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MECANISMOS RESPONSABLES DEL
PROCESO DE METASTATIZACIÓN
Células y Exosomas Circulantes
Félix Bonilla Velasco
H. Universitario Puerta de Hierro Majadahonda
Madrid
SESIÓN INVESTIGACIÓN TRASLACIONAL II
CTCs
Adhesión intercelular
Uniones Adherentes E-cadherina
SNAIL1, E-cadherina, VDR, ZEB1
E-Cad
TCF/LEF
C-myc, CD1...
+
SNAIL1 ZEB1
+
+
VDR
B-Catenina
APC
GSK
Axina
E-Cad
SNAIL1
E-Cadherina
?
Adhesión Celular
Cambios funcionales de las CTCs
• La célula tumoral pierde la capacidad de anclaje
• Necesita activar los mecanismos de degradación de la ME
• Bloquea la actividad mediada por células citolíticas
• Se adhiere al endotelio capilar
• Colabora en acondicionamiento del nicho
• Promueve angiogénesis
CTC frequency in PB
CTC Pleomorphism
Original Biopsy Wright-Giemsa CTC Fluorescent CTC
CTC Heterogeneity
CTC lung Cancer CTC Breast Cancer CTC Colon Cancer
Detección de CTCs
• Las CTCs deben ser distinguidas de otras células no específicas
• En base a tinción con anti-CK
• Las CTCs pueden perder las CK en el proceso de la EMT
• Capacidad de diferenciar endoteliales, mesenquimales, SC
• Otros marcadores específicos
Diameter
larger
than 5μm
+
Specific markers
Multiplex in situ RNA analysis
Recuperación de CTCs
Enriquecimiento y aislamiento
• Inmunomagnético
• Centrifugación
• Filtración
• Citometría
• Electroforesis
CTC como subrogado del tumor
• Ayuda en la elección de tratamiento
• Identifica enfermedad mínima residual
• Perfiles de resistencia a tratamiento
• Análisis de mecanismos de metástasis
• Posibilidad de hallar nuevas dianas terapéuticas
Conclusiones
• Métodos de identificación y aislamiento mejorables
• Información pronóstica en base a su presencia
• Perfiles moleculares posibles
• Ausencia de estudios de validación
• Significado clínico incierto
Schwarzenbach y col., Nat Rev Cancer 2011
Generación de microvesículas
circulantes
Sin tinción IP
Ultrastructure of exosomes
Raposo G; JCB, 2013
Exosome structure
Azmi et al, Cancer Met Rev, 2013
Raposo G; JCB, 2013
Exosomes secretion
Exosomes secretion
Azmi et al, Cancer Met Rev, 2013
Exosomes cell integration
El Andaloussi et al, Nat Rev Drug Disc, 2013
Exosomas derivados de células
tumorales necesitan
proteoglicanos, en la
membrana de la célula
receptora, para su
internalización.
Christianson et al, PNAS 2013
Transfer by exosomes
Raposo G; JCB, 2013
Exosomes vs Microvesicles
El Andaloussi et al, Nat Rev Drug Disc, 2013
Exomes in other fluids
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
high in Tbal
equal high in Tpl
Tpl vs Tbal
% o
f m
iRN
As
incr
ease
d 4
-fold
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
high in NTpl
equal high in Tpl
Tpl vs NTpl
% o
f m
iRN
As
incr
ease
d 4
-fold
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
high in NTbal
equal high in NTpl
NTpl vs NTbal
% o
f m
iRN
As
incr
ease
d 4
-fold
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
high in NTbal
equal high in Tbal
Tbal vs NTbal
% o
f m
iRN
As
incr
ease
d 4
-fold
Rodriguez et al; Genes Chrom Cancer, in press
NT-BAL NT-PL
T-PL T-BAL
47 KDa
Visualización de exosomas.
Detección de flotilina en exosomas.
Silva J, Gen Chromo Cancer 2012
Niveles de exosomas en pacientes con cáncer y controles sanos
Silva J, Gen Chromo Cancer 2012
Exosome levels Clinicopathological
parameters
Cases (%)
Low levels (%) High levels (%)
p
Sex
Male
Female
58.2
41.8
25.2
15.5
33
26.3
0.530
Localization
Rectum
Left
Right
31.1
30
38.9
13.3
10
17.8
17.8
20
21.1
0.602
VI
Yes
No
34.1
65.9
9.9
30.8
24.2
35.1
0.105
Tumor size
≤4cm
>4cm
44.3
55.7
19.3
22.7
25
33
0.793
CEA
≤3mg/mL
>3mg/mL
30.3
69.7
18.4
23.7
11.9
46
0.029
LNM
Yes
No
45.1
54.9
17.6
23.1
27.5
31.8
0.774
TD
Well
Moderate
Poor
15.4
67
17.6
6.6
31.9
2.2
8.8
35.1
15.4
0.039
Stage
I
II
III
IV
7.7
43.9
37.4
11
3.3
18.7
15.4
3.3
4.4
25.2
22
7.7
0.909
Relapse
No
Yes
75.3
24.7
30.3
11.2
45
13.5
0.670
Death
No
Yes
83.3
16.7
37.8
3.3
45.5
13.4
0.069
Relación entre niveles de exosomas en plasma y pronóstico.
Silva J, Gen Chromo Cancer 2012
Iero M y col., Cell Death and Differ 2008
Acciones
efectoras de
los
exosomas
liberados por
células
tumorales
La transferencia de MET desde los exosomas derivados de tumor a las células progenitoras de la MO promueve el proceso metastásico
in vivo, mediante su modulación y movilización
Nat Med, 2012
Promoting tumor effects
Soldevilla et al, Hum Mol Genet, 2013
Promoting tumor effects
Soldevilla et al, Hum Mol Genet, 2013
ΔNp73 exosme levels and survival
Exosomes cargo
Schorey JS y col., Traffic 2008
http://exocarta.org/
4563 proteins
1639 mRNAs
764 miRNAs
From 146 studies
Funciones de los exosomas
HUPHM
Gemma Domínguez
Beatriz Soldevilla
Coral San Millán
Cristina Peña
Mercedes Herrera
Alberto Herrera
Jose M García
Irene Gómez
Ester Martinez
Javier Silva
Vanesa García
Marta Rodríguez
Beatriz Gil
Félix Bonilla
IIB-AS
Jose M González-Sancho
Maria J Larriba
Alberto Muñoz
CIB
Rodrigo Barderas
Ignacio Casal
IMIM
Manuel Beltrán
Antonio García de Herreros
Columbia U
Jose M Silva
CNIO
Manuel Collado
Manuel Serrano
Karolinska CC
Arne Östman
Oslo U
Andrew Collins
ISCIII
Angel Zaballos
HVS
Rufo Rodríguez
C O L A B O R A C I O N E S
Recuperación de CTCs
Tráfico intercelular de exosomas
Simpson R.J. et al. Expert Reviews. 2009.
Exosomes in plasma
Azmi et al, Cancer Met Rev, 2013
Influencia del estroma
Celulas: mRNA LISCH7 (17.5%) Medio: mRNA LISCH7 (74.7%)
Fluorescently label CTCs
Exosomes and immune system
Marleav et al., J Trans Med 2012
Metástasis de B16-F10 cels en ratones
tratados con diferentes exosomas
Transferencia de Met exosomal a
progenitores de la médula ósea
Peinado H, Nat Med, 2012