así la importancia de los sustituyentes y su posición en el núcleo indánico

para que el compuesto resulte activo/inactivo frente al VDVB.


61

N4-TSC R1 R2 R3 R4 CE50 (µM) CC50 (µM) IS

1 H H H H >10 >10 -

2 H

hHH

H H NO2 >10 >10 -

3 H

H H F >20 >20 -

4 H H H Cl >20 >20 -

5 H H H CH3 >20 >20 -

6 H H H OCH3 >10 >10 -

7 H OCH3 OCH3 H 8,4 ± 0,4 >10 >1,2

8 H OCH3 OCH3 NO2 0,7 ± 0,1 >10 >14,3

9 H OCH3 OCH3 F 4,0 ± 0,8 >20 >5,0

10 H OCH3 OCH3 Cl 6,6 ± 0,2 >10 >1,5

11 H OCH3 OCH3 CH3 8,8 ± 0,1 >20 >2,3

12 H OCH3 OCH3 OCH3 12,9 ± 0,9 >20 >1,6

13 H CH3 H H >10 >10 -

14 H CH3 H NO2 8,7 ± 1,1 >20 >2,3

15 H CH3 H F 11,3 ± 1,7 >20 >1,8

16 H CH3 H Cl 13,1 ± 2,0 >20 >1,5

17 H CH3 H CH3 ND 24,1 ± 1,7 -

18 H CH3 H OCH3 19,9 ± 2,6 >20 >1,0

19 OCH3 OCH3 H H >15 >15 -

20 OCH3 OCH3 H NO2 >15 >15 -

21 OCH3 OCH3 H F >15 >15 -

22 OCH3 OCH3 H Cl >15 >15 -

23 OCH3 OCH3 H CH3 ND 13,0 ± 3,3 -

24 OCH3 OCH3 H OCH3 >15 >15 -

5,6-TSC - - - - 3,8 ± 0,4 >80 >21,1

Ribavirina - - - - 7,7 ± 1,5 54,4± 3,8 7,1

Tabla 4. Valores de actividad in vitro anti-VDVB de las N4-TSCs. ND: no determinado.

En cuanto a las variaciones en la posición para del arilo unido al N4, el compuesto más

activo de esta familia de N4-TSCs posee la sustitución nitro (derivado 8). Dentro de la

serie 5-metilo, el 14 que también presenta dicho sustituyente fue el más activo (CE50 =

8,7 µM). Cabe mencionar que el nitro es el grupo con mayor efecto atractor de

electrones estudiado en esta serie, y fue al mismo tiempo el que resultó asociado a una


62

mejor actividad antiviral. Asimismo, la incorporación de halógenos también produjo un

aumento de la actividad comparada con aquellos compuestos que están sin sustituir en

posición para. El compuesto 9 sustituido con fluor y el derivado 10 con cloro

presentaron una CE50 de 4,0 y 6,6 µM respectivamente. Para la serie 5-metilo dichos

sustituyentes presentaron actividad en el mismo orden, es decir más activo el sustituido

con fluor con una CE50 de 11,3 µM (derivado 15) y luego con el cloro con una CE50 de

13,1 µM (derivado 16). Estas observaciones pueden ser explicadas por el notable efecto

inductivo de los halógenos. En particular, el fluor presenta una mayor

electronegatividad que el átomo de cloro, lo cual lo posiciona como más activo. Por otro

lado, la sustitución del arilo con metoxilo (dador de electrones) fue la que dio lugar a

compuestos con la más baja actividad para la serie 5,6-dimetoxilo y 5-metilo con un

valor de CE50 de 12,9 y 19,9 µM para el compuesto 12 y 18 respectivamente. En el caso

de la serie 5,6-dimetoxilo, la sustitución con un grupo metilo con menor efecto dador de

electrones respecto al metoxilo presentó una mayor actividad (CE50 del compuesto 11 =

8,8 µM)

En resumen, teniendo en cuenta el análisis de las características de los sustituyentes en

la posición para del arilo unido al N4, se pudo observar que grupos atractores de

electrones favorecen la actividad mientras que grupos dadores la disminuyen. Se puede

inferir que el efecto electrónico en el R4 es el que modula la actividad antiviral y que la

sustitución en el indano juega un rol determinante para definir activos/inactivos frente al

VDVB para esta serie de compuestos.

2.3. Estudios de resistencia cruzada

La ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el virus (RdRp) lleva a cabo la

replicación del genoma viral. La estructura tridimensional de la enzima se parece a una

mano derecha compuesta de palma, pulgar y dedos (Figura 27) como se observa en

otras clases de polimerasas: ARN polimerasa dependiente de ADN, ADN polimerasa

dependiente de ADN y ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa reversa).

Sin embargo, los dedos y los dominios del pulgar varían significativamente entre las

diferentes clases de polimerasas. Una característica única de la estructura de la RdRp

son las ''yemas de los dedos'', que consisten en varias hebras de cadenas polipeptídicas

que conectan los dedos y el pulgar87

. Esta conexión restringe el gran movimiento que


63

estos dominios exhiben en otras clases de polimerasas. Las yemas de los dedos

contienen los motivos I y II de la RdRp los cuales se han propuesto que unen el

templado de ARN y los nucleótidos trifosfatos88,89

.

Figura 27. Estructura de la RdRp. La palma, dedos y pulgar se encuentran coloreados

en rojo, verde y azul respectivamente.

En trabajos previos del grupo de investigación, la 5,6-TSC fue caracterizada como un

inhibidor no nucleosídico de la RdRp viral27

. En dicho estudio fueron seleccionadas

cinco mutantes del virus resistentes al compuesto pero sensibles a ribavirina, cuatro de

las cuales llevan la mutación N264D, ubicada en la yema de los dedos de la RdRp y la

quinta mutante muestra además la mutación A392E, ubicada en el dominio de los

dedos.

Teniendo en cuenta estos resultados, se estudió mediante ensayos de resistencia cruzada

la nueva N4-TSC 8 frente al virus con la RdRp wild type y al virus con la doble mutante

N264D/A392E resistente a 5,6-TSC (de aquí en adelante RdRp mutada) con el fin de

dilucidar el mecanismo de acción del compuesto como probable inhibidor de la enzima.

Asimismo, se evaluó también la 5,6-TSC como compuesto de referencia para contrastar

los resultados encontrados. La resistencia cruzada fue evaluada mediante la reducción

del efecto citopático (ECP) por MTS/PES. Dicho ensayo se basa en los cambios

bioquímicos y moleculares que ocurren en las células infectadas, los cuales alteran la

viabilidad celular y pueden determinarse de forma espectroscópica.

Los resultados mostraron que el virus con la RdRp wild type fue sensible a la N4-TSC 8

y a la 5,6-TSC (CE50 = 0,45 y 1,95 µM respectivamente), es decir que dichos

compuestos fueron activos como anti-VDVB (Tabla 5). Estos resultados estuvieron en

concordancia con la actividad encontrada previamente para los compuestos con el


64

método de reducción de UFP. Por otro lado, los resultados del ensayo de ECP de los

compuestos frente al virus con la RdRp doble mutada mostraron valores de CE50

mayores a 10 y 80 µM para el derivado 8 y la 5,6-TSC respectivamente. De esta forma

se evidenció que el efecto de los compuestos es sensible a las mutaciones de la

polimerasa ya que para la 5,6-TSC y el derivado 8 se redujo la actividad más de 41 y 22

veces respectivamente. De los resultados obtenidos se concluye que la RdRp, al igual

que para la 5,6-TSC, sería el blanco de acción del compuesto 8.

CE50 (µM)

5,6-TSC Compuesto 8

VDVB con la RdRp wild type 1,95 ± 0,54 0,45 ± 0,08

VDVB con la RdRp N264D/A392E >80 >10

Tabla 5. Resultados de resistencia cruzada para la 5,6-TSC y la N4-TSC 8.

2.4. Docking molecular

Dados los resultados de resistencia cruzada y con el fin de explorar las interacciones

ligando-RdRp que determinan el modo de unión y la influencia de los aminoácidos

mutados en el desarrollo de resistencia, se realizó un estudio de docking molecular.

Dicho estudio es considerado una técnica computacional directa ya que se debe conocer

la estructura tridimensional de la diana biológica, la cual es utilizada para predecir la

conformación que adopta un ligando en el espacio explorado de la macromolécula. Sin

embargo, cabe aclarar que los estudios de docking no suelen ser adecuados para analizar

los valores teóricos de energía libre de unión debido a las numerosas aproximaciones

del método90,91

.

Para la realización de los cálculos de docking, el programa efectúa una búsqueda

conformacional del ligando dentro de una grilla tridimensional de puntos en la cual se

encuentra la macromolécula de interés. El programa arroja una serie de resultados que

corresponden a diferentes poses del ligando ordenadas en un ranking en función del

tamaño del cluster (conjunto de conformaciones similares) y de la energía del complejo.

Para el estudio de docking se realizó el procesamiento computacional de la estructura

cristalizada de la RdRp (PDB: 1S48) en la cual se reemplazaron las seleniometioninas


65

(las que provienen de la técnica utilizada para la cristalografía de rayos X) por

metioninas y se refinó el modelo teniendo en cuenta el diagrama de Ramachandran. En

paralelo se modeló y minimizó energéticamente el compuesto 8 y la 5,6-TSC.

En el proceso para realizar un docking resulta importante definir un espacio

tridimensional en la macromolécula en el cual se llevarán a cabo los cálculos. Este

espacio puede delimitarse a partir de conocer el sitio activo o de unión de ligandos.

Teniendo en cuenta que ningún ligando fue co-cristalizado con la enzima, se utilizó el

programa metaPocket 2.0 para identificar sitios putativos de unión en la superficie de la

enzima. Dicho programa utiliza ocho métodos distintos de predicción de sitios de unión

y los combina para mejorar los cálculos92

. Mediante este programa fue posible encontrar

tres sitios putativos de unión de los compuestos estudiados con la enzima, de los cuales

sólo uno se ubicó en la región cercana a los aminoácidos 264 y 392 donde se encuentran

las mutaciones de la RdRp resistente (Figura 28). Por lo tanto, éste fue el sitio donde se

llevó a cabo el estudio de docking.

Figura 28. Representación de la caja que delimita el sitio donde se llevó a cabo el

estudio de docking. Los aminoácidos 264 y 392 se encuentran ilustrados como esferas.

Los resultados mostraron las distintas conformaciones que puede adoptar cada ligando

en el sitio estudiado de la enzima. De todas ellas, se eligió la que tuvo el valor teórico de

energía libre de unión más favorable. Las interacciones observadas del compuesto 8 con

la RdRp wild type (Figura 29 A) fueron: i) dos puentes de hidrógeno entre el N2 y N

4 de

la función tiosemicarbazona con los aminoácidos E226 y F224, respectivamente; (ii)

puente de hidrógeno entre el oxígeno del grupo 6-metoxilo y el grupo hidroxilo de

Y289; (iii) interacción π-π stacking entre el arilo unido al N4 y la cadena lateral de

F224; (iv) interacción no polar entre el anillo indánico y A222.


66

Por otro lado, en la posición de mejor puntuación del complejo RdRp mutada-

compuesto 8 (Figura 29 B) se observó: i) puente de hidrógeno entre el N1 y el

aminoácido A222; ii) puente de hidrógeno entre el N4 y G220; iii) interacción no polar

entre el anillo indánico y A222. Teniendo en cuenta que la disposición espacial entre los

dos complejos estudiados fue muy distinta, se decidió analizar una segunda orientación

del ligando con la RdRp mutada que fuese similar a la adoptada en el complejo con

RdRp wild type (Figura 29 C). Se observó que a pesar de la orientación similar del

ligando en el sitio de unión, sólo se formó un puente de hidrógeno entre N2 y el

aminoácido E226. Además, cabe destacar que no se formaron puentes de hidrógeno

entre el grupo 5,6-dimetoxilo del indano y los aminoácidos de la enzima mutada.

Asimismo, con el fin de comparar si el modo de unión y las interacciones observadas

para el derivado 8 se mantenían en la 5,6-TSC con la enzima wild type, se realizó un

docking para este último compuesto. Los resultados indicaron que la conformación

adoptada en ambos casos con la enzima fue superponible y se encontraron, excepto las

correspondientes al arilo N4, el mismo tipo de interacciones con la RdRp (Figura 30).

En resumen, los resultados mostraron la diferente calidad y cantidad de interacciones

entre el compuesto 8 y la enzima wild type y mutada. Dicho estudio resaltó la

importancia de la sustitución 5,6-dimetoxilo en el núcleo indánico ya que a diferencia

de la wild type, no pudo establecerse ningún puente de hidrógeno con la enzima mutada.

Además, la superposición del complejo enzima-ligando para el compuesto 8 y la 5,6-

TSC en la enzima wild type permitió visualizar que las conformaciones adoptadas

fueron similares, por lo cual el mecanismo de acción de los compuestos sería similar.

Dichos resultados de cálculo están en concordancia con los obtenidos en el estudio de

resistencia cruzada, ya que ambos compuestos fueron activos en el virus con la enzima

wild type pero dicha actividad resultó afectada cuando el virus presentaba la doble

mutación. Por otro lado, los resultados también concuerdan con lo observado en la

relación estructura-actividad, dado que las N4-TSCs con la sustitución 5,6-dimetoxilo

resultaron las más activas, por lo tanto dicha sustitución es clave para la inhibición de la

enzima y por lo tanto para la acción anti-VDVB.


67

Figura 29. Docking molecular. Patrones de interacción del compuesto 8 con la RdRp

(ID PDB: 1S48). Detalles de la conformación de mejor energía libre de interacción del

compuesto en el bolsillo de unión de la enzima A) wild type y B) mutada. C) Detalles de

la conformación del compuesto con una orientación similar a la obtenida para la enzima

wild type. Los diferentes tipos de átomos en la N4-TSC se representa de la siguiente

manera: carbonos, cian; nitrógenos, azules; oxígenos, rojos; azufre, amarillo;

hidrógenos, blancos. Las líneas discontinuas color cian indican puentes de hidrógeno.

Se representan las cadenas laterales de los aminoácidos que establecen interacciones

favorables y aquellas que corresponden a las mutaciones resistentes.

Figura 30. Docking comparativo del compuesto 5,6-TSC (carbonos representados de

color rosa) y el derivado 8 (carbonos representados de color verde) con la enzima RdRp

wild type. Las líneas discontinuas color cian indican los puentes de hidrógeno.

A B C


68

2.5. Cálculo de la energía libre de unión

Las simulaciones de dinámica molecular son un complemento para analizar mecanismos

de acción ya que permiten describir un sistema de manera temporal. A partir de un

modelo inicial formado por N partículas que interaccionan, el cual puede provenir de

datos experimentales o teóricos, se determinan sus movimientos individuales en función

del tiempo. Dicha trayectoria sigue las ecuaciones correspondientes a las leyes de

movimiento de Newton, mediante las cuales se genera la secuencia temporal de la

evolución del sistema.

Debido a la complejidad de los cálculos, las ecuaciones de movimiento son integradas

en pequeños pasos sucesivos luego de un cierto tiempo denominado time step (dt), en el

cual en cada uno de ellos se obtiene una descripción del sistema (frame). Asimismo, en

cada paso se calculan las fuerzas de los átomos y luego se combinan con las posiciones

iniciales para generar la trayectoria. La elección del dt resulta de considerar la duración

de los fenómenos que se desean observar y el “costo” computacional. Para las

biomoléculas los movimientos de las vibraciones de los enlaces se encuentran en el

rango de los femtosegundos (fs), por lo cual el dt debería ser lo suficientemente

pequeño para reproducir estos movimientos.

Las interacciones entre macromoléculas y ligandos pueden ser estudiadas utilizando

herramientas de dinámica molecular, mediante las cuales es posible estimar la energía

libre de unión. Entre ellas, se encuentra el método de mecánica molecular/Poisson

Boltzmann surface area (MM/PBSA), el cual permite obtener tendencias comparativas

de gran utilidad para el estudio de interacciones ligando-proteína.

El método de MM/PBSA evalúa la energía libre de los estados iniciales y finales, por lo

cual se lo considera como un método de punto final. El cálculo de energía libre puede

dividirse en tres partes como se indica en la siguiente ecuación:

El primer término de ∆EMM es la energía de mecánica molecular, que incluye las

contribuciones de enlace, de van der Waals (∆EvdW) y electrostática (∆Eele). Cabe aclarar

que cuando no existen uniones covalentes entre el ligando y la macromolécula la

contribución de enlace es nula. El segundo término es la energía de solvatación (∆Gsol),


69

que incluye el componente polar (∆Gpol) y no polar (∆Gnopol). El último término es la

temperatura absoluta por la entropía (T∆S).

Con el fin de medir el ∆Gunión para el derivado 5,6-TSC y la N4-TSC 8 con la RdRp wild

type y mutada, se realizaron los cálculos de MM/PBSA de dichos compuestos con las

dos formas de la enzima. Como se indica en la Tabla 6, el complejo correspondiente al

compuesto 8 con la RdRp wild type presentó el valor de energía más favorable (∆Gunión

= -8,37 kcal/mol), seguido por el complejo de la 5,6-TSC con la RdRp wild type

(∆Gunión = -7,38 kcal/mol). En cambio, los complejos con la enzima mutada mostraron

un cambio desfavorable de energía con valores de ∆Gunión de -6,57 y -5,89 kcal/mol para

el derivado 8 y la 5,6-TSC respectivamente. De esta manera, se observó que el orden de

las energías estuvo en concordancia con los valores de actividad experimentales, es

decir las interacciones de ∆Gunión con valores más negativos se correspondieron con las

de menor CE50.

Con el fin de determinar el tipo de interacciones que más contribuyen en el ∆Gunión, se

realizaron comparaciones de los componentes de las energías libres (Tabla 6). En todos

los complejos la energía de van der Waals debida a las interacciones de tipo

hidrofóbicas fue la interacción más contribuyente para la unión. También se registraron

en todos los casos interacciones favorables debido a la energía electrostática y en menor

medida debida a la energía de solvatación no polar. Por otro lado, dichas contribuciones

favorables fueron contrarrestadas por la energía de solvatación polar y la entropía.

Al comparar las variaciones de cada componente de la energía entre los dos sistemas

correspondientes al derivado 8, se observó que en la contribución electrostática hubo

una diferencia de 1,60 kcal/mol a favor del complejo con la enzima wild type, siendo

este tipo de energía el que mostró la mayor variación entre los dos sistemas estudiados.

En el caso de las diferencias de energía de van der Waals el valor de diferencia

encontrado fue de 1,39 kcal/mol nuevamente a favor del sistema wild type. Para el

componente de la energía de solvatación polar, la variación fue de 0,94 kcal/mol a favor

del sistema mutado. Cabe señalar que la contribución de la solvatación no polar y

entrópica no mostraron diferencias entre los modelos estudiados. Para el compuesto 5,6-

TSC se encontraron resultados análogos, es decir, los cambios de energía entre los

complejos se centraron principalmente en la contribución electrostática (variación de

0,96 kcal/mol) y las interacciones de van der Waals (variación de 0,95 kcal/mol).


