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Síntesis de nanoparticulas poliméricas de quitosano funcionalizadas con

extractos de la mora (Rubus glaucus) y su evaluación preliminar como agentes

antimicrobianos

Article · August 2012

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Marilyn Porras-Gómez

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INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS Y BIOLÓGICASFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIAUNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

Síntesis de Nanoparticulas Poliméricas de Quitosano Funcionalizadas con extractos dela mora (Rubus glaucus) y su Evaluación preliminar como agentes antimicrobianos

Porras, M1., Madrigal, S2 y Vega, J1

1Laboratorio Nacional de Nanotecnología LANOTEC, Costa Rica2Laboratorio Nacional de Polímeros PoliUNA, Costa Rica

Resumen

El objetivo de este trabajo ha sido evaluar el efecto bacteriostático de nanopartículas de quitosano funcionalizadascon agentes antioxidantes de extractos de frutas tropicales.En la síntesis y caracterización de nanopartículas de quitosano funcionalizadas se manipulan variablesexperimentales para obtener concentraciones y otros parámetros que presenten efecto bacteriostático en seisespecies de bacterias patógenas ATCC, tanto gram-negativas: Escherichia coli, Serratia marcescens yPsudomona aeroginosa; como gram-positivas: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Enteroccus faecalis.La hipótesis planteada supone que al funcionalizar las nanopartículas sintetizadas mediante el método degelificación iónica con tripolifosfato de sodio como agente entrecruzante, con agentes activos provenientesde extractos de la fruta tropical mora (Rubus glaucus), al contener agentes antioxidantes, expresados comoconcentración de acido gálico, otorgan a las nanopartículas de quitosano la capacidad de inhibir el crecimientobacteriano.Este trabajo se ha concentrado en el estudio de las propiedades de la mora como agente modificante de lasnanopartículas de quitosano y la evaluación preliminar de su actividad antimicrobiana. Se evaluó el contenidode polifenoles de la fruta y su actividad antimicrobiana en conjunto con las nanopartículas frente a losmicroorganismos patógenos antes mencionados. Las frutas evaluadas presentan contenidos de compuestosfenólicos de aproximadamente 100 mg de ácido gálico/100g y actividad antimicrobiana frente a las bacteriasgram-positivas S. aureus, E. faecalis, y B. subtilis y la gram-negativa S. marcescens, determinada por porcentajesde inhibición de un ámbito entre 10% y 60% con respecto al control positivo. Estos resultados muestran queestos nanoproductos tienen potencial como posibles agentes antimicrobianos para ser utilizados en la industriafarmaceútica.

Palabras clave: agentes antimicrobianos, polifenoles, efecto bacteriostático, quitosano, nanopartículas poliméricas.

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Synthesis of polymer chitosan nanoparticles funtionalized with blackberryextracts(Rubus glaucus) and its preliminary evaluation as antimicrobial agents

Abstract

The aim of this study is to evaluate the bacteriostatic effect of functionalized chitosan nanoparticles withantioxidants from tropical fruit extracts.In the synthesis and characterization of functionalized chitosan nanoparticles variables are treated in orderto obtain concentrations and other parameters, which shows bacteriostatic effect on some species of pathogenicgram-negative ATCC bacterias: Escherichia coli, Serratia marcescens and Pseudomona aeroginosa, and gram-positives: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Enterococcus faecalis.The hypothesis assumes that functionalized nanoparticles synthesized according to the ion gelation methodusing tripolyphosphate as crosslinking agent, with modifying agents from blackberry tropical fruit extracts(Rubus glaucus), containing antioxidants, expressed as gallic acid concentration, provides chitosan nanoparticlesthe ability to inhibit bacterial growth.This research performed a preliminary evaluation of the polyphenol content and antimicrobial activity inconjunction with the nanoparticles against pathogens mentioned above. The evaluated fruits exhibit concentrationsof 100 mg of gallic acid/100g and antimicrobial activity against the gram-positive S. aureus E. faecalis andB. subtilis, and the gram-negative S. marcescens determined by disc diffusion method showing an inhibitiondiameter between 10% and 60 % compared to positive control. These results show the potential of thesenanoproducts as antimicrobial agents for use in the pharmaceutical industry.

Key words: antimicrobial agents, polyphenols, bacteriostatic effect, chitosan, polimeric nanoparticles.

