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SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E
INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM
MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
2007
BLGO. ELIZABETH ANAYA RAMÍREZDRA. CECILIA MORÓN CORTIJO
BLGO. PATRICIA ARIAS PAREDEST.M. JOHANN CHAUCA TORRES
TÉC. LAB. RAÚL ROMÁN CUÉLLAR
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº65
SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM
I. IDENTIFICACION
Código del proyecto OGITT: 2-01-05-03-073
Centro de Referencia: Centro Nacional de Salud Pública
Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas
Título del Proyecto: “Serodiagnóstico de Rickettsiosis por prueba ELISA e Inmunofluorescencia IFI IgM”
Autores:
Blgo. Elizabeth Anaya Ramírez
Dra. Cecilia Morón Cortijo
Blgo. Patricia Arias Paredes
T.M. Johann Chauca Torres
Téc. Lab. Raúl Román Cuéllar
Lugar de ejecución:
Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud
Año de ejecución: 2005 - 2006
SERODIAGNÓSTICO DE RICKETTSIOSIS POR PRUEBA ELISA E INMUNOFLUORESCENCIA IFI IGM
II. RESUMEN
Objetivo: Implementar y validar una prueba ELISA e IFI IgM para rickettsiosis, demostrar la detección
temprana de anticuerpos IgM en pacientes agudos y contribuir con el diagnóstico diferencial de etiologías con
cuadro febril indiferenciado. Material y Método: Para éste estudio se aplicó una modificación del método IFI
utilizado en el Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud, descrito en el Manual
de Referencia del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas UTMB (1) y una modificación del método ELISA
descrito en McDade et al, 1988 (2). Se tomaron 55 sueros negativos y 100 sueros positivos de pacientes
procedentes de la seroteca 2005-2006 del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del INS. Finalmente se
seleccionaron 15 sueros de pacientes con diagnóstico serológico confirmado para otras enfermedades
bacterianas como brucelosis, leptospirosis y sífilis. Se utilizó como antígeno para la prueba ELISA un lisado
total del referencial Rickettsia akarii cepa Kaplan y para la prueba IFI fueron células Vero infectadas con R.
akarii cepa Kaplan proporcionadas gentilmente por el Dr. D.Walker del UTMB-Galveston-Texas-EUA.
Resultados: La prueba ELISA indirecta IgM mostró una Sensibilidad de 78% (78/100), una Especificidad de
80% (44/55), un VPP de 87.6% (78/89), un VPN de 66.7% (44/66) y una reacción cruzada con otras etiologías
bacterianas de 20% (3/15), mientras que la prueba de Inmunofluorescencia IFI IgM mostró una Sensibilidad
de 82% (82/100), una Especificidad de 90.9% (50/55), un VPP de 94.3% (82/87), un VPN de 73.5% (50/68) y
una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 13.3% (2/15). Conclusiones: El método ELISA
indirecta IgM estandarizado en el presente trabajo no es una prueba útil para ser aplicado en el diagnóstico de
rickettsiosis debido a su limitada sensibilidad y especificidad, sin embargo; la prueba IFI IgM presenta una
mejor sensibilidad (82%) y especificidad (90.9%) lo que indica que puede ser utilizada en estudios
epidemiológicos y en la vigilancia de la Rickettsiosis en el Perú.
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III. INTRODUCCION
La rickettsiosis es una enfermedad causada por una bacteria coco bacilar gram – negativa, intracelular
obligatoria y pertenece al grupo de las patologías bacterianas metaxénicas porque dentro del ciclo biológico
está involucrado un artrópodo (3,4). La bacteria pertenece al género Rickettsia y se caracteriza por ser
intracelular obligatoria. Estos microorganismos mueren al separarlos de la célula huésped (4,5). En la última
edición del Manual de Bergey (6), las rickettsias están clasificadas de la siguiente manera: Phylum BXII
Proteobacteria phy. nov, Orden II Rickettsiales, Familia I Rickettsiaceae, Genero I Rickettsias.