70

Teniendo en cuenta que las mayores variaciones de energía entre los complejos con la

RdRp wild type y mutada estuvieron centradas en las interacciones electrostáticas, se

analizó el número de puentes de hidrógenos a lo largo del tiempo (Figura 31). Los

resultados indicaron que el complejo entre la enzima wild type con el compuesto 8

mantuvo al menos un puente de hidrógeno el 35% del tiempo. Además, cabe destacar,

que en dicho complejo se observó la presencia de los 3 puentes de hidrógeno

encontrados previamente en el estudio de docking. En cuanto al complejo 5,6-TSC y la

enzima wild type, hubo al menos un puente de hidrógeno el 30 % del tiempo. Por el

contrario, los complejos con la enzima mutada mostraron que a lo largo del tiempo

estudiado los puentes de hidrógeno estuvieron presentes en menos del 15% de los

frames. De esta forma, se evidenció que la formación de puentes de hidrógeno sería

determinante para la interacción entre los compuestos y la enzima y por lo tanto para las

actividades observadas en el ensayo de resistencia cruzada.

Los valores de ∆Gunión calculados por MM/PBSA indicaron diferencias entre los cuatro

modelos estudiados, resultando los sistemas con la enzima wild type las de menor

energía y por lo tanto las más favorables termodinámicamente. Asimismo, se estableció

como factor principal de las diferencias observadas la contribución electrostática. Estos

resultados computacionales estuvieron en concordancia con el ensayo de resistencia

cruzada y proporcionaron información sobre la magnitud y calidad de interacciones

establecidas entre la polimerasa viral y el ligando. Por lo tanto, a partir de los resultados

teóricos se infiere una directa correlación entre la capacidad del ligando de interaccionar

con la enzima y la actividad anti-VDVB.

Compuesto 8 Compuesto 8 5,6-TSC 5,6-TSC

RdRp wild type RdRp mutada RdRp wild type RdRp mutada

ΔEvdW -37,08 -35,69 -36,10 -35,15

ΔEele -14,12 -12,52 -13,02 -12,06

ΔGNP -4,07 -4,27 -3,89 -3,92

ΔGPB 32,82 31,88 33,38 33,12

-TΔS 14,08 14,03 12,25 12,12

ΔGunión -8,37 -6,57 -7,38 -5,89

Tabla 6. Energías libre de unión y sus componentes para el compuesto 8 y 5,6-TSC con

la enzima RdRp wild type y mutada. Los valores de energía se expresan en kcal/mol.


71

Figura 31. Número de puentes de hidrógeno en función del tiempo. Complejo entre el

compuesto 8 y la: A) RdRp wild type; B) RdRp mutada. Complejo entre el compuesto

5,6-TSC y la: C) RdRp wild type; D) RdRp mutada.

A

B

C

D


72

En resumen:

La N4-TSC 8 es la más activa de la serie.

Grupos atractores de electrones en R4 y la sustitución 5,6-dimetoxilo en el

indano potencian la actividad antiviral.

Para la mayoría de los compuestos no se evidencian efectos citotóxicos en

células MDBK.

Los estudios de resistencia cruzada, docking y dinámica molecular indican

que la diana biológica del derivado 8 sería la RdRp viral.

.

Resultados y discusión | Trypanosoma cruzi

73

3. Trypanosoma cruzi

Con el fin de investigar la acción anti-tripanosomátida de las 30 N4-TSCs sintetizadas,

se determinaron de forma paralela las actividades biológicas de las mismas frente a T.

cruzi y T. brucei. En esta sección se describen y discuten los resultados de evaluación

antichagásica frente a las tres formas del parásito: epimastigote, tripomastigote y

amastigote y se presenta el análisis del estudio de la relación estructura-actividad. A la

vez, se exponen los resultados de citotoxicidad en células Vero. Por último, se muestran

los resultados de actividad de los compuestos más activos frente a la enzima cruzipaína,

llevada a cabo para dilucidar su probable mecanismo de acción.

3.1. Actividad anti T. cruzi de las N4-TSCs

Las 30 N4-TSCs fueron evaluadas frente a la forma epimastigote (clon CL Brener) y

tripomastigote (cepa Tulahuén, stock Tul2). Se realizó un screening a la concentración

final de 20 µM para conocer la potencia de los compuestos, de tal forma que se pudiese

identificar las N4-TSCs prometedoras. Asimismo, cabe mencionar que los valores de

CI50 determinados previamente frente a epimastigotes para esta familia de compuestos,

habían presentado valores desde 1,0 µM a mayores de 50 µM28

.

En los estudios frente a la forma epimastigote los resultados fueron expresados como

porcentaje de inhibición a la concentración de 20µM. En este primer experimento

ninguno de los compuestos resultó más activo que la droga de referencia benznidazol

(inhibición del 67,1 %). No obstante, los compuestos 7 y 10 mostraron porcentajes de

inhibición superiores al 50 % (Tabla 7). Cabe destacar que los compuestos 1, 4, 5, 7, 10

y 11 habían sido previamente estudiados frente a una cepa distinta de epimastigotes

(cepa Tulahuén), para la cual se había medido la actividad por un método

espectrofotométrico28

. En aquella experiencia, el compuesto 4 había presentado una CI50

de 25 µM y los otros cuatro compuestos habían mostrado una CI50 por debajo de 10

µM. Sin embargo, en esta oportunidad no se evidenciaron actividades similares, a

excepción del compuesto 4. Dichas diferencias pueden ser explicadas por la distinta

cepa estudiada, la variación inter-laboratorio y de operador, y el distinto método

empleado para la determinación de la actividad anti-chagásica.


74

En una siguiente etapa, se continuó con los estudios para la forma tripomastigote (forma

infectiva en el mamífero) cuyos resultados fueron expresados como porcentaje de lisis.

Cuatro compuestos (1, 2, 4 y 7) mostraron valores de lisis superiores al del benznidazol

para esta forma del parásito (Tabla 7). Debido a estos resultados alentadores, se

ensayaron concentraciones crecientes de dichas N4-TSCs con el fin de determinar el

valor de CE50. Sin embargo, dada la solubilidad limitada de los compuestos en el medio

de cultivo no se pudo determinar dicho valor.

La comparación de los resultados entre las dos formas del parásito mostró para los

compuestos 1, 2, 4 a 7, 12, 13, 15 a 17, 21 y 28 una misma tendencia de actividad. Sin

embargo, para el resto de los compuestos hubo divergencias en los resultados obtenidos

entre ambas formas del parásito. En particular, hubo notables diferencias de actividad

para los compuestos 11 y 29 para los cuales el porcentaje de inhibición alcanzó casi el

50% y el 38% respectivamente en parásitos epimastigotes. No obstante, cuando se

estudió el efecto de dichas N4-TSCs para la forma tripomastigote la actividad fue nula

para ambos compuestos. El caso inverso ocurrió para los compuestos 14 y 20, es decir,

nula o muy pobre actividad fue observada en la forma epimastigote, pero valores de lisis

cercanos al 50 % fueron observados para la forma tripomastigote. De esta forma, según

el compuesto fue posible evidenciar o no una correlación de actividad medida entre los

dos estadios de T. cruzi.

En lo que respecta a la citotoxicidad de las N4-TSCs, se evaluó su efecto en células de

mamífero Vero mediante la reducción metabólica de MTT. Ninguno de los compuestos

evidenció citotoxicidad a la máxima concentración soluble en el medio de cultivo (entre

20 y 100 µM según el compuesto). Por otro lado, el benznidazol tampoco evidenció

efecto citotóxico para el valor de concentración final de 100 µM. Asimismo, para dicho

compuesto de referencia se pudo determinar la CC50 obteniéndose un valor de 291 µM.


75

N4-TSC R1 R2 R3 R4 Epimastigotes Tripomastigotes

Células

Vero

% inhibición

(a 20 µM)

% lisis

(a 20 µM)

CC50

(µM)

1 H H H H 42,6 ± 1.9 56,7 ± 5,9 >20

2 H H H NO2 39,6 ± 3.4 56,0 ± 4,1 >50

3 H H H F 22,7 ± 2.1 9,1 ± 0,7 >80

4 H H H Cl 40,3 ± 3.4 67,9 ± 3,4 >40

5 H H H CH3 31,4 ± 2,0 27,3 ± 1,8 >50

6 H H H OCH3 16,3 ± 1,2 11,4 ± 1,1 >70

7 H OCH3 OCH3 H 55,0 ± 2,9 56,0 ± 5,5 >25

8 H OCH3 OCH3 NO2 27,7 ± 2,6 46,7 ± 3,7 >30

9 H OCH3 OCH3 F 41,2 ± 3,1 23,3 ± 2,6 >30

10 H OCH3 OCH3 Cl 65,4 ± 2,4 44,3 ± 0,8 >30

11 H OCH3 OCH3 CH3 49,2 ± 1,0 0,0 ± 0,0 >50

12 H OCH3 OCH3 OCH3 25,7 ± 2,3 18,2 ± 0,9 >30

13 H CH3 H H 39,7 ± 4,1 31,8 ± 2,7 >35

14 H CH3 H NO2 1,5 ± 1,2 51,1 ± 1,4 >60

15 H CH3 H F 42,7 ± 1,9 38,7 ± 1,8 >80

16 H CH3 H Cl 34,6 ± 2,6 46,0 ± 2,9 >50

17 H CH3 H CH3 15, 7 ± 2,5 27,0 ± 2,2 >50

18 H CH3 H OCH3 29,1 ± 1,8 36,5 ± 1,2 >50

19 OCH3 OCH3 H H 30,2 ± 2,6 40,9 ± 1,6 >25

20 OCH3 OCH3 H NO2 10,6 ± 1,3 42,9 ± 2,5 >30

21 OCH3 OCH3 H F 30,3 ± 1,7 36,4 ± 3,0 >30

22 OCH3 OCH3 H Cl 29,3 ± 1,9 4,5 ± 0,6 >30

23 OCH3 OCH3 H CH3 20,3 ± 1,7 41,3 ± 1,9 >50

24 OCH3 OCH3 H OCH3 8,6 ± 1,0 31,7 ± 2,8 >30

25 H Br H H 30,4 ± 4,2 50,7 ± 2,1 >20

26 H Br H NO2 25,5 ± 2,3 44,4 ± 3,9 >100


76

27 H Br H F 45,4 ± 3,0 23,8 ± 1,5 >40

28 H Br H Cl 41,1 ± 2,7 36,2 ± 3,4 >30

29 H Br H CH3 38,0 ± 2,4 0,0 ± 0,0 >40

30 H Br H OCH3 30,1 ± 2,9 16,0 ± 1,2 >100

Bz - - - - 67,1 ± 2,1 52,4 ± 2,6 291±16,8

Tabla 7. Porcentajes de inhibición de T. cruzi en su forma epimastigote y de lisis para

la forma tripomastigote para una concentración 20 µM de compuesto. Resultados de

CC50 en células Vero. Bz: benznidazol.

En una etapa posterior, se ensayaron en amastigotes los cuatro compuestos que

presentaron la mayor actividad frente a los tripomastigotes, los cuales también habían

resultado activos frente a la forma epimastigote (1, 2, 4 y 7).

Los resultados obtenidos mostraron que los cuatro compuestos fueron activos frente a

los amastigotes de T. cruzi. En particular los compuestos 1 y 7 fueron los de mayor

actividad, con porcentajes de inhibición del 86 y 82 % (a la concentración final de 20

µM), respectivamente (Tabla 8 y Figuras 32 y 33). Por otro lado, los compuestos 2 y 4

también presentaron actividad pero con valores de inhibición del parásito menores que

los compuestos anteriores, de 54 y 64 % respectivamente para la misma concentración

(Tabla 8 y Figura 32). Teniendo en cuenta dichos resultados, se determinó la CI50 de las

N4-TSCs 1 y 7 para los cuales se obtuvieron los valores de 7,54 y 7,40 µM,

respectivamente (Tabla 8). El control positivo utilizado fue el benznidazol para el cual

se obtuvo una CI50 de 1,41 µM. Si bien las N4-TSCs no superaron la actividad de la

droga de referencia para esta forma del parásito, su actividad no resulta despreciable y

resultan de interés para ser utilizadas como punto de partida de futuras

farmacomodulaciones.

N4-TSC % de inhibición para: CI50 (µM)

20 µM 10 µM 1 µM

1 86,4 ± 13,0 61,6 ± 9,1 4,1 ± 1,1 7,54 ± 1,5

2 54,2 ± 8,4 31,1 ± 3,5 2,8 ± 0,9 ND

4 64,4 ± 12,6 17,5 ± 5,3 5,0 ± 1,7 ND

7 81,8 ± 9,3 71,7 ± 6,6 15,0 ± 2,8 7,40 ± 1,1

Tabla 8. Porcentajes de inhibición de T. cruzi en su forma amastigote luego del

tratamiento con N4-TSCs a las concentraciones de 20, 10 y 1 µM. ND: no determinado.


77

Inh

ibic

ión

(%

)

1 2 4 7

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

2 0 M

1 0 M

1 M

Figura 32. Porcentaje de inhibición de T. cruzi en su forma amastigote para las N4-

TSCs 1, 2, 4 y 7 a las concentraciones ensayadas.

Figura 33. Efecto del compuesto 1 sobre amastigotes de T. cruzi. A) Control sin tratar,

donde se observa gran número de parásitos por célula. B) Células tratadas con la N4-

TSC 1, donde el número de parásitos en las células es nulo o muy reducido. Imágenes

tomadas con aumento de 40X.

En resumen, se determinaron las actividades de las 30 N4-TSCs sintetizadas para una

concentración final de 20 µM en epimastigotes y tripomastigotes. Dos N4-TSCs

(derivados 7 y 10) presentaron porcentajes de inhibición en la forma epimastigote por

encima del 50 % y cuatro compuestos (derivados 1, 2, 4 y 7) presentaron valores de lisis

en tripomastigotes por encima del benznidazol (52,4 %). Asimismo, dichas N4-TSCs

fueron activas frente a la forma amastigote y en particular dos de ellas (derivados 1 y 7)

presentaron una CI50 por debajo de 10 µM. En cuanto a las determinaciones en las

células Vero ningún compuesto presentó citotoxicidad en las condiciones estudiadas, lo

cual indica la selectividad de los derivados frente al parásito.

A B


78

3.2. Relación estructura-actividad cualitativa

Con el fin de encontrar las características estructurales de las N4-TSCs que modifican la

actividad anti-T. cruzi se analizaron los resultados en la forma epimastigote y

tripomastigote.

3.2.1. Resultados en epimastigotes

Los resultados en epimastigotes mostraron que las variaciones en el arilo unido al N4

modifican la actividad. Compuestos con los sustituyentes: H, F y Cl fueron los que

presentaron los mejores valores de inhibición con valores de 30 a 55 %, 22 a 45 % y 29

a 65 % respectivamente. Cabe destacar que el hidrógeno y el fluor comparten la

característica de tener un reducido radio de van der Waals por lo cual el reemplazo de H

por F se lo considera desde la farmacomodulación como un cambio de isostería no

clásico. Asimismo, el reemplazo de F por Cl es un reemplazo isostérico clásico ya que

se conserva el mismo número de electrones de valencia. De esta forma, se evidenció que

las N4-TSCs que presentan dichos cambios isostéricos conservan la actividad evaluada.

Por otro lado, los sustituyentes nitro y metoxilo en el arilo unido al N4 presentaron los

porcentajes de inhibición más bajos, con valores de 1 a 39 % y 8 a 30 %

respectivamente. En cuanto a la sustitución con un grupo metilo, los valores de

actividad fueron variables, obteniéndose un rango de valor de inhibición entre 15 % y

49 %.

Respecto a la sustitución en el anillo indánico los derivados de 5,6-dimetoxilo fueron

los más activos, presentando cuatro compuestos (7, 9, 10 y 11) porcentajes de inhibición

entre 41 y 65 %. Los derivados con H y Br en posición 5 presentaron buenos valores de

actividad con porcentajes de inhibición que llegaron a 42 y 45 % respectivamente. Por

otro lado, la sustitución con 5-metilo presentó actividades anti-epimastigote variables,

con un valor máximo de inhibición del 42 % para el compuesto 15 y un valor mínimo

del 1 % para el derivado 14. La sustitución 4,5-dimetoxilo fue la menos favorable para

la actividad ya que ningún compuesto superó el 30 % de inhibición.

En resumen, teniendo en cuenta el análisis de las características de los sustituyentes en

el arilo unido al N4 se pudo observar que F y sus isósteros H y Cl presentaron los

mejores valores de actividad. Asimismo, se observó que la sustitución en el indano


79

modula también la actividad, resultando la sustitución 5,6-dimetoxilo la más

conveniente para las N4-TSCs estudiadas.

3.2.2 Resultados en tripomastigotes

Los resultados en tripomastigotes también mostraron que las variaciones en el arilo

unido al N4 modifican la actividad. En este análisis, al igual que lo observado para

epimastigotes, la sustitución con R4 = Cl fue la que presentó el compuesto más activo

(N4-TSC 4) con el 68% de lisis. En cuanto a los compuestos con R4 = NO2 e H se

obtuvieron buenos valores de actividad para todos sus derivados, con porcentajes de

lisis de 42 a 56 % y de 31 a 56% respectivamente. En este sentido, hubo diferencia con

lo observado para la sustitución con nitro respecto a los epimastigotes. Asimismo, otra

diferencia con lo observado en epimastigotes, fue la actividad para los derivados con

fluor ya que en tripomastigotes no presentaron los mejores valores de actividad,

observándose el máximo porcentaje de lisis del 38 % y el mínimo del 9 %. Por otro

lado, los derivados con metilo y metoxilo presentaron pobres valores de lisis, a

excepción de los derivados 18 y 23 con 36 y 41 % respectivamente.

En cuanto a la sustitución en el núcleo indánico no se observó una tendencia definida,

todas las series de indanonas evaluadas presentaron actividades variables.

En síntesis, la actividad observada para las N4-TSCs en tripomastigotes fue buena para

los compuestos con la sustitución nitro e hidrógeno en R4. Sin embargo, más allá de esta

tendencia no se evidenció una relación directa de las actividades con las propiedades

estructurales de los compuestos.

3.3. Evaluación de las N4-TSCs frente a la cruzipaína

La cruzipaína (Cz) es la principal cisteína proteasa de T. cruzi. Dicha enzima es

codificada por una extensa familia de genes polimórficos y se expresa en los distintos

estadíos del ciclo de vida del parásito aunque su mayor concentración se presenta en los

epimastigotes25,93

. Respecto a su localización subcelular, se halla principalmente en los

lisosomas pero también se ha observado algunas isoformas minoritarias en la membrana

plasmática del parásito94

.


80

La Cz juega un rol fundamental en la invasión de las células huésped ya que degrada los

tejidos, facilita la penetración del parásito y participa en la evasión del sistema inmune.

Asimismo, participa en la nutrición y proliferación de epimastigotes y amastigotes y en

la metaciclogénesis (transformación de epimastigotes a tripomastigotes metacíclicos)

por lo cual resulta esencial en el ciclo de vida del parásito93,95

. Por otro lado, la

inhibición de la Cz altera su paso desde el complejo de Golgi a los lisosomas

induciendo concomitantemente su acumulación en las vesículas de Golgi. Dicha

acumulación provoca alteraciones ultraestructurales que llevan finalmente a la muerte

del parásito. Por estos motivos la Cz ha resultado un blanco quimioterapéutico de gran

interés en la búsqueda de antichagásicos.