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Introducción

Los productos derivados de frutas tropicales se hanconsiderado por siglos únicamente como delicatessengastronómicos. Sólo recientemente se han reconocidocomo fuentes de compuestos fitoquímicos conpotenciales efectos favorables para la salud.Las moras son consideradas en la actualidad comouna fuente rica de polifenoles. Estudios recientes(Armentia, Lombardero, Barber, Callejo, Vega,Martínez y Rebollo, 1999) han encontrado que losextractos de antocianinas provenientes de variasespecies de mora podrían ejercer actividadesanticancerígenas in vitro, reducir la inflamación ymodular la respuesta inmune. Los compuestospolifenólicos presentes mayoritariamente en estafruta son taninos elágicos y antocianinas. Loscompuestos formados a partir de la hidrólisis detaninos elágicos han recibido gran atención, debidoa sus importantes actividades biológicas tales comoactividad antimutagénica, antiviral, anticancerígena,antitumoral y antioxidante (Armentia, et al., 1999,p. 398). Las antocianinas son los pigmentos másimportantes de las plantas vasculares, responsablesde colores naranja, rosa, rojo, violeta y azul en lasflores y frutos de algunas de ellas. Estos compuestosademás poseen actividad antioxidante y desempeñanun papel importante en la prevención deenfermedades cardiovasculares, cáncer, diabetes,entre otras.Un grupo creciente de evidencias sugieren que elconsumo regular de los productos de frutas comomora y cacao o el uso de sus principios activos comoagentes terapéuticos podrían influir favorablementeen la lucha contra las enfermedades cardiovascularese incluso en otras patologías como el cáncer. Sinembargo, se hacen investigaciones para definir lamagnitud real de estos beneficios y elucidar susposibles mecanismos de acción (Gutiérrez, 2002).Las áreas tropicales son ricas en fuentes desconocidasde fitoquímicos con potenciales aplicaciones enfarmacología, medicina y alimentos funcionales. Unestudio reciente efectuado en Costa Rica (Madrigal,Rodríguez, Krueger, y Reed, 2010) con una colecciónde frutas tradicionales (17 muestras) fueronseleccionadas para identificar su composiciónpolifenólica (ensayo Folin-Ciocalteu), su actividadantioxidante (ensayo DPPH) y propiedadesantibacterianas in vitro (difusión en disco). Losresultados mostraron que al menos ocho de lasmuestras analizadas son fuentes naturales depolifenoles con importante actividad antioxidante y

tres de ellas muestran un significativo efectoantibacteriano tanto en bacterias gram-positivascomo bacterias gram-negativas, en comparación conel control (ampicilina 2 mg/ml). Los datosexperimentales sugieren que los extractospolifenólicos aislados de las frutas tradicionales deCosta Rica podrían ser fuentes interesantes de losfitoquímicos para controlar o prevenir las infeccionesbacterianas en humanos.Es importante aclarar términos de actividadmicrobiana; al hablar acerca de un antibiótico osustancia bactericida se hace referencia a unantimicrobiano que es capaz de destruir el agentepatógeno de interés (destrucción de la pared celularde la bacteria). Dentro de este grupo se encuentranlas penicilinas, las quinolonas, las cefalosporinas,la vancomicina, los aminoglucósidos y la polimixina.Para el caso de las sustancias o antibióticosbacteriostáticos se hace referencia a otro mecanismode acción que se traduce en una inhibición delcrecimiento o multiplicación de las bacterias con elobjetivo de que, al aplicarlo, sea el propio sistemainmunológico del animal el que detenga la infección.Dentro de este grupo se clasifican las tetraciclinas,la lincomicina, la eritromicina, las sulfamidas, elcloramfenicol, entre otros. El presente trabajo se haenfocado en la búsqueda de agentes bacteriostáticosaplicables contra las bacterias gram-positivas y gram-nega t ivas menc ionadas an te r io rmen te .En la actualidad los polímeros naturales son utilizadoscomo biomateriales siendo uno de los másimportantes el quitosano, polisacárido catiónicolineal compuesto por unidades de (1-4)-2-desoxi-2-amino-D-glucopiranosa (D-glucosamina) (GlcN) y(1-4)-2-desoxi-2-acetamido-D-glucopiranosa (N-acetyl-D-glucosamina) (GlcNAc) derivado pordesacetilación de quitina: poli [-(1-4)-2 acetamida-2-desoxi-D-glucopiranosa]. Esta última es la segundasustancia polimérica natural más abundante despuésde la celulosa y se extrae por métodos químicos apartir de los exoesqueletos de crustáceos y de laconcha caliza de moluscos (Gutiérrez, 2002).En su estructura, de acuerdo con la Fig. 1, el nitrógenose encuentra como una amina alifática primaria yorigina reacciones típicas de ese grupo funcional.