El género Rickettsia está clasificado es base a proteínas de superficie inmunodominantes rOmpA y rOmpB
(proteínas externas de membrana A y B) permite la diferenciación de dos grupos; el grupo de las fiebres
manchadas (SFG) y el grupo tifus (TG). El gen que expresa rOmpA se ha identificado en casi todas las
especies del SFG y no se ha encontrado en el TG (3,4,7). Los vectores involucrados en la transmisión de la
enfermedad son las garrapatas, ácaros, piojos corporales humanos y pulgas, estos artrópodos son
ectoparásitos de animales asociados con el hombre como animales domésticos y roedores (3,4,5).
La enfermedad está relacionada a las condiciones en que habita el ser humano, esto se refleja en ocurrencia
de epidemias explosivas de tifus epidémico cuando las condiciones socio culturales son precarias como en
época de guerra, pobreza, hacinamiento, etc (3,8,5).
Perú reporta mas del 50 % de los casos notificados de Tifus epidémico a nivel mundial procedentes de zonas
endémicas de la sierra sur y central, en los departamentos de Cuzco, Apurimac, Ayacucho, Puno y Arequipa
confirmados por exámenes de laboratorio (9,10), teniendo como causas principales: las condiciones precarias
en que viven los pobladores de nuestras provincias y las deficientes medidas del control de brotes o endemias
(11), estudios posteriores han determinando la importancia de las pulgas, piojos, garrapatas y ácaros en la
transmisión de las rickettsiosis (12). Desde 1999 se ha reportado casos de rickettsiosis en nuevas zonas de
Perú (13,14) que incluyen zonas de altura, áreas tropicales y semitropicales. Anticuerpos de clase IgM
pueden ser detectados a partir de la primera semana de fase aguda de la enfermedad por lo cual es
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necesario contar con métodos apropiados de diagnóstico como IFI y ELISA IgM, procedimientos altamente
sensibles y específicos (15,16).
Rickettsiosis es una enfermedad metaxénica emergente y reemergente en diferentes zonas de Perú, con
cuadro febril indiferenciado por lo que es importante que sea considerado como un diagnóstico diferencial de
etiologías como, dengue, leptospirosis, bartonelosis, influenza entre otras, donde es necesario considerar el
incremento de febriles negativos a etiologías endémicas de la zona, así como la presencia de vectores
potencialmente infectivos para la transmisión de rickettsiosis (piojos, pulgas, garrapatas y ácaros). La
detección de anticuerpos IgM por ELISA e IFI aún no ha sido implementada en el país para la captación de
casos agudos de rickettsiosis, debido a que los anticuerpos IgG presentes en la muestra sérica actúan
competitivamente con los anticuerpos IgM dando como resultado falsos positivos, por lo que se hace
necesario aplicar sistemas de pre tratamiento óptimos a los sueros a fin de evitar falsos positivos (21).
Las enfermedades asociadas a Rickettsias como por ejemplo Grupo Tifus y Grupo de Fiebres Manchadas,
constituyen causas importantes de morbi-mortalidad alrededor del mundo. En México, en un brote de una
enfermedad febril aguda no determinada al inicio, que parecía compatible con dengue, se realizo una
investigación que demostró la existencia de una infección por Rickettsias del Grupo Fiebre Manchada (17,18).
La presentación clinica de Rickettsiosis del Grupo Tifus y sobre todo Fiebre Manchada es poco especifica lo
que puede llevar a confusion en el diagnostico diferencial con otras infecciones que existen en áreas
endémicas del país como dengue, leptospirosis, influenza, fiebre tifoidea, etc. Los síntomas y signos del tifus
y en general de las demás rickettsiosis son variados y dependen del órgano afectado asi como de la
liberación de citoquinas en el torrente sanguineo. Fiebre, tos, cefalea, escalofríos, mialgias, artralgias,
anorexia, vómitos y dolor abdominal ocurren en diferentes proporciones en los pacientes afectados por tifus.
Otros síntomas y signos incluyen la presencia de brotes cutáneos maculopapulares, purpúricos y petequiales;
síntomas asociados con el SNC tales como convulsiones, ataxia, fotofobia; hepato/esplenomegalia e ictericia
también se pueden presentar. Todos estos síntomas son inespecíficos, y por tanto el diagnóstico preciso
descansa en criterios claves clínicos y epidemiológicos, los cuales son confirmados por el laboratorio (19).