Desde el trabajo de Du y col.11

en 2002, numerosas TSCs han sido descriptas como

inhibidoras tanto de la enzima recombinante (cruzaína) como la nativa extraída del

parásito (Cz). De esta forma, se decidió investigar si los compuestos 1, 2, 4 y 7, los

cuales habían resultado ser los más activos sobre las tres formas del parásito, son

capaces de inhibir la enzima. Para determinar dicha inhibición se procedió a detectar la

actividad proteolítica de la Cz mediante una zimografía en presencia y ausencia de los

compuestos a ensayar. La técnica consiste en una electroforesis de la enzima en gel de

poliacrilamida, dicho gel tiene en su composición gelatina la cual sirve como sustrato de

la Cz. Luego de la incubación y tinción con Coomassie blue se puede detectar una zona

sin coloración la cual se corresponde con la degradación del gel debido a la actividad

proteolítica de la enzima.

Se realizaron dos zimografías debido a las limitaciones de tamaño del gel. En el primer

gel se incubaron las N4-TSCs 1 y 2. En el segundo gel se incubaron los compuestos 4 y

7. En ambos ensayos se corrió un estándar comercial de sustancias con pesos

moleculares conocidos, el cual permite identificar la posición correspondiente a la

enzima en la corrida, y los siguientes controles: Cz sin tratar (control sin tratar), Cz

incubada con 5% de DMSO (control de vehículo) y Cz incubada con E-64, un epóxido

que inhibe irreversiblemente una amplia gama de cisteína peptidasas96,97

(control

positivo de inhibición).

Los resultados en ambos geles mostraron la acción proteolítica de la Cz al encontrarse

degradado en el gel una región en forma de banda ancha correspondiente a un peso

molecular aparente cercano a los 45 kDa. Se observó que en el control de vehículo, el


81

gel fue degradado de igual manera que en el control sin tratar, poniendo así en evidencia

que el DMSO, a la concentración evaluada, no tuvo efecto sobre la actividad

enzimática. Cabe aclarar que la banda de intensidad más tenue que se observó cercana a

los 55 kDa corresponde a una impureza que no se logra separar de la Cz con el método

de extracción utilizado98

. La calle correspondiente al control de inhibición de la enzima,

mostró que el gel se mantuvo integro en la región de la Cz luego de la incubación,

demostrando así la ausencia de actividad proteolítica debida a la presencia del inhibidor

de referencia.

Los resultados de las dos zimografías mostraron que luego de la incubación con los

compuestos 1, 2, 4 y 7 el gel fue degradado de igual forma que en el control sin tratar y

que el control de vehículo (Figuras 34 y 35). De esta forma se determinó que dichos

compuestos estudiados no tuvieron la propiedad de inhibir la Cz en las condiciones

evaluadas.

Teniendo en cuenta los resultados de la zimografía para los cuatro compuestos

ensayados, se concluye que ninguno de ellos logró inhibir a la cruzipaína. Por lo tanto,

esta enzima no sería el blanco de las N4-TSCs ensayadas y su efecto en el parásito sería

debido a otros mecanismos aún no estudiados.

Figura 34. Primera zimografía. a: estándar de pesos moleculares; b: Cz (control sin

tratar); c: Cz incubada con E-64 (control positivo de inhibición); d: Cz incubada con el

compuesto 1; e: Cz incubada con el compuesto 2; f: Cz incubada con DMSO (control de

vehículo). Las zonas más claras se deben a la degradación de la gelatina por parte de las

proteasas.

a b c d f

e

220 kDa

91 kDa

50 kDa

35 kDa


82

Figura 35. Segunda zimografía. a: estándar de pesos moleculares; b: Cz (control sin

tratar); c: Cz incubada con E-64 (control positivo de inhibición); d: Cz incubada con el

compuesto 4; e: Cz incubada con el compuesto 7; f: Cz incubada con DMSO (control de

vehículo). Las zonas más claras se deben a la degradación de la gelatina por parte de las

proteasas.

En resumen:

Los derivados 1, 2, 4 y 7 son activos frente a las tres formas de T. cruzi y su

diana biológica no sería la cruzipaína.

Los átomos de H, F y Cl en R4 y la sustitución 5,6-dimetoxilo en el indano

potencian la actividad frente a epimastigotes.

No se estableció una relación directa entre las propiedades estructurales de

las N4-TSCs y la actividad frente a tripomastigotes.

Ningún compuesto resultó citotóxico en células Vero a la máxima

concentración evaluada

a b c d f

e

220 kDa

91 kDa

50 kDa

35 kDa

Resultados y discusión | Trypanosoma brucei

83

4. Trypanosoma brucei

Como se mencionó en la sección anterior, las 30 N4-TSCs sintetizadas fueron evaluadas

también como antiparasitarios frente a T. brucei. En esta sección se describen las

actividades de estos compuestos y se presenta y discute un análisis de la relación

estructura-actividad y QSAR llevado a cabo para determinar las propiedades que

modulan la actividad observada. Se exponen los resultados de inhibición de proteasas

por parte del compuesto más activo, realizada con el fin de conocer el probable

mecanismo de acción. Finalmente se muestran resultados de la captación intracelular del

compuesto y diversos estudios por citometría de flujo y microscopía electrónica para

evaluar el tipo de muerte celular que induce el compuesto más activo.

4.1. Actividad anti-T. brucei de las N4-TSCs

Las 30 N4-TSCs fueron evaluadas in vitro frente a T. brucei brucei en su forma

sanguínea (bloodstream) cepa 427. Se determinó para todos los compuestos la CI50

excepto para seis derivados (18, 20, 21, 22, 23 y 24) ya que la misma se encontraría por

encima de 30 µM, concentración en la cual los compuestos tienen una solubilidad

limitada.

Los resultados indicaron que seis compuestos (2, 8, 10, 14, 15 y 25) presentaron valores

de CI50 por debajo de 10 µM (Tabla 9). En particular, el compuesto 8 fue el más activo

de toda la serie estudiada con un valor de CI50 de 2,51 µM y resultó ocho veces más

activo que una de las drogas de referencia utilizada (CI50 de la eflornitina = 21,55 µM).

Teniendo en cuenta los valores de citotoxicidad frente a células Vero, se calculó el

índice de selectividad (IS) para las N4-TSCs como el cociente entre la máxima

concentración evaluada para la citotoxicidad y la CI50 (Tabla 9). Dentro de los 30

compuestos, aquel que presentó mayor selectividad fue el derivado 8 (IS > 11,95). Por

este motivo, los estudios posteriores de mecanismo de acción y de tipo de muerte

celular se llevaron a cabo con dicho derivado.


84

N4-TSC R1 R2 R3 R4 CI50 (µM)

CC50

(µM) IS

1 H H H H 12,07 ± 1,43 >20 >1,66

2 H H H NO2 6,96 ± 0,59 >50 >7,18

3 H H H F 11,22 ± 0,73 >80 >7,13

4 H H H Cl 14,25 ± 1,74 >40 >2,81

5 H H H CH3 35,23 ± 3,50 >50 >1,42

6 H H H OCH3 19,99 ± 1,27 >70 >3,50

7 H OCH3 OCH3 H 14,55 ± 1,37 >25 >1,72

8 H OCH3 OCH3 NO2 2,51 ± 0,21 >30 >11,95

9 H OCH3 OCH3 F 17,10 ± 1,21 >30 >1,75

10 H OCH3 OCH3 Cl 7,25 ± 0,49 >30 >4,14

11 H OCH3 OCH3 CH3 12,97 ± 1,40 >50 >3,86

12 H OCH3 OCH3 OCH3 18,29 ± 1,86 >30 >1,64

13 H CH3 H H 13,10 ± 0,74 >35 >2,67

14 H CH3 H NO2 8,41 ± 0,54 >60 >7,13

15 H CH3 H F 9,48 ± 0,42 >80 >8,44

16 H CH3 H Cl 25,71 ± 3,10 >50 >1,94

17 H CH3 H CH3 33,30 ± 2,99 >50 >1,50

18 H CH3 H OCH3 >30 >50 -

19 OCH3 OCH3 H H 12,34 ± 1,42 >25 >2,03

20 OCH3 OCH3 H NO2 >30 >30 -

21 OCH3 OCH3 H F >30 >30 -

22 OCH3 OCH3 H Cl >30 >30 -

23 OCH3 OCH3 H CH3 >30 >50 -

24 OCH3 OCH3 H OCH3 >30 >30 -

25 H Br H H 8,70 ± 0,58 >20 >2,30

26 H Br H NO2 11,52 ± 1,50 >100 >8,68

27 H Br H F 18,45 ± 0,83 >40 >2,17


85

28 H Br H Cl 20,86 ± 1,18 >30 >1,44

29 H Br H CH3 23,91 ± 0,95 >40 >1,67

30 H Br H OCH3 24,54 ± 0,79 >100 >4,07

Ptm - - - - (9,1 ± 0,12)x10-4

ND -

Efl - - - - 21,55 ± 2,29 580 ± 61 26,91

Tabla 9. Resultados de CI50 en T. brucei brucei en su forma sanguínea (bloodstream)

cepa 427 y CC50 en células Vero. ND: no determinado. Ptm: pentamidina. Efl:

eflornitina.

8

lo g [c o n c e n tra c ió n (M )]

% i

nh

ibic

ión

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 0


% i

nh

ibic

ión

0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

2


% i

nh

ibic

ión

0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Figura 36. Curvas de porcentaje de inhibición vs. log de la concentración para los

derivados: A) 2; B) 8 y C) 10.

4.2. Relación estructura-actividad cualitativa

La variabilidad de los sustituyentes en el indano y en la posición para del arilo unido al

N4, junto con la determinación de los valores de CI50, permitieron estudiar de forma

cualitativa aquellas propiedades estructurales que se encuentran relacionadas con la

actividad medida.

Se observó que la naturaleza del sustituyente en posición para del grupo N4-arilo tiene

un efecto importante en la actividad biológica ensayada. Las N4-TSCs con un grupo

nitro en la posición R4 presentaron las mejores actividades dentro de la serie derivada de

1-indanona (CI50 2 = 6,96 µM), 5,6-dimetoxi-1-indanona (CI50 8 = 2,51 µM), y 5-metil-

1-indanona (CI50 14 = 8,41 µM). En el caso de los derivados de la 5-bromo-1-indanona

el compuesto sustituido con el grupo nitro (26) fue el segundo más activo de dicha serie

con un valor de CI50 de 11,52 µM. Asimismo, los compuestos sin sustituir (R4 = H)

mostraron en general buenos valores de actividad, aunque por debajo de aquellos

A B C


86

sustituidos con el grupo nitro. Por otro lado, los grupos metilo y metoxilo en R4 se

correspondieron con bajas actividades para cada una de las series de 1-indanonas. La

sustitución con los átomos de F y Cl en R4 mostraron valores de actividad variables.

El análisis de la sustitución del núcleo indánico mostró que la presencia de grupos

metoxilos en las posiciones 4 y 5 conllevó a la perdida de actividad, con excepción del

compuesto 19 con un valor de CI50 de 12,34 µM. Sin embargo, cuando en la indanona

los metoxilos se encuentran en posición 5 y 6 la actividad alcanzó los mejores valores

(entre 2,51 y 18,29 µM), demostrando así la importancia de la posición de estos

sustituyentes en la indanona. Por otro lado, las N4-TSCs derivadas de la 5-bromo y 5-

metil presentaron en general una reducción en su actividad respecto de sus análogos

derivados de la 1-indanona (sin sustituyentes en el núcleo indánico).

En síntesis, la actividad observada fue buena para los compuestos con la sustitución

nitro e hidrógeno en R4. Asimismo, se evidenció que el patrón y la sustitución en el

núcleo indánico influyen en la actividad, siendo los derivados de la 1-indanona y la 5,6-

dimetoxi-1-indanona los de mejor efecto anti-T. brucei.

4.3. Estudios de QSAR

Teniendo en cuenta los resultados encontrados previamente de relación estructura-

actividad cualitativa se decidió llevar a cabo un estudio en el mismo sentido pero de

forma cuantitativa (QSAR) con el objeto de describir matemáticamente la actividad

anti-T. brucei para esta serie de compuestos.

Como se mencionó en la introducción, QSAR es un método que contribuye en el diseño

de fármacos. Es una estrategia para la cual no se necesita conocer la diana biológica ya

que el modelo se basa en conocer las propiedades de los compuestos para desarrollar

ecuaciones de correlación con la actividad biológica medida. Para llevar a cabo el

estudio se necesita básicamente tres tipos de información: estructura molecular, datos de

actividad biológica y propiedades fisicoquímicas de los compuestos (las cuales se

expresan por medio de descriptores numéricos). Los datos de actividad biológica son

experimentales y es recomendable que provengan de un solo laboratorio de

investigación para asegurar que los resultados fueron obtenidos bajo las mismas

condiciones y bajo los mismos errores sistemáticos, operativos y de manipulación


87

humana. En cuanto a los descriptores moleculares, estos pueden ser obtenidos de forma

experimental o calculados computacionalmente.

Cuando se cuenta con la información previamente mencionada se puede utilizar el

método de regresión lineal múltiple para obtener la ecuación de correlación. Para ello se

toma como variable dependiente los valores de actividad biológica y como variables

independientes los descriptores. Las expresiones más sencillas de estos modelos

normalmente adoptan la siguiente forma:

Donde “y” representa la actividad biológica medida, “x” son los descriptores y “a” los

coeficientes para el ajuste de la ecuación.

La ecuación de QSAR permite dos tipos de aplicaciones: uno prospectivo y otro

retrospectivo. El primero de ellos permite predecir la actividad biológica de compuestos

aun no sintetizados, los cuales deben compartir características estructurales con los

compuestos incluidos en el estudio para no salir del patrón químico tenido en cuenta,

por lo cual es conveniente una amplia variabilidad estructural. El otro tipo de aplicación

(el retrospectivo) permite analizar las moléculas ya sintetizadas y evaluadas para

entender la correlación no siempre evidente entre estructuras y actividades.

Todeschini y Consonni definen a un descriptor molecular como el resultado final de un

procedimiento lógico y matemático, el cual transforma la información química

codificada dentro de una representación simbólica de una molécula en un número útil o

como el resultado de algún experimento estandarizado99

. Los descriptores moleculares

se pueden subclasificar en:

-Descriptores 0D: obtenidos partir de contar átomos.

-Descriptores 1D: obtenidos a partir de contar fragmentos de la molécula.

-Descriptores 2D: obtenidos a partir de incorporar información topológica

-Descriptores 3D: obtenidos a partir de tener en cuenta la estructura tridimensional de la

molécula.

El número de descriptores a considerar está en función de las herramientas

computacionales y del número de moléculas incluidas en el estudio. Un error frecuente


88

consiste en agregar un espacio numérico sobredimensionado para describir cada

molécula, es decir cuando el número de descriptores es elevado respecto al número de

las moléculas lo cual conduce a un overfitting.

El modelo debe ser validado de forma interna y externa. La validación interna tiene

como fin corroborar la correlación entre la actividad biológica y los descriptores

seleccionados. Para ello se tienen en cuenta distintos estadísticos: R2 (coeficiente de

determinación), SD (desvío estándar), F (estadístico de Fisher) y el test de student para

cada variable del modelo. Por otro lado, la validación externa permite estimar la

incertidumbre asociada a las predicciones del modelo. Para ello se dividen los datos en

dos grupos: el denominado training set y el test set. Los modelos se generan con los

datos del training set y esos mismos modelos se ponen a prueba aplicándolos sobre el

test set para corroborar si predicen la actividad biológica conocida.

Con el objetivo de llevar a cabo un estudio de QSAR que explicite la relación entre las

N4-TSCs y la actividad anti-T. brucei, se modelaron en primer lugar cada uno de los

compuestos que presentaron un valor definido de CI50. Para ello, se utilizó el programa

HyperChem teniendo en cuenta la configuración E de las N4-TSCs previamente

identificada mediante el análisis de los espectros de RMN.

En el primer estudio de QSAR se generó un pool de confórmeros para cada una de las

N4-TSCs con configuración E mediante el programa Ballon, a partir del cual se

calcularon diversos descriptores 0D, 1D, 2D y 3D con el programa PaDEL Descriptor.

Luego, teniendo en cuenta los valores de actividad anti-T. brucei expresados como

pCI50 (log 1/CI50) y los descriptores calculados anteriormente se generaron diferentes

modelos mediante algoritmo genético utilizando el programa McQSAR. Si bien en este

estudio no fue posible encontrar un modelo matemático que describiese la actividad

biológica, se observó la inclusión de descriptores 3D en la mayoría de las ecuaciones

generadas.

Como se mencionó anteriormente, los descriptores tridimensionales dependen de las

coordenadas x, y, z de los átomos de la molécula. Por este motivo, se decidió realizar un

estudio de QSAR que mantuviera fija, no sólo la configuración E, sino también las

conformaciones más estables de los compuestos. Considerando el ángulo diedro (ϕ)

formado por los átomos N-N-C-N (Figura 37 A) se describen en literatura dos


89

conformaciones relevantes por su estabilidad, la syn y la anti (Figura 37 B)100–103

. La

anti corresponde a la conformación en la cual el N1 y el N

4 se encuentran en forma

opuesta, mientras que la syn corresponde a la conformación donde dichos átomos se

encuentran del mismo lado del plano considerado. Resultó entonces necesario en el

estudio de 3D-QSAR tener en cuenta los isómeros E syn y E anti, que serán

denominados como “Syn” y “Anti”. Se generaron dos estudios de QSAR separados

para cada isómero, considerando sólo un conjunto de compuestos elegidos en función

de asegurar la diversidad estructural y el rango de actividades biológicas para la

construcción del modelo (training set de 17 compuestos, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14,

15, 16, 19, 27, 28, 29 y 30) y reservando el resto (test set) para la futura validación

externa.

Figura 37. A) Ángulo diedro considerado para el estudio de 3D-QSAR. B)

Conformaciones de mínima energía del compuesto 1 correspondientes al isómero E anti

(izquierda) y E syn (derecha).

Por otro lado, se comparó gráficamente mediante el mapa de potencial electrostático la

distribución de la densidad electrónica para los compuestos más activos frente a los

menos activos y además entre el confórmero “Syn” y el “Anti”. En la Figura 38 se

representan los dos confórmeros estudiados del compuesto 8 (el más activo de la serie)

y los dos confórmeros estudiados del compuesto 5 (el menos activo con valor conocido

de CI50). A partir de dichas imágenes se pudo visualizar que los distintos sustituyentes

A


90

en el indano y en el arilo unido al N4 tienen un efecto diferencial sobre la distribución

electrónica en la función tiosemicarbazona. Se observó en general que la densidad

electrónica de dicha función es menor para los compuestos más activos y para la

conformación “Syn” (Figura 38).

Figura 38. Superficies de potencial electrostático para los confórmeros “Syn” y “Anti”

del compuesto 8 y 5. El color rojo de la escala cromática representa la mayor densidad

electrónica mientras que el color azul indica que la densidad electrónica es la de menor

valor.

Teniendo en cuenta los resultados diferenciales observados en los mapas de potencial

electrostático, se calcularon una serie de descriptores electrónicos para los estudios de

QSAR. Mediante el programa Gaussian 09, se obtuvieron: las energías de HOMO y

LUMO, dureza química, momento dipolar, electrofilicidad, refractividad, y distintos

esquemas de cargas (RESP y Mulliken) sobre distintos átomos (Tabla 10).