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Debido a las características benéficas mencionadas,el quitosano ha sido utilizado como material de paredpara encapsular compuestos bioactivos y en eldesarrollo de sistemas de liberación de sustancias(Peniche, Argüelles, Peniche, y Acosta, 2003).Investigaciones realizadas en 1992 (Hassan, Parish,y Gallo, 1992) y 1993 (Ohya, Takei, Kobayashi, yOuchi, 1993) desarrollaron microcápsulas dequitosano (<10•m) para la liberación específica deagentes anticancerígenos.El quitosano tiene aplicaciones farmacéuticas comomatriz de liberación prolongada de drogas y enterapia génica, aplicaciones biomédicas talescomofabricación de materiales bioadhesivos,fungistáticos, hemostáticos y en el tratamiento deheridas por quemaduras, donde se aplican vendajeshúmedos denominados apósitos, que debencomportarse de manera homóloga a la piel alcanzandoun 85% de humedad y buena permeabilidad,otorgándole así, condiciones adecuadas para repararsesin alteraciones. El quitosano ha mostrado buenosresultados facilitando la cicatrización y mejorandolas funciones de las células inflamatorias (Fuentesy Pastor de Abram, 2004).El quitosano puede asociarse a sustancias cargadasnegativamente, incluidas proteínas, polisacáridosaniónicos y ácidos nucleícos presentes en la piel.Posee propiedades antimicrobianas, es biocompatibley clínicamente ha demostrado no producir reaccionesalérgicas después de su implantación, inyección oaplicación tópica. Además es biodegradable(Márquez, Cartagena y Pérez, 2009).Las nanopartículas sintetizadas a partir de quitosanose forman de acuerdo a una aproximación de tipobottom-up como resultado de procesos de auto-asociación o entrecruzamiento, en virtud de los cualeslas cadenas poliméricas se ordenan en estructurasnanoscópicas, ya sea por interacciones inter ointramoleculares de tipo covalente o no covalente.En estas nanopartículas o nanoesferas el fármaco

puede ser atrapado o ligado a la matriz poliméricasólida o semisólida (Rinaudo, 2008).

El quitosano inhibe el crecimiento de bacteriaseficazmente, pero los efectos inhibitorios difierencon respecto al peso molecular del quitosano y eltipo de bacteria. El quitosano generalmente ejercemayor efecto bactericida contra microorganismosgram-positivos. La actividad antibacteriana delquitosano es afectado por el pH y su mayor actividadse encuentra con bajos valores de pH, aquellosverificados experimentalmente en el rango 4,5-5,8.(Begin y Calsteren, 1999).En este trabajo se han evaluado las propiedadesantimicrobianas del quitosano como sistema deencapsulamiento y transporte de moléculasprovenientes de la exatrcción de compuestos de lafruta tropical Rubus glaucus con alto contenido encompuestos fenólicos.

Materiales y métodos

Síntesis de las nanopartículas de quitosanoSe empleó el método de gelificación iónica contripolifosfato sódico. En esta técnica la formaciónde la cubierta de las nanopartículas tiene lugar debidoa una reacción de gelificación iónica entre unpolímero y un ion de carga opuesta.Se preparó una solución de quitosano de 0.10% v/ven ácido acético 0.50% v/v, a base de una soluciónmadre de 0.50% m/v de quitosano.Como agente entrecruzante se empleó tripolifosfatode sodio 0.25% m/v.Para la formación de las nanopartículas se mezclapoco a poco en agitación constante la solución dequitosano con las soluciones de tripolifosfato desodio.

Funcionalización de las nanopartículas de quitosano

El extracto de la mora (rubus glaucus) se empleócomo agente modificante de las nanopartículas dequitosano.La extracción se realizó a través de acetona al 70%;los productos se liofilizaron durante tres días parasu deshidratación.Para la identificación de la composición polifenólicase realizó el ensayo Folin-Ciocalteu con el que seobtuvo la concentración de ácido gálico como seexpresa en la Tabla 1 de la sección de los resultados.

Figura 1. Unidades repetidas de quitosanoD= D-Glucosamina A= N-acetil-D-glucosamina.

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En la Tabla 2 se visualiza la identificación para losproductos obtenidos.Mediante vórtex en agitación constante se mezclóla solución de nanopartículas de quitosano con lasolución del agente modificante (0,02 g/mL) parasu funcionalización. Es importante mencionar queesto produce la funcionalización de la superficie dela nanopartícula, con el fin de evitar que en el sistemasea necesario estrictamente la ruptura de lasnanopartículas para que se libere el componente.

Caracterización de las nanopartículas de quitosano

Para la caracterización de los productos obtenidos,tanto en el caso de las nanopartículas de quitosanosimples, como para las nanopartículas de quitosanofuncionalizadas, se emplearon las técnicas de

microscopía de fuerza atómica, termogravimetría ygoniometría.