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El diagnóstico de laboratorio del tifus se ha basado históricamente en la serologia, inicialmente con la
aglutinación con Proteus vulgaris cepa OX-19 cuya sensibilidad y especificidad es muy baja. Pruebas
serológicas más específicas incluyen la inmunofluorescencia indirecta (IFI), e inmunoperoxidasa,
consideradas como “ gold standard” para el diagnóstico serológico de tifus y rickettsias en general.
Un título de 1:64 es considerado el valor mínimo para diagnóstico presuntivo de infección por rickettsia.
Criterios para un diagnóstico de infección reciente por rickettsia son: (a) un aumento del título serológico al
cuádruple del valor obtenido con la primera muestra; (b) un título mayor o igual de 1:256 en la etapa aguda.
El número real de casos de tifus no se conoce debido en parte a la dificultad en el diagnóstico clínico, puede
ser confundida con otras enfermedades como influenza, dengue, fiebre tifoidea, malaria, leptospirosis,
arbovirus, enterovirus, arenavirus, entre otros. Aún en áreas en donde infecciones por tifus son bien
conocidas por la comunidad médica, el diagnóstico clínico correcto inicial de tifus se hace solo en 5 a 10% de
casos (20).
La prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) es la prueba “gold estándar” de las pruebas serológicas,
permite detectar anticuerpos IgG, IgM o ambas. Las infecciones por Rickettsias del SFG y TG no son
diferenciadas por esta prueba; existe reacción cruzada entre ambos grupos. La prueba demostró tener una
especificidad del 100% y una sensibilidad del 84.6% (22).
Otra técnica descrita para el diagnóstico de rickettsiosis, es una ELISA de tipo indirecta (23,24,25,26), donde
la mayor complejidad radica en la producción del antígeno (8), debidoa que los métodos descritos, exigen
separación total de Rickettsias de la célula huésped por métodos de separación con gradiente de densidad
con Renografina (27,28,29). La Renografina es un compuesto formado por diatrozoato de meglumina,
diatrozoato de sodio utilizado para dar un contraste idóneo en radiografías a las vías urinarias y exploraciones
angiografías (30), también ha sido utilizado para el aislamiento de clamidias y mitocondrias (28). Este método
logra separar 3.3mg por huevo embrionado, 0.27mg por frasco de cultivo celular de Rickettsia typhi y
Rickettsia prowazekii del huésped eucarionte, y resulta sumamente costoso (29).
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Las técnicas de separación con gradiente de sucrosa también han sido probadas, la eficiencia del método es
nula debido a que en el proceso se pierde la capacidad antigénica de la bacteria (27,29). Por otro lado,
técnicas menos sofisticadas de separación no han sido probadas.
Este mismo problema esta presente en la purificación de varios tipos de virus, es por eso que se han
publicado técnicas basadas en centrifugaciones progresivas a diferentes gravedades, las cuales logran
separar parcialmente el virus del huésped eucarionte para luego usar este extracto purificado utilizado en
inmunoensayos como la prueba ELISA (31).
Los ELISA que usan antígeno purificado presentan una alta sensibilidad a diluciones de suero de hasta
1/10000, además de ser mas sensible que técnicas como Micro aglutinación (MA) y Fijación de Complemento
(CF) por solo necesitar una concentración de 0.5 ug/mL de antígeno (24), también se reporta que aunque
ELISA es más sensible, la prueba IFI es más específica (23, 25, 32).
Si bien existe una prueba ELISA para diagnostico de Rickettsiosis, aún no se ha probado con antígeno total
lo cual reduciría enormemente el costo de la prueba.
Las técnicas en nuestro país para el diagnostico de esta enfermedad son poco desarrolladas y no se ha
realizado la estandarización de una prueba ELISA indirecta ni IFI IgM con antígeno crudo total.
Es importante resaltar que el presente trabajo tiene importancia en la epidemiología de la enfermedad,
además de reforzar la vigilancia en zonas endémicas del país.