N4-TSCs 8 “Syn”

N4-TSCs 8 “Anti”

N4-TSCs 5 “Syn”

N4-TSCs 5 “Anti”


91

N4-TSC CI50 EHOMO ELUMO qN1 qN2 qC(=S) qS(=C) qN4

1 12,07 -8,5376 -0,7745 -0,3605 -0,5726 -0,2176 -0,3402 -0,8478

2 6,96 -9,0324 -2,2537 -0,3789 -0,5697 0,1996 -0,3068 -0,8518

3 11,22 -8,6218 -0,8837 -0,3644 -0,5737 0,4515 -0,3367 -0,8536

4 14,25 -8,6388 -0,8959 -0,3657 -0,5730 -0,1527 -0,3328 -0,8520

5 35,23 -8,4945 -0,7565 -0,3595 -0,5732 0,0251 -0,3437 -0,8478

6 19,99 -8,4267 -0,7578 -0,3591 -0,5748 0,4198 -0,3449 -0,8490

7 14,55 -8,4869 -0,7752 -0,3750 -0,5718 -0,2205 -0,3437 -0,8437

8 2,51 -8,7492 -2,3193 -0,3945 -0,5682 0,1947 -0,3136 -0,8569

9 17,10 -8,5563 -0,8848 -0,3792 -0,5728 0,4490 -0,3405 -0,8503

10 7,25 -8,5590 -0,8993 -0,3807 -0,5721 -0,1561 -0,3376 -0,8558

11 12,97 -8,4614 -0,7601 -0,3739 -0,5726 0,0215 -0,3480 -0,8540

12 18,29 -8,4336 -0,7650 -0,3736 -0,5742 0,0215 -0,3504 -0,8538

13 13,10 -8,5145 -0,7536 -0,3655 -0,5725 -0,2178 -0,3429 -0,8481

14 8,41 -8,9952 -2,2419 -0,3844 -0,5694 0,1994 -0,3096 -0,8499

15 9,48 -8,5982 -0,8618 -0,3698 -0,5735 0,4509 -0,3399 -0,8502

16 25,71 -8,6145 -0,8742 -0,3712 -0,5729 -0,1532 -0,3360 -0,8377

17 33,30 -8,4732 -0,7362 -0,3646 -0,5731 0,0250 -0,3463 -0,8323

19 12,34 -8,5236 -0,5656 -0,3699 -0,5720 -0,2182 -0,3426 -0,8432

25 8,70 -8,6258 -0,7722 -0,3579 -0,5730 -0,2177 -0,3322 -0,8487

26 11,52 -9,1191 -0,9825 -0,3711 -0,5693 0,2018 -0,3010 -0,8518

27 18,45 -8,7082 -2,3075 -0,3622 -0,5745 0,4532 -0,3288 -0,8478

28 20,86 -8,7249 -1,0724 -0,3632 -0,5736 -0,1521 -0,3252 -0,8479

29 23,91 -8,5800 -0,9658 -0,3571 -0,5736 0,0238 -0,3355 -0,8484

30 24,54 -8,5058 -0,9731 -0,3569 -0,5752 0,4207 -0,3370 0,8488

Tabla 10. Propiedades electrónicas calculadas para el isómero “Syn”. Los valores de

CI50 están expresados en µM y los de energía de HOMO (EHOMO) y energía de LUMO

(ELUMO) en eV. qN1: carga Mulliken en el nitrógeno 1. qN2: carga Mulliken en el

nitrógeno 2. qC(=S): carga Mulliken en el carbono unido al azufre. qS(=C): carga

Mulliken en el azufre de la función tiosemicarbazona. qN4: carga Mulliken en el

nitrógeno 4.


92

Como resultado de los estudios con cada isómero sólo se obtuvo un modelo de QSAR

estadísticamente válido para los confórmeros “Syn”. En el mismo, se determinó que la

carga en el nitrógeno 2 (qN2) y el descriptor MaxHssNH correlacionan con la actividad,

resultando la siguiente ecuación:

Ecuación 1: pCI50 = 83,25 . qN2 + 11,94 . MaxHssNH + 47,13

n = 17; R2 = 0,809; SD = 0,167; F = 25,37

Donde el descriptor MaxHssNH es de tipo bidimensional y describe el estado

electrotopológico de un tipo de átomo, en este caso de los hidrógenos unidos a

nitrógeno104

. Para evaluar la ortogonalidad de este descriptor electrotopológico respecto

al de la carga en el N2 se evaluó el grado de correlación entre ambos, donde se consideró

para ello que el valor de R2 debe ser como mínimo de 0,5. Los resultados estadísticos

obtenidos indicaron la independencia de las variables (n = 24; R2

= 0,28; SD = 0,01; F =

8,80).

Teniendo en cuenta la ecuación 1 se analizó en detalle los valores de cargas parciales en

los distintos átomos de cada molécula. En particular, viendo la importancia de los

átomos de hidrógeno unidos a nitrógeno, se decidió calcular las diferencias de cargas

Mulliken entre los hidrógenos y el nitrógeno al que están unidos (ΔqH2/qN2 y ΔqH4/qN4)

(Tabla 11).

N4-TSC qN2 qH2 ΔqH2/qN2 qN4 qH4 ΔqH4/qN4

1 -0,5726 0,4267 0,9993 -0,8478 0,4294 1,2772

2 -0,5697 0,4266 0,9981 -0,8518 0,4362 1,2881

3 -0,5737 0,4266 0,9990 -0,8536 0,4296 1,2832

4 -0,5730 0,4264 1,0010 -0,8520 0,4308 1,2829

5 -0,5732 0,4264 0,9996 -0,8478 0,4284 1,2763

6 -0,5748 0,4315 1,0012 -0,8490 0,4288 1,2778

7 -0,5718 0,4270 1,0009 -0,8437 0,4293 1,2730

8 -0,5682 0,4309 1,0004 -0,8569 0,4393 1,2962

9 -0,5728 0,4269 1,0004 -0,8503 0,4294 1,2797

10 -0,5721 0,4261 0,9985 -0,8558 0,4308 1,2865


93

11 -0,5726 0,4322 1,0004 -0,8540 0,4289 1,2829

12 -0,5742 0,4274 1,0002 -0,8538 0,4280 1,2818

13 -0,5725 0,4273 1,0007 -0,8481 0,4295 1,2776

14 -0,5694 0,4284 1,0023 -0,8499 0,4369 1,2868

15 -0,5735 0,4263 0,9981 -0,8502 0,4310 1,2812

16 -0,5729 0,4273 1,0020 -0,8377 0,4305 1,2682

17 -0,5731 0,4289 1,0020 -0,8323 0,4281 1,2604

19 -0,5720 0,4323 1,0023 -0,8432 0,4290 1,2722

25 -0,5730 0,4280 1,0009 -0,8487 0,4338 1,2825

26 -0,5693 0,4258 0,9989 -0,8518 0,4290 1,2808

27 -0,5745 0,4286 1,0011 -0,8478 0,4315 1,2793

28 -0,5736 0,4282 1,0001 -0,8479 0,4317 1,2796

29 -0,5736 0,4276 1,0011 -0,8484 0,4284 1,2768

30 -0,5752 0,4274 0,9999 0,8488 0,4288 1,2776

Tabla 11. Cargas parciales Mulliken para el confórmero “Syn”. qN2: carga en el

nitrógeno 2. qH2: carga en el hidrógeno unido directamente al nitrógeno 2. ΔqH2/qN2:

diferencia entre la carga en el hidrógeno y el nitrógeno 2. qN4: carga en el nitrógeno 4.

qH4: carga en el hidrógeno unido directamente al nitrógeno 4. ΔqH4/qN4: diferencia entre

la carga en el hidrógeno y el nitrógeno 4.

A partir de estos nuevos datos de cargas parciales y sus diferencias se propuso generar

nuevos modelos de QSAR superadores, donde el significado fisicoquímico de sus

descriptores fuera más simple de interpretar. Para ello, se mantuvieron los mismos

compuestos del training set anterior y se incluyeron los descriptores que se muestran en

la Tabla 11. Se obtuvieron varias ecuaciones de correlación estructura-actividad para el

confórmero de tipo “Syn”, mientras que para el confórmero “Anti” no se encontró

ninguna ecuación de correlación válida estadísticamente. A continuación se muestra el

modelo de QSAR con el mayor nivel de significación generado en esta etapa (Ecuación

2) y el gráfico de correlación entre los valores de actividad calculados y los

determinados de forma experimental (Figura 39).

Ecuación 2: pCI50 = 71,40 . qN2 + 20,54. ΔqH4/qN4 + 19,46

n = 17; R2 = 0,800; SD = 0,132; F = 28,04


94

Figura 39. Correlación entre los valores de actividad calculados vs. los experimentales.

Para esta última ecuación se evaluó la ortogonalidad de las variables y se comprobó la

independencia de las mismas a través de sus estadísticos (n = 24; R2

= 0,22; SD = 0,01;

F=6,15). Además, se calcularon los estadísticos para los coeficientes de cada descriptor

donde para qN2 se obtuvo un valor de t de Student de 3,16 y un p-valor de 0,007; y en

el caso de ΔqH4/qN4 un valor de t de Student de 3,22 y un p-valor de 0,006. Se distinguió

así para ambos descriptores valores estadísticamente significativos (p-valor < 0,05).

Las ecuaciones 1 y 2 permiten explicar la relación estructura-actividad, siendo sus

valores estadísticos calculados similares. En ambos casos se encuentra incluido el

descriptor qN2, en la primera ecuación el coeficiente que lo acompaña tiene un valor de

83,25 mientras que en la segunda ecuación es de 71,40, su valor positivo indica que para

lograr una buena actividad es necesario que qN2 adquiera los mayores valores posibles.

Por otro lado en la ecuación 1 el otro descriptor presente fue MaxHssNH el cual como

se mencionó anteriormente brinda información sobre el estado electrónico y topológico

de los hidrógenos unidos a N, considerando para ello las distancias con los átomos

vecinos y el estado intrínseco del átomo. En este caso mayores valores de MaxHssNH

se correlacionan con una mejor actividad biológica. Respecto a la ecuación 2, la

segunda variable es ΔqH4/qN4, es decir el valor dado por la diferencia de carga entre el

hidrógeno unido al nitrógeno 4 y este átomo. Considerando esta variable, su pendiente

positiva de 20,54 indica que valores más positivos del descriptor (Tabla 11) se

corresponden con las mejores actividades, lo cual es coincidente con lo observado para

los compuestos 2, 8, 14 y 26 (con R4 = NO2). Analizando en conjunto los valores de los


95

estadísticos obtenidos y el grado de abstracción e interpretación desde el punto de vista

fisicoquímico la ecuación 2 resultó superadora.

La validación externa de la ecuación 2 se realizó con los compuestos que no habían sido

empleados en la generación del modelo. Se tomaron las N4-TSCs 3, 4, 9, 12, 17, 25 y 26

como test set para evaluar el poder predictivo de la ecuación. Se calculó el valor de

r2

PRESS el cual es un estadístico que permite evaluar si el modelo es robusto. Cuando su

valor es mayor a 0,5 se puede indicar una buena predictibilidad externa105

. Dicho

estadístico se define matemáticamente como:

Donde SD = ∑ (pCI50 experimental del test set - pCI50 promedio del training set)2 y

PRESS = ∑ (pCI50 experimental del test set - pCI50 predicha del test set)2

Los resultados encontrados mostraron que para los compuestos evaluados en esta

instancia, el modelo resultó adecuado para la predicción de los valores de pCI50 ya que

el valor de r2

PRESS fue de 0,63. En la Tabla 12 se presentan los resultados de actividad

predichos y experimentales, así como los residuos respecto al valor experimental para el

test set.

N4-TSC pCI50exp pCI50calc Residuo

3 4,950 4,854 -0,096

4 4,846 4,896 0,049

9 4,767 4,846 0,079

12 4,738 4,789 0,052

17 4,478 4,428 -0,049

25 5,060 4,889 -0,171

26 4,939 5,119 0,180

Tabla 12. Valores de actividad biológica experimentales y calculados. pCI50exp: valor

de pCI50 experimental. pCI50calc: valor de pCI50 calculado a partir de la ecuación 2.


96

En resumen, según los resultados de este estudio de QSAR la actividad anti-T. brucei de

las N4-TSCs dependería de la carga sobre el N

2 y de la diferencia de cargas entre el

nitrógeno 4 y el hidrógeno unido directamente a este átomo. Además, se resalta la

importancia de las conformaciones adoptadas por la molécula, siendo las “Syn” las que

estarían implicadas en la actividad biológica evaluada.

4.4. Evaluación de la N4-TSC más activa frente a proteasas

Las proteasas de T. brucei juegan un rol fundamental en el ciclo de vida del parásito y

en la patogénesis de la enfermedad del sueño y nagana. Las proteasas descriptas en T.

brucei incluyen aquellas pertenecientes a la familia de las cisteína, serina, treonina y

metalo peptidasas. Estudios in vitro e in vivo han demostrado que estas enzimas son

blancos validados para el desarrollo de drogas frente a dicha tripanosomiasis95,106,107

.

Teniendo en cuenta que numerosas TSCs han sido reportadas como inhibidoras de

cisteína proteasas de T. brucei 108,109

, se decidió investigar si el compuesto más activo de

la serie de N4-TSCs ensayada (derivado 8) manifiesta la propiedad de inhibir alguna

proteasa del parásito. Con este objetivo, se realizó una zimografía a partir de un lisado

de parásitos en donde el sustrato fue la gelatina previamente agregada a un gel de

poliacrilamida. Cabe mencionar la conveniencia de aplicar este método separativo ya

que permite investigar varias proteasas al mismo tiempo a partir de un lisado celular sin

necesidad de purificar las enzimas110,111

.

En el ensayo se corrió un estándar comercial con sustancias de pesos moleculares

conocidos, un lisado de parásitos sin tratar (control sin tratar), un lisado de parásitos

incubado con 5% de DMSO (control de vehículo), un lisado de parásitos con E-64

(control positivo de inhibición) y un lisado de parásitos con el compuesto 8.

Los resultados mostraron la presencia de varias proteasas en el lisado de parásito

sembrado. La incubación con el compuesto 8 no logró la inhibición de ninguna de las

proteasas de T. brucei reveladas en el gel, ya que el patrón de bandas observado fue el

mismo que el del control sin tratar y el control de vehículo (Figura 40). Esto indica que

el compuesto más activo no estaría ejerciendo su efecto a través de la inhibición de estas

enzimas, por lo cual sería otro su mecanismo de acción.


97

Figura 40. Zimografía de un lisado de T. brucei. a: estándar de pesos moleculares; b:

lisado de parásitos (control sin tratar); c: lisado de parásitos incubado con E-64 (control

positivo de inhibición); d: lisado de parásitos incubado con el compuesto 8; e: lisado

incubado con DMSO (control de vehículo). Las zonas más claras se deben al consumo

de la gelatina por parte de las proteasas.

4.5. Captación intracelular de las N4-TSCs

Se observó que las N4-TSCs tienen la capacidad de emitir fluorescencia luego de ser

excitadas con una luz de longitud de onda de 405 nm. En la Figura 41 se representa la

fluorescencia emitida a distintas longitudes de onda para seis de los compuestos

evaluados. Se evidenció que el compuesto 14 es el que emite mayor intensidad de

fluorescencia. En el caso del compuesto más activo frente a T. brucei (compuesto 8), se

observó un pico a 415 nm y otro de similar intensidad a 468 nm. Estas propiedades de

emisión de fluorescencia de las N4-TSCs se encuentran relacionadas con su estructura

química debido a la presencia de dobles enlaces conjugados que producen una elevada

deslocalización electrónica.

Aprovechando la cualidad de las N4-TSCs estudiadas de emitir fluorescencia, se

procedió a evaluar si el compuesto 8 (el más activo) y el compuesto 14 (por ser el que

fluoresce con mayor intensidad) eran internalizados por los parásitos luego de su

tratamiento. Para ello, los parásitos fueron tratados durante 4 y 24 h con el compuesto

correspondiente y luego se visualizaron mediante microscopio confocal (laser de

a b c d e

220 kDa

91 kDa

50 kDa

35 kDa


98

excitación de 405 nm). En las imágenes obtenidas se pudo observar la localización de la

fluorescencia en el interior del parásito, lo cual demuestra que ambos compuestos

fueron internalizados por la célula tanto a las 4 h como 24 h de tratamiento (Figura 42).

Además, cabe destacar que en las imágenes se visualizó la fluorescencia de los

compuestos en todo el espacio intracelular del parásito por lo cual las N4-TSCs

estudiadas no presentaron una localización subcelular específica para los tiempos

ensayados.

Por otro lado, se estudió el perfil de fluorescencia de las N4-TSCs luego de ser excitadas

a 488 nm, por ser esta una longitud de onda muy utilizada en los laser de microscopía y

citometría de flujo. En dicho estudio se determinó que no hay emisión de fluorescencia

luego de la excitación a esta longitud de onda.

Figura 41. Espectro de emisión para distintas N

4-TSCs luego de ser excitadas a 405 nm.


99

Figura 42. Microscopía confocal. Parásitos sin tratar (A, a, B, b); tratados con el

compuesto 8 durante 4 h (C, c) y 24 h (D, d); y con el compuesto 14 durante 4 h (E, e) y

24 h (F, f).

4.6. Mecanismo de muerte celular inducido por el compuesto 8

La apoptosis es un tipo de muerte celular regulada (MCR) dependiente de energía en la

cual se reconocen determinados cambios morfológicos y bioquímicos. Las alteraciones

celulares que ocurren durante este proceso en los metazoos incluyen: la activación de

caspasas, disminución del volumen celular, exposición de fosfatidilserina (PS) en la

superficie externa celular, alteraciones mitocondriales, condensación de la cromatina,

fragmentación nuclear, compactación del citoplasma, membrana con aspecto de burbuja

y formación de cuerpos apoptóticos112

.

Si bien varias de las características clásicas de apoptosis descriptas para organismos

multicelulares han sido observadas en organismos unicelulares como los protozoarios,

aún no han sido detectadas las caspasas, consideradas fundamentales para la apoptosis

Co

ntr

ol

l

N4-T

SC 8

8

N4-T

SC 1

4

4 h 24 h

A

C

E

a

c

e

b

d

f

B

D

F


100

en metazoos113–115

. Por este motivo, se considera que en los protozoos el evento que

ocurre puede considerarse similar a la apoptosis116

.

La necrosis es otro tipo de muerte celular que se caracteriza por edema celular, aumento

de la permeabilidad de la membrana plasmática y finalmente la ruptura de la misma. De

esta forma se libera el contenido celular al medio circundante pudiendo desencadenar un

proceso inflamatorio en el huésped. Por este motivo, en la búsqueda de un tratamiento

quimioterapéutico, resulta de interés conocer el tipo de muerte en el caso que esta haya

sido desencadenada por la acción del fármaco, ya que gatillar un proceso necrótico no

resulta conveniente. Diferentes marcadores, que pueden ser analizados por citometría de

flujo, permiten poner en evidencia el tipo de muerte celular que ocurre luego de la

exposición a un agente químico o físico.