Ensayos microbiológicos

Se empleó el método Kirby-Bauer (método dedifusión en agar) para la determinación de sensibilidadde los agentes microbianos a los agentes de prueba,con la modificación de aplicar los agentes de pruebade manera directa sobre el cultivo y no utilizar discosde papel de filtro. Se mide el diámetro (halos) deinhibición producido por cada agente de prueba.Se empleó como control positivo cloramfenicol 30ug y como control negativo ácido acético 0,5% v/vdurante los ensayos.Es importante desatacar que los resultados de losensayos microbiológicos son preliminares y sepresentan sólo de manera descriptiva. El número deréplicas para los ensayos fue de tres, por tanto seaplica desviación estándar para las pruebas desensibilidad, pero no para los controles.

Resultados Preliminares

Los resultados obtenidos mediante microscopía defuerza atómica, puede visualizarse en la Fig. 2. lasimágenes escaneadas con 5 •m de área. En la imagenA aparecen las nanopartículas de quitosano sinfuncionalización y se observa que están más dispersasen comparación con la imagen B. De esto se concluyeque el agente modificante también funciona comoagente entrecruzante, ya que se observa mayoraglomeración en las nanopartículas funcionalizadascon el agente modificante de la mora.

Figura 2. Imágenes de microscopía de fuerza atómica donde A representa el barrido de las NCsy B el de las NCS funcionalizadas.

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De acuerdo a la Fig. 3, que representa el gráfico delongitud y tamaño de los escaneos y la Tabla 3,

los diámetros de partícula oscilan entre 98 nm y102 nm en promedio. Los resultados obtenidos congoniometría (Fig. 4) muestran una efectiva incorporación de la sustancia

activa en la nanopartícula, lo que evidencia sufuncionalización. Lo anterior se deduce debido aque en la imagen A el promedio de ángulo de contactofue muy similar al del agente modificante de mora(imagen B), con valores de 59,49 y 56,60respectivamente. Por otra parte, para lasnanopartículas funcionalizadas (imagen C) el ánguloaumentó a un valor promedio de 87,08. De acuerdoal termograma (Fig. 5) y la Tabla 4, las nanopartículasfuncionalizadas presentan un comportamientotérmico dual con respecto a los dos precursores, lascurvas de las nanopartículas con y sinfuncionalización son similares al inicio deltermograma, pero a medida que este avanza en

Figura 3. Gráfico de longitud por microscopía defuerzaatómica.

Figura 4. Imágenes de goniometría para la muestras

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función de la temperatura se asemejan lasnanopartículas funcionalizadas y el agentemodificante de la mora.

Las nanopartículas de quitosano funcionalizadaspresentan mayor efecto bacteriostático enmicroorganismos gram-positivos que lasnanopartículas de quitosano sin funcionalizar, talcomo se muestra en los gráficos de la Fig. 6.

Figura 6. Gráficos del porcentaje de inhibición enbacterias gram-negativas y gram-positivasEn la Fig. 7 se ilustran algunos de los halosinhibitorios en S. aureus y E. faecalis para muestrasde nanopartículas funcionalizadas con el agentemodificante proveniente del extracto de mora (11,12 y 13).

las bacterias Sa y Ef.

Tabla 4. Temperaturas de descomposición para lasmuestras

Figura 5. Termograma de las tres muestras.Temperatura °C

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Discusión

La concentración de ácido gálico del extracto de lamora oscila entre 90 y 100 mg/100mg (Tabla 2).

Según las imágenes de microscopía de fuerza atómicalas nanopartículas funcionalizadas presentan mayoraglomeración y están presentes en mayor cantidadque las no funcionalizadas.El tamaño promedio del diámetro de lasnanopartículas de quitosano es de 100 nmaproximadamente (Tabla 3).

Con los resultados de termogravimetría y goniometríase concluye que la funcionalización de lasnanopartículas es efectiva, ya que estas presentanpropiedades tanto de sus precursores, es decir, delas nanopartículas sin funcionalizar como del agentemodificante.De acuerdo al gráfico de la Fig. 6 y las Tablas 5-11,dónde se determinan los halos inhibitorios; ocurreinhibición bacteriana en las bacterias gram-positivas:64% de inhibición en S. aureus y 54,2% en E.faecalis, con respecto al control positivo.

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En microorganismos gram-negativos la bacteria S.marcescens alcanzó 33,3% de inhibición, mientrasque la inhibición en P. aeruginosa y E. coli fue menora 20,0%.De los halos de inhibición según la Tabla 5, seconcluye que las nanopartículas de quitosano poseeninhibición del crecimiento microbiano y que lafuncionalización de las mismas con moléculas delextracto de mora (agente modificante) aumenta dichaactividad.El efecto resultante sobre los agentes patógenospuede atribuirse a la presencia de polifenoles,saponinas, alcaloides, taninos, entre otros, presentesen el agente modificante empleado (extracto demora).

Referencias

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