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IV. MATERIAL Y METODOS:
Material biológico: La cepa de Rickettsias utilizada en el estudio es de una Cepa Referencial de Rickettsia
akarii del Laboratorio Referencial de la UTMB (University Texas Medical Branch)
Sueros: Se seleccionó 100 sueros positivos de pacientes con rickettsiosis de diferentes áreas geográficas
del Perú y remitidos al Instituto Nacional de Salud, procedentes de la seroteca del Laboratorio de Metaxénicas
Bacterianas (INS). Todos fueron diagnosticados positivos para anticuerpos IgTotal (IgM+IgG+IgA) contra al
antígeno rickettsial con la prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Los sueros negativos (n=55) fueron
seleccionados de pacientes que fueron negativos para IFI tanto para anticuerpos IgTotales como para IgG
contra antígeno rickettsial.
Conjugado: Conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado a peroxidasa
(SIGMA) para la prueba ELISA y conjugado Anti-human IgM (u cadena específica) elaborado en cabra ligado
a isotiocianato de fluoresceína-FITC (CALBIOCHEM) para la prueba IFI.
Producción de antígeno rickettsial: Se utilizó cultivos celulares VERO incubados a 37°C (incubadora,
MEMMERT) en frascos para cultivo celular de 75 cm2 (FALCON) con una monocapa formada en un 80% (ver
Fig. Nº1) enriquecida con medio EMEM (Medio Mínimo Esencial con sales de Earles, GIBCO) y 10% de suero
bovino fetal (SBF). Se retiró el medio y se añade una suspensión de antígeno Rickettsia akarii reconstituida
en un 1ml de agua destilada estéril y diluida 1:15 en buffer sucrosa – fosfato – glutamato estéril o, cultivos
positivos criopreservado. Incubar a 34°C por 1 hora, agitando suavemente cada 15 min., agregar medio
EMEM con 5% SBF sin antibiótico e incubar a 34°C por 7-10 días (3). Monitorear el cultivo con ayuda de
un microscopio de luz invertida (CARL ZEISS) hasta observar efecto citopático (ECP) en 90-100% (ver Fig.
N°2), desprender las células infectadas con tripsina (GIBCO), y centrifugar por 10minutos a 5000 rpm,
recuperar el pellet, resuspender en PBS y centrifugar. Repetir el proceso 2 veces mas (5). Finalmente el pellet
se diluye en PBS 1X y se hace un conteo de células en microscopio de luz invertida (400x) con Cámara de
Neubauer (ver Fig. N° 3).
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El antígeno rickettsial crudo fue procesado según Cruz y col. (31), sin embargo, la ruptura celular fue
realizada por sonicación con seis toques de 10 segundos cada uno con intervalos de 10 segundos a 4 ºC.,
centrifugar a 2000 rpm, separar el sobrenadante para inmufluorescencia y determinación de concentración
proteica por método de Lowry (33).
Fig.N°1: Cultivo normal de células VERO. A 400x. Fig.N°2: Cultivo infectado de células Vero con Rickettsia akarii. A 400x.
Figura N°3. Cámara de Neubauer usada para conteo celular.
Titulación de antígeno: Se prepararon diferentes diluciones de antígeno con PBS pH 7.2 y se utilizaron
microplacas para ELISA Polysorp (NUNC NALGENE) de 8 x 12 pocillos de fondo plano, donde se dispenso
100μL de las diluciones del antígeno. Se incubaron 24 horas a 4°C (23,24). Luego de la incubación se
elimino el excedente de las diluciones y se guarda a -20°C.
Titulación del suero: Se diluyó los sueros controles con PBS Tween-20 al 3% de leche descremada. Las
diluciones se dispensaron 100 μL a cada pocillo. Se incubaron por 30min. a 37°C y se lava por 6 veces (24).
Titulación de conjugado: Se prepararon las diluciones con buffer PBS Tween-20 al 3% de leche
descremada (24), se incubaron por 30min.a 37°C y se lavaron seis veces, se agregó el sustrato o –
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fenilendiamina (OPD) con peroxido de hidrógeno diluido en buffer citrato y se incubaron 15min.a temperatura
ambiente (24). Se agregó solución de parada ácido sulfúrico 1M y se leyó a 490nm en un lector para ELISA
ThermoLabsystem.