La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrica que permite

ser utilizada para diversas aplicaciones en la investigación básica y aplicada, ensayos

clínicos, diagnóstico y seguimiento de pacientes entre otras. El principio en el que se

basa esta tecnología radica en hacer pasar las células suspendidas de forma alineada y

de a una por delante de una luz láser (Figura 43). El impacto del haz de luz en cada

célula produce señales que corresponden a diferentes características de la misma, las

cuales son recogidas por distintos detectores. La información obtenida puede ser

clasificada en aquellas generadas por la dispersión de la luz incidente y la emisión de

luz por los fluoróforos que son utilizados como marcadores. Cabe destacar que los datos

obtenidos corresponden a un gran número de células (habitualmente 10 mil), por lo cual

posiciona a esta metodología sobre otras donde el tamaño de muestra suele ser bastante

más pequeño.

Los citómetros de flujo están formados por un complejo sistema de fluídica el cual

permite el enfoque hidrodinámico del flujo celular que asegura el alineamiento de las

células y su paso una por una. El equipo cuenta con un sistema óptico el cual

comprende la óptica de excitación y de lectura. El primero de ellos está constituido por

el láser y las lentes que permiten enfocar y colimar la luz. La óptica de lectura está

compuesta por las lentes de recolección y filtros ópticos de la luz emitida luego de la

interacción entre el láser y las células. De esta manera, se seleccionan las longitudes de

onda que se dejan pasar hacia el sistema de detección. Finalmente, el análisis


101

electrónico de la luz dispersada y la fluorescencia emitida se cuantifica con

herramientas computacionales.

Figura 43. Esquema de disposición de elementos en un citómetro de flujo.

Como se mencionó previamente, cierta información proviene de las señales de

dispersión de la luz. Dicha dispersión está en función de las características morfológicas

de las células como son el tamaño celular y su granulosidad. En el equipo se miden dos

fracciones de dispersión mediante un detector en línea con el rayo de luz denominado

FSC (por Forward Scatter) y una segunda fracción mediante el detector SSC (por Side

Scatter) ubicado en ángulo recto con respecto al láser.

El segundo tipo de información que se puede obtener es el originado por las señales de

fluorescencia. Para ello se emplean diversos fluoróforos o marcadores fluorescentes.

Cada uno posee un pico de excitación y una longitud de onda de emisión característica

que son detectados por diversos detectores conocidos como FL1-3.

Teniendo en cuenta la importancia de determinar el tipo de muerte celular y

aprovechando la gran utilidad de la citometría de flujo para este análisis, se utilizó dicha

tecnología en los parásitos tratados con el derivado 8. De esta manera, se evaluaron

varias de las características de las células y los procesos moleculares vinculados a la

apoptosis luego de la exposición de los parásitos a la droga. Se determinó: variación del

tamaño celular, presencia de especies reactivas del oxígeno (ROS), cambios en el

potencial de membrana mitocondrial, exposición de PS en la cara extracelular de la

membrana plasmática y fragmentación del ADN.


102

4.6.1 Determinación del tamaño celular

Los gráficos de FSC resultan útiles para detectar cambios en el tamaño celular y

pueden, por lo tanto, ser utilizados para evaluar la disminución de este parámetro

relacionado con la muerte celular117,118

.

Para determinar si el tratamiento con el compuesto 8 afecta el volumen celular de T.

brucei se analizó mediante citometría de flujo los valores de FSC y se compararon con

los valores del control sin tratar. Los parásitos se incubaron durante 24 h con una

concentración final de 5 y 10 µM de compuesto. Los resultados mostraron que a la

máxima concentración evaluada se evidenciaron células con una reducción en el tamaño

celular con respecto al control (Figuras 44 y 45), las cuales fueron definidas en el

gráfico de FSC vs SSC como una población de “tamaño pequeño”. Por otro lado,

cuando los parásitos se trataron con una concentración final de 5 µM se observó

también la disminución del tamaño pero en menor proporción. En conclusión se pudo

inferir que el tratamiento con el compuesto 8 induce una disminución del tamaño

celular, la cual es concentración dependiente. Estos resultados están en concordancia

con una de las características de los procesos definidos como similares a la apoptosis

que pueden ocurrir en los tripanosomátidos.

Figura 44. Tamaño celular en T. brucei luego de 24 h de tratamiento con el derivado 8.

A) control de parásitos. B) Incubados con el compuesto 8 en una concentración final de

5 µM y C) 10 µM. En forma ovalada se marca a la derecha la población de parásitos

que corresponden a un tamaño normal y a la izquierda la población de menor tamaño. El

gráfico es un típico dot plot de al menos tres experimentos independientes.

A B C

SSC

FSC


103

Figura 45. Variaciones en el tamaño celular en T. brucei luego de 24 h de tratamiento

con el derivado 8. Los histogramas de relleno gris representan el control sin tratar y los

histogramas de línea gris sin relleno corresponden a los parásitos tratados. A) Parásitos

totales incubados con 5 µM y B) 10 µM de compuesto. El gráfico es un típico

histograma de al menos tres experimentos independientes. C) Gráfico de barras de las

poblaciones de tamaño normal y pequeño. Los resultados representan la media ± SD (n

= 3). p-valor < 0,05 (*) y < 0,01 (**) fue considerado significativo con respecto al

control.

4.6.2. Determinación de especies reactivas del oxígeno

El equilibrio redox intracelular resulta esencial para la homeostasis de toda célula. En

los tripanosomátidos dicho equilibrio es regulado por mecanismos distintos al de las

células de mamíferos ya que emplean el tripanotión (bis-glutationilespermidina) como

principal cofactor redox, y carecen de enzimas tales como: glutatión reductasa,

tiorredoxina reductasa, catalasa, y glutatión peroxidasas selenio dependientes119–121

.

Además, se ha evidenciado la relación directa entre el aumento intracelular de las

especies reactivas del oxígeno (ROS) y la muerte celular regulada en T. brucei, por lo

cual el mantenimiento del equilibrio redox tiene un rol esencial en las decisiones de

vida/muerte114,122,123

. Por estos motivos, alterar el equilibrio redox de los parásitos

puede representar una estrategia útil para el desarrollo de antitripanosomátidos124–126

.

Por otro lado, se ha reportado que algunas TSCs tienen la capacidad de mediar sus

efectos biológicos a través de la inducción de ROS127,128

. Para evaluar si el tratamiento

de los parásitos con el compuesto 8 conlleva a un aumento en los niveles de ROS, se

recurrió a la tecnología de citometría de flujo utilizando la sonda diacetato de 2’,7’-

diclorodihidrofluoresceína (H2-DCF-DA). Este reactivo no fluorescente atraviesa la

Even

tos

FSC

A B C

Ev

en

tos

(%

)

C o n tr o l 5 M 1 0 M

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

C é lu la s n o rm a le s

C é lu la s p e q u e ñ a s

***

**

*


104

membrana plasmática e intracelularmente es hidrolizado a diclorodihidrofluoresceína

(H2-DCF), la cual ante la presencia de ROS es rápidamente oxidada a

diclorofluoresceina (DCF), altamente fluorescente (Figura 46).

Figura 46. Activación de la sonda diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína

(H2DCF-DA) para detectar ROS.

La N4-TSC 8 fue evaluada a la concentración final de 10 µM durante 2 h y 4 h y los

controles considerados fueron: los parásitos tratados con DMSO (control) y los

parásitos tratados con H2O2 (control positivo). Los resultados mostraron que la

intensidad de fluorescencia de la sonda aumentó significativamente luego de las 4 h, la

señal de DCF se incrementó ocho veces respecto al control. Por otro lado, no se

encontraron diferencias significativas entre el tratamiento a las 2 h con respecto al

control de células sin tratar (Figuras 47 y 48). De esta manera, se evidenció la inducción

de especies oxidantes luego de 4 h en presencia de la N4-TSC, lo cual pone de

manifiesto un probable mecanismo por el cual ejerce su acción el compuesto

relacionado con el tipo de muerte del parásito.

Figura 47. Estrés oxidativo en T. brucei. Parásitos incubados con A) DMSO (control);

luego del tratamiento con el compuesto 8 durante B) 2h y C) 4h y D) con peróxido de

hidrógeno. Los gráficos son un típico histograma de al menos tres experimentos

independientes.

A B D C

Even

tos

DCF


105

Flu

ore

sc

en

cia

DC

F (

u.a

)C o n tr o l 2 h 4 h H 2 O 2

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

*

**

Figura 48. Variaciones en la intensidad de fluorescencia media. Los resultados

representan la media ± SD (n = 3). p-valor < 0,05 (*) y < 0,01 (**) fue considerado

significativo con respecto al control.

4.6.3. Determinación del potencial de membrana mitocondrial

Las alteraciones en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) han sido estudiadas

como uno de los marcadores de muerte celular en los protozoos. Dicho fenómeno puede

estudiarse por citometría de flujo mediante la utilización de la sonda Mito Tracker Red

CMXRos. Esta sonda es un colorante catiónico lipofílico fluorescente que puede

acumularse selectivamente en las mitocondrias dependiendo del potencial de las

mismas. El potencial negativo de la mitocondria permite que el colorante ingrese en ella

y una vez en su interior forma uniones covalentes con grupos tioles de la

mitocondria129,130

.

Con el fin de estudiar si el compuesto 8 provoca cambios a nivel del ΔΨm se realizó un

ensayo por citometría de flujo con la sonda Mito Tracker Red. La N4-TSC 8 fue

evaluada a la concentración final de 10 µM durante 2 h. Los controles considerados

fueron: parásitos tratados con DMSO (control) y parásitos tratados con el desacoplante

mitocondrial carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona (cccp) (control positivo). Los

resultados mostraron que la fluorescencia de la sonda varió significativamente luego de

las 2 h (Figuras 49 y 50), lo cual indica la capacidad por parte del compuesto 8 de

alterar el potencial de membrana mitoncondrial en las condiciones estudiadas. De esta

manera se puso en evidencia uno de los fenómenos que caracterizan los procesos

similares a la apoptosis que puede ocurrir en T. brucei.


106

Figura 49. Determinación de potencial de membrana mitocondrial. Parásitos incubados

con A) DMSO (control); B) luego del tratamiento con el compuesto 8 durante 2h y C)

con cccp. Los gráficos son un típico histograma de al menos tres experimentos

independientes.

Flu

ore

sc

en

cia

(u

.a)

C o n tr o l 8 c c c p

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

**

**

Figura 50. Determinación de potencial de membrana mitocondrial. Los resultados

representan la media ± SD (n = 3). p-valor < 0,01 (**) fue considerado significativo con

respecto al control.

4.6.4. Ensayo de doble marcación con anexina V e yoduro de propidio

La anexina V (AV) tiene la capacidad de unirse a la PS, la cual desde las etapas

tempranas de apoptosis transloca desde el citosol hacia el lado externo de la membrana

plasmática. En estas etapas la membrana conserva su capacidad de excluir colorantes

vitales como el yoduro de propidio (IP). Cuando la membrana plasmática pierde

integridad dicha sonda ingresa y se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos de

doble cadena. Por lo tanto, la detección de fenotipos apoptóticos se realiza mediante la

doble tinción con AV (marcada con FITC) e IP. De esta forma, la posibilidad de una

Even

tos

Mito-Tracker Red CMXRos


107

doble tinción permite distinguir cuatro tipos de poblaciones celulares: células viables

(AV- IP

-), células apoptóticas tempranas (AV

+ IP

-), células apoptóticas

tardías/necróticas (AV+ IP

+) y células necróticas (AV

- IP

+).

Un aspecto importante a tener en cuenta en este tipo de ensayo es la degradación del

ADN, que conlleva a falsos negativos de IP. Por este motivo se debe realizar el ensayo a

diferentes tiempos luego de la inducción de la muerte celular, para observar los cambios

de la población de parásitos entre los cuatro tipos posibles.

Con el fin de determinar si el compuesto 8 tiene la capacidad de inducir la exposición de

PS, se evaluó mediante citometría de flujo la fluorescencia de las sondas AV e IP luego

de incubar los parásitos con el compuesto a una concentración final de 10 µM durante

12h, 24h y 48h. Se utilizaron como controles: parásitos sin tratar (control) y parásitos

sometidos a un shock térmico de 60°C durante 3 min (ST) (control positivo).

Como se observa en las Figuras 51 y 52, a las 12 h de incubación con el compuesto no

hubo cambios significativos en la distribución de la población de parásitos. Sin

embargo, cuando el tratamiento duró 24 h un porcentaje significativo ocupó el

cuadrante AV+ IP

- indicando la presencia de células que conservan la integridad de su

membrana pero exponen PS, siendo este fenómeno un marcador de apoptosis temprana.

Por otro lado, a las 48h de tratamiento la mayor parte de la población se ubicó en los

cuadrantes de IP+ lo cual indica apoptosis tardía y necrosis.

De esta manera, los resultados indicaron que el compuesto estudiado desencadena en T.

brucei uno de los procesos (exposición de PS) característicos de un fenotipo apoptótico.


108

Figura 51. Determinación de la exposición de PS. Parásitos incubados con A) DMSO

(control); B) sometidos a shock térmico (ST) (control positivo); tratados con el

compuesto 8 durante C) 12 h, D) 24h y E) 48h.

Ev

en

tos

(%

)

C o n tr o l 1 2 h 2 4 h 4 8 h S T

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

A V - IP -

A V + IP -

A V + IP +

A V - IP +

**

**

**

Figura 52. Poblaciones celulares luego del tratamiento. Los resultados representan la

media ± SD (n = 3). p-valor < 0,01 (**) fue considerado significativo con respecto al

control.

IP

Anexina V


109

4.6.5. Ensayo TUNEL

La técnica de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)

permite la detección de ADN fragmentado. Se basa en la adición in situ de dUTPs en las

regiones cortadas del ADN catalizado por la enzima deoxinucleotidil transferasa.

Dichos dUTPs se encuentran marcados fluorescentemente por lo cual pueden

identificarse de forma simple y selectiva mediante citometría de flujo.

Se evaluó la capacidad del compuesto 8 de inducir cortes en el ADN mediante el kit “in

situ cell death” el cual se basa en la técnica de TUNEL. Para el ensayo se testeó el

compuesto en una concentración final de 5 y 10 µM durante 24h. Como controles se

tuvieron en cuenta: parásitos incubados con DMSO (control) y parásitos tratados con

ADNasa I (control positivo).

Los resultados mostraron que luego de las 24 h con el tratamiento de la N4-TSC la

intensidad de fluorescencia detectada fue mayor respecto al control (Figuras 53 y 54).

En el caso del tratamiento con 5 µM se obtuvo una media de células apoptóticas del

33%. Asimismo, cuando la concentración de compuesto fue el doble, 10 µM final, el

porcentaje de células apoptóticas tuvo una media del 81%. De esta forma, se evidenció

la capacidad del compuesto de inducir cortes en el ADN para los tiempos y

concentraciones estudiadas.

Figura 53. Efecto del compuesto 8 en la fragmentación del ADN de T. brucei. Los

cortes en el ADN fueron analizados mediante la técnica de TUNEL. Los parásitos se

incubaron con A) DMSO durante 24 h (control), B) ADNasa I (control positivo), y con

la N4-TSC a la concentración final de C) 5 µM y D) 10 µM.

dUTP-fluoresceína

Even

tos


110

Cé

lula

s p

os

itiv

as

%C o n tr o l 5 M 1 0 M AD N a s a I

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

**

**

**

Figura 54. Poblaciones celulares positivas para TUNEL luego del tratamiento

correspondiente. Los resultados representan la media ± SD (n = 3). p-valor < 0,01 (**)

fue considerado significativo con respecto al control.

En resumen, con las técnicas empleadas de citometría de flujo para el compuesto 8 se

observaron las siguientes características en los parásitos: reducción del volumen,

inducción de ROS, despolarización de ΔΨm, exposición de PS al exterior de la

membrana plasmática y fragmentación del ADN. Como conclusión de dichos resultados

se infiere que el compuesto 8 desencadena procesos característicos del fenotipo

apoptótico en T. brucei.

4.6.6. Microscopía electrónica de transmisión para ultraestructura

Para determinar el efecto del compuesto 8 sobre la morfología ultraestructural de T.

brucei se trataron los parásitos en fase exponencial con dicho derivado a la

concentración final de 7,5 µM durante 24 h y se observaron los cortes al microscopio

electrónico de transmisión. Asimismo, se observaron parásitos sin tratar como control.

Los cambios más frecuentes observados en los aislamientos tratados con el compuesto

fueron: i) alteraciones en la forma de la membrana conservando la integridad (Figura 55

d, e, h); bolsillo flagelar dilatado (Figura 55 f); apariencia de dos o más flagelos por

parásito (Figura 55 d, g) y alteraciones en el kinetoplasto (Figura 55 e). Dichas

características ultraestructurales en conjunto con los resultados de citometría de flujo

permiten afirmar la muerte celular de manera regulada. Asimismo, alteraciones en el

bolsillo flagelar, flagelos y kinetoplasto son descriptas como típicos cambios

morfológicos de la MCR.


111

Figura 55. Cambios ultraestructurales en T. brucei tratados con el compuesto 8. a, b y

c) Células control sin tratar. d, e, f, g, h) Células tratadas con la concentración final 7,5

µM del derivado 8 durante 24 h. Nótese en: d) el número de flagelos y la alteración de

la membrana plasmática; e) la alteración del kinetoplasto y la alteración de la

membrana plasmática; f) el bolsillo flagelar dilatado; g) el número de flagelos; h)

alteración de la membrana plasmática. La barra de escala representa 0,5 µm.

Abreviaciones y símbolos utilizados: N: núcleo; F: flagelo; FP: bolsillo flagelar; K:

kinetoplasto; A: acidocalcisoma; flecha blanca: glicosoma; fecha negra: alteraciones de

membrana.


112

En resumen:

El derivado 8 es el más activo de la serie y su diana biológica no serían las

proteasas del parásito.

La sustitución con nitro en R4 potencia la actividad frente al parásito. Los

derivados de la 1-indanona sin sustituyentes en el núcleo indánico y de la

5,6-dimetoxi-1-indanona fueron los de mejor efecto anti-T. brucei.

Se establece una correlación cuantitativa de la actividad biológica con la

carga del nitrógeno 2 y la diferencia de carga entre el nitrógeno 4 y su

hidrógeno.

El compuesto 8 ejerce su acción de forma selectiva sobre T. brucei

mediante un mecanismo de muerte regulado, el cual concuerda con

características del fenotipo apoptótico.

.

CAPÍTULO IV

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y métodos

115

CAPÍTULO IV. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Síntesis de las N4-TSCs

1.1. Reactivos y solventes

Todos los reactivos utilizados en las síntesis, cuya preparación no haya sido descrita,

fueron adquiridos comercialmente en Sigma-Aldrich.

Los solventes empleados fueron de calidad analítica y fueron suministrados por

Sintorgan.

1.2. Técnicas instrumentales

Las síntesis llevadas a cabo utilizando tecnología de microondas fueron realizadas en un

equipo Anton Parr Monowave 300, de potencia regulable entre 1 y 600 W, equipado

con sensor de presión y temperatura.

Los puntos de fusión se determinaron en un equipo Thomas Hoover, las unidades están

expresadas en grados centígrados (°C) y no están corregidas.

Los espectros de RMN fueron realizados en un equipo Bruker Avance II de 600 Mhz o

en un Bruker Avance II de 300 Mhz. Los solventes usados fueron CDCl3 o DMSO-d6

según se indica en cada caso. Los desplazamientos (δ) se expresan en ppm, tomando

como referencia interna la señal del tetrametilsilano (TMS) en CDCl3 o DMSO-d6. Las

constantes de acoplamiento (J) se expresan en hertz (Hz). Las multiplicidades de las

señales en los espectros de RMN están abreviadas de la siguiente forma: s, singlete; d,

doblete; dd doble doblete; t, triplete; y m, multiplete. La transformación y visualización

de los espectros se realizó con el software MestreNova.

Los espectros de IR se obtuvieron a partir de pastillas de KBr utilizando un equipo de

FT-IR Perkin Elmer Spectrum One o en un equipo FT-IR Shimadzu IRAffinity.

Los espectros de masa de alta resolución se obtuvieron en un equipo Bruker micrOTOF-

Q II con fuente de ionización a presión atmosférica por electrospray (ESI). Los

espectros fueron tomados en modo positivo y los datos se expresan en unidades de

masa/carga (m/z).


116

1.3. Procedimiento general para la síntesis de las N4-TSCs

Método A: 1) Una mezcla de la correspondiente 1-indanona (3,8 mmol) e hidrato de

hidrazina al 85% (0,9 ml; 18,0 mmol) en isopropanol (5 ml) se calentó a reflujo. El

avance de la reacción se monitoreó por CCD usando CHCl3:EtOH (1:0,1) como FM. El

solvente se evaporó y el residuo se disolvió en CHCl3 (20 ml), se secó sobre Na2SO4

anhidro, se filtró y se evaporó nuevamente para obtener el derivado bruto. Las

hidrazonas obtenidas fueron recristalizadas en metanol. Las características físicas de las

hidrazonas derivadas de la 1-indanona, 5,6-dimetoxi-1-indanona y 5-metil-1-indanona

se correspondieron con las descriptas en literatura131–133

. 2) Una solución del

correspondiente isotiocianato (3,0 mmol) en benceno (5 ml) se añadió gota a gota a una

solución de la hidrazona (2,5 mmol) en benceno (10 ml). La mezcla resultante se agitó a

temperatura ambiente hasta desaparición de la hidrazona, monitoreado por CCD usando

CHCl3:EtOH (1:0,1) como FM. El sólido obtenido se filtró y se lavó con benceno (5 ml)

y con etanol (2 ml). Las N4-TSCs obtenidas se recristalizaron de etanol.

Método B: una mezcla de la correspondiente 1-indanona (0,378 mmol), hidrato de

hidrazina al 85% (21 µl; 0,435 mmol), el correspondiente isotiocianato (0,430 mmol),

ácido acético (20 µl) e isopropanol (0.5 mL) contenidos en un tubo de vidrio con tapón,

se colocó en un microondas de síntesis a 90°C, 30 W, 2,5 bar con agitación magnética.

El avance de la reacción se monitoreó por CCD usando CHCl3:EtOH (1:0,1) como FM.

La mezcla obtenida se suspendió en agua (5 ml), se filtró y lavó con etanol (2 ml). Las

N4-TSCs obtenidas se recristalizaron de etanol.

1.4. Descripción de los compuestos nuevos

4,5-dimetoxiindan-1-ona hidrazona

Rendimiento: 68%

Pf: 149-155°C.


117

IR v/cm-1

(KBr): 3333 y 3187 (estiramiento N-H), 1633 (estiramiento C=N), 1268 y

1060 (estiramiento C-O).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 3,05 (m, 4H, 2CH2), 3,90 (s, 3H, OCH3), 3,92 (s, 3H, OCH3),

5,10 (s, 2H, NH2), 6,93 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-Ar), 7,63 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-Ar).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 25,7 (CH2), 28,8 (CH2), 56,4 (OCH3), 60,4 (OCH3), 112,5,

118,4, 132,3, 142,8, 145,4, 155,0, 169,4 (C=N).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C11H15N2O2 calculado: 207,1134; encontrado:

207,1153.

5-bromoindan-1-ona hidrazona

Rendimiento: 70%

Pf: 184-185°C

IR v/cm-1

(KBr): 3344 y 3198 (estiramiento N-H), 1639 (estiramiento C=N).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 3,05 (m, 2H, CH2), 3,10 (m, 2H, CH2), 5,22 (s, 2H, NH2),

7,46 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-Ar), 7,54 (s, 1H, H-Ar), 7,78 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-Ar).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 28,3 (CH2), 28,4 (CH2), 123,8, 125,6, 128,9, 130,4, 137,3,

151,7, 169,6 (C=N).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C9H9BrN2 calculado: 225,0069; encontrado:

225,0027.

Indan-1-ona N-(4-nitrofenil)tiosemicarbazona (2)

Pf: 171-172°C.

IR v/cm-1


1337 (vibración NO2), 1192 (estiramiento C=S).


118

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,87 (m, 2H, CH2), 3,24 (m, 2H, CH2), 7,36 (m, J = 7,5 Hz,

1H, H-Ar), 7,40 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,46 (m, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,80 (d, J =

7,5 Hz, 1H, H-Ar), 8,08 (d, J = 9,0Hz, 2H, H-Ar), 8,28 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H-Ar), 8,61

(s, 1H, NNH), 9,71 (s, 1H, NH-Ar).


127,7, 132,0, 136,5, 144,1, 144,5, 149,3, 158,2 (C=N), 175,1 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+

C16H15N4O2S calculado: 327,09102;

encontrado: 327,09136.

Indan-1-ona N-(4-fluorofenil)tiosemicarbazona (3)

Pf: 170-172°C.

IR v/cm-1

(KBr): 3279 y 3199 (estiramiento N-H), 1606 (estiramiento C=N), 1230

(estiramiento C-F), 1181 (estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,85 (m, 2H, CH2), 3,22 (m, 2H, CH2), 7,10 (m, 2H, H-Ar),

7,33 (m, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,38 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,42 (m, J = 7,5 Hz, 1H,

H-Ar), 7,62 (dd, J1 = 8,8 Hz, J2 = 4,8 Hz, 2H, H-Ar), 7,77 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar),

8,56 (s, 1H, NNH), 9,26 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 26,8 (CH2), 28,7 (CH2), 115,7 y 115,8 (d, J = 22,7 Hz),

121,9, 125,9, 126,7 y 126,7 (d, J = 8,3 Hz), 127,8, 131,6, 134,1, 136,8, 149,0, 157,4

(C=N), 160,1 y 161,7 (d, J = 245,9 Hz) (C-F), 176,6 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C16H15FN3S calculado: 300,09652;


Indan-1-ona N-(4-metoxifenil)tiosemicarbazona (6)

Pf: 172-173°C.


119

IR v/cm-1


1037 (estiramiento C-O), 1187 (estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,83 (m, 2H, CH2), 3,21 (m, 2H, CH2), 3,83 (s, 3H, OCH3),

6,94 (d, J = 8,2 Hz, 2H, H-Ar), 7,32 (m, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,38 (m, J = 7,5 Hz, 1H,

H-Ar), 7,41 (m, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 2H, H-Ar), 7,77 (d, 7,5 Hz,

1H, H-Ar), 8,47 (s, 1H, NNH), 9,20 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 26,7 (CH2), 28,7 (CH2), 55,6 (OCH3), 114,2, 121,9, 125,9,

126,6, 126,7, 127,5, 131,1, 131,4, 137,0, 148,9, 156,9, 157,0 (C=N), 158,1, 176,8

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H18N3OS calculado: 312,11651;


5,6-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-nitrofenil)tiosemicarbazona (8)

Pf: 214-216 °C.

IR v/cm-1


1344 (vibración NO2), 1261 y 1075 (estiramiento C-O), 1197 (estiramiento C=S).


3,96 (s, 3H, OCH3), 6,84 (s, 1H, H-Ar), 7,16 (s, 1H, H-Ar), 8,04 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-

Ar), 8,26 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 8,56 (s, 1H, NNH), 9,58 (s, 1H, NH).

13C-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 28,6 (CH2), 28,7 (CH2), 56,1 (OCH3), 56,3 (OCH3),

105,1, 108,3, 112,9, 124,7, 126,9, 129,5, 143,7, 146,1, 149,3, 152,9 (C=N), 160,6, 175,7

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C18H19N4O4S calculado: 387,11215;



120

5,6-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-fluorofenil)tiosemicarbazona (9)

Pf: 185-186°C.

IR v/cm-1


1079 (estiramiento C-O), 1219 (estiramiento C-F), 1198 (estiramiento C=S).


3,96 (s, 3H, OCH3), 6,85 (s, 1H, H-Ar), 7,12 (d, J1 = 8,6 Hz, 2H, H-Ar), 7,18 (s, 1H, H-

Ar), 7,61 (dd, J1 = 8,6 Hz, J2 = 4,8 Hz, 2H, H-Ar), 8,52 (s, 1H, NNH), 9,19 (s, 1H, NH).

13C-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 28,0 (CH2), 28,1 (CH2), 55,6 (OCH3), 55,8 (OCH3),

104,4, 107,8, 114,8 y 115,0 (d, J = 22,4 Hz), 128,4 y 128,4 (d, J = 8,1 Hz), 129,4, 135,7,

142,6, 148,8, 152,1 (C=N), 158,5, 158,9, 159,7 y 161,3 (d, J = 242,0 Hz) (C-F), 177,0

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C18H19FN3O2S calculado: 360,11765;


5,6-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-metoxifenil)tiosemicarbazona (12)

Pf: 198-199 °C.

IR v/cm-1

(KBr): 3312 y 3216 (estiramiento N-H), 1603 (estiramiento C=N), 1249, 1238

y 1075, 1023 (estiramiento C-O), 1196 (estiramiento C=S).


3,92 (s, 3H, OCH3), 3,93 (s, 3H, OCH3), 6,83 (s, 1H, H-Ar), 6,93 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H-

Ar), 7,15 (s, 1H, H-Ar), 7,49 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H-Ar), 8,47 (s, 1H, NNH), 9,11 (s, 1H,

NH).


121

13C-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 28,3 (CH2), 28,6 (CH2), 55,8 (OCH3), 56,1 (OCH3), 56,3

(OCH3), 104,9, 108,3, 113,8, 128,3, 130,0, 132,7, 142,9, 149,3, 152,5 (C=N), 157,5,

158,6, 177,1 (C=S).



5-Metilindan-1-ona N-feniltiosemicarbazona (13)

Pf: 184-186 °C.

IR v/cm-1


(estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,41 (s, 3H, CH3), 2,83 (m, 2H, CH2), 3,16 (m, 2H, CH2),

7,14 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 7,18 (s, 1H, H-Ar), 7,24 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,41

(t, J = 7,5 Hz, 2H, H-Ar), 7,65 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 7,70 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-

Ar), 8,49 (s, 1H, NNH), 9,36 (s, 1H, NH).

13C-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 22,2 (CH3), 27,2 (CH2), 28,7 (CH2), 121,8, 124,6, 126,4,

126,6, 128,9, 129,1, 134,5, 138,4, 142,4, 149,6, 157,4 (C=N), 176,2 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H18N3S calculado: 296,12159; encontrado:

296,12260.

5-Metilindan-1-ona N-(4-nitrofenil)tiosemicarbazona (14)

Pf: 203-204 °C.

IR v/cm-1




122


7,17 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-Ar), 7,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-Ar), 8,07 (d, 2H, J = 9,1 Hz,

H-Ar), 8,27 (d, J = 9,1 Hz, 2H, H-Ar), 8,59 (s, 1H, NNH), 9,70 (s, 1H, NH).

13C-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 22,0 (CH3), 27,2 (CH2) ,28,5 (CH2), 104,9, 121,7, 122,3,

124,7, 126,5, 128,3, 126,5, 142,1, 142,8, 144,16, 144,5, 149,7, 168,8, 175,0 (C=S).



5-Metilindan-1-ona N-(4-fluorofenil)tiosemicarbazona (15)

Pf: 173-175 °C.

IR v/cm−1




7,09 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 7,14 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 7,18 (s, 1H, H-Ar), 7,62

(dd, J1 = 8,9 Hz, J2 = 4,8 Hz, 2H, H-Ar), 7,65 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 8,51 (s, 1H,

NNH), 9,25 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 22,2 (CH3), 27,2 (CH2), 28,7 (CH2), 115,8 y 116,0 (d, J =

22,7 Hz), 121,8, 126,6, 126.9 y 126,9 (d, J = 8,25 Hz), 129,0, 134,4, 142,5, 149,6, 157,7

(C=N), 160,2 y 161,9 (d, J = 245,7 Hz) (C-F), 176,7 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H17FN3S calculado: 314,11217;


5-Metilindan-1-ona N-(4-clorofenil)tiosemicarbazona (16)

Pf: 169–170°C.


123

IR v/cm−1


(estiramiento C=S).


7,14 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,17 (s, 1H, H-Ar), 7,35 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 7,64

(d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 7,66 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 8,51 (s, 1H, NNH), 9,31 (s,

1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 22,2 (CH3), 27,2 (CH2), 28,7 (CH2), 121,9, 125,8, 126,6,

128,9, 129,2, 131,6, 134,3, 137,0, 142,6, 149,7, 157,8 (C=N), 176,1 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H17ClN3S calculado: 330,08262;


5-Metilindan-1-ona N-(4-metilfenil)tiosemicarbazona (17)

Pf: 179–180°C.

IR v/cm−1


(estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,37 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,82 (m, 2H, CH2), 3,16

(m, 2H, CH2), 7,14 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 7,18 (s, 1H, H-Ar), 7,21 (d, J = 8,3 Hz,

2H, H-Ar), 7,54 (d, J = 8,3 Hz, 2H, H-Ar), 7,65 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 8,47 (s, 1H,

NNH), 9,26 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 21,4 (CH3), 22,2 (CH3), 27,2 (CH2), 28,7 (CH2), 121,7,

124,8, 126,5, 128,9, 129,7, 134,4, 136,2, 136,3, 142,3, 149,4, 157,2 (C=N), 174,7

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C18H20N3S calculado: 310,1378; encontrado:

310,1384


124

5-Metilindan-1-ona N-(4-metoxifenil)tiosemicarbazona (18)

Pf: 178–180°C.

IR v/cm−1




3,83 (s, 3H, OCH3), 6,94 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-Ar), 7,13 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 7,18

(s, 1H, H-Ar), 7,52 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-Ar), 7,65 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-Ar), 8,49 (s,

1H, NNH), 9,19 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 21,9 (CH3), 26,9 (CH2), 28,5 (CH2), 55,6 (OCH3), 114,2,

121,6, 126,4, 126,7, 128,7, 131,1, 134,3, 142,1, 149,3, 157,1, 158,1 (C=N), 176,7

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+C18H20N3OS calculado: 326,1322; encontrado:

326,1326.

4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-feniltiosemicarbazona (19)

Pf: 197-199 °C.

IR v/cm−1

(KBr): 3259 y 3161(estiramiento N-H), 1594 (estiramiento C=N), 1256 y



3,95 (s, 3H, OCH3), 6,93 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,24 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,41

(t, J = 7,3 Hz, 2H, H-Ar), 7,50 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,72 (d, J = 7,3 Hz, 2H, H-

Ar), 8,49 (s, 1H, NNH), 9,35 (s, 1H, NH).


117,8, 124,6, 126,4, 129,1, 130,9, 138,4, 142,3, 150,5, 156,9 (C=N), 162,2, 176,8

(C=S).


125



4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-nitrofenil)tiosemicarbazona (20)

Pf: 223-225 °C.

IR v/cm−1


1324 (vibración NO2), 1271 y 1058 (estiramiento C-O), 1199 (estiramiento C=S).




1H, NH).


117,2, 122,1, 124,0, 130,9, 141,8, 145,1, 155,2, 157,2 (C=N), 177,2 (C=S).



4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-fluorofenil)tiosemicarbazona (21)

Pf: 182–183°C.

IR v/cm−1


1076 (estiramiento C-O), 1220 (estiramiento C-F), 1202 (estiramiento C=S).



(d, J = 8,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,61 (dd, J1 = 8,9 Hz, J2 = 4,8 Hz, 2H, H-Ar), 8,49 (s, 1H,

NNH), 9,22 (s, 1H, NH).


126


115,9 y 116,0 (d, J = 22,1 Hz), 117,8, 126,9 y 126,9 (d, J = 8,27 Hz), 130,8, 134,4,

142,4, 145,9, 155,3, 157,2 (C=N), 160,2 y 161,9 (d, J = 246 Hz) (C-F), 176,6 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C18H19FN3O2S calculado: 360,1177;


4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-(4clorolfenil)tiosemicarbazona (22)

Pf: 179-180 °C.

IR v/cm−1

(KBr): 3288 y 3142 (estiraminto N-H), 1583 (estiramiento C=N), 1271 y





1H, NH).


117,8, 125,8, 129,2, 130,7, 131,6, 137,0, 142,4, 145,9, 155,4, 157,3 (C=N), 176,0

(C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C18H19ClN3O2S calculado: 376,0881;


4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-metilfenil)tiosemicarbazona (23)

Pf: 179-181°C.

IR v/cm−1




127


3,92 (s, 3H, OCH3), 3,95 (s, 3H, OCH3), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,23 (d, J = 8,3

Hz, 2H, H-Ar), 7,50 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-Ar), 7,55 (d, J = 8,3 Hz, 2H, H-Ar), 8,47 (s,

1H, NNH), 9,26 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 21,2 (CH3), 25,6 (CH2), 27,2 (CH2), 56,4 (OCH3), 60,5

(OCH3), 112,9, 117,6, 123,0, 124,7, 129,5, 129,5, 130,7, 135,6, 136,1, 142,1, 155,0

(C=N), 173,3 (C=S).


encontrado: 356.1456.

4,5-Dimetoxiindan-1-ona N-(4-metoxilfenil)tiosemicarbazona (24)

Pf: 176-177°C.

IR v/cm−1

(KBr): 3301 y 3154 (estiramiento N-H), 1598 (estiramiento C=N), 1262,

1243 y 1073, 1058 (estiramiento C-O), 1180 (estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2.85 (m, 2H, CH2), 3.21 (m, 2H, CH2), 3,85 (s, 3H, OCH3),

3,92 (s, 3H, OCH3), 3,95 (s, 3H, OCH3), 6,95 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-Ar), 6,96 (d, J = 8,9

Hz, 2H, H-Ar), 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-Ar), 7,54 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 8,48 (s,

1H, NNH), 9,18 (s, 1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 25,5 (CH2), 27,1 (CH2), 55,5 (OCH3), 56,3 (OCH3), 60,3

(OCH3), 112,7, 114,0, 117,4, 126,6, 130,6, 131,0, 141,9, 145,5, 154,9, 157,9 (C=N),

177,8 (C=S).



5-Bromoindan-1-ona N-feniltiosemicarbazona (25)


128

Pf: 196-198°C.

IR v/cm−1


(estiramiento C=S).

1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,85 (m, 2H, CH2), 3,20 (m, 2H, CH2), 7,26 (t, J = 7,5 Hz,

1H, H-Ar), 7,41 (t, J = 7,9 Hz, 2H, H-Ar), 7,46 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,53 (d, 1H,

H-Ar), 7,63 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,69 (d, J = 7,9 Hz, 2H, H-Ar), 8,52 (s, 1H,

NNH), 9,31 (s, 1H, NH).