Prueba de Inmufluorescencia Indirecta IgM: Descongelar las láminas 30 min. antes de realizar la prueba.
Diluir el suero del paciente en buffer PBS 1:4, tomar un volumen de ésta dilución y diluir 1:4 con el reactivo
Diluyente IgM PreTreatment (FOCUS), incubar a temperatura ambiente por 15min, centrifugar y diluir 1:4 con
PBS + skim milk 3% y agregar 10ul del suero diluido a cada círculo de la lámina e incubar en cámara húmeda
a 37 °C por 30min. Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS pH 7.2 por 10 minutos
cada vez, dejar secar a temperatura ambiente o por 5 min. a 37°C, una vez seco agregar 10μL del conjugado
(diluido 1:10) por cada circulo de la lamina incubar por 30min. en cámara húmeda a 37°C.
Retirar las laminas de la cámara húmeda y lavar 3 veces con PBS pH 7.2 por minutos cada vez. Dejar secar
y realizar el montaje para observar al microscopio de inmunofluorescencia con objetivo 40x (LEICA DMLS).
Ensayo ELISA IgM: Se diluyeron los sueros en buffer diluyente (ver anexo), se dispenso 100 μL en cada
pocillo de la placa (Polysorb, NUNC nalgene) y se incubaron por 30 min. a una temperatura de 37°C, lavar
seis veces con 300 μL de buffer de lavado (ver anexo) por cada lavado en un lavador automático
(Thermolabsystem). Se agrego 100μL de conjugado diluido en buffer diluyente, se incubo por 30 min. a una
temperatura de 37°C (24). Finalmente, agregar 100μL de sustrato, incubar por 15 min. a temperatura
ambiente y agregar la solución de parada (ver anexo)(24). Se leyó a 490nm en un lector ELISA
Thermolabsystem.
ANALISIS DE DATOS: Obtenidas las lecturas, se procedió a analizar los datos para obtener los valores de
Especificidad, Sensibilidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo de la prueba, aplicando las
siguientes fórmulas:
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PRUEBA REFERENCIA (IFI IgTotal)
PRUEBA (ELISA IgM
/ IFI IgM) POSITVO NEGATIVO TOTAL
POSITIVO a b a+b
NEGATIVO c d c+d
TOTAL a+c b+d n
Tabla Nº 1. Modelo de Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM e IFI IgM.
Sensibilidad (Se): Es la probabilidad de que la prueba de resultado positivo cuando la enfermedad esta
presente (34,35).
cnegativosfalsosapositivos
apositivosSe
Especificad (Sp): Es la probabilidad de que la prueba de resultado negativo cuando realmente no existe la
enfermedad (34,35).
bpositivosfalsosdnegativos
dnegativosSp
)(
Valor Predictivo Positivo (VPP): Es la probabilidad de presentar la enfermedad cuando es positivo a la
prueba (34,35).
bpositivosfalsosapositivos
apositivosVPP
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Valor Predictivo Negativo (VPN): Es la probabilidad de estar sin la enfermedad cuando eres negativo a la
prueba .(34,35)
dnegativosfalsoscnegativos
cnegativoVPN
)(
Valor de Corte ( VC ): Se procedió a realizar el cálculo del Valor de corte en base a las lecturas de los
controles negativos y positivos obtenidos, aplicando la siguiente fórmula: VC= XCN + 2DS
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V. RESULTADOS
V.1. Producción del antígeno Rickettsial: se observó que lisar las células con sonicador es mejor que
siguiendo el protocolo original shock térmico (31). Para elegir la dilución de antígeno apropiada se obtuvo
70.37µg/mL de concentración proteica con una producción en masa de antígeno de R. akarii.
V.2. Titulación del antígeno y suero: Se probaron 3 diferentes diluciones seriadas (Tabla Nº2), de las
cuales se obtuvieron valores de densidad óptica (OD) del pool de sueros positivo y del pool de sueros
negativos. Para determinar la mejor dilución se dividió el valor del OD del pool de sueros positivos entre el
valor del OD del pool de sueros negativos, y obtener el valor (ratio) que represente la dilución optima a la cual
el valor del OD del pool positivo se separa mas del valor del OD del pool negativo, reportándose que la
dilución optima del antígeno fue 1/50 con un ratio de 3.27 con una dilución de suero de 1/50. (Tabla Nº2).