129,0, 130,8, 135,87, 137,9, 145,3, 150,4 (C=N), 175,9 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C16H15BrN3S calculado: 360,01646;


5-Bromoindan-1-ona N-(4-nitrofenil)tiosemicarbazona (26)

Pf: 191-193°C.

IR v/cm−1



1H-RMN (CDCl3) δ ppm: 2,88 (m, 2H, CH2), 3,23 (m, 2H, CH2), 7,44 (d, J = 9,1 Hz,

2H, H-Ar), 8,02 (s, 1H, H-Ar), 8,06 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H-Ar), 8,24 (d, J = 9,1 Hz, 2H,

H-Ar), 8,28 (d, J = 9,1 Hz, 1H, H-Ar), 8,61 (s, 1H, NH), 9,64 (s, 1H, NH).


149,5 (C=N), 157,3, 176,9 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C16H14BrN4O2S calculado: 405,00154;



129

5-Bromoindan-1-ona N-(4-fluorofenil)tiosemicarbazona (27)

Pf: 198-199°C.

IR v/cm−1




2H, H-Ar), 7,47 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,56 (s, 1H, H-Ar), 7,63 (dd, J1 = 8,9 Hz, J2

= 4,8 Hz, 2H, H-Ar), 7,64 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 8,56 (s, 1H, NNH), 9,23 (s, 1H,

NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 27,1 (CH2), 28,7 (CH2), 116,0 y 116,1 (d, J = 22,8 Hz),

123,2, 126,1, 126,9 y 127,0 (d, J = 8,3 Hz), 129,4, 131,2, 134,2, 136,1, 150,9 (C=N),

156,1, 159,9 y 161,6 (d, J = 264,17 Hz) (C-F), 176,9 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C16H14BrFN3S calculado: 378,00704;


5-Bromoindan-1-ona N-(4-clorofenil)tiosemicarbazona (28)

Pf: 199-201°C.

IR v/cm−1


(estiramiento C=S).


2H, H-Ar), 7,46 (d, J = 8,3 Hz 1H, H-Ar), 7,54 (s, 1H, H-Ar), 7,63 (d, J = 8,3 Hz, 1H,

H-Ar), 7,66 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-Ar), 8,52 (s, 1H, NNH), 9,26 (s, 1H, NH).


130,9, 131,4, 135,7, 136,5, 150,5 (C=N), 155,7, 176,0 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C16H14BrClN3S calculado: 393,97748;



130

5-Bromoindan-1-ona N-(4-metilfenil)tiosemicarbazona (29)

Pf: 182-184°C.

IR v/cm−1


(estiramiento C=S).


7,21 (d, J = 8,2 Hz, 2H, H-Ar), 7,45 (d, J = 8,3, 1H, H-Ar), 7.52 (d, J = 8,2, 2H, H-Ar),

7,53 (s, 1H, H-Ar), 7,62 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 8,50 (s, 1H, NNH), 9,22 (s, 1H,

NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 21,4 (CH3), 27.0 (CH2), 28,7 (CH2), 123,2, 124.9, 126,0,

129,4, 129,7, 131,2, 135,7, 136,3, 136,5, 150,8 (C=N), 155,7, 176,6 (C=S).

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H17BrN3S calculado: 374,0327;


5-Bromoindan-1-ona N-(4-metoxifenil)tiosemicarbazona (30)

Pf: 184-185°C.

IR v/cm−1




6,94 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-Ar), 7,45 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 7,51 (d, J = 8,8 Hz, 2H,

H-Ar), 7,53 (s, 1H, H-Ar), 7,62 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-Ar), 8,50 (s, 1H, NNH), 9,14 (s,

1H, NH).

13C-RMN (CDCl3) δ ppm: 26,6 (CH2), 28,3 (CH2), 55,5 (OCH3), 105,8, 114,1, 122,8,

126,5, 127,6, 129,0, 130,9, 135,2, 150,8 (C=N), 155,8, 158,7, 174,7 (C=S).


131

EM de alta resolución (ESI) m/z: [M+H]+ C17H17BrN3OS calculado: 390,0270;


2. Estudios biológicos

2.1. Virus de la diarrea viral bovina

2.1.1. Cultivo celular y virus

Células de riñón bovino Madin Darby (MDBK) se hicieron crecer en el medio E-MEM

(medio esencial mínimo Eagle) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB,

Internegocios), 2mM de L-glutamina, 100 µM de aminoácidos no esenciales, 100 µg/ml

de estreptomicina y 100 UI/ml de penicilina (medio de crecimiento). Se utilizó el

VDVB cepa tipo 1 NADL, biotipo CP (VDVB-1, ATCC VR 534).

2.1.2. Ensayo de reducción de placas

Se sembraron en una placa de cultivo de 24 pocillos 1,3x105 células MDBK por pocillo.

Después de incubar durante 24 h con 5% de CO2 a 37°C se removió el medio de

crecimiento, se lavaron las células con buffer fosfato salino (PBS) y se infectaron con

100 UFP del VDVB. Después de 1 h de incubación a 37°C se lavaron las células con

PBS y se agregaron los compuestos a evaluar en cada pocillo. Se utilizó ribavirina y

5,6-TSC como controles positivos. Asimismo, se incluyeron como controles células sin

tratar y células sin infectar. Después de incubar durante 72 h con 5% de CO2 a 37°C, las

células se fijaron con 10% de formaldehído, se tiñeron con 0,75% de cristal violeta y se

contaron las placas virales. La concentración efectiva 50 (CE50) fue definida como la

concentración del compuesto que reduce el número de placas virales en un 50% con

respecto al control infectado sin tratar y fue determinada a partir de curvas de

concentración-respuesta utilizando GraphPad Prism. Se llevaron a cabo tres

experimentos independientes por triplicado.

2.1.3. Estudios de resistencia cruzada

El compuesto 8 y la 5,6-TSC fueron evaluados mediante el ensayo de reducción del

ECP frente al virus con la enzima RdRp wild type y con las mutaciones N264D y


132

A392E27

. En el ensayo de reducción del ECP se sembraron en una placa de cultivo de

96 pocillos 1x104 células MDBK por pocillo. Después de incubar durante 24 h en una

estufa con 5% de CO2 a 37°C, las células se infectaron con el VDVB a una

multiplicidad de infección de 0,01 UFP/célula. Se utilizó ribavirina y 5,6-TSC como

controles positivos. Asimismo, se incluyeron células sin tratar y células sin infectar.

Después de incubar durante 72 h a 37ºC, se determinó el ECP midiendo la viabilidad

celular por MTS/PES (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,

Promega). La concentración efectiva 50 (CE50) fue definida como la concentración del

compuesto que reduce el ECP en un 50% con respecto al control infectado sin tratar y

fue determinada a partir de curvas de concentración-respuesta utilizando GraphPad

Prism. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes por cuadruplicado.

2.2. Trypanosoma cruzi

2.2.1. Cultivo celular de epimastigotes

Se cultivaron epimastigotes de T. cruzi (clon CL Brener) a 28°C durante 5 a 7 días (fase

exponencial de crecimiento) en medio líquido monofásico Brain Heart Triptose (BHT:

infusión cerebro-corazón 33 g/l, triptosa 3 g/l, Na2HPO4 4 g/l, KCl 0,4 g/l, glucosa 0,3

g/l y hemina 20 mg/l) suplementado con 10% de SFB (Natocor), 100 UI/ml de

penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina.

2.2.2. Actividad anti-epimastigotes de T. cruzi

Las células se cosecharon mediante centrifugación y se resuspendieron en medio fresco,

realizando el recuento en un contador de células Coulter Counter (Beckman). Se

sembraron en placas de 96 pocillos 1x106 parásitos/pocillo. Se agregaron los

compuestos a evaluar en una concentración final de 20 µM a partir de una solución

madre en DMSO. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo nunca superó

el 1% y el control se realizó en presencia de 1% de DMSO y en ausencia de cualquier

compuesto. Se utilizó benznidazol (Bz) como control positivo. Los parásitos se

incubaron a 28°C, durante 120 h. Luego de este tiempo se procedió a realizar el

recuento de los parásitos vivos mediante el contador de células. Se determinó el

porcentaje de inhibición para una concentración 20 µM de compuesto. Se llevaron a

cabo tres experimentos independientes por triplicado.


133

2.2.3. Obtención de tripomastigotes sanguíneos

Los parásitos fueron tomados de ratones BALB/c infectados previamente con la cepa

Tulahuén, stock Tul2. Dicha cepa es mantenida de rutina en el estadio de tripomastigote

sanguíneo por infecciones sucesivas en el bioterio del Instituto Nacional de

Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén”.

2.2.4. Actividad anti-tripomastigotes sanguíneos de T. cruzi

Se cuantificaron los parásitos mediante recuento en cámara de Malassez y se sembraron

en placas de 96 pocillos fondo en U 5x104

parásitos/pocillo, utilizando el medio BHT

sin suplementar con SFB. Se trataron las células con una concentración final de 20 µM

de compuesto a partir de una solución madre en DMSO. La concentración final de

DMSO en el medio de cultivo nunca superó el 1% y el control se realizó en presencia de

1% de DMSO y en ausencia de cualquier compuesto. Se utilizó Bz como control

positivo. Los parásitos se incubaron durante 24 h a 4°C. Luego de ese tiempo se

procedió a realizar el recuento de los parásitos vivos mediante el método de Pizzi-

Brener. Se determinó el porcentaje de lisis para una concentración final de 20 µM de

compuesto. Se llevaron a cabo al menos tres experimentos independientes por

duplicado.

2.2.5. Cultivo celular de tripomastigotes

El mantenimiento de tripomastigotes (clon CL Brener) se realizó en cultivos de células

Vero. Se cultivaron células Vero (células epiteliales de riñón derivadas de mono verde

africano) a 37°C, con 5% de CO2 en medio RPMI suplementado con 10% de SFB

(Natocor), 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml estreptomicina. Los parásitos fueron

cosechados del sobrenadante de cultivo, centrifugados a 1800 rpm durante 10 min, re-

suspendidos en medio RPMI suplementado con 10% SFB y mantenidas a 4°C durante

todo el procedimiento.

2.2.6. Actividad anti-amastigotes de T. cruzi

Se sembraron un total de 1x104 células Vero/pocillo sobre cubreobjetos circulares de 12

mm introducidos en placas de 24 pocillos e incubados a 37°C con 5% de CO2 durante 2

h. A continuación se infectaron con 1x105 tripomastigotes/pocillo obtenidos


134

previamente de cultivos de células Vero. Las células fueron incubadas durante 24 h a

37°C con 5% de CO2. Luego de dicho tiempo, se lavaron los cultivos para eliminar los

parásitos no internalizados y las células fueron tratadas con distintas concentraciones de

los compuestos a evaluar diluidas en DMSO. La concentración final de DMSO en el

medio de cultivo nunca superó el 0,25% y el control se realizó en presencia de 0,25% de

DMSO y en ausencia de cualquier compuesto. Se utilizó Bz como control positivo. Las

células se incubaron durante 72 h adicionales. Los cubreobjetos con las células

adheridas se retiraron de la placa y las células se fijaron con metanol y se tiñeron con

Giemsa (Merck) para su observación al microscopio de campo claro. Se exploraron los

cubreobjetos con aumentos de 40X fotografiando un mínimo de 10 campos distintos al

azar (Laica CTR Mic, Alemania). Se cuantificó el número de amastigotes/célula

realizando un recuento mínimo de 200 células/cubreobjeto. Se llevaron a cabo tres

experimentos independientes por duplicado.

2.2.7. Obtención de la cruzipaína

La purificación de la Cz se llevó a cabo a partir de epimastigotes de T. cruzi. La primera

parte de la purificación incluyó la obtención del extracto libre de células. Para ello, se

lisaron los parásitos mediante dos ciclos consecutivos de congelado y descongelado y se

re-suspendieron en una solución de sacarosa 0,25 M y KCl 5 mM (3 ml/gr de parásitos).

El homogenato resultante se centrifugó a 7000 rpm durante 10 min a 5 °C, el

sobrenadante se recuperó y el precipitado se volvió a resuspender en la misma solución

y se centrifugó a 12000 rpm durante 15 min a 5°C. Los sobrenadantes se clarificaron

por centrifugación a 19000 rpm durante 30 min a 4°C. A continuación se realizó la

precipitación con solución saturada de sulfato de amonio pH 7,5. La suspensión se

centrifugó a 12000 rpm durante 15 min a 5 °C. Se recuperó el pellet y se re-suspendió

en buffer TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM). Se dializó 2 veces y se dejó

durante toda la noche a 4 °C.

La segunda parte de la purificación de la Cz se realizó por medio de una cromatografía

de afinidad con Concanavalina A (Con-A). Para ello, al extracto libre de células

dializado se le agregó CaCl2, MgCl2 y MnCl2 hasta alcanzar una concentración final 3

mM de cada uno, y el mismo se centrifugó a 10000 rpm durante 12 min a 5°C. El

sobrenadante resultante se eluyó utilizando α-metil-manopiranósido 10% en una

columna de ConA-Sepharosa. La columna se lavó hasta absorbancia nula a 280 nm en


135

el eluato. Se recuperaron las fracciones con actividad enzimática sobre sustrato sintético

cromogénico Bz-Pro-Phe-Arg-pNA, y se dializaron contra Tris-HCl 50 mM pH 7.6 a

4°C. Los pasos de la purificación fueron controlados mediante determinación de

proteínas y actividad enzimática frente a sustratos sintéticos cromogénicos, SDS PAGE

y Western Blot con suero policlonal específico para Cz.

2.2.8. Zimografía

En un gel de poliacrilamida 10% con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y 0,15% de

gelatina incorporada como sustrato, se sembraron 10 µL de una dilución 1:100 de la

enzima purificada (20 U/ml) en PBS 50 mM pH 7,3 y DTT 5 mM por calle. Asimismo,

se corrió un estándar comercial de sustancias con pesos moleculares conocidos

(Prestained Broad Range Protein Marker 2-220 kDa, Genbiotech). La corrida se realizó

a 120 V durante 2 h a 4°C. Una vez finalizada se lavó el gel dos veces durante 15 min

con 0,1% Tritón X-100 y se incubó cada calle con el compuesto correspondiente

durante 24 h a 37°C en buffer MES 0,1 M con agregado de DTT 0,5 mM. Se incluyeron

los siguientes controles: la Cz sin tratar, la Cz incubada con 5% de DMSO y la Cz

incubada con E-64. Luego de la incubación se procedió a teñir el gel con Coomassie

brilliant blue R-250. Los resultados entre las distintas condiciones las bandas fueron

analizados mediante el programa Fiji134

. Se llevaron a cabo tres experimentos

independientes.

2.3. Trypanosoma brucei

2.3.1. Cultivo celular

Se cultivó la forma sanguínea (bloodstream) long slender de T. brucei brucei (cepa 427)

a 37°C, 5% de CO2, en medio CMM (Creek’s minimal médium)135

suplementado con

10% SFB (Natocor), 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Para la

conservación y preservación del cultivo anterior, se cosecharon los parásitos en la mitad

de la fase exponencial de crecimiento (1x106 parásitos/ml), se les agregó 10% de

glicerol estéril y se los colocó en criotubos, los cuales fueron congelados lentamente

hasta -80°C. A las 24 h los criotubos fueron colocados en N2 líquido hasta el momento

de su utilización. Para su uso se descongelaron rápidamente en estufa de 37°C. Se los


136

colocó en 5 ml de medio de cultivo CMM suplementado con 10% SFB y se centrifugó a

3000 rpm durante 3 minutos. El pellet se re-suspendió en 3 ml de medio de cultivo y se

lo trasvasó a una botella de cultivo celular.

2.3.2. Actividad anti-T. brucei

Las células se cosecharon en fase exponencial y se re-suspendieron en medio CMM

fresco, haciendo el recuento en el contador de células Coulter Counter (Beckman). Se

sembraron en placas de 96 pocillos 5x105 parásitos/pocillo. Se agregó la cantidad

indicada del compuesto estudiado a partir de una solución madre en DMSO. La

concentración final de DMSO en el medio de cultivo nunca superó el 0,8%. El control

se realizó en presencia de 0,8% de DMSO y en ausencia de cualquier compuesto y se

utilizó eflornitina y pentamidina como controles positivos. Se incubaron los parásitos a

37°C, 5% de CO2 durante 72 h. Luego de este tiempo se procedió a realizar el recuento

de los parásitos vivos mediante el contador de células. La concentración inhibitoria 50

(CI50) definida como la concentración de compuesto que inhibe en un 50% el

crecimiento con respecto al control sin tratar, se determinó a partir de curvas

concentración-respuesta usando GraphPad Prism. Se llevaron a cabo al menos tres

experimentos independientes por triplicado.

2.3.3. Lisado de T. brucei

A partir de un cultivo celular de T. brucei se realizó el recuento de parásitos mediante el

contador de células, se cosecharon mediante centrifugación a 3000 rpm durante 3 min y

se lavaron con PBS glucosa 3%. Se preparó luego el lisado de T. brucei mediante tres

ciclos consecutivos de congelado a -20°C y descongelado en hielo.

2.3.4. Zimografía

En un gel 10% SDS-PAGE con 0,15% de gelatina incorporada como sustrato se sembró

15 µL del lisado de T. brucei por calle (equivalente a 2x106 parásitos) y se corrió un

estándar comercial de sustancias con pesos moleculares conocidos (Prestained Broad

Range Protein Marker 2-220 kDa, Genbiotech). La corrida se realizó a 120 V durante 2

h a 4°C. Una vez finalizada se lavó el gel dos veces durante 15 min con 0,1% Tritón X-

100 y se incubó cada calle con el compuesto correspondiente durante 24 h a 37°C en


137

buffer MES 0,1 M con agregado de DTT 0,5 mM. Se incluyeron los siguientes

controles: lisado de parásitos sin tratar, lisado de parásitos incubados con 5% de DMSO

y lisado de parásitos incubados con E-64. Luego de la incubación se procedió a teñir el

gel con Coomassie brilliant blue R-250. Se llevaron a cabo tres experimentos

independientes.

2.3.5. Captación intracelular de las N4-TSCs

Se trataron 5x106 T. brucei con el compuesto 8 ó 14 durante 24 h a una concentración

final de 5 µM y durante 4 h a una concentración final de 20 µM a 37°C y 5% de CO2.

Se utilizó como control parásitos sin tratar. Posteriormente se los lavó con PBS y se los

fijó con 2% de solución de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente.

Se los lavó dos veces con PBS y se los montó sobre un portaobjeto con glicerol. Las

muestras fueron visualizadas mediante microscopio confocal Leica TCS SP5 excitando

a 405 nm. Las imágenes fueron procesadas con el programa Fiji134

.

2.3.6. Determinación del tamaño celular

Se trataron 1x105 T. brucei con el compuesto 8 a una concentración final de 5 µM y 10

µM durante 24h a 37°C y 5% de CO2, luego se lavaron dos veces en PBS y se

detectaron en un equipo de citometría de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, USA).

Se utilizó un control de células sin tratar y tratadas con el vehículo de DMSO. Un total

de 10 mil eventos fueron adquiridos en la región correspondiente a los parásitos. El

análisis y los histogramas del parámetro FSC fueron realizados utilizando el programa

FlowJo Versión X.0.7. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes por

triplicado.

2.3.7. Determinación de especies reactivas del oxígeno

Se trataron 3x105 parásitos con el compuesto 8 a una concentración final de 10 µM

durante 2 y 4 h a 37°C y 5% de CO2. Se utilizó como control positivo 1 mM de H2O2

durante 10 min. Luego del tratamiento correspondiente se lavaron las células dos veces

con PBS. A continuación se agregó la sonda 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato

(H2-DCF-DA) en una concentración final de 30 µM, se incubó 30 min a 37°C. Se

utilizaron como controles: i) células sin tratar con agregado de sonda; ii) células tratadas


138

con el vehículo de DMSO y con sonda; iii) células sin tratar y sin agregado de sonda y;

iv) células tratadas y sin agregado de sonda. La fluorescencia fue medida en el

citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson, USA). Un total de 10 mil eventos

fueron adquiridos en la región correspondiente a los parásitos. Para el análisis y las

representaciones gráficas se usó el programa FlowJo Versión X.0.7. Se llevaron a cabo

tres experimentos independientes por triplicado.

2.3.8. Determinación del potencial de membrana mitocondrial

Se sembraron en una placa de 96 pocillos 4x105 parásitos/pocillo. Se trataron las células

con el compuesto 8 a una concentración final de 10 µM durante 2 h a 37°C y 5% de

CO2. Se utilizó como control positivo parásitos tratados por 1 h con 300 µM de

carbonilcianato m-clorofenil-hidrazona (cccp). Se lavaron los parásitos dos veces con

PBS, se agregó la sonda Mito Tracker® Red CMXRos y se incubó 30 min a 37°C. Se

utilizaron como controles: i) células sin tratar con agregado de sonda; ii) células tratadas

con el vehículo de DMSO y con sonda; iii) células sin tratar y sin agregado de sonda y

iv) células tratadas y sin agregado de sonda. La fluorescencia fue medida mediante

citometría de flujo. El equipo y el software utilizado fue el mismo que en las

determinaciones anteriores por citometría de flujo. Se llevaron a cabo tres experimentos

independientes por triplicado.

2.3.9. Ensayo de doble marcación con anexina V e yoduro de propidio

Se siguió el procedimiento descripto por el fabricante del kit I de FITC Annexin V

Apoptosis Detection (BD) con algunas modificaciones. Se sembraron en una placa de

96 pocillos 4x105 parásitos/pocillo. Se trataron las células con el compuesto 8 a una

concentración final de 10 µM durante 12, 24 y 48 h a 37°C y 5% de CO2. Se utilizó

como control positivo células sometidas a shock térmico de 60°C durante 3 min. Se

lavaron los parásitos con PBS, se agregó 5 µl de la sonda FITC anexina V y 6 µl de IP y

se dejó incubando 30 min. Se utilizaron como controles: i) células sin tratar con

agregado de sonda; ii) células tratadas con el vehículo de DMSO y con sonda; iii)

células sin tratar y sin agregado de sonda y; iv) células tratadas y sin agregado de sonda.

La fluorescencia fue medida mediante citometría de flujo. El equipo y el software

utilizado fue el mismo que en las anteriores determinaciones por citometría de flujo. Se

llevaron a cabo tres experimentos independientes por triplicado.


139

2.3.10. Ensayo TUNEL

Se siguió el procedimiento descripto por el fabricante del kit In situ cell death detection

kit, fluorescein (Roche). Se sembraron en una placa de 96 pocillos 1x105

parásitos/pocillo. Se trataron las células con el compuesto 8 a una concentración final de

5 y 10 µM durante 24 h a 37°C y 5% de CO2. Se lavaron los parásitos con PBS, se

fijaron con 2% de paraformaldehído durante 20 min y se volvieron a lavar con PBS. Se

permeabilizaron con 0,1% de Tritón X-100 en 0,1% de citrato de sodio durante 2 min en

hielo y se lavaron con PBS. Se utilizó como control positivo parásitos permeabilizados

y tratados con 1 µl de ADNasa I (Promega) durante 10 min. Se agregó 5 µl de la enzima

deoxinucleotidil transferasa, 45 µl de dUTP-fluoresceína y se incubó durante 1 h a

37°C. Se utilizaron como controles: i) células sin tratar con agregado de enzima y dUTP

marcados; ii) células tratadas con el vehículo de DMSO con agregado de enzima y

dUTP marcados; iii) células tratadas con agregado de dUTP marcados y sin el agregado

de enzima. El equipo y el software utilizado fue el mismo que en las determinaciones

anteriores por citometría de flujo. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes

por triplicado.

2.3.11. Microscopia electrónica de transmisión para ultraestructura

Se trataron 3x108

parásitos con 7,5 µM de concentración final del derivado 8 durante 24

h a 37°C y 5% de CO2. Luego de dicho tiempo se cosecharon y se lavaron dos veces

con PBS. En paralelo se trabajó con un control de 1x108 parásitos sin tratar. Las células

se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5% en buffer fosfato 0,1 M pH 7.4

durante 4 h a 4 °C, se lavaron dos veces y se fijaron posteriormente con 1% de tetróxido

de osmio en el mismo buffer durante 60 min a 4 °C. Las células se lavaron con agua

doblemente destilada y el material se deshidrató gradualmente en concentraciones

crecientes de etanol. Las muestras fueron embebidas en resina epoxi “Durcupan”. Una

vez polimerizada la resina se realizaron cortes ultrafinos de 70-90 nm de espesor. Las

secciones se montaron en grillas de cobre y se contrastaron con acetato de uranilo y

citrato de plomo. Se observó en un microscopio electrónico de transmisión MET Zeiss

109 y se obtuvieron imágenes con la cámara Gatan W10000.


140

2.4. Ensayo de Citotoxicidad

2.4.1. Ensayo de efecto citotóxico en células MDBK

Se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos 1x104 células/pocillo.

Después de 24 h de incubación a 37°C, 5% de CO2, se agregaron diluciones de las N4-

TSCs en DMSO. Se utilizó como control células sin tratar. Las células proliferaron

durante 72 h a 37°C. Luego de dicho tiempo se determinó la viabilidad celular mediante

el método MTS/PES del kit Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay

(Promega) siguiendo el procedimiento del fabricante. Se incubó durante 2 h 30 min a

37°C y se leyeron las absorbancias a 490 nm. Se llevaron a cabo tres experimentos

independientes por triplicado.

2.4.2. Ensayo de efecto citotóxico en células Vero

Se sembraron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos 1x104 células/pocillo en

medio de cultivo RPMI. Después de 24 h de incubación a 37°C, 5% de CO2, se

agregaron diluciones de las N4-TSCs en DMSO. La concentración final de DMSO en el

medio de cultivo nunca superó el 0,6 % y el control se realizó en presencia de 0,6 % de

DMSO y en ausencia de cualquier compuesto. Las células proliferaron durante 72 h a

37°C con 5% de CO2. Luego de dicho tiempo se lavaron con PBS y se les agregó 100 µl

de medio fresco y 15 µl de una solución madre de MTT (5mg/ml). Se incubó durante 1

h 30 min en oscuridad, 37°C y 5% de CO2. Se lavaron las células y se disolvió el

colorante con 100 µl de DMSO. Se leyeron las absorbancias a 578 nm con referencia de

630 nm. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes por triplicado.

3. Estudios computacionales

3.1 Modelado molecular

Las N4-TSCs fueron modeladas con el programa HyperChem 8.0.7, pre-optimizadas con

el campo de fuerza MM+ y posteriormente con el método semi-empírico AM1,

utilizando el algoritmo Polak-Ribiere con criterio de convergencia inferior a 0.001

Kcal/(Å.mol) ó máximo de 9000 iteraciones. Las geometrías fueron finalmente


141

optimizadas utilizando el programa Gaussian 09 mediante el método de HF con la base

6-31G(d).

3.2. Docking molecular

La estructura de rayos X de la enzima RdRp del VDVB se obtuvo de la base de datos

PDB (http://www.rcsb.org) con el código 1S48136

. Los residuos de selenometionina se

modificaron de nuevo a residuos de metionina, se añadieron hidrógenos polares y las

moléculas de agua fueron removidas. La enzima fue optimizada con el programa

NAMD 2.9137

utilizando el campo de fuerza CHARMM. El sitio de unión putativo para

los compuestos seleccionados en la RdRp se determinó utilizando el servidor

Metapocket 2.092

. Mediante dicho procedimiento se encontraron tres sitios de unión

putativos en la superficie de la enzima; sin embargo, sólo uno se encontró en la región

cercana a los aminoácidos 264 y 392 de la RdRp mutada utilizada en el ensayo de

resistencia cruzada. Por lo tanto, este sitio fue elegido para llevar a cabo el

procedimiento de docking molecular. Se utilizó el software AutodockTools 1.5.6 para

obtener los archivos inputs de la macromolécula y de los ligandos con el formato pdbqt.

Los cálculos fueron llevados a cabo mediante el programa Autodock 4.2138

. Para los

cálculos se definió un espacio de 60 x 60 x 60 puntos en el plano xyz y una distancia de

0,375 Å y centrado en el sitio elegido. Los ligandos fueron completamente flexibles

durante el procedimiento, mientras que la proteína se mantuvo rígida. El docking se

realizó con 1000 corridas utilizando el algoritmo genético lamarckiano. La selección

final del modo de unión se realizó teniendo en cuenta la energía de unión libre estimada

y el tamaño del cluster. Las interacciones de unión fueron visualizadas en el programa

Chimera 1.8139

.

3.3. Dinámica molecular y MM/PBSA

Las mejores conformaciones del docking molecular fueron utilizadas como estructuras

de partida para el estudio de dinámica molecular. Las simulaciones se realizaron con el

programa NAMD 2.9 utilizando el campo de fuerza Amber. Cada complejo fue

solvatado en un caja de agua explícita descripta con el potencial TIP3P con la distancia

mínima de 10 Å desde la superficie de la proteína hasta el borde de la caja. Se agregaron

iones cloruro para neutralizar el sistema. La primera minimización de energía del


142

sistema se realizó con la proteína restringida conformacionalmente, seguida de una

segunda minimización sin restricciones. Luego, la temperatura se incrementó

gradualmente hasta 300 K durante 300 ps usando un ensamble canónico (NVT) y se

equilibró durante un período de 3 ns a 1 atm y una temperatura de 300 K. Las

producciones se llevaron a cabo durante 6 ns en condiciones de número de partículas,

presión y temperatura constantes (NPT) y con un paso de tiempo de integración de 2 fs.

La malla de partículas Ewald se utilizó para tratar interacciones electrostáticas de largo

alcance; el algoritmo SHAKE se aplicó a todos los átomos de hidrógeno y la distancia

límite de van der Waals se estableció en 10 Å. Las trayectorias se analizaron utilizando

el programa VMD. Las energías libres de unión (ΔGunión) se estimaron mediante el

método MM/PBSA a partir de 1000 frames obtenidos en la producción. Para el cálculo

de entropía se llevó a cabo el método de modos normales en la zona de la interacción

proteína-ligando. La formación de puente de hidrógeno fue considerada para una

distancia menor a 2,5 Å y un ángulo mayor a 120°.

3.4. Cálculo de descriptores

A cada una de las N4-TSCs se le calcularon distintos descriptores moleculares (0D, 1D,

2D y 3D), utilizando el programa PaDEL Descriptor 2.15140

. El cálculo de las

propiedades electrónicas (HOMO, LUMO, momento dipolar, potencial electrostático y

distintos esquemas de carga: Mulliken, RESP, al igual que los mapas de potencial

electrostático) se realizó con el programa Gaussian 09 mediante el método de HF con la

base 6-31G(d).

Las imágenes de los mapas de potencial electrostático fueron obtenidas con el programa

GaussView 4.1, representados en una escala de colores que va del rojo (densidad de

carga negativa) hasta el azul (densidad de carga positiva).

3.5. QSAR

Los primeros modelos de QSAR se llevaron a cabo con el programa McQSAR 1.2141

a

partir de los conformeros generados con el programa Balloon142

. Se tomaron en cuenta

descriptores moleculares calculados con el programa PaDEL Descriptor y los datos de

actividad biológica sobre T. brucei expresados como pCI50. El algoritmo genético


143

empleado en el programa McQSAR fue configurado con el valor de 0,5 como máxima

colinealidad entre descriptores y con 3 descriptores como máximo para cada ecuación.

La segunda generación de modelos de QSAR se calculó a partir de las propiedades

electrónicas determinadas mediante Gaussian 09. Las ecuaciones matemáticas y el

análisis estadístico de las mismas se realizaron con el módulo de análisis de datos

incluido en el programa Microsoft Excel 2007.

4. Análisis estadístico

Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism versión

6.00 ó el módulo de análisis de datos incluido en el programa Microsoft Excel 2007. La

comparación entre las medias de dos grupos se realizó mediante la prueba t-Student

(para muestras con varianzas iguales). Para las comparaciones entre múltiples grupos se

utilizó el análisis de varianza (ANOVA), seguido de los post tests de Bonferrony o

Dunnett. Los p-valor < 0,05 (*) y p-valor < 0,01 (**) fueron considerados

estadísticamente significativos. Los modelos de QSAR se realizaron a partir de

regresiones lineales múltiples y se tomaron en cuenta para las ecuaciones el coeficiente

de determinación, el estadístico de Fisher, el desvío estándar y el test de Student para

cada variable del modelo.

Capítulo V.

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Conclusiones y perspectivas

147

Capítulo V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Se han sintetizado y caracterizado estructuralmente 30 tiosemicarbazonas de 1-

indanonas N4-aril sustituidas con distintos sustituyentes en el anillo indánico así como

en la posición para del arilo unido al N4. La variedad de los sustituyentes en cuanto a las

distintas calidades electrónicas y/o estéricas permitieron, luego de los ensayos

biológicos, el análisis de la relación estructura-actividad.

Se compararon los rendimientos y tiempos de reacción de la síntesis de las N4-TSCs y

se llegó a la conclusión que la metodología one-pot que utiliza la radiación de

microondas es más ventajosa en tiempos y rendimientos de reacción que la metodología

convencional.

Los compuestos fueron evaluados como antivirales frente al virus de la diarrea viral

bovina. Se concluyó en el estudio de relación estructura-actividad que sustituyentes

atractores de electrones en el arilo unido al N4 son importantes para la actividad

antiviral, mientras que dadores de electrones en dicha posición no se relacionan con

buenos valores de actividad. Asimismo se concluyó que los compuestos con la

sustitución 5,6-dimetoxilo o 5-metilo son activos frente al VDVB, mientras que la

actividad se pierde con las N4-TSCs sin sustituir en el indano o con la sustitución 4,5-

dimetoxilo. De esta manera se concluyó que el tipo y patrón de sustituciones en el

indano juegan un rol determinante para definir N4-TSCs activas/inactivas frente al

VDVB.

Por otro lado, a partir del ensayo de resistencia cruzada, el cual sugiere que el

compuesto 8 actuaría inhibiendo la ARN polimerasa viral dependiente de ARN, se

llevaron a cabo estudios computacionales. En los estudios de docking molecular con la

enzima wild type se evidenció para el compuesto estudiado interacciones de puente de

hidrógeno, π-π stacking y no polar entre el grupo 5,6-dimetoxi, el indano, y la función

tiosemicarbazona con la enzima. En el modelo de la RdRp mutada se perdieron

interacciones de puente de hidrógeno y de π-π stacking. De esta forma, en concordancia

con el ensayo de resistencia cruzada, se concluyó la importancia de los aminoácidos

mutados en la interacción dada entre la molécula y el sitio de la enzima donde se llevó a

cabo la simulación. Por otro lado, en las dinámicas moleculares realizadas se evidenció

que la componente electrostática y de van der Waals son las de mayor incidencia en la


148

energía del complejo compuesto-enzima. Asimismo, se encontró que la formación de

puentes de hidrógeno resultaría un factor determinante para la interacción del

compuesto con la enzima y por ende para su actividad. Estos datos, juntos con los de

resistencia cruzada, dan sustento a la hipótesis de establecer esta enzima y este sitio

como potencial blanco de la N4-TSC estudiada.

Por otro lado, en la evaluación de los compuestos frente a la forma epimastigote,

tripomastigote y amastigote de T. cruzi se identificaron derivados activos frente a las

tres formas. Asimismo, se evidenció que su mecanismo de acción no resulta ser la

inhibición de la cruzipaína. De esta forma surge como perspectiva explorar otros

posibles blancos de acción para los compuestos. En los análisis de relación estructura-

actividad para la forma epimastigote se concluyó que el H, F y Cl en la posición R4 y la

sustitución 5,6-dimetoxilo en el indano potencian la actividad. En cuanto a la forma

tripomastigote, no se estableció una relación directa entre las propiedades estructurales

de los compuestos y su actividad.

En los estudios frente a T. brucei seis N4-TSCs presentaron una CI50 por debajo de 10

µM, siendo el compuesto 8 el más activo de la serie. El análisis de estructura-actividad

en T. brucei permitió concluir que la sustitución con nitro en el arilo unido al N4

potencia la actividad. Por otro lado se concluyó que los derivados sin sustituir en el

indano y los que poseen la sustitución 5,6-dimetoxilo se vinculan con los mejores

valores de actividad. En los estudios de QSAR se pudo observar que la actividad está

condicionada a descriptores cuánticos, la carga parcial sobre el átomo de N2

y la

diferencia de cargas entre el N4 y el hidrógeno unido a este. Además, a partir del modelo

de QSAR obtenido se concluyó que la conformación relacionada con la actividad

correspondería a la “Syn” ya que sólo para dicha conformación se encontró correlación

con la actividad.

Por otro lado, en el estudio del compuesto más activo frente a las proteasas presentes en

el lisado de parásitos se observó que éstas no resultan ser su blanco. Se determinaron los

eventos que contribuyen a la muerte del parásito mediante estudios de citometría de

flujo y microscopía. Los parásitos tratados con la N4-TSC más activa evidenciaron la

disminución del tamaño celular, generación de especies reactivas del oxígeno,

despolarización de la membrana mitocondrial, exposición de PS en la superficie externa

de la membrana plasmática, degradación del ADN y alteraciones ultraestructurales.


149

Todas ellas indicaron que el compuesto produce muerte celular regulada con fenotipo

apoptótico.

Respecto a los ensayos en células MDBK y Vero ninguna N4-TSC presentó

citotoxicidad, lo cual resulta una característica relevante en la búsqueda de fármacos y

apoya la continuación de los estudios.

En conclusión, los modelos teóricos indirectos permitieron conocer las características

estructurales que son determinantes en la actividad anti-T. brucei. Los modelos teóricos

directos permitieron conocer y entender el mecanismo de acción del compuesto más

activo frente al VDVB. El compuesto 8 surge como una molécula líder que permitirá su

optimización para un futuro uso como antiviral y antiparasitario. La relación entre el

patrón estructural y las características biológicas estudiadas en el presente trabajo

proporcionan valiosas bases para continuar con el diseño de nuevas moléculas

antivirales y antiparasitarias.

Capítulo V.

REFERENCIAS

Referencias

153

REFERENCIAS

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