DILUCIONES DE SUERO
1/100 1/50 1/25
1/25 1.80 2.75 2.67
1/50 3.01 3.27 2.70
DILUCION
ANTIGENO
ELISA IgM 1/100 2.36 1.97 2.01
Tabla Nº 2. Titulación de antígeno a diferentes concentraciones de suero, el conjugado se trabajo a dilución 1/1000. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio.
V.3. Titulación del conjugado y suero: Los datos también son representados con ratios, además
también se probaron distintas soluciones la mismas diluciones del pool de sueros positivo y negativo (Tabla
Nº3). La dilución óptima de conjugado fue 1:1000 con un ratio de 4.93 (Tabla Nº3 )
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DILUCIONES DE SUERO
1/100 1/50 1/25
1/1000 2.77 4.93 3.51DILUCION
CONJUGADO
ELISA IgM 1/2000 2.74 4.17 4.38
Tabla Nº 3 Titulación del conjugado a diferentes diluciones de suero. El antígeno se trabajo a una dilución de 1/50. Los resultados están expresados en ratios, OD del pool positivo entre OD del pool negativo. Esta resaltado el mayor valor de ratio
V.4. Análisis de datos: Después de encontrar la dilución óptima del antígeno, del suero, y del conjugado
se procesaron por la prueba ELISA IgM e IFI IgM los sueros controles y los casos confirmados por IFI IgTotal,
y se halló el punto de corte con lo que se calculó la sensibilidad, especificidad , VPP, VPN para cada prueba,
tal como se muestra en la Tabla N°4, 5 y 6.
PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal
PRUEBA (ELISA IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL
POSITIVO a 78 b 11 a+b 89
NEGATIVO c 22 d 44 c+d 66
TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155
Tabla Nº 4. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar ELISA IgM en rickettsiosis. k=0.83
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PRUEBA REFERENCIAL IFI IgTotal
PRUEBA (IFI IgM) INFECTADOS NORMALES TOTAL
POSITIVO a 82 b 05 a+b 87
NEGATIVO c 18 d 50 c+d 68
TOTAL a+c 100 b+d 55 n 155
Tabla Nº 5. Tabla para la comparación de la prueba referencial (IFI IgTotal) y la prueba a estandarizar IFI IgM en rickettsiosis. k=0.88
RESULTADO FINALABREV. VALOR (%)
ELISA IgM
VALOR (%)
IFI IgM
VALOR DE CORTE VC 0.51 1/ 64
SENSIBILIDAD Se 78 82
ESPECIFICIDAD Sp 80 90.9
VALOR PREDICTIVO POSITIVO VPP 87.6 94.3
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO VPN 66.7 73.5
Tabla N°6: Resultado de las evaluaciones realizadas para las pruebas ELISA IgM e IFI IgM para rickettsiosis hallados en el presente trabajo.
Se observa en la Tabla N°6 que la prueba IFI IgM para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente
trabajo presentó una mejor especificidad y sensibilidad, en comparación con la prueba ELISA IgM..
En la Tabla N°4 y 5 se muestran los resultados de ELISA e IFI IgM y se compara ambas pruebas con índices
de concordancia como el índice Kappa que con una valor de 0.83 y 0.88 nos indica que hay una mejor
concordancia para la prueba IFI IgM.
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VI. DISCUSION
El antígeno producido en el presente trabajo (31) es un extracto crudo, lo que indica que puede presentar
reacción no especifica en la prueba (34). Muchos protocolos de purificación de antígeno utilizan Renografina
para hacer una gradiente de separación y obtienen hasta una cantidad de 3.3 mg de Rickettsias purificadas
por frasco de cultivo celular (27, 28, 29), nuestros resultados muestran que a partir de 05 frascos de cultivo
celular (24mL aproximadamente con una concentración 1.5 x 107 células/mL) es posible obtener una
concentración de antígeno rickettsial de 70.37 µg. La cantidad de antígeno purificado con Renografina es
mucho mayor que la obtenida en el presente trabajo, sin embargo; la diferencia en los costos es muy
significativa. Es importante señalar que debe utilizarse un mismo lote de preparación de antígeno para
estandarizar y validar la prueba (34).
La estandarización de la prueba ELISA (24) fue adaptada a las condiciones de laboratorio relacionadas al tipo
de placa, buffer de sensibilización, agente bloqueador, y conjugado. La placa de elección fue NUNC polysorb,
por ser una placa de baja adherencia que solo se enlaza con partículas hidrofóbicas, al trabajar con un
antígeno parcialmente purificado esta selección en el enlace es un ventaja porque hay menos probabilidad
que se adhiera proteínas que den reacción no especifica (36). En relación al buffer de sensibilización se
selecciona al que más se aproxime al punto isoeléctrico de la proteína que se va adherir al plástico (34). En
nuestro trabajo, el antígeno utilizado tiene una mixtura de proteínas y por lo tanto no se puede calcular el
punto isoeléctrico, por ello se requiere un buffer neutral como PBS a un pH 7.2 (34).
Se han probado antígenos mas específicos como con LPS (lipopolisacaridos de membrana) con costos
elevados y donde se reportan 100% de sensibilidad y 87.5% de especificidad (25), sin embargo; en el
presente estudio se muestra una aceptable sensibilidad y especificidad con una producción de antígeno a
menor costo.
La sensibilidad y la especificidad fueron calculadas por el método de análisis de casos, el mas conocido es el
punto de corte que se halla calculando el promedio de los seis negativos mas tres desviaciones estándar (34)
y necesita 30 casos como mínimo para su evaluación (35) pudiendo resultar una limitante para otros estudios.
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La prueba IFI IgM presenta los mejores resultados en la evaluación tanto en sensibilidad (82%), especificidad
(90.9%) y concordancia en relación a la prueba “gold estandar” IFI IgTotal utilizada en el INS (k=0.88) y
teniendo en cuenta la menor complejidad que requiere para su implementación (20,21,22) por lo que sería de
gran utilidad en estudios epidemiológicos de zonas endémicas para rickettsiosis y mejorando aún más su
especificidad podría ser de aplicación en el diagnóstico.
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VII. CONCLUSIONES
La lisis del antígeno rickettsial con ultrasonido (sonicador) ofrece mejores resultados que la
producida con shock térmico.
La concentración de antígeno para revestir el pocillo de la microplaca de ELISA IgM es de
1.4μg/mL (1/50), mientras que en la IFI IgM se requiere 103 células/ml sin aplicación de lisis
celular.
La dilución del conjugado anti-human IgM (u cadena especifica) sintetizado en cabra y ligado
con peroxidasa fue 1/1000, mientras que la dilución del conjugado anti-human IgM ligado a FITC
fue de 1/100.
La sensibilidad y especificidad detectada para la prueba IFI IgM fue mayor que la encontrada en
la prueba ELISA IgM,
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VIII. BIBLIOGRAFIA
1. IFA procedure for detection of antibodies to Rickettsia rickettsii. Infectious Diseases Reference
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SOLUCIONES Y BUFFER
Buffer salino fosfato (PBS al 1M)
Cloruro de sodio (NaCl) 8g
Cloruro de potasio (KCl) 0.2g
Fosfato monobásico de sodio anhídrido (Na2HPO4) 0.91g
Fosfato monobásico de potasio anhídrido (KH2PO4) 0.14g
Agua bidestilada 1 L
Regular hasta pH 7.2 con Ácido Clorhídrico 1M y con Hidróxido de sodio 1M
Buffer de lavado Buffer de dilución
Buffer PBS Buffer PBS
Tween 20 al 0.5% Skim milk al 2.5%
Tween 20 al 0.5%
Buffer citrato
Ácido cítrico (C6H8O7) 5.1g
Fosfato monobásico de potasio anhídrido (Na2HPO4) 7.47g
Agua destilada 1L
Preparación de sustrato Reactivo parada:
Buffer citrato 12.5 mL Ácido sulfúrico (H2SO4) al 1N
Pastilla de OPD (1 unidad) 5 mg Ácido sulfúrico (H2SO4) 53 ml
Peroxido de hidrogeno H2O2 5 µL Agua destilada 100 ml